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Biochemistry

Petits dosages colorimétriques de Lactate intracellulaire et Pyruvate chez le nématode Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Health Science, School of Sports & Health Science, Daito Bunka University, 2Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 3Department of Health Management, School of Health Study, Tokai University

Summary

Nous décrivons une extraction artisanale modifiée et les dosages colorimétriques de lactate et pyruvate chez le nématode elegans de c. Lors de l’utilisation de trousses d’analyse commerciale, le développement technique de leur sensibilité et de précision est important. Précipitation de protéines dans l’extraction est l’étape la plus critique pour le dosage des métabolites intracellulaires.

Abstract

Lactate et pyruvate sont des intermédiaires clés des voies métaboliques intracellulaires de l’énergie. Le rapport lactate/pyruvate dans les cellules de surveillance permet de déterminer s’il existe un déséquilibre dans le métabolisme de l’énergie liée à l’âge entre la phosphorylation oxydative mitochondriale et de la glycolyse aérobie. Ici, nous montrons l’utilisation des kits de dosage colorimétrique commercial de lactate et pyruvate dans l’organisme modèle c. elegans. Récemment, la sensibilité et la précision des kits de dosage colorimétrique/fluorimétrique ont été améliorées considérablement par la recherche et de développement menées par les fabricants de réactifs. Les réactifs améliorées ont permis l’utilisation des essais à petite échelle avec une plaque à 96 puits chez c. elegans. En général, un dosage fluorimétrique est une sensibilité supérieure à un dosage colorimétrique ; Toutefois, l’approche colorimétrique est plus approprié pour l’usage dans des laboratoires communs. Une autre question importante à ces essais pour la détermination quantitative est la précipitation de protéines de homogénéisé c. elegans échantillons. Dans notre méthode de précipitation de protéines, précipitants communs (e.g., acide trichloracétique, acide perchlorique et acide métaphosphorique) sont utilisés pour la préparation de l’échantillon. Un échantillon de test sans protéine est préparé en ajoutant directement froid précipitant (concentration finale de 5 %) au cours de l’homogénéisation.

Introduction

Les concentrations de lactate et pyruvate sont largement considérées comme intermédiaires du métabolisme énergétique et sont liées aux États de la glycolyse, cycle des acides tricarboxyliques (TCA) et chaîne de transport des électrons dans les cellules des organismes aérobies. Une série de réactions dans la glycolyse oxyder le glucose en pyruvate, qui se trouve à un carrefour métabolique et peut être converti d’hydrates de carbone à travers gluconéogenèse, d’acides gras et le métabolisