Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

doi: 10.3791/57806 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

En av de mest utfordrende stress forholdene som organismer møte under sin levetid innebærer akkumulering av oksidanter. Under oksidativt stress avhengige celler tungt molekylær chaperones. Her presenterer vi metoder brukes til å undersøke redoks regulert anti-aggregering aktiviteten, samt for å overvåke strukturendringer styrer funksjonen Anstandsdame bruker HDX-MS.

Abstract

Levende organismer må regelmessig takle varierende miljøer i løpet av livssyklusen, inkludert endringer i temperatur, pH, akkumulering av frie radikaler og mer. Disse svingningene kan føre til en utbredt protein unfolding, aggregering, og celle død. Derfor har celler utviklet et dynamisk og stress-spesifikke nettverk av molekylære chaperones, som opprettholde en "sunn" proteom under stress forhold. ATP-uavhengig chaperones utgjør en stor klasse av molekylære chaperones, som fungerer som første linje forsvar molekyler, beskytter mot protein samling på en stress-avhengige måte. En funksjon disse chaperones har felles er deres evne til å utnytte strukturelle plastisitet for stress-spesifikke aktivisering, anerkjennelse, og utgivelsen av misfolded klienten.

I dette papiret fokuserer vi på funksjonelle og strukturelle analysen av en slik egentlig uordnede Anstandsdame, bakteriell redoks regulert Hsp33, som beskytter proteiner mot aggregering under oksidativt stress. Her presenterer vi en verktøykasse ulike teknikker for å studere redoks regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging conformational endringer av Anstandsdame, underliggende sin virksomhet. Spesielt vi beskrive en arbeidsflyt som inkluderer utarbeidelse av fullt redusert og fullstendig oksidert proteiner, etterfulgt av en analyse av Anstandsdame anti-aggregering aktivitet i vitro bruker lys-spredning, med fokus på graden av den anti-aggregering aktivitet og dens kinetics. For å overvinne hyppige outliers akkumulert under aggregasjon analyser, beskriver vi bruken av Kfits, en ny grafisk verktøyet hvilke innrømmer enkel behandling av kinetic målinger. Dette verktøyet kan lett brukes på andre typer kinetic mål for fjerne outliers og passende kinetic parametere. Til relatere funksjonen med proteinstruktur, beskriver vi oppsett og arbeidsflyten en strukturell massespektrometri teknikk, hydrogen-deuterium exchange massespektrometri, som tillater kartlegging av conformational endringer på Anstandsdame og substrat under ulike stadier av Hsp33 aktivitet. Av samme metode kan brukes på andre protein-protein og protein-ligand interaksjoner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Celler støter ofte en opphopning av reaktive oksygen arter (ROS) som biprodukter åndedrett1,2, protein, lipid oksidasjon3,4og tilleggsprosesser5, 6,7. Til tross for ROS' fordelaktige rolle i ulike biologiske prosesser som cellular signal8,9 og immunrespons10, kan en ubalanse mellom ROS produksjon og dens avgiftning oppstå, fører til oksidativt understreke7. Biologiske mål for ROS er proteiner og lipider nucleic syrer, oksidasjon som påvirker deres struktur og funksjon. Derfor er akkumulering av mobilnettet oksidanter sterkt knyttet til en rekke ulike patologi inkludert kreft9,11, betennelse12,13og aldring14, 15, og har blitt funnet for å være involvert i starten og progresjon av nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers, Parkinsons og ALS sykdom16,17,18.

Både nylig syntetisert og modne proteiner er svært følsom for oksidasjon på grunn av de potensielt skadelige endringene av deres side kjeder, som forme proteiner struktur og funksjon19,20. Derfor fører oksidativt stress vanligvis til en utbredt protein inaktivering, misfolding og aggregering, til slutt fører til celledød. En av de elegante mobilnettet strategiene for å takle den potensielle skaden av protein oksidasjon er å benytte redoks-avhengige chaperones, som hemmer utbredt protein aggregering, i stedet for danner stabile kompleksene med misfolded klient proteiner21 ,22,23. Disse første linje forsvar chaperones aktiveres raskt som en områdespesifikk oksidasjon (vanligvis på cystein rester) at de konverteres til potent anti-aggregering molekyler24. Siden oksidativt stress resulterer i Hemming av åndedrett og nedgang i mobilnettet ATP nivåer25, er Kanonisk ATP-avhengige chaperones mindre effektive under oksidativt stress forhold25,26 ,27. Derfor redoks-aktivert ATP-uavhengig chaperones spiller en viktig rolle i å opprettholde protein homeostase ved akkumulering av oksidanter bakterier og eukaryoter (f.eks, Hsp3328 og RidA29 i bakterier, Get330 i gjær, peroxiredoxins31 i eukaryoter). Aktiviteten til disse chaperones avhenger sterkt reversibel strukturelle conformational forandringer indusert av en områdespesifikk oksidasjon som avdekker hydrofobe regioner involvert i anerkjennelse av misfolded klient proteiner.

Forskning av anti-aggregering mekanismen og prinsipper anerkjennelse av klienten proteiner av chaperones er ikke lett på grunn av dynamisk og heterogenic natur Anstandsdame-underlaget interaksjoner32,33, 34,35,36,37. Men stress regulert chaperones har en mulighet til å fremme vår forståelse av funksjonen anti-aggregering evne til å: 1) få to ulike former av Anstandsdame, aktiv (f.eksoksidert) og inaktiv (f.eks redusert), med introduksjon eller fjerning av en belastning enkelt bytte mellom dem (f.eks, oksiderende og redusere agent), 2) har en rekke forskjellige underlag, 3) utgjør svært stabile kompleksene med klienten proteiner som kan bli vurdert av ulike strukturelle metoder og 4) fokusere utelukkende på underlaget anerkjennelse og utgivelse, formidlet av redoks-avhengige conformational endringer, som fleste av disse chaperones mangler folding evnen.

