Summary
유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.
Abstract
생명체는 온도, pH, 반응 산소 종의 축적 등에서 변화를 포함 하 여 그들의 수명 주기 동안 환경 변동에 대처 하기 위해 정기적으로 필요 합니다. 이러한 변동 광범위 한 단백질 전개, 집계,으로 이어질 수 있으며 세포 죽음. 따라서, 세포 스트레스 조건 중 "건강 한" 프로테옴을 유지 하는 분자 보호자의 역동적이 고 스트레스 관련 네트워크를 진화 했다. ATP-독립 보호자 일선 방위 분자, 스트레스-종속 방식에서 단백질 집계에 대 한 보호로 봉사 하는 분자 보호자의 1 개의 주요 클래스를 구성 합니다. 한 이러한 보호자 공통점 기능은 그들의 스트레스 관련 활성화, 인식 및 misfolded 클라이언트의 버전에 대 한 구조적인가 소성을 활용 하는 능력.
이 문서에서 우리는 한 그러한 본질적으로 무질서 보호자, 단백질 산화 스트레스 동안 집계에 대 한 보호는 세균성 산화 규제 Hsp33의 기능 및 구조 분석에 집중 한다. 여기, 선물이, 보호자의 구조적 변화를 매핑 뿐만 아니라 보호자 redox 규제 활동, 공부에 대 한 다양 한 기술의 도구 상자 밑에 그것의 활동. 특히, 우리는 보호자 안티 집계 활동에서 생체 외에서 빛 산란을 사용 하 여의 정도에 초점을 맞추고의 분석 이어서 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비를 포함 하는 워크플로 설명 합니다 반대로 집계 활동과 그 활동입니다. 극복 하기 위해 자주 outliers 집계 분석 하는 동안 축적 된, Kfits, 운동 측정의 쉬운 처리를 수 있는 새로운 그래픽 도구 사용을 설명 합니다. 이 도구는 쉽게 다른 유형의 outliers를 제거 및 운동 매개 변수 피팅 운동 측정에 적용할 수 있습니다. 단백질 구조와 기능을 연결할 설치 및 워크플로 구조 질량 분석 기술, 수소 중수소 교환 질량 분석, 구조적 변화의 매핑은 보호자 수의 설명 및 Hsp33 활동의 다른 단계 동안 있는 기질 다른 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용에는 동일한 방법론을 적용할 수 있습니다.
Introduction
셀 자주 발생 하는 반응성 산소 종 (선생님)의 호흡1,2, 단백질 및 지질 산화3,4및 추가 프로세스5, 부산물 생산의 축적 6,7. 선생님 셀룰러 신호8,9 및 면역 응답10등 다양 한 생물학 과정에서 유익한 역할에 불구 하 고 선생님 생산 및 그것의 해독 사이의 불균형이 발생할 수 있습니다, 산화를 선도 7스트레스. 선생님의 생물 목표 단백질, 지질 및 핵 산의 산화가 그들의 구조와 기능에 영향을 미칠 있습니다. 따라서, 셀룰러 oxidants의 축적은 강하게 pathologies 암9,11, 염증12,13, 노화14, 등의 다양 한 범위에 연결 15, 그리고 발병 및 Alzheimer의, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환의 진행, 그리고 루 게 릭 병 질환16,,1718에 관련 된 발견 되었습니다.
모두 새로 합성 하 고 성숙한 단백질 단백질 구조와 기능19,20모양 그들의 사이드 체인의 잠재적으로 유해한 수정으로 인 산화에 매우 민감합니다. 따라서, 산화 스트레스는 일반적으로 광범위 한 단백질 비활성화, misfolding 및 집계, 결국 세포 죽음으로 이어지는 리드. 광범위 한 단백질 집계 misfolded 클라이언트 단백질21와 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 대신 억제 redox 종속 보호자를 활용 하는 단백질 산화의 잠재적인 손상에 대처 하기 위해 우아한 셀룰러 전략 중 하나 ,,2223. 이 첫 번째-라인 방어 보호자 강력한 안티 집계 분자24로 그들을 변환 하는 (보통에 시스테인 잔류물) 사이트별 산화에 의해 급속 하 게 활성화 됩니다. 산화 스트레스 조건25,26 동안 정식 ATP 의존 보호자는 덜 효과적인 산화 스트레스 결과 호흡 억제 및 세포질 ATP 레벨25감소, 이후 27. 따라서, ATP 독립 보호자 redox 활성화 재생 oxidants 박테리아 및 진핵생물의 축적에 따라 단백질 항상성 유지에 중요 한 역할 (예:Hsp3328 , RidA29 박테리아, Get3에에서30 효 모, peroxiredoxins31 진핵생물에서에서). 이러한 보호자의 활동 강하게 소수 지역 misfolded 클라이언트 단백질의 인식에 관련 된 폭로 사이트 산화에 의해 유도 된 가역 구조 구조적 변화에 따라 달라 집니다.
반대로 집계 메커니즘 및 클라이언트 단백질의 인식 보호자에 의해 통치 원리의 연구 보호자 기판 상호 작용32,33의 역동적이 고 heterogenic 특성상 쉽지 않다 34,35,,3637. 그러나, 스트레스 통제 보호자는 그들의 능력 때문 반대로 집계 함수에 대 한 우리의 이해를 전진 하는 기회: 1)는 보호자, (예를 들면, 산화) 활성 및 비활성 (예를 들어, 두 가지 형태를 얻을 감소), 소개 또는 쉽게 전환 (예:산화 제, 환 원제), 그들 2 스트레스 조건 제거)는 광범위 한 기판, 3) 클라이언트 단백질에 의해 평가 될 수 있는 매우 안정적인 단지 형성 다른 구조적 방법론, 및 4) 기판 인식 및 릴리스, 대부분 이러한 보호자의 접는 기능 부족으로 redox-종속 구조적 변화에 의해 중재에 전적으로 초점을.
