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Biochemistry

线虫线虫中乳酸和丙酮酸细胞的小尺度比色测定

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807

Summary

本文介绍了一种改良的小尺度萃取和比色法测定乳酸和丙酮酸在线虫中的含量.使用商用试剂盒时, 其灵敏度和准确度的技术发展非常重要。在萃取中蛋白质沉淀是定量测定细胞内代谢产物的关键步骤。

Abstract

乳酸和丙酮酸是细胞内能量代谢通路的关键中间体。监测细胞中的乳酸/丙酮酸比值有助于确定线粒体氧化磷酸化与有氧糖酵解之间年龄相关能量代谢是否失衡。在这里, 我们展示了用于乳酸和丙酮酸的商业色度测定试剂盒在模型有机体C. 线虫中的应用。近年来, 试剂制造商进行的研究和开发大大提高了比色/荧光试剂盒的灵敏度和准确度。改进后的试剂能够在线虫中使用96孔板的小尺度检测。一般来说, 荧光检测优于比色法的灵敏度;然而, 比色法更适合在普通实验室中使用。定量测定中的另一个重要问题是均匀化的C. 线虫样本的蛋白质沉淀。在我们的蛋白质沉淀方法中, 常用的铈沉淀剂 (三氯乙酸酸、高氯酸和偏磷酸酸) 用于样品制备。在均匀化过程中, 通过直接添加冷沉淀剂 (最终浓度为 5%) 制备无蛋白测定样品。

Introduction

乳酸和丙酮酸浓度被广泛认为是能量代谢的中间体, 与糖酵解的状态、三羧酸酸 (TCA) 循环和有氧生物细胞中的电子传输链有关。在糖酵解氧化葡萄糖到丙酮酸的一系列反应, 它位于一个新陈代谢的十字路口, 可以通过糖异生转化为碳水化合物, 通过乙酰 CoA, 脂肪酸和能量代谢, 和氨基酸丙氨酸。TCA 循环发生在足够的溶解氧的存在下, 是葡萄糖转化为能量的基础。特别是, 二次代谢的改变是一种有趣的现象, 其中糖酵解主要用于能源生产和有氧线粒体呼吸, 涉及 TCA 循环和电子传输链, 是下调在哺乳动物癌细胞1,2。我们最近发现, 在模型有机体线虫线虫(线虫) 的衰老过程中, 乳酸水平和随之而来的乳酸/丙酮酸 (L/P) 比率下降。同样, 我们发现, 哺乳动物肿瘤抑制 p53 ortholog 相比 CEP-1 在C. 线虫通过激活其转录目标3, 在与年龄有关的能量代谢变化中发挥重要作用。

在生物检测中, 如测定细胞中的乳酸和丙酮酸浓度, 比色/荧光试剂盒的灵敏度、准确度、样本大小和孵育时间都得到了显著改善。由于技术创新, 我们现在能够分析各种代谢产物和中间代谢产物, 而不需要大规模的C. 线虫的培养, 因为它的体积小, 很难得到。一般而言, 比色法测定的灵敏度小于荧光测定的量级;然而, 比色法更适合于普通实验室的设置。此外, 含有均质性和蛋白质沉淀的萃取技术对于定量测定线虫细胞中乳酸和丙酮酸浓度是至关重要的, 因为这种线虫被封闭在外骨骼中.称为角质层, 不同于哺乳动物培养细胞系4,5。在这里, 我们描述了使用商业色度测定试剂盒分析乳酸和丙酮酸浓度的协议, 包括从线虫中抽取样品的技巧。

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Protocol

1.线虫的同步培养

  1. 在播种前, 培养大肠杆菌 (大肠杆菌) 菌株 OP50 过夜在37摄氏度300毫升的 Luria-贝塔尼 (LB) 汤液培养基。将培养的 OP50 储存在-4 摄氏度。
    1. 要使 LB 汤液培养基, 使用10克胰蛋白胨, 5 克酵母提取物, 10 克氯化钠和1.5 毫升 1 N 氢氧化钠, 并添加到 1 L 与去离子水。高压 釜。
      注意: OP50 和C. 线虫菌株可从线虫遗传学中心 (明尼苏达大学, 圣保罗, MN, 美国)。
  2. 要使线虫生长培养基 (NGM) 琼脂, 使用3克氯化钠, 2.5 克蛋白胨, 17 克琼脂, 和975毫升去离子水。高压 釜。冷却至55摄氏度, 然后 sterilely 添加, 按顺序, 1 ml 1 M MgSO4, 1 毫升 1 M CaCl2, 1 毫升5毫克/毫升胆固醇乙醇, 25 毫升1米磷酸钾 pH 6.0 90 毫米培养皿。
    1. 对于 1 M 磷酸钾 pH 6.0, 使用 108.3 g 的 KH2PO4和 46.6 g2HPO4, 并添加去离子水到 1 l. 热压罐6
  3. 在 NGM 琼脂板上传播1-2 毫升培养的 OP50。为了使一层薄薄的 OP50, 在添加任何线虫之前, 在室温下一夜之间孵育盘子。
    注: 接种 OP50 的 NGM 琼脂板可在室温下储存2-3 周。
  4. 添加至少100蠕虫到 NGM 琼脂板与 OP50, 和文化在20摄氏度, 直到成人阶段。至少需要三块板。
  5. 要在子宫内收集卵子, 请将妊娠雌雄同体从三 NGM 琼脂板转移至15毫升锥形管中的5毫升 s 缓冲液, 用15毫升 s 缓冲液在室温下用离心法洗涤3次蠕虫, 并在室温下在三十年代的 300 x g处清洗。
    1. 要使 S 缓冲, 使用5.9 克氯化钠和50毫升 1 M 磷酸钾 pH 6.0, 添加到 1 L 与去离子水。热压罐6
  6. 溶解在碱性次氯酸盐溶液中的蠕虫 axenization 和散装鸡蛋分离 (0.5 毫升新鲜漂白剂或等效: 5-6% 次氯酸钠, 0.1 毫升10米氢氧化钠, 约4.5 毫升 S 缓冲)6, 并站在10-15 分钟的解决方案室温混合通过反相。
    注意: 在15分钟内, 成人蠕虫应该溶解, 留下一个朦胧的解决蛋从他们的尸体释放 (释放的鸡蛋应该使用立体显微镜确认)。而不是0.1 毫升 10 n 氢氧化钠, 0.2 毫升 5 N 氢氧化钠也可以使用。
  7. 次氯酸盐处理后, 用15毫升 s 缓冲液洗涤卵颗粒3次, 并在5-6 毫升 s 缓冲液中重悬。在20摄氏度的 S 缓冲液中孵化已释放的卵, 不含大肠杆菌, L1 期幼虫的年龄同步培养。
  8. 为了确定 L1 阶段幼虫的近似数量, 在重悬幼虫至少3次后, 在10µL 的 S 缓冲液中使用立体显微镜对蠕虫进行计数, 并计算平均值。然后, 转移 L1 阶段幼虫到五 NGM 琼脂板与 OP50 (1,500-3, 000 蠕虫每板使用90毫米培养皿), 和文化在20摄氏度, 直到他们成长到年轻的成人阶段, 当自受精开始和几个鸡蛋奠定 (通常后 3 d说)。

2. 从线虫中提取细胞分数

  1. 收集从五 NGM 琼脂板与 S 缓冲区 (图 1A) 的年轻成人阶段 (5 天的动物) 蠕虫。
    1. 要选择只有活蠕虫使用蔗糖方法6浮选在 30% (w/v) 蔗糖, 混合蠕虫悬浮在3-4 毫升 S 缓冲液与等量冰冷 60% (瓦特/v) 蔗糖在15毫升锥形管。旋转管在 1500 x g在十五年代在4摄氏度和去除漂浮的蠕虫成一个新鲜的管, 通过移动他们从管壁与巴斯德移液器。
  2. 用 S 缓冲液在 1500 x g上离心3次, 三十年代在4摄氏度。使用1000µL 微量吸管尖 (图 1B) 检查离心后的水洗蠕虫的湿量。
  3. 将洗涤过的蠕虫添加到等量的冰冷 10% (三氯乙酸) 酸 (TCA; 最终浓度为 5%), 用于蛋白质沉淀 (图 1C)。而不是 TCA, 高氯酸 (PCA) 或偏磷酸酸可以使用。
  4. 用沉淀剂的40冲程在聚四氟乙烯均质机 (波特-埃尔维耶姆组织磨床) 中均匀化蠕虫, 并在冰上旋转 1300 rpm。
  5. 将匀浆转化为新鲜的1.5 毫升微管与巴斯德移液器, 油脂实验使用超声波均质机3分钟 (3 倍1分钟) 与20% 占空比在冰上。
  6. 8000 x g离心10分钟, 4 摄氏度, 澄清匀浆。将上清液与 4 M KOH (0.25 体积到 10% TCA) 对冰20分钟, 并离心在 8000 x g 10 分钟在4摄氏度。上清 (作为测试样本) 可以存储在-80 摄氏度, 直到以下检测。

3. 使用比色测定试剂盒进行乳酸测定

  1. 使用比色测定试剂盒 (材料表) 测量测试样品中乳酸的浓度。对测试样品进行双面检查。将测试样本的5或10µL 添加到96孔板上, 并使用试剂盒提供的乳酸测定缓冲液将容积调整为50µL。
  2. 对于乳酸标准曲线, 稀释100毫米 L (+)-乳酸标准到1毫米与乳酸测定缓冲液。添加 0, 2, 4, 6, 8 和10µL 的1毫米 L (+)-乳酸标准, 这是提供与试剂盒, 成一系列的水井。
  3. 添加50µL 反应混合物 (含 46:2: 2 的乳酸测定缓冲液, 乳酸酶混合物和乳酸探针, 无水; 所有试剂都提供试剂盒) 或背景控制组合 (包含48:2 乳酸测定缓冲液和乳酸探针) 到每个井并在室温下孵育30-60 分钟, 而样品则受光保护。
  4. 使用微孔板读取器测量每孔 570 nm 的吸光度, 并从反应混合物的吸光度中减去背景控制组合的吸光度。
  5. 绘制乳酸标准曲线。从乳酸标准曲线计算测试样本的乳酸浓度。

4. 使用比色测定试剂盒进行丙酮酸测定

  1. 使用比色测定试剂盒 (材料表) 测量上清液 (试样) 中丙酮酸的浓度。对测试样品进行双面检查。添加10µL 的测试样品和90µL 的工作试剂 (包含94:1 的酶混合物和染料试剂, 其中提供了试剂盒) 成96孔板和孵育在室温下30分钟, 而样品是保护从光。
  2. 使用微孔板读取器测量每孔 570 nm 的吸光度。
  3. 绘制丙酮酸标准曲线。从丙酮酸标准曲线计算试样的丙酮酸浓度。

5. 蛋白质测定与蛋白质含量正常化

  1. 使用比色测定试剂盒 (材料表) 测量上清液 (测试样本) 中的蛋白质浓度。然而, 这一步不限于检测试剂盒, 其他方法可以用来测量蛋白质浓度。
  2. 使用每种总蛋白浓度在测试样品中对乳酸和丙酮酸浓度的值进行规范化。
    注意: 即使在蛋白质沉淀之后, 测试样品中的蛋白质浓度也被充分检测, 并用于样品之间的规范化步骤。

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Representative Results

使用比色法测定乳酸和丙酮酸浓度的定量, 我们显示了这些检测的准确性与以前的报告中的线虫7,8。在这里, 样品萃取过程中的蛋白质沉淀是生成精确值的最关键步骤。对于蛋白质沉淀, 常见的铈沉淀剂 (e.、TCA、PCA 或偏磷酸酸) 可用于制备测试样本 (图 1)。然而, 在线虫中, 有必要在蠕虫的均质化过程中进行蛋白质沉淀 (表 1)。除了准确性, 这些检测对测量小样本中的乳酸和丙酮酸浓度有足够的敏感性, 并且能够在短时间内检测到它们 (两种检测的反应孵育时间至少为30分钟) ( 图 2-3)。实际上, 我们在最近的报告3中介绍了这些数据。因此, 我们可以检测年龄相关的新陈代谢变化, 表明细胞乳酸水平和随之而来的 l-/P 比值在衰老期间减少, 而且我们在cep-1突变体3中也显示出不同的能量代谢。

Figure 1
图 1.细胞代谢物的提取过程.(A) 1,500-3, 000 蠕虫被放置在一个 NGM 琼脂板 (90 毫米培养皿)。从五片上的蠕虫中提取足够的比色测定。(B) 每片五片3000和1500个蠕虫收集的蠕虫分别显示在面板的左侧和右侧。每个15毫升管中的湿卷均为 < 0.5 毫升, 足以检测。(C) 在蠕虫均匀化过程中使用 10% TCA 的蛋白质沉淀。将蠕虫添加到冷 10% TCA 中的匀质机必须在蠕虫均匀化之前执行。否则, 使用比色测定试剂盒 (数据如表 1所示) 在测试样本中无法检测到乳酸和丙酮酸细胞。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 2
图 2.采用比色法试剂盒测定乳酸标准的色度色素沉着模式.(a) 在比色法中使用的96孔板的井, 以及 l-乳酸 (+) 标准的稀释系列。增加乳酸浓度导致更强烈的粉红色颜色。BG 表示对稀释系列的乳酸探针的背景。(B) 乳酸标准曲线的比色测定法。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 3
图 3.使用比色测定试剂盒对丙酮酸标准的色度着色模式.(A) 使用比色法测定的96孔板井和丙酮酸盐标准稀释系列。丙酮酸浓度的增加导致浅粉色色素增加。(B) 用于比色测定的丙酮酸标准曲线。请点击这里查看这个数字的更大版本.

测试样本 乳酸 (毫米) 丙酮酸 (毫米)
均匀化过程中的蛋白质沉淀样品 3.07 ±0.94 0.22 ±0.08
均匀化后的蛋白质沉淀样品 ND ND
均匀化和超速离心后的完整胞浆分数 * 1.12 0.06

表 1.不同时间的蛋白质沉淀对野生型 N2 5 天龄动物细胞乳酸和丙酮酸检测的影响.数据表示平均值 + 标准差 (SD) 至少三个测定值。ND 表示未检测到。* 采用超速离心无蛋白质沉淀法, 初步进行萃取工艺。

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Discussion

在使用这些色度测定试剂盒时, 样品萃取中最关键的步骤是在C. 线虫中准确检测细胞乳酸和丙酮酸是均匀化过程中的蛋白质沉淀 (图 1)。没有必要使用聚四氟乙烯均质机, 因为其他均质机 (冲击和锥形组织磨床或珠磨机) 也适合小规模的蠕虫提取。在蛋白质沉淀之前, 我们没有检测到使用匀质器提取的测试样品中的乳酸和丙酮酸。此外, 乳酸和丙酮酸水平在使用超速离心而不是蛋白质沉淀分离的胞浆分数中显著降低 (表 1)。这些建议, 样品提取是关键的检测细胞代谢物在生化方法使用线虫.线虫。对于蛋白质沉淀, 不仅 TCA, 而且其他几个铈沉淀剂 (PCA 或偏磷酸酸) 可用于生化方法7,9。根据上一份报告, 使用 TCA 导致约12% 的 NADH 在酶法测定血乳酸和丙酮酸中消失。因此, 作者认为, 使用酶法测定9时, 应选择5% 偏磷酸酸作为乳酸和丙酮酸的蛋白质沉淀剂。它表明 TCA 部分变性蛋白质包括许多酶。然而, 我们没有关于蛋白质铈沉淀剂的问题, 当使用比色检测检测细胞乳酸和丙酮酸。

在本研究中, 我们使用商业色度测定试剂盒定量测定乳酸和丙酮酸 (图 2图 3 )。与以前的检测试剂盒相比, 其灵敏度和样品尺寸均优于7;因此, 我们使用较小的刻度提取来制备测试样本, 并报告了线虫3中细胞乳酸和丙酮酸浓度的差异。我们发现在野生型线虫中乳酸的年龄相关的降低和随之而来的 l-/P 比值, 发现 p53/CEP-1 通过激活其转录靶点, 在能量代谢的年龄相关变化中发挥重要作用。2,3. 因此, 对线虫中的能量代谢的分析有利地得益于使用改进的色度测定试剂盒, 至少在某种程度上。

图 3B所示, 在这种比色法 (不是荧光测定) 中, 乳酸浓度低于 2 mM 往往是更大的。因此, 荧光测定法可能适合于更准确地测定乳酸。这些检测试剂盒的功能支持比色和荧光检测, 以便在用户实验室中对产品进行选择。使用目前的商业色度测定试剂盒来定量测定细胞代谢物的浓度仍然比较昂贵。然而, 使用常用仪器和分光光度板读取器可以在较小的实验室中充分执行试验。

迄今为止, 在模型有机体C. 线虫中使用常规生化方法的报告相对较少, 通常需要大规模蠕虫养殖, 与遗传研究5相比。然而, 近年来生物检测系统的显著进展 (例如, 提高检测试剂盒的灵敏度和稳定性) 使研究使用线虫C. 线虫, 它是小的, 由少于1000个细胞组成, 更多很有吸引力, 在实验室中很容易进行。今后, 使用质谱 (ms) 和气相色谱/质谱法 (GC/MS) 进行有效的代谢组学分析可以帮助减少某些问题, 如大规模培养、分析敏感性和特异性, 并有助于阐明细胞代谢在衰老和人类疾病包括癌症中的作用10。展望未来, 更简单的方法, 如比色测定试剂盒, 将是有效的筛选工具之前, 更精确的仪器分析。

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Disclosures

作者声明他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作得到了大东文化大学对 Sumino 筌的专项研究资助的财政支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit
BioAssay
Systems
#EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

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References

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生物化学 140 期 线虫线虫 能量代谢 乳酸 丙酮酸 常见沉淀剂 比色测定
<em>线虫</em>线虫中乳酸和丙酮酸细胞的小尺度比色测定
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Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N.More

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

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