Her analyserer vi den bakterielle redoks regulert Anstandsdame Hsp33's anti-aggregering aktivitet, en viktig komponent i den bakterielle forsvar mot oksidering-indusert protein aggregering28. Når redusert, er Hsp33 et tett foldet sink-bindende protein uten Anstandsdame aktivitet; imidlertid utsettes for oksidativt stress, gjennomgår Hsp33 omfattende conformational endringer som utsetter sin substrat bindende områder38,39. Ved oksidasjon er sink ion som er sterkt bundet til fire høyt konservert cystein rester av C-terminalen domenet utgitt40. Dette resulterer i dannelsen av to disulfide obligasjoner, en utfoldelse av C-terminalen domenet, og en destabilisering av de tilstøtende koblingsfunksjonalitet region41. Regionene C-terminalen og linker er svært fleksibel og er definert som egentlig eller delvis disordered. Ved retur til ikke forhold, cysteinene blir redusert og Anstandsdame tilbake til sin opprinnelige brettet tilstand uten anti-aggregering aktivitet. Refolding av Anstandsdame fører til en ytterligere unfolding og destabilization bundet klient protein, som utløser overtatt kanoniske Anstandsdame systemet, DnaK/J, for refolding38. Analyse av Hsp33's samhandling nettsteder antyder at Hsp33 benytter både sin ladet uordnede områder samt hydrofobe regionene på linker og N-terminal domene å fange misfolded klient proteiner og hindre deres aggregering38, 42. i foldet staten, disse områdene er skjult av brettet linker og C-terminalen domene. Interessant, fungerer regionen koblingsfunksjonalitet som en gatekeeper av Hsp33's foldet og inaktiv tilstand, "sensing" folding statusen sin ved C-terminalen domene34. Når ustabil av mutagenese (enten en punkt mutasjon eller en full sekvens forstyrrelsene), konverteres Hsp33 til en constitutively aktive Anstandsdame uansett redoks staten sin redoks-sensitive cysteinene43.

Protokollene presenteres her tillate overvåking av Hsp33's redoks-avhengige Anstandsdame aktivitet, samt kartlegging conformational endringer på aktivering og bindende klient proteiner. Denne metoden kan tilpasses til forskning andre Anstandsdame-klienten godkjenning modeller så vel som ikke-Anstandsdame protein-protein interaksjoner. Dessuten, presenterer vi protokoller for utarbeidelse av fullt redusert og oksidert chaperones som kan brukes i studier av andre redoks-bryteren proteiner, for å avsløre potensielle roller av protein oksidasjon på protein aktiviteten.

Spesielt vi beskriver en prosedyre for å overvåke Anstandsdame aktivitet i vitro og definere sine substrat spesifisitet under ulike typer protein aggregasjon (kjemisk eller termisk indusert) bruker lysspredning (LS) målt ved en fluorospectrometer44. Under aggregering, spredning lys på 360 nm øker raskt på grunn av den økende turbiditet. Dermed overvåkes aggregering i en tidsavhengige måte på denne bølgelengde. LS er en rask og følsom metode for protein aggregering og dermed anti-aggregering aktiviteten til et protein rundt med nanomolar konsentrasjoner, aktivere karakterisering av protein aggregering-relaterte kinetic parametere under forskjellige forhold. Videre LS protokollen beskrevet her krever ikke dyrt instrumentering, og lett kan opprettes i et laboratorium.

Likevel er det ganske utfordrende å få "ren" kinetic kurver og utlede et protein kinetic parametere fra slike lys spredning eksperimenter, støy og det store antallet outliers luftbobler og store mengder. For å overvinne denne hindringen, presenterer vi en ny grafisk verktøy, Kfits45, brukes for å redusere støy i ulike kinetic målinger, spesielt utstyrt for protein aggregering kinetic data. Denne programvaren gir foreløpige kinetic parametere for en tidlig vurdering av resultatene og lar brukeren "ren" store datamengder raskt uten å påvirke egenskapene kinetic. Kfits er implementert i Python og tilgjengelig i åpen kildekode 45.

En av de utfordrende spørsmålene i feltet gjelder kartlegging samhandling områder mellom chaperones og deres klient proteiner og forstå hvordan chaperones gjenkjenner en rekke misfolded underlag. Dette spørsmålet er mer komplisert når studere svært dynamisk protein komplekser som involverer egentlig disordered chaperones og aggregering utsatt underlag. Heldigvis strukturelle massespektrometri har dramatisk avansert det siste tiåret, og har klart å gi nyttige metoder og verktøy for å analysere strukturelle plastisitet og tilordne rester involvert i protein anerkjennelse46, 47 , 48 , 49. Her presenterer vi en slik teknikk-hydrogen-deuterium exchange massespektrometri (HDX-MS)-som tillater kartlegging av rester nivå endringer i en strukturell konformasjon ved protein endring eller protein/Ligand binding35, 50,,51,,52,,53,,54,,55. HDX-MS bruker kontinuerlig utveksling av ryggraden bygget av deuterium, frekvensen som påvirkes av kjemiske miljøet, tilgjengelighet og kovalente og ikke-kovalente bindinger56. HDX-MS sporer prosessene exchange bruker et deuterated løsemiddel, vanligvis tungtvann (D2O), og lar målingen basert på endringen i molekylvekt etter hydrogen deuterium Exchange. Lavere priser på hydrogen-deuterium exchange kan resultere fra bygget deltar i hydrogenbindinger, eller bare fra steric hinder, som angir lokale endringer i strukturen57. Endre på en ligand binding eller post-translasjonell modifikasjoner kan også føre til forskjeller i hydrogen miljø, med en binding som resulterer i forskjeller i hydrogen-deuterium exchange (HDX) priser46,53.

Vi brukt denne teknologien til 1) Hsp33 kartregioner som raskt utvikler seg ved oksidasjon, fører til aktivering av Hsp33, og 2) definerer potensielle bindende grensesnittet av Hsp33 med sin fulle misfolded underlaget, citrate syntase (CS)38.

Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet kan brukes for å studere redoks-avhengige funksjoner proteinene i vitro, definere anti-aggregering aktivitet og rollen til strukturelle endringer (hvis noen) i protein-funksjonen. Disse metodene kan lett tilpasses ulike biologiske systemer og brukes i laboratoriet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse av fullt redusert og fullstendig oksidert proteiner

  1. Utarbeidelse av en fullt redusert protein
    Merk: Her beskriver vi reduksjon av sink inneholder protein og bruke en ZnCl2 løsning gjenopprettet Zn-innlemmet, redusert protein. ZnCl2 løsningen kan være erstattet eller forkastet. Merk at tid og temperatur av reduksjon avhenger av protein stabilitet og funksjon, og er dermed bestemte per protein.
    1. Tine protein prøven på is og spinn ned Fjern oppsamlinger. Inkuber utvalget for minst 1,5 t på 37 ° C med 5 mM DTT og 20 µM ZnCl2 (opp til 70% protein konsentrasjon).
      Merk: Temperaturen på dette trinnet er protein-avhengige og bør justeres protein stabilitet.
    2. Fjerne DTT med avsalting kolonner.
      Merk: Det er ulike avsalte kolonner som er tilgjengelige. Protokollen nedenfor beskriver fremgangsmåten bruker bestemte avsalting kolonner (se Tabell for materiale). Før du bruker andre avsalting kolonner, anbefaler vi å undersøke effektiviteten av DTT fjerning og protein utvinning, siden noen avsalting kolonner kan delvis absorbere protein av interesse.
      1. Equilibrate kolonnen med kalium fosfat (KPi) bufferen (40 mM, pH 7.5) ved å fylle kolonnen helt med bufferen og la bufferen renne ut. Gjenta denne prosessen 2 x.
      2. Fjerne hvite disk filteret i kolonnen ved forsiktig skyve det ned med pinsett og fjerne det. Det er enklest å fjerne mens kolonnen er fylt med KPi bufferen. Fylle kolonnen med KPi buffer og sentrifuge det 1000 x g i 3 minutter.
      3. Overføre kolonnen til en ren tube, legge til protein prøven sakte til midten av kolonnen og sentrifuge det 1000 x g i 2 minutter. DTT-fri protein er nå i gjennomflytsenhet.
    3. Sjekk dens konsentrasjoner (f.eksbruke en UV/Vis spectrometer) og måle sin absorbans ved 280 nm. Beregne protein konsentrasjonen med Øls lov.
    4. Distribuere halvparten av protein prøvene i dele. Inkuber dele anaerob forhold (f.eksved hjelp av en anaerob chamber) for 20 min for en fullstendig fjerning av oksygen. Seal rør med plastfolie og lagre prøver på 20 ° C eller-80 ° C, avhengig av protein.
      Merk: Istedet for benytter det anaerobe kammeret, rør kan også være glimtet med argongass fjerne oksygen.
  2. Utarbeidelse av et fullstendig oksidert protein
    Merk: Det anbefales å forberede oksidert protein prøver fra fullt redusert proteiner (beskrevet tidligere). Dette reduserer heterogenitet i oksidasjon stater i cysteinene. Det er mulig å bruke forskjellige oksiderende reagenser; Her er vi fokuserer på hydrogenperoksid (H2O2).
    FORSIKTIG: Unngå over-oksidasjon som kan føre til uønskede intramolekylære disulfide obligasjoner og irreversibel oksidasjon av ulike aminosyrer, inkludert cystein, metionin, tyrosin og andre.
    1. Gjenværende protein prøven, legge til 5 mM H2O2 (fersk utvannet) og ruge det 3 h på 40 ° C mens risting.
      Merk: Temperaturen på dette trinnet er protein-avhengige og bør justeres protein stabilitet.
    2. Equilibrate kolonnen med KPi buffer (40 mM, pH 7.5) ved å fylle kolonnen helt med bufferen og la bufferen renne ut. Gjenta denne prosessen 2 x.
    3. Fjerne hvite disk filteret i kolonnen ved forsiktig skyve det ned med pinsett og fjerne det. Det er enklest å fjerne mens kolonnen er fylt med KPi bufferen.
    4. Fylle kolonnen med KPi buffer og sentrifuge det 1000 x g i 3 minutter.
    5. Overføre kolonnen til en ren tube, legge til oksidert protein prøven sakte til midten av kolonnen og sentrifuge det 1000 x g i 2 minutter; oksidert protein er nå i gjennomflytsenhet.
    6. Kontroller de protein konsentrasjonene som i trinn 1.2.5, dele oksidert proteiner i dele og lagre dem på 20 ° C eller-80 ° C, protein-avhengige.

2. lys spredning aggregering analysen

Merk: Alle konsentrasjoner i denne analysen er Anstandsdame - og underlaget-spesifikk, og bør kalibreres. Alle buffere bør være 0.22 µm-filtrert, som det er svært viktig at bufferne er partikler eller luftbobler og cuvettes er rent og støvfritt. Det er svært viktig å bruke en rørestang plassert i kvarts cuvette. Sjekk forskjellige rørestang størrelser og former for å sikre en effektiv blanding av hele løsningen uten å produsere uønskede luftbobler. Videre er det forskjellige flouorospectrometers tilgjengelig i laboratorier og fasiliteter. Her ble en bestemt fluorospectrometer (se Tabell for materiale) brukt. Instrumenter har en mangfoldig følsomhet, måler hastighet og sampler parametere. Derfor skal nøyaktig parametrene (f.eks, utslipp og eksitasjon båndbredde, følsomhet og andre) optimaliseres ved hjelp av en kjent aggregering utsatt protein og tilsvarende vilkårene. Bruke citrate syntase (CS) og/eller luciferase som første underlag i nanomolar konsentrasjoner anbefales.

  1. Kjemisk aggregering analysen
    1. Klargjør denaturert underlaget ved rugende 12 µM CS overnatter i 40 mM HEPES (pH 7.5) og 4.5 M GdnCl. For å bevare pH, løses GdnCl i 40 mM HEPES (pH 7.5).
    2. Åpne programmet fluorospectrometer og gå til kurset måling. Angi parametere: temperatur: 25 ° c. Λem: 360; EM båndbredde: 5 nm; Λex: 360; Ex båndbredde: 2,5 nm; og Data intervall: 0,5 s.
    3. Forberede prøven ved å legge til 1600 µL 40 mm HEPES kvarts søppel. Cuvette inn prøven holderen og la prøven nå ønsket temperatur.
    4. Angi omrøring til 600 rpm og starte målingen før en opprinnelig plan er etablert. Holde omrøring på for hele målingen.
    5. Å måle CS aggregering i fravær av en Anstandsdame, på 120 s til målet, legge (forsiktig, men raskt) 10 µL denaturert cs (siste konsentrasjon av 75 nM). Fortsette målene for 1200 s.
    6. Å måle CS aggregering i nærvær av Hsp33, på 60 s til målet, legge Hsp33 (siste konsentrasjon av 300 nM). Etter en ekstra 60 s, legge 10 µL denaturert cs (siste konsentrasjon av 75 nM). Fortsette målene for 1200 s.
      Merk: Når du legger til underlaget eller Anstandsdame, for å unngå innsetting av bobler, bruke en 10-µL pipette.
  2. Termisk aggregering analysen
    Merk: Temperaturen for termisk aggregering analysen avhenger protein stabiliteten og bør justeres hver protein uavhengig.
    1. Åpne programmet fluorospectrometer og gå til kurset måling. Angi parameterne som følger: temperatur: 43 ° C; Λem: 360; Utslipp båndbredde: 5 nm; Λex: 360; Eksitasjon båndbredde: 2,5 nm; og Data intervall: 0,5 s.
    2. Forberede prøven ved å legge til 1600 µL forvarmes 40 mm HEPES kvarts søppel. Cuvette inn prøven holderen og la prøven nå 43 ° C.
    3. Angi omrøring til 600 rpm og starte målingen før en opprinnelig plan er etablert. Holde omrøring på for hele målingen.
    4. Å måle CS aggregering i fravær av en Anstandsdame, på 120 s til målet, forsiktig legge CS (siste konsentrasjon av 125 nM) og fortsette måle for 1200 s.
    5. Å måle CS aggregering i nærvær av Hsp33, på 60 s til målet, legge Hsp33 (siste konsentrasjon av 600 nM). Etter en ekstra 60 s, legge til CS (siste konsentrasjon av 125 nM). Fortsette målene for 1200 s.
      Merk: Når du legger til underlaget eller Anstandsdame, unngå innsetting av bobler.
  3. Data analyse og støy fjerning av Kfits
    Merk: Kfits er tilgjengelig ved bruk av Kfits har tidligere blitt beskrevet i Rimon et al. 45
    1. Last opp datafilen.
      Merk: Er rå resultatene fra lysspredning målinger i et kommadelt eller tabulatordelt tekstformat.
    2. For å fjerne støy, velger du parametere for forretningsanalyse. Bruk automatisk beste modellen (anbefalt), merke flagget støy er alltid over signal .
    3. Fjerne manuelt åpenbare outliers med de grønne og røde justerbar linjene; Dette trinnet vil filtrere støy over den grønne linjen og under den røde linjen.
    4. Angi grunnlinjen og passer kurven. Etter anvender støy terskelen, dataoverføre behandlet.

3. hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

  1. Forberedelse av buffere og protein prøver (Hsp33 og Hsp33-CS kompleks)
    1. Fortynne protein prøvene å en final konsentrasjon av 1 mg/mL i 25 mM Tris-HCl buffer ved pH 7.5 og overføre dem til 1.5-mL hetteglass.
    2. Klargjør protein-underlaget komplekse eksempler ved rugende Hsp33 med CS i forholdet 1:1.5 på 43 ° C.
      1. Legge til CS på en step-wise måte å unngå noen raske aggregering og sikre en fruktbar binding mellom Hsp33 og termisk ufalsede CS.
      2. Bruk minst fire trinn (dvs., hver gang legge en fjerdedel av det siste bindet) og Inkuber prøvene i 15 min etter hvert tillegg til at CS beskyttelse av Hsp33.
    3. Fjerne noen aggregater med en 30 minutters sentrifugering 16.000 x g på 4 ° C.
      Merk: Nye protein-underlaget komplekser må være forberedt frisk. Substrat tillegg bør gjøres gradvis; ellers oppstår aggregering. Temperatur, substrat og underlaget konsentrasjoner er protein-spesifikk.
    4. Forbered en buffer H (25 mM Tris-HCl, pH 7.5), som fungerer som deuterasjon (deuterering), og en buffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7.09), som er den deuterasjon (deuterering)-bufferen. Også forberede en fersk slukke buffer (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, 0,1% maursyre).
      Merk: Slukke bufferen skal være optimalisert for protein av interesse for å få dekningen maksimal sekvens etter pepsin fordøyelsen.
    5. Overføre alle buffere og prøver til ampuller og plassere dem i riktig skuffer. Hold buffere H og D ved 25 ° C (skuff 25 ° C). på den annen side, hold prøver og slukke buffer på 0 - 2 ° C (brett 0 ° C). Sett prøvene i 150-µL glass inserts (se Tabell for materiale) først, og deretter overføre dem i hetteglass.
  2. Utarbeidelse av apparatet
    Merk: Masse spectrometer kommer med to medfølgende programvare: en kontroller pumpene og den andre kontroller det masse spectrometer (se Tabell for materiale). De neste trinnene beskrives med disse to programmer.
    1. Slå på alle kjøleenheter manuelt. Når alle kjølesystemer når sine mål temperaturer, manuelt slå på både høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) og lasting pumper.
      Merk: I vårt tilfelle viste to kjøling bad og en kjøling boks (som inneholder felle og analytisk kolonner). En kjøleenheten kjøler skuffen ved 0 ° C, mens den andre holder skuffen ved 25 ° C; temperaturen for kjøling-boksen er 1-2 ° C.
    2. Åpne programmet som kontrollerer både pumper, i tillegg til programvaren som styrer den masse spectrometer; Kontroller at MS er i ventemodus.
    3. Koble HPLC stikkontakt ventilen fra MS kilden vaske systemet først med en "trippel renset" løsning (1% maursyre, 33% acetonitrile, 33% isopropanol, 33% metanol), deretter med buffer B (80% acetonitrile, 0,1% maursyre) og til slutt med buffer en (0,1% maursyre, pH 2,25), og deretter sette inn kolonnen pepsin i systemet. Hvis endre buffere, må du rense begge pumpene før du fortsetter.
    4. Kontroller at vannmengden for begge pumpene er 0,1 mL/min og trykket er stabil.
    5. Etter vask systemet med en jevn flyt og jevnt trykk, HPLC uttaket inn MS kilden og aktivere MS.
  3. Masse spectrometer parametere
    1. Angi peptid ionisering til electrospray ionization (ESI) ved 175 ° C, skjede gasstrømmen 17, aux gass gløden på 2 og spray spenningsnivået 4.5 kV (supplerende figur 1).
    2. Angi parametrene som følger for de ikke-deuterated prøvene.
      1. Angi parametere: skanneområde m/z til 300-1500; Oppløsningen til 70.000; Automatisk få kontroll mål (AGC) til 106; og maksimum injeksjon (det) på 100 ms.
        Merk: De 5 mest intense ionene med gratis stater mellom 2 og + 6 (intensitet høyere enn 1,3 x 104) og en dynamisk vindu av 30 vil bli isolert.
      2. Utføre ion fragmentering ved høyere energi collisional dissosiasjon (HCD) i flere-kollisjon cellen med normalisert kollisjon energi (NCE) lik 28. Oppdage fragment ioner ved tandem MS med en oppløsning på 35.000, AGC målet 105, maksimal den på 60 ms, og et isolasjon vindu 2.0 m/z.
    3. For de deuterated prøvene, ansette MS1 bare med en høyere oppløsning på 140 000 og annet lignende parametre.
  4. Kjører eksperimentet
    1. Angi magasinene på følgende måte.
      1. Plasser buffer H og D i skuffen 25 ° C, og plasser prøver og slukke buffer i 0 ° C skuffen.
      2. Sted X tom ampuller, justert i begge skuffene, der X = antall prøver x antall tidspunkt.
        Merk: I 25 ° C skuffen, tom hetteglass tjene som reaksjon ampuller, og i skuffen 0 ° C, de tjener som slukker hetteglass.
      3. Hver av Tom hetteglass inneholder en tom Glassinnsatsen; forkaste og sa setter du inn mellom eksperimenter.
        Merk: For å kjøre HDX forsøket på den mest effektive og minst tidkrevende måten, en programvare som gjør det mulig å kjøre samtidig (supplerende figur 2) ble brukt. De neste trinnene vil bli beskrevet ved hjelp av denne programvaren.
    2. Åpne programvaren. Angi parametrene programmet utføre følgende.
      1. Inkuber hvert utvalg (5 µL) med 45 µL bufferen D i flere minutter, avhengig av tidspunkt som er valgt (f.eks1, 3, 18, 40 og 100 min) på 25 ° C. Inkuber ikke-deuterated prøven med 45 µL bufferen H i stedet.
      2. Umiddelbart etter inkubasjon, bland 50 µL deuterated protein i 50 µL iskald slukke bufferen og injisere dem i en immobilisert pepsin kolonne (20 mm i lengde, 2.0 mm i diameter).
      3. Elute noen peptider fra kolonnen pepsin i kolonnen pre spylt med buffer A for 6 min med en hastighet på 50 µL/min. holde buffer A i boksen kjøling ved 0 ° C.
      4. Elute peptidene av pre kolonnen i kolonnen C18 analytisk (C18 kolonne, 130 Å, 1,7 µm, 2.1 mm x 50 mm, holdt ved 0 ° C) atskilt ved å bruke en lineær gradient acetonitrile på 100 µL/min. Kjør acetonitrile forløpningen bruke acetonitrile 100% som buffer B : 7 minutter til 2%, 7 min på 10-30%, 2,5 min 30-90%, 1,5 min på 90% i rask gradering for 1 min på 90-8%, og til slutt equilibrate kolonnen for 4 min på 2%.
    3. Bygge en løpende rekkefølge (se utfyllende figur 2): gå inn tidspunkt, eksempel navn, og steder i magasinene, samt buffer navnene og plasseringene.
      Merk: Programvaren lar justeringen av alle forskjellige kjører ganger i et program som kjører flere prøver samtidig, effektivt redusere kjører ganger.
  5. Dataanalyse
    Merk: Vi samarbeider med flere programmer under data-analyse, inkludert Proteom oppdageren og MaxQuant (gratis programvare) for peptid identifikasjon og analyse av sekvens dekning, samt HDX workbench, en gratis programvare som lar analyse av deuterium innlemmelse i proteiner, og sammenligne HDX priser mellom ulike sett av eksperimenter. De neste trinnene beskrives med disse programmene.
    1. Analysere peptid dekning av prøven ved å kjøre ikke-deuterated kontroll eksemplene i programvaren (supplerende Figur 3). Konfigurere programvaren bruker følgende parametere.
      1. Bruk metoden Sequest HT med et Nei-enzym (uspesifikke) cleave. Søk etter peptider 4 144 aminosyrer med en masse toleranse for 7 ppm og 0,5 Da for forløperens ion og fragment. Tillate en dynamisk metionin oksidering.
      2. Opprette en database for protein, der programvaren kan bestemme peptid dekning. Eksportere de identifiserte peptidene i tekstformat.
    2. Analysere deuterated resultatene med HDX workbench fri programvare58.
      1. Åpne redigeringsprogrammet protein og definere protein ved å sette inn filen for protein sekvensen og peptid dekning.
      2. Deretter åpne redigeringsprogrammet Setup eksperimentere veiviseren og angi alle innganger forespurt.
        Merk: Programmet krever antall eksempler, antall tidspunkt, antall gjentak, pH verdien av bufferne og temperaturen.
      3. Endelig inndataparameterne om masse spectrometer brukt, etter som programmet genererer en liste over oppdagede peptider.
        Merk: Programvaren oppdager "HDX" peptidene, undersøker isotop klynger og demonstrerer en tydelig visualisering av deuterasjon (deuterering) i prøvene.
  6. Data presentasjon
    1. Etiketten områdene med en ydmyk deuterasjon (deuterering) opptak på strukturen PyMol programvare eller noen annen visualisering programvare.
    2. Introdusere deuterium opptak nivåer i stedet for verdiene som B-faktor.
      Merk: En grunnleggende veiledning kan finnes på https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De to metodene presentert gjør det mulig å følge den krevende aktivitet og dynamikken i protein interaksjoner mellom en Anstandsdame og dens substrat. Videre gjør reduksjon-oksidasjon protokollen at utarbeidelsen av en fullt redusert og fullstendig oksidert Anstandsdame, gir en mer grundig forståelse av aktivisering mekanisme redoks-avhengige uordnede chaperones.

Først brukte vi lysspredning undersøke redoks-avhengige aktiviteten til Anstandsdame. Lysspredning ble utført på et kjemisk og termisk denaturert CS protein i nærvær av oksidert (aktiv) eller redusert (inaktiv) Anstandsdame (figur 1). Kjemisk rødsprit fører til en rask CS samling av refolding av et fullt denaturized protein i ugunstige buffer forhold. På den annen side, resultater termisk-indusert aggregering fra en relativt langsom unfolding innfødt foldet underlaget. Derfor varierer disse typer aggregering prosesser i sine kinetisk parametere. Videre kan ulike chaperones variere i å hindre aggregering av samme underlaget i forskjellige aggregering moduser.

I begge former for rødsprit, tillegg av oksidert Hsp33 i molar forholdet 1:4 (CS: Hsp33) helt avskaffet aggregering, senke 360 nm målingene ubetydelig verdier. Tilstedeværelsen av en redusert Hsp33, derimot, hadde ingen effekt på CS stabiliteten og ga en aggregering kurve lik den oppdaget i fravær av en Anstandsdame (figur 1). Resultatene ble analysert og renset fra bakgrunnsstøy med Kfits, som skjematisk beskrevet i figur 2.

Omrisset av HDX-MS teknikken begynner med inkubasjonstiden for Anstandsdame med deuterium oksid, etterfulgt av slukke og fordøyelsen, og endelig MS analyse og hydrogen-deuterium utveksle profilering (Figur 3). Under HDX-MULTIPLE Sclerosis, ble Anstandsdame inkubert på brettet ved 25 ° C i en D2O inneholder buffer. Etter en bestemt inkubasjon tid kontrollert av prøven håndtering robot-system, protein løsningen ble overført til slukke løsningen, surt og denaturing, på brettet ved 0 ° C. Lav pH og lav temperatur bremser hydrogen utveksling og bevarer deuterasjon (deuterering) nivåer av alle amid bygget, mens denaturing kjemiske utfolder seg proteinet og gjør det mulig å bli riktig fordøyd. Robotic systemet overfører prøven fra brett ved 0 ° C til kjøling boksen der den flyter i kolonnen online pepsin fordøyelsen. Umiddelbart etter protein fordøyelse, peptidene videre til kolonnen C18-felle for avsalte og fjerning av rask utskiftbare D2O (hovedsakelig finnes på side kjede atomene) og skilles deretter bruke kolonnen C18 og analysert ved hjelp av masse massespektrometri. Eksempel flyten er kontrollert av en to-ventil system, som 1) sikrer separasjon av pepsin og C18 kolonnen buffere for å hindre inaktivering av pepsin av organiske løsemidler og 2) kan kort avsalte av peptider fjerne raskt utskiftbare D2O molekyler og salter (Figur 4).