여기, 우리 세균 redox 규제 보호자 Hsp33의 안티 집계 활동, 산화 유도 단백질 집계28에 대 한 세균 방어 시스템의 중요 한 구성 요소를 분석합니다. Hsp33는 활동 없이 보호자; 밀접 하 게 접힌된 아연-바인딩 단백질 감소, 그러나, 산화 스트레스에 노출 되 면 Hsp33의 기판 바인딩 지역38,39노출 광범위 한 구조적 변화를 겪 습. 산화, 시 C 터미널 도메인의 4 개의 높은 보존된 시스테인 잔류물에 강력 하 게 바인딩된 아연 이온 출시40입니다. 이 결과 C 터미널 도메인 및 인접 한 링커 지역41의 불안의 전개는 두 개의 이황화 결합의 대형에. C-터미널, 링커가 지역은 매우 유연 하며 본질적으로 또는 부분적으로 무질서로 정의 됩니다. 아닌 스트레스 조건에 반환, 시는 시스테인 감소 되 고는 보호자 안티 집계 활동 없이 네이티브 접힌된 상태로 돌아갑니다. 보호자의 refolding 더 전개를 지도 하 고 바인딩된 클라이언트 단백질 트리거 refolding38정식 보호자 시스템, DnaK/J, 그것의 이동의 불안정. Hsp33의 상호 작용 사이트의 분석 제안 Hsp33 사용 하 여 두의 충전 무질서 잡으려고 링커 N 맨끝 도메인에 소수 성 영역 뿐만 아니라 영역 클라이언트 단백질을 misfolded 고 방지 그들의 집계38, 42. 접힌된 상태에서이 지역 접힌된 링커 및 C 터미널 도메인으로 숨겨져 있습니다. 흥미롭게도, 링커 지역 "감지" 그것의 인접 한 C 터미널 도메인34의 접는 상태 Hsp33의 접힌된 비활성 상태의 게이트 키퍼 역할을 합니다. (포인트 돌연변이 또는 전체 순서 섭 동에 의해 중) mutagenesis에 의해 불안정 하 게, 일단 그것의 산화 환 원에 민감한 시스테인43의 산화 환 원 상태 Hsp33 constitutively 활성 보호자 관계 없이로 변환 됩니다.
여기에 제시 된 프로토콜 활성화 시 매핑은 구조적 변화 뿐만 아니라 Hsp33의 redox 종속 보호자 활동 모니터링 클라이언트 단백질의 바인딩을 허용 합니다. 이 방법론은 다른 보호자 클라이언트 인식 모델 뿐만 아니라 비 보호자 단백질-단백질 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 단백질 활동에 단백질 산화의 잠재적인 역할을 다른 산화 환 원 스위치 단백질의 연구에 사용할 수 있는 완벽 하 게 감소 하 고 산화 보호자의 준비에 대 한 프로토콜을 제시.
우리가 보호자 활동에서 생체 외에서 모니터링 하 고 다른 유형의 단백질 집계 (화학적 또는 열 유도) 산란 (LS)에 의해 측정을 사용 하 여에서 그것의 기질 특이성을 정의 하는 절차를 설명 하는 구체적으로 fluorospectrometer44. 집계, 동안 360 nm 증가 급속 하 게 증가 탁 때문에 분산을 빛. 따라서,이 파장에서 시간에 따른 방식으로 집계를 모니터링할 수 있습니다. LS는 단백질 집계 및 따라서 nanomolar 농도, 활성화 단백질 집계 관련 운동 매개 변수에서 다른 특성을 사용 하 여 관심사의 단백질의 안티 집계 작업 테스트를 위한 신속 하 고 민감한 방법 조건입니다. 또한, 여기에 설명 된 LS 프로토콜 비싼 장비를 요구 하지 않는다 그리고 어떤 실험실에 쉽게 설치 될 수 있다.
그럼에도 불구 하 고, 그것은 "깨끗 한" 운동 곡선을 얻을 수와 같은 빛을 뿌리는 실험, 소음 및 공기 방울 및 큰 집계에 의해 생성 된 outliers의 많은 수에서 단백질의 운동 매개 변수를 파생 하는 매우 도전. 이 장애물을 극복 하기 위해 소설 그래픽 도구, Kfits45, 다른 운동 측정, 특히 단백질 집계 운동 데이터에 대 한 장착에 잡음 레벨을 감소 시키기를 위해 사용 하는 것이 선물이. 이 소프트웨어는 결과의 초기 평가 대 한 예비 운동 매개 변수를 제공 하 고 "깨끗 한" 많은 양의 데이터 신속 하 게 운동 속성을 영향을 주지 않고 사용자 수 있습니다. Kfits 파이썬에서 구현 이며 45오픈 소스에서 사용할 수 있습니다.
필드에 도전적인 질문 중 하나는 보호자와 그들의 클라이언트 단백질 사이 상호 작용 사이트를 매핑 및 보호자 misfolded 기판의 넓은 범위를 인식 하는 방법을 이해 관련이 있습니다. 이 질문은 더 복잡 보호자 및 집계 경향이 기판 무질서 공부 본질적으로 포함 하는 매우 동적인 단백질 복합물. 다행히도, 구조 질량 분석은 극적으로 지난 10 년간 고급 고가 성공적으로 도움이 접근 및 구조상가 소성을 분석 하 고 잔류물 단백질 인식46, 에 지도 하는 도구 47 , 48 , 49. 여기, 선물이 하나 이러한 기술은 수소 중수소 교환 질량 분석 (HDX-MS)-단백질 수정 또는 단백질/Ligand 바인딩35, 구조 형태에 잔류물 수준 변경의 매핑 수 있습니다 50,51,,5253,54,55. HDX MS 중수소, 화학 환경, 접근성, 속도의 영향을 받는 여 백본 hydrogens의 지속적인 교류를 사용 및 공유 및 공유 결합56. HDX MS deuterated 용 매, 일반적으로 중 수 (D2O)를 사용 하 여 이러한 exchange 프로세스를 추적 하 고 측정 수소 중수소 교환에 따라 분자량의 변화에 따라 수 있습니다. 수소 중수소 교환 속도가 느리거나 hydrogens 수소 결합에 참여 또는, 간단 하 게, 구조57에서 로컬 변경 사항을 나타내는 입체 방해에서에서 발생할 수 있습니다. Ligand 바인딩 또는 포스트 번역 상 수정 변경 수소 중수소 교환 (HDX) 요금46,53에 차이에 결과 바인딩을 사용 하 여 수소 환경에 차이 또한 발생할 수 있습니다.
우리는 급속 하 게 산화, Hsp33의 활성화로 이어지는 시 전개 2) 그것의 전체 길이 misfolded 기판, 구 연산 염 synthase (CS)38와 Hsp33의 잠재적인 바인딩 인터페이스 정의 1) 지도 Hsp33 지역에이 기술을 적용.
이 원고에 설명 된 방법은 redox 종속 기능 단백질에 체 외에, 안티 집계 활동 및 정의 구조 변경의 역할 (있을 경우) 단백질 기능 연구에 적용할 수 있습니다. 이러한 방법론을 쉽게 다양 한 생물 학적 시스템에 적응 하 고 실험실에서 적용 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 완벽 하 게 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비
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완벽 하 게 감소 된 단백질의 준비
참고: 여기, 우리가 설명 아연 포함 된 단백질 및 단백질 Zn 통합, 감소 된 상태를 복원할 ZnCl2 를 사용 하 여 솔루션의 감소. ZnCl2 솔루션 대체 하거나 삭제 될 수 있습니다. Note 시간과 온도 감소 과정의 단백질 안정성과 기능에 따라 달라 집니다 및 특정 단백질 당 이렇게 이다.- 얼음에 단백질 견본을 해 동 하 고 제거 집계 아래로 회전. 5mm DTT와 37 ° C와 20 µ M ZnCl2 에서 적어도 1.5 h에 대 한 샘플을 품 어 (단백질 농도의 최대 70%).
참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다. - DTT 염 열을 사용 하 여 제거 합니다.
참고: 다른 담 열을 사용할 수 있습니다. 프로토콜 아래 특정 염 열 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 프로시저를 설명 합니다. 다른 염 열을 사용 하기 전에 일부 염 열 부분적으로 관심사의 단백질을 흡수 수 있습니다 이후 DTT 제거 및 단백질 복구의 그들의 효율성을 검토 하는 것이 좋습니다.- 해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 칼륨 인산 (KPi) 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.
- 부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다. KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.
- 깨끗 한 튜브로 열 전송 열의 중간에 천천히 단백질 샘플을 추가 하 고 2 분 1000 x g에서 원심. DTT 무료 단백질 통해 흐름에 지금 있다.
- 그것의 농도 확인 (예를 들어, UV/Vis 분 광 계를 사용 하 여) 280에서의 흡 광도 측정 하 고 nm. 맥주의 법률을 사용 하 여 단백질 농도 계산 합니다.
- Aliquots에는 단백질의 절반을 배포 합니다. 20 분 산소의 완전 한 제거를 위한 혐 기성 조건 (예를 들어, 혐 기성 챔버를 사용 하 여)에서 aliquots를 품 어. 플라스틱 필름으로 튜브를 봉인 하 고-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질에 따라 샘플을 저장 합니다.
참고: 혐 기성 챔버를 사용 하 여 대신 튜브 수 또한 될 번쩍이 아르곤 가스를 산소를 제거.
- 얼음에 단백질 견본을 해 동 하 고 제거 집계 아래로 회전. 5mm DTT와 37 ° C와 20 µ M ZnCl2 에서 적어도 1.5 h에 대 한 샘플을 품 어 (단백질 농도의 최대 70%).
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완벽 하 게 산화 단백질의 준비
참고:이 좋습니다 완벽 하 게 감소 된 단백질 (앞서 설명한)에서 산화 단백질 샘플 준비 하. 이 시스테인의 산화 상태에서이 질을 줄일 것입니다. 그것은 다른 산화 시 약;를 사용 하 여 여기, 우리는 과산화 수소 (H2O2)에 집중 하 고 있다.
주의: 이상의 산화를 바람직하지 않는 intramolecular 이황화 채권과 시스테인, 메티오닌, 티로신, 등을 포함 한 다른 아미노산의 돌이킬 수 없는 산화를 피하십시오.- 나머지 단백질 샘플 5 m m H2O2 (갓 희석)를 추가 하 고 동요 하는 동안 40 ° C에서 3 시간 그것을 품 어.
참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다. - 해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 KPi 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.
- 부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다.
- KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.
- 깨끗 한 튜브로 열을 전송 열의 중간에 천천히 산화 단백질 견본을 추가 하 고 2 분;에 대 한 1000 x g에서 원심 산화 단백질 통해 흐름에 지금 있다.
- 1.2.5, 단계에서 단백질 농도 산화 단백질으로 aliquots, 분열과-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질-의존에서 그들을 저장 확인 하십시오.
- 나머지 단백질 샘플 5 m m H2O2 (갓 희석)를 추가 하 고 동요 하는 동안 40 ° C에서 3 시간 그것을 품 어.
2입니다. 빛 집계 분석 결과 비 산
참고:이 분석 결과에 모든 농도 보호자 및 기판 관련, 고 보정 해야 합니다. 모든 버퍼 버퍼는 어떤 입자의 무료 또는 기포와 큐 벳은 깨끗 하 고 먼지가 매우 중요 0.22 μ m 필터링 되어야 합니다. 석 영 cuvette에 교 반기를 사용 하 여 매우 중요 하다. 다른 활동가 크기와 모양이 바람직하지 않은 기포를 생성 하지 않고 전체 솔루션의 한 효율적인 혼합 수 있도록 확인 하십시오. 또한, 있다 다른 flouorospectrometers 사용할 수 있는 실험실과 시설에서. 여기, 특정 fluorospectrometer는 사용 되었다 ( 재료의 표참조). 다른 악기는 다양 한 감도, 측정 속도, 및 샘플러 매개 변수가 있습니다. 따라서, 정확한 측정 매개 변수 (예를 들어, 방출 및 여기 대역폭, 감도, 및 다른 사람) 알려진된 집계 하기 쉬운 단백질 및 그 해당 조건 사용 하 여 최적화 되어야 합니다. 구 연산 염 synthase (CS) luciferase nanomolar 농도에서 초기 기판으로 이용 하는 것이 좋습니다.
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화학 집계 분석 결과
- 잠복기 12 µ M CS 하룻밤에 40 mM HEPES (pH 7.5)으로 변성된 기판 준비 및 4.5 M GdnCl. PH를 유지 하기 위해 GdnCl 40 mM HEPES (pH 7.5)에서 해산.
- Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수 설정: 온도: 25 ° C; Λem: 360; Em 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 대역폭 ex: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.
- 석 영 cuvette에 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더에는 베트를 삽입 하 고 원하는 온도 도달 하는 샘플을 보자.
- 감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.
- 120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하기 위해 측정에 s 추가 (부드럽게, 그러나 신속 하 게) 변성된 CS의 10 µ L (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.
- 60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (300의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, 변성된 CS의 10 µ L 추가 (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.
참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품의 삽입을 방지 하기 위해, 10 µ L 피 펫을 사용 합니다.
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열 집계 분석 결과
참고: 열 집계 분석 결과 대 한 온도 그리고 단백질 안정성에 따라 조정 되어야 한다 하지 각 단백질에 독립적으로.- Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정: 온도: 43 ° C; Λem: 360; 방출 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 여기 대역폭: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.
- 석 영 cuvette에 미리 따뜻하게 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더는 베트를 삽입 하 고 샘플 43 ° c.에 도달 하 게
- 감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.
- 120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s는 부드럽게 CS 추가 (125의 최종 농도 nM) 1200에 대 한 측정을 계속 하 고 s.
- 60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (600의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, CS 추가 (125의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.
참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품 삽입을 하지 마십시오.
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Kfits 데이터 분석 및 잡음 제거
참고: Kfits 에서 사용할 수 를 사용 하 여 Kfits 의 이전에서 설명 하고있다 Rimon 외. 45- 데이터 파일을 업로드.
참고: 입력 텍스트 쉼표 구분 또는 탭 구분 형식으로 산란 측정에서 원시 결과 이다. - 모든 소음을 제거 하려면 분석 매개 변수를 선택 합니다. 자동 최고의 모델 을 사용 (권장), 잡음은 항상 신호 플래그를 표시 합니다.
- 명백한 outliers 녹색과 빨간색 조절 라인;를 사용 하 여 수동으로 제거 이 단계는 녹색 선 위와 아래 빨간색 선 잡음을 필터링 합니다.
- 기준선과 맞는 곡선을 설정 합니다. 노이즈 임계값을 적용 한 후 처리 된 데이터를 다운로드 합니다.
- 데이터 파일을 업로드.
3. 수소 중수소 교환 질량 분석
- 버퍼 및 단백질 샘플 (Hsp33 및 Hsp33 CS 복잡 한)의 준비
- 25mm Tris HCl 버퍼 pH 7.5에에서 1 mg/mL의 최종 농도에 단백질 샘플을 희석 하 고 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.
- 43 ° c.에 1:1.5의 비율로 CS와 Hsp33를 배양 하 여 단백질 기질 복잡 한 샘플을 준비
- 어떤 빠른 집계를 피하기 위해 하는 Hsp33와 열 펼친된 CS 간의 유익한 바인딩을 단계별 방식에서 CS를 추가 합니다.
- 적어도 4 개의 단계를 사용 하 여 (즉, 최종 볼륨의 4 분의 1을 추가 하는 각 시간) 및 Hsp33에 의해 CS 보호 수 있도록 모든 추가 후 15 분에 대 한 샘플을 품 어.
- 모든 집계에서 4 ° c.에서 16000 x g 30 분 원심 분리를 사용 하 여 제거
참고: 새로운 단백질 기질 단지 준비 되어야 한다 신선한. 기판 또한 점차; 여야 한다 그렇지 않으면, 집계 발생 합니다. 온도, 기판, 및 기질 농도 단백질 다릅니다. - H (25mm Tris HCl, pH 7.5), deuteration 제어 역할, 버퍼와 버퍼 D (25mm Tris DCl, pH 7.09)는 deuteration 버퍼를 준비 합니다. 또한 신선한 냉각 버퍼 (150 m m 3 M GdnCl, TCEP 0.1% 포 름 산)을 준비 합니다.
참고: 냉각 버퍼 최적화 되어야 합니다 관심사의 단백질을 위해 펩 신 소화 후 최대한 시퀀스 범위를 얻기 위하여. - 튜브로 모든 버퍼 및 샘플을 전송 및 적절 한 쟁반에 넣어. 저장할 버퍼 H와 D 25 ° c (트레이 25 ° C); 다른 한편으로, 0-2 ° C (0 ° C 트레이)에서 샘플 및 냉각 버퍼를 개최. 150 µ L 유리 삽입에 샘플을 배치 ( 재료의 표참조) 먼저, 다음 튜브에 그들을 전송.
- 악기의 준비
참고: 질량 분석기 소프트웨어 프로그램을 동반 2와 함께 제공: 하나 펌프, 제어와 다른 제어 질량 분석기 ( 테이블의 자료를 참조). 이 두 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.- 수동으로 모든 냉각 장치를 켭니다. 모든 냉각 시스템의 목표 온도 도달, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로드 펌프에 수동으로 전환 합니다.
참고: 우리의 경우,이 2 개의 냉각 목욕 및 냉각 상자 (이 트랩 및 분석 열 포함)의 구성 됩니다. 한 냉각 장치 냉각 0 ° C에서 트레이 다른 25 ° C에서 트레이 유지 하면서 냉각 상자의 온도 1-2 ° C 이다. - 오픈 모두 펌프를 제어 하는 소프트웨어 뿐만 아니라 소프트웨어를 제어 하는 질량 분석기; MS는 대기에 다는 것을 확인 하십시오.
- MS 소스에서 HPLC 출구 밸브를 분리 및 세척 시스템 (1% 포 름 산, 33% 이기, 소 프로 파 놀 33%, 33% 메탄올), "트리플 청소기" 솔루션으로 먼저 다음 버퍼 B (80% 이기, 0.1% 개미 산 성), 그리고 마지막으로와 버퍼 (0.1% 개미의 산 성, pH 2 월 25 일), 펩 신 열 시스템에 삽입. 버퍼를 변경 하는 경우 계속 하기 전에 두 펌프를 제거 해야 합니다.
- 두 펌프의 유량 0.1 mL/min 이며 압력은 안정 되어 있는 확인 하십시오.
- 씻은 후 꾸준한 흐름 및 꾸준한 압력 시스템, MS 소스에 HPLC 콘센트를 삽입 하 고 MS를 켭니다.
- 수동으로 모든 냉각 장치를 켭니다. 모든 냉각 시스템의 목표 온도 도달, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로드 펌프에 수동으로 전환 합니다.
- 질량 분석기 매개 변수
- 175 ° C, 17, 2, 보조 가스 발광 및 4.5에서 스프레이 전압 칼 집 가스 흐름에서 분무 이온화 (ESI)에 펩 티 드 이온화 설정 kV (보충 그림 1).
- 다음과 같이 비 deuterated 샘플에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.
- 매개 변수 설정: 스캔 범위 m/z 300-1500; 해상도를 70000; 자동 이득 제어 대상 (AGC) 106; 그리고 100 ms에 (그것은) 최대 주입 시간.
참고: + 2와 + 6 사이 충전 상태와 5 가장 강렬한 이온 (1.3 x 10 보다 더 높은 그들의 강도4)에 30의 동적 창 격리 됩니다. - 높은 에너지 collisional 분리 (HCD) 정규화 된 충돌 에너지 (후부 터) 28 크거나 여러 충돌 셀에 의해 이온 조각화를 수행 합니다. 탠덤 MS 10의 35000, AGC 대상의 해상도에 의해 조각 이온을 검출5, 최대 60 ms, 그리고 2.0 m/z의 격리 창에서.
- 매개 변수 설정: 스캔 범위 m/z 300-1500; 해상도를 70000; 자동 이득 제어 대상 (AGC) 106; 그리고 100 ms에 (그것은) 최대 주입 시간.
- Deuterated 샘플에 대 한 MS1 만 140, 000의 높은 해상도 그렇지 않으면 유사한 매개 변수를 사용 합니다.
- 실험을 실행
- 다음과 같은 방식으로 트레이 설정 합니다.
- 트레이 25 ° C, H와 D 버퍼 장소 다음 샘플 및 냉각 버퍼 0 ° C 트레이에 놓습니다.
- 장소 X 빈 튜브, 두 용지함에 정렬, 어디 X = x 시간 포인트 수 샘플 수.
참고: 25 ° C 트레이에 빈 튜브 역할 반응 튜브, 그리고 그들은 튜브를 냉각 될 트레이 0 ° C에서. - 빈 병의 각 포함 빈 유리 삽입; 삭제 및 바꾸기 말했다 실험 사이 삽입 합니다.
참고: 가장 효율적이 고 최소 시간이 걸리는 방법, 샘플을 동시에 실행할 수 있는 소프트웨어에서에서 HDX 실험을 실행 하려면 (보충 그림 2) 사용 되었다. 이 소프트웨어를 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.
- 소프트웨어를 엽니다. 다음을 수행 하는 프로그램 매개 변수를 설정 합니다.
- 선택 하는 시간 포인트에 따라 몇 분 동안 버퍼 D의 45 µ L를 각 샘플 (5 µ L)를 품 어 (예, 1, 3, 18, 40, 및 100 분) 25 ° c.에 대신 버퍼 H의 45 µ L와 비 deuterated 샘플을 품 어.
- 부 화 후 즉시 차가운 냉각 버퍼의 50 µ L에 deuterated 단백질의 50 µ L를 혼합 하 고 고정된 펩 신 열 (직경에서 2.0 m m, 길이 20 m m)에 그들을 투입 합니다.
- 50의 속도로 6 분에 대 한 버퍼 A와 그것을 세척 하 여 펩 신 열에서 모든 펩 티 드를 전 열에 elute µ L/분 계속 버퍼 A에 0 ° c.에 냉각 상자
- C18 분석 열으로 전 열에서 펩 티 드 elute (C18 열, 130 Å, 1.7 µ m, 2.1 m m x 50 m m, 0 ° C에서 보관) 이기 그라데이션 버퍼 B 100% 이기를 사용 하 여 100 µ L/분 실행에 이기의 선형 그라디언트를 적용 하 여 그들을 분리 하 고 : 2%, 10-30%, 30-90%, 90%, 90-8%, 1 분 동안 빠른 그라데이션에 1.5 분에서 2.5 분에서 7 분 7 분 및 마지막으로 2%에서 4 분에 대 한 열을 equilibrate.
- 빌드 실행 시퀀스 (보충 그림 2참조): 모든 시간 포인트, 샘플 및 쟁반, 버퍼 이름에 있는 위치 이름과 위치를 입력 하십시오.
참고: 소프트웨어는 실행 시간을 감소 하는 한 번에, 효율적으로 하는 여러 샘플을 실행 하는 프로그램으로 모든 다른 실행 시간의 맞춤 수 있습니다.
- 다음과 같은 방식으로 트레이 설정 합니다.
- 데이터 분석
참고: 협력 펩 티 드 식별 및 HDX 워크 벤치, 시퀀스 범위의 분석에 대 한 프로테옴 발견자 와 MaxQuant (무료 소프트웨어)를 포함 한 데이터 분석 과정에서 여러 가지 소프트웨어 프로그램을 단백질, 중수소 결합의 분석 및 실험의 다른 세트 사이 HDX 속도의 비교를 허용 하는 무료 소프트웨어. 이러한 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.- 소프트웨어 (보충 그림 3)를 통해 비 deuterated 제어 샘플을 실행 하 여 샘플의 펩 티 드 범위를 분석 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 소프트웨어를 설정 합니다.
- (불특정) 아니 효소 Sequest HT 메서드를 사용 하 여 다니엘. 7 ppm 및 선구자의 이온 및 조각에 대 한 0.5 다의 대량 허용 오차 4-144 아미노산의 펩 티 드에 대 한 검색. 동적 메티오닌 산화에 대 한 허용.
- 단백질,이 통해 소프트웨어 펩 티 드 범위를 확인할 수 있습니다에 대 한 데이터베이스를 만듭니다. 텍스트 형식으로 확인 된 펩 티 드를 내보냅니다.
- HDX 워크 벤치 무료 소프트웨어58을 사용 하 여 deuterated 결과 분석 합니다.
- 단백질 편집기 열고 단백질 시퀀스 및 펩 티 드 적용 파일을 삽입 하 여 단백질을 정의 합니다.
- 다음, 설치 마법사 실험 편집기를 열고 요청 하는 모든 입력을 입력 합니다.
참고: 샘플 수, 시간 포인트 수, 복제 수, 버퍼, 그리고 온도 pH 값, 프로그램 필요합니다. - 마지막으로, 질량 분석기, 사용 후 프로그램 검색 된 펩 티 드의 목록이 생성 관련 매개 변수를 입력 합니다.
참고: 소프트웨어 "HDX" 펩 티 드를 감지, 동위 원소 클러스터를 검사 하 고 샘플에서 deuteration의 명확한 시각화를 보여 줍니다.
- 소프트웨어 (보충 그림 3)를 통해 비 deuterated 제어 샘플을 실행 하 여 샘플의 펩 티 드 범위를 분석 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 소프트웨어를 설정 합니다.
- 데이터 프레 젠 테이 션
- PyMol 소프트웨어 또는 다른 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 구조체에 경의 표 deuteration 통풍 관으로 영역을 레이블을 지정 합니다.
- B 요소 값 대신 중수소 이해 수준을 소개 합니다.
참고: 기본 자습서 https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners에서 찾을 수 있습니다.
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Representative Results
제시 하는 두 가지 방법 운동 활동과 보호자와의 기판 간의 단백질 상호 작용의 역동성에 따라 가능 하 게. 또한, 감소-산화 프로토콜 redox 의존 무질서 보호자의 활성화 메커니즘의 더 심도 있는 이해를 주는 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 보호자의 준비를 수 있습니다.
첫째, 우리는 보호자의 redox 종속 활동 검사 산란 사용. 산란 화학적 및 열 변성된 CS 단백질 산화 (활성)의 존재에서 수행 되었다 또는 감소 (비활성) 보호자 (그림 1). 화학 변성 불리 한 버퍼 조건에서 완전히 denaturized 단백질을 refolding에 의해 유도 된 빠른 CS 집계 이끌어 낸다. 다른 한편으로, 열 유도 집계 기본적으로 접힌된 기판의 상대적으로 느린 전개에서 유래한 다. 따라서, 이러한 서로 다른 유형의 집계 프로세스 그들의 운동 매개 변수에서 다릅니다. 또한, 다른 보호자는 다른 집계 모드에서 동일한 기판의 집계를 방지 하기 위해 그들의 능력에서 달라질 수 있습니다.
변성의 두 형태에의 추가 1: 4의 어 금 니 비율 Hsp33을 산화 (CS: Hsp33) 완전히 무시할 값을 360 nm 수치를 낮추는 집계를 폐지. 다른 한편으로, 감소 된 Hsp33의 존재 CS 안정성에 영향을 주지 않습니다 졌고는 집계 곡선 (그림 1) 보호자의 부재에서 발견 하는 것과 유사한 했다. 결과 분석 하 고 Kfits, 그림 2에서 설명으로 개요로 사용 하 여 배경 잡음에서 청소 했다.
HDX MS 기술의 개요 냉각 및 소화, 중수소 산화물과 함께 보호자의 부 화와 함께 시작 하 고 마침내 MS 분석 및 수소 중수소 교환 프로 파일링 (그림 3). HDX-MS, 동안는 보호자 D2O 포함 된 버퍼에 25 ° C에서 용지함에 알을 품는. 로봇 시스템을 처리 하는 샘플에 의해 제어 되는 특정 보육 시간 후 단백질 해결책 냉각 솔루션, 산 성 및 변성, 이전에 0 ° c.에 트레이 낮은 pH 및 낮은 온도 수소 교환 속도가 느려집니다 그리고 변성 화학 펼쳐져 단백질을 제대로 소화 될 수 있도록 하는 동안 모든 아 미드 hydrogens의 deuteration 수준 유지. 로봇 시스템 어디 온라인 펩 신 소화 열에 흐르는 냉각 상자에 0 ° C에서 용지함에서 샘플을 전송 합니다. 직후 단백질 소화는 펩 티 드 C18-트랩 열 담 및 빠른 교환 D2O (주로 측면 체인 원자에 있음)의 제거에 대 한 진행 및 C18 열을 사용 하 여 다음 분리와 질량을 사용 하 여 분석 분석입니다. 샘플 흐름 1) 유기 용 매로는 펩 신의 비활성화를 방지 하기 위하여 펩 신 및 C18 열 버퍼의 분리를 보장 하 고 2) 수 있게 빨리 제거 하는 펩 티 드의 짧은 담 2-밸브 시스템에 의해 제어 됩니다. 교환 D2O 분자 고 소금 (그림 4).
계산 분석 후 접수 deuteration 프로필 각 펩 티 드에 대 한 D2O. 보육 시간의 기능으로 질량에서 변화를 보여주는 HDX 워크 벤치 소프트웨어는 각 조건 (예를 들어, 언바운드 폼에서 활성 보호자)의 통계 분석을 만들기 위해 실험적인 복제의 비교를 허용 한다. 다음 단계는 다른 샘플; 사이 deuteration 곡선의 비교 예를 들어 바운드 보호자 고 언바운드 보호자. 이러한 비교 다른 보호자의 동반 기질 바인딩 구조 섭을 밝힐 수 있다. 느린 교류 바인딩된 상태에서 하는 잔류물은 가능성이 바인딩 파트너와 상호 작용. 그것은 중요 감소 수소-중수소 환율 기판(그림 5)와 실제 직접 상호 작용 없이 바인딩 시 특정 지역의 refolding 나타낼 수도 있습니다. HDX 워크 벤치 소프트웨어는 전체 단백질의 범위를 통해 deuteration 표준 오류를 표시 하 여 "섭 동" 보기에서 결과의 검사를 허용 한다.
이 경우 HDX MS의 기판 CS에 바운드 및 언바운드 보호자 Hsp33 사이 deuteration 패턴을 비교를 사용 되었다. 결과 (그림 5B) 보호자의 C-터미널 redox 스위치 도메인 내에서 클라이언트 상호 작용 사이트 공개. 감소 하는 동안 Hsp33는 상호 작용 사이트 묻혀있다 완전히 정렬 된 구조를 하고있다. Hsp33의 구조를 손실 하 고 산화 스트레스; 감지할 때 작동 된다 따라서, 우리는 조건 모두 바운드 및 언바운드 (그림 5C) 감소와 산화 Hsp33 비교. 결과 유사 펩 티 드 곡선을 생성 하는 감소 된 Hsp33, 바운드 또는 언바운드, 여부 산화 Hsp33 표시 상당한 차이 보여 줍니다. 산화 Hsp33 샘플 30 %deuteration 차이 바운드 및 언바운드 보호자의 allosteric 방해를 나타내는 바인딩된 단백질의 특정 영역을 보여 줍니다. N 맨끝 및 thermobile 링커 지구에서 추가 펩 티 드의 분석 보충 그림 3에 표시 됩니다.
그림 1 . 산란에 의해 집계 분석입니다. 화학적 및 열 변성된 CS의 집계 모니터링 했습니다 존재 산화 Hsp33 (적색), Hsp33 (블루), 감소 또는 보호자 (블랙)의 부재. 360에 가벼운 뿌리기 nm 1200에 대 한 모니터링은 또는 감소 Hsp33 고원 대략 300의 측정에 도달, 집계 CS의 존재는 보호자의 부재에서 화학 집계 동안 미 (A). (B) 열 집계 동안는 CS 또는 감소 Hsp33 존재는 보호자의 부재에서 점차적으로 집계. 두 분석 실험에서 산화 Hsp33의 존재 완전히 폐지 집계로 무시할 수 360 nm 신호에 의해 증명 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Kfits를 사용 하 여 소음 및 데이터 분석의 제거. 이 패널 Rimon 외 에 텍스트에 설명 된 대로 Kfits 도구에서 데이터 분석 및 잡음 제거를 요약 하는 스키마를 보여 줍니다. 45. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . HDX MS 방법론의 워크플로. HDX MS는 단백질의 등뼈를 따라 균일 하 게 분산 하는 아 미드 hydrogens의 화학 환경 결정을 deuterated 용 매를 사용 합니다. 관심사의 단백질의 기본 형태에서 deuterating 버퍼에 특정 시간 동안 incubated 다음 수소 중수소 교환 낮은 온도에서 산 성 조건에 의해 침묵 이다. 단백질은 펩 신 등의 산 성 조건 하에서 효소 안정에 의해 소화 된다. 이후에 펩 티 드 desalted 고 다시 exchange를 피하기 위해 짧은 시간에 분리. 마지막으로 펩 티 드 질량 분석기에 의해 분석 되 고 중수소 통풍 관은 HDX 워크 벤치 무료 소프트웨어58에 의해 예 분석 소프트웨어에 의해 평가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. 완전 자동화 된 HDX MS 시스템의 구성 요소. (A)이 회로도 HDX-MS의 시스템의 모든 부분을 나타냅니다: 로드 펌프, HPLC 펌프 제어 버퍼 흐름 및 샘플 시스템 내에서 전송. 로봇 시스템에는 두 개의 주사기와 트레이 deuterated 샘플을 준비 하 고는 온라인 소화 열 통해 냉각 상자 (LC 구획)의 입력된 밸브에는 단백질을 전송 하는 데 사용 되는 포함 되어 있습니다. 소화 펩 티 드는 C18 트랩 및 분리 열으로 이동, 이후 분리, 그리고 질량 분석기로 이동 합니다. (B)이이 패널으로 실험실에서 만들어진 실제 HDX 시스템 설치 프로그램을 보여 줍니다. (C)이이 패널 온라인-소화와 펩타이드 분리 유체 구성의 도식 프레 젠 테이 션을 보여줍니다. 소화 및 분리 시스템 로드 및 삽입 모드 간에 전환할 수 있는 각 하나의 밸브가 있다. (왼쪽)에 첫 번째 밸브 주입 포트에 연결 하 고 펩 신 수 지를 손상 시킬 수 있는 어떤 유기 용 매 없이 산 성 버퍼를 사용 하 여 펩 신 열에 샘플을 감독 로드 펌프에 의해 제어 됩니다. 샘플은 빠른 deuterated 원자 (주로 측면 체인)의 교환 뿐만 아니라 중수소의 잔류물을 제거 하는 트랩 열에 오른쪽 밸브에 전송 됩니다. 트랩 열에서 1-2 분의 간단한 세척 후 밸브 로드 의 모드를 변경 하 고 샘플 이기의 농도 증가 함께 HPLC 펌프를 사용 하 여 C18 분리 열으로 씻어. 샘플은 대량 분석을 위한 질량 분석기로 전송 됩니다. 튜브의 길이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . HDX MS 결과. (A) 결과 HDX 워크 벤치 소프트웨어에 의해 생성 된 단백질 조각 당 시간이 지남에 deuteration 백분율로 표시 됩니다. 각 그래프 중 산화 또는 감소, 그리고 바운드 및 언바운드 샘플 사이 비교 단백질 샘플을 보여 줍니다. 여기에 표시 된 펩 티 드 파편 펩 티 드 YVVITITPSEG 링커 지역에서 발견 되며 LQVMPAQNAQQDDFD C-말단에 있는 펩 티 드. (B) 바운드 및 언바운드 단지의 deuteration 차이 최종 결과 아미노산 당 섭 동을 보여줍니다. Hsp33 보호자의 (C) 구조 모델 링커 및 C 터미널 불안정 한 지역에 걸쳐 deuteration 이해 차이 보여 줍니다. 이 패널 PyMol 소프트웨어를 사용 하 여 만들어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1입니다. 질량 분 서 계를 운영 하는 프로그램의 인터페이스. 프로그램 최적화 HDX 실험에 사용 되는 질량 분석기 메서드 매개 변수를 정의 하는 데 사용 됩니다. 다른 프로그램에서 인식 되도록 메서드에서 메서드 매개 변수 (왼쪽된 패널)를 저장할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2. 이 그림에 시스템 및 MS-LC 시스템 나눠 로봇 샘플링의 통합 플랫폼으로 소프트웨어의 스크린샷입니다. 소프트웨어 deuterated 버퍼 (파란색 화살표)에 정의 된 보육 시간에 따라 HDX 실험을 예약 하 여 실행 시간을 최적화 합니다. 예를 들어 위의 Hsp33 변종 STIL, 서로 다른 시간에 대 한 알을 품을 deuterated 버퍼에서의 2 일차 분석의 17의 다이어그램은 0-100 분까지 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 3. 이 PGBD 및 계34라는 그림 다른 Hsp33 이체에서 여러 Hsp33 펩 티 드의 중수소 통풍 관의 분석. 음모 언바운드 (빨강) 및 바인딩 (파란색) 상태에서 Hsp33에 동일한 영역의 중수소 통풍 관에 변화를 보여 줍니다. N 맨끝 영역에서 펩 티 드 링커 지역에서 조각을 표시 펼친된 기판, 구 연산 염 synthase와의 상호 작용에 따라 HDX 비율에 있는 상당한 감소 반면 HDX 요금에 큰 차이 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서에서 우리는 redox 종속 보호자 활동의 분석 및 클라이언트 단백질의 바인딩 따라 구조 변화의 특성에 대 한 프로토콜 제공. 이들은 잠재적인 보호자 기판 단지 정의 하 고 잠재적인 상호 작용 사이트 분석을 보완 방법론입니다.
여기, 우리는 잘 공부 보호자 기판 CS와 redox 규제 보호자 Hsp33 사이 복잡 한 특성에 대 한 이러한 프로토콜을 적용. 우리는 두 가지 유형의 단백질 집계 분석, 그들의 운동 및 초기 상태에 다 제시: 화학 변성 중 기판 열 집계 중 변성된 형태에서 그것의 전개 과정을 시작 합니다 전개는 기판의 기본 형태에서 시작 됩니다.
빛 산란 측정 단백질 집단의 상대적 크기를 모니터링 하는 데 유용한 도구입니다. 우리는 보호자의 활성 상태를 확인 하려면이 메서드를 사용 하 여, 하는 동안는 일반 집계 조건, 다른 단백질의 안정성을 비교 하거나 불안정 돌연변이 기판와 보호자 모두 공부 공부를 더 사용할 수 있습니다.
그것의 간명에도 불구 하 고 산란 방법 몇 가지 outliers와 시끄러운 데이터를 생성할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 위에서 설명 하는 Kfits 소프트웨어를 개발 했다. Kfits 소프트웨어는 간단 하 고 빠르게 시끄러운 데이터의 제거 뿐만 아니라 산란 곡선에서 운동 매개 변수를 계산할 수 있습니다. Kfits 단백질 집계 제한 되지 않습니다 그리고 운동 측정의 모든 종류에 적용할 수 있습니다.
따라서 여기에 설명 된 방법론은 간단 하 고, 실행 하기 쉬운 하지 소모. 그들은 몇 일 이내에 검사를 그들의 redox 의존을 사용 하는 다른 분자 보호자에 적용할 수 있습니다. 또한, 다른, 비 산화 종속 보호자의 반대로 집계 활동 산란 및 Kfits의 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 그것은 온도, 단백질 농도, 측정 시간 등의 다른 매개 변수는 조정할 각 단백질 시스템에 독립적으로 해야 하는 것이 중요.
주기 작업 보호자 제어 구조 정보를 얻기 위해 우리는 HDX MS 방법론을 제시. 산란 절차는 달리는 더 복잡 한 기술 이며 특정 계측 질량 분 서 계 하 고, 선호, 샘플 준비를 위한 로봇 시스템을 포함 하 여 필요 합니다. 그러나,이 설정을 설정할 수 있습니다, 기존 시설에 로봇 시스템 없이. 설정 되 면 절차는 비교적 간단 하며 고해상도 방법론 (예를 들어, X-ray와 NMR)에 의해 unreached 수도 있는 어려운 단백질 복합물의 분석
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그녀의 도움이 토론에 대 한 Meytal Radzinski에 게 감사 하 고 HDX 분석 플랫폼을 설정 하는 동안 그들의 무제한 지원에 대 한 문서, 그리고 패트릭 그리핀와 그의 실험실 멤버를 읽고 중요 한 있습니다. 저자는 독일-이스라엘 재단 (나-2332-1149.9/2012), Binational 과학 재단 (2015056), 마리 퀴리 통합 그랜트 (618806), 이스라엘 과학 재단 감사 (1765/13 고 2629/16), 그리고 인간 프론티어 과학 그들의 재정 지원 프로그램 (CDA00064/2014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents | |||
| Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
| Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
| Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
| Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
| Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
| ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
| PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
| Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
| citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
| HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
| Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
| Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
| 150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
| pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
| PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
| Software, Software Tools, Database search | |||
| Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html |
References
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
- Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
- Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
- Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
- He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
- Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
- Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
- Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
- Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
- Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
- Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
- Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
- Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
- Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
- Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
- Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
- Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
- Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
- Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
- Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
- Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
- Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
- Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
- Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
- Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
- Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
- Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
- Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
- Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
- Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
- Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
- Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
- Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
- Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
- Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
- Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
- Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
- Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
- Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
- Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
- Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
- Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
- Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
- Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
- Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
- Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
- Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
- Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
- Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
- Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
- Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
- Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
- Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
- Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56 (48), 6329-6342 (2017).
- Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).