Etter beregningsorientert analysen mottar vi en deuterasjon (deuterering)-profil for hver peptid, viser en endring i massen som en funksjon av inkubasjon tiden i D2O. HDX Workbench programvaren tillater sammenligning av eksperimentelle gjentak for å lage statistiske analyser av hver betingelse (f.eks, en aktiv Anstandsdame i et ubundet skjema). Det neste trinnet er en sammenligning av deuterasjon (deuterering) kurver mellom forskjellige prøver; for eksempel en bundet Anstandsdame og en ubundet chaperone. Disse sammenligningene forskjellige Anstandsdame stater kan avsløre de strukturelle forstyrrelser som følger substrat bindende. Rester som viser en tregere utveksling tilstanden bundet samarbeidsstil trolig en binding partner. Det er viktig å merke seg at redusert hydrogen-deuterium valutakurser kan også angi en refolding for en bestemt region ved binding uten faktiske direkte samspill med underlaget (figur 5et). HDX Workbench programvaren tillater undersøkelse av resultatene i visningen "forstyrrelsene" ved å vise deuterasjon (som deuterering) med en standard feil over dekning av hele protein.

I dette tilfellet ble HDX-MS brukt til å sammenligne deuterasjon (deuterering) mønsteret mellom den bundne og ubundne Anstandsdame Hsp33 til sin substrat CS. Resultatene viser en klient-interaksjon området C-terminalen redoks bryteren domenet Anstandsdame (figur 5B). Mens redusert, har Hsp33 en helt bestilte struktur, der webområdene samhandling er gravlagt. Hsp33 mister sin struktur og blir funksjonelle når det sanser oksidativt stress; Derfor sammenlignet vi den redusert og oksidert Hsp33 under både bundne og ubundne forhold (figur 5C). Resultatene viser at mens det redusert Hsp33, enten bundet eller ubundet, produserer lignende peptid kurver, oksidert Hsp33 viser en betydelig forskjell. Oksidert Hsp33 prøvene viser 30% deuterasjon (deuterering) forskjell i bundne og ubundne Anstandsdame, med bestemte bundet protein som angir en allosteric hindring. Analyse av ekstra peptider fra N-terminalen og regionene thermobile linker vises i supplerende figur 3.

Figure 1
Figur 1 . Aggregering analyse av lysspredning. Aggregering av kjemisk og termisk denaturert CS var overvåket i nærvær av oksidert Hsp33 (rød), redusert Hsp33 (blå), eller i fravær av Anstandsdame (svart). En lysspredning på 360 nm blitt overvåket i 1200 s. (A) under kjemiske aggregering, i fravær av en Anstandsdame eller i nærvær av en redusert Hsp33, CS samlet, nå en platå rundt 300 s til målet. (B) under termisk aggregering, CS samlet gradvis i fravær av en Anstandsdame eller i nærvær av en redusert Hsp33. I begge analyser avskaffet tilstedeværelse av oksidert Hsp33 helt aggregering, som ble demonstrert av ubetydelig 360-nm målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Fjerning av støy og dataanalyse bruker Kfits. Dette panelet viser et skjema som oppsummerer data analyse og støy fjerning av verktøyet Kfits som beskrevet i teksten og Rimon et al. 45. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Arbeidsflyt av HDX-MS metodikken. HDX-MS benytter deuterated løsemidler å bestemme kjemiske miljøet av amid bygget, jevnt fordelt langs ryggraden i protein. Protein av interesse er ruges i en deuterating buffer i sin opprinnelige form i bestemte tidsperioder, deretter hydrogen-deuterium utveksling er slukket av Sure forhold ved lav temperatur. Proteinet er fordøyd av et enzym stabil Sure forhold, for eksempel pepsin. Etterpå er peptidene avsalte og atskilt på kort tid å unngå en tilbake utveksling. Endelig peptidene analyseres av en masse spectrometer og vurderes deuterium opptak av en analyseprogramvare, for eksempel ved HDX Workbench fri programvare58. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Komponenter av helautomatisk HDX-MS. (A) denne skjematisk diagram av HDX-MS representerer alle deler av systemet: lasting pumpen og HPLC pumpe Kontrollflyt-bufferen og prøven overføre innenfor systemet. Robotic systemet inneholder to sprøyter og skuffer som brukes til å forberede deuterated prøven og overføre proteiner til den online fordøyelse kolonnen via input ventilen boksen kjøling (LC rom). Deretter er fordøyd peptidene rettet til kolonnene C18 felle og separasjon, senere skilt, og rettet mot det masse spectrometer. (B) dette panelet viser faktiske HDX systemoppsettet som det ble opprettet i laboratoriet. (C) dette panelet viser en skjematisk fremstilling av online-fordøyelsen og peptid separasjon fluidic konfigurasjonen. I fordøyelsen og separasjon systemer har en ventil hver som kan byttes mellom laste og injisere . Første ventilen (på venstre) er koblet til porten som injeksjon og styres av lasting pumpen, regi prøver i kolonnen pepsin bruker surt bufferen uten noen organisk løsemiddel som kan skade pepsin harpiks. Prøven overføres til høyre ventilen i kolonnen felle fjerne rester deuterium samt utvekslet rask deuterated atomer (hovedsakelig av siden kjedene). Etter en kort vask av 1-2 min i kolonnen felle, ventilen endres modus laste og prøven er vasket i kolonnen for C18-separasjon bruker mye HPLC pumpen med økende konsentrasjoner av acetonitrile. Prøven overføres til masse spectrometer for en masse analyse. Lengden på rørene er merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . HDX-MS resultater. (A) resultatene presenteres prosentvis deuterasjon (deuterering) over tid per protein fragment, generert av HDX Workbench . Hvert diagram viser et protein utvalg, enten oksidert eller redusert, og sammenligner mellom bundne og ubundne prøvene. Peptid fragmenter vises her er peptid YVVITITPSEG funnet i regionen linker og peptid LQVMPAQNAQQDDFD funnet i C-terminus. (B) det endelige resultatet, som deuterasjon (deuterering) forskjellen mellom bundet og ubundet komplekser, viser forstyrrelsene per aminosyre. (C) en strukturell modell av Hsp33 Anstandsdame viser deuterasjon (deuterering) opptak forskjellene i linker og C-terminalen ustabil regioner. Dette panelet er opprettet ved hjelp av PyMol programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1. Grensesnittet i programmet opererer masse spectrometer. Programmet brukes til å optimalisere og definere masse spectrometer metodeparametere brukes for HDX eksperimentet. Metodeparametere (i venstre panel) kan lagres i metoden slik at gjenkjennes av andre programmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2. Denne illustrasjonen viser et skjermbilde av programvare som fungerer som en integrasjonsplattform for robotic prøvetaking deler og MS-LC-systemet. Programvaren optimaliserer kjøretiden ved planleggingen av HDX eksperimentet, etter definerte inkubasjon tiden i deuterated buffer (blå piler). For eksempel ovenfor er et diagram av 17 kjøres to replicative analyser av Hsp33 varianten STIL, ruges i en deuterated buffer i forskjellige tider, fra 0 - 100 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3. Denne illustrasjonen viser en analyse av deuterium opptaket av flere Hsp33-peptider fra ulike Hsp33 varianter, kalt PGBD og REV34. Tomter vise endringer i deuterium opptaket av det samme området i Hsp33 i ubundet (rød) og bundet (blå) stater. Peptider fra regionen N-terminal viser ingen signifikant forskjell i HDX priser, mens fragmenter fra regionen koblingsfunksjonalitet viser en betydelig reduksjon i HDX priser på samspill med oppslåtte underlaget, citrate syntase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I dette papiret gitt vi protokoller for analyse av redoks-avhengige Anstandsdame aktivitet og karakterisering av strukturelle endringer ved binding av en klient protein. Dette er supplerende metoder å definere potensielle Anstandsdame-underlaget komplekser og analysere potensielle samhandling områder.

Her brukt vi disse protokollene for karakterisering av en kompleks mellom redoks regulert Anstandsdame Hsp33 med et godt studert Anstandsdame substrat CS. Vi presentert to ulike typer protein aggregering analyser, som varierer i deres kinetic og opprinnelige tilstand: under en kjemisk rødsprit, underlaget starter den etterfølgende prosessen fra denaturert skjemaet mens under en termisk aggregering, den unfolding startes fra den opprinnelige formen av underlaget.

Lys-spredning målinger er et nyttig verktøy for å overvåke relative protein aggregering. Mens vi bruker denne metoden til å fastslå Anstandsdame aktive staten, kan det videre brukes å studere generell aggregering vilkår, sammenligne stabiliteten til et annet protein, eller å studere destabiliserende mutasjoner både i underlaget og chaperone.

Til tross for sin enkelhet, kan metoden lysspredning produsere støyende data, med flere outliers. For å overvinne problemet, utviklet vi Kfits programvaren beskrevet ovenfor. Kfits -programvaren gjør det mulig å enkelt og raskt fjerne store mengder støyende data, samt beregne kinetic parameterne fra lysspredning kurven. Kfits er ikke begrenset til protein aggregering og kan brukes til alle typer kinetic målinger.

Dermed er metodikkene som er beskrevet her enkel, lett å utføre og ikke tidkrevende. De kan brukes til ulike molekylær chaperones, slik at deres redoks avhengighet undersøkes innen et par dager. Videre kan anti-aggregering aktiviteten til andre, ikke-redoks avhengige chaperones evalueres ved hjelp av beskrevet protokoller lysspredning og Kfits. Det er viktig å merke seg at ulike parametere, for eksempel temperatur, protein konsentrasjon og måling tid må justeres hver protein systemet uavhengig.

For å få strukturinformasjon styrer en Anstandsdame arbeider syklus, presentert vi metodikken HDX-MS. I motsetning til lysspredning prosedyren, det er en mer kompleks teknologi og krever bestemte instrumentering, inkludert en masse spectrometer og helst en robot-system for eksempel utarbeidelse. Men kan dette oppsettet etableres, selv uten robotic systemet, i et eksisterende anlegg. Når det er opprettet, fremgangsmåten er relativt enkel og tillater analyse av utfordrende protein komplekser som kan være unreached av høyoppløselige metoder (f.eksX-ray og NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlig å Meytal Radzinski for hennes nyttig diskusjoner og kritisk lesing av artikkelen og Patrick Griffin og hans lab medlemmer for deres ubegrenset hjelp ved opprettelse HDX analyse plattform. Forfatterne er takknemlig for den tysk-Israel Foundation (I-2332-1149.9/2012), den Binational Science Foundation (2015056), Marie Curie integrering tilskudd (618806), Israel Science Foundation (1765/13 og 2629/16), og den menneskelige Frontier vitenskap Programmet (CDA00064/2014) for deres støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292, (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417, (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98, (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25, (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44, (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32, (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12, (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20, (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18, (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19, (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288, (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23, (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42, (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82, (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427, (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17, (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291, (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291, (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56, (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280, (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51, (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427, (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27, (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429, (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281, (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292, (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135, (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275, (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14, (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285, (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24, (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34, (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24, (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24, (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142, (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291, (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56, (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, (9), 1512-1521 (2012).
Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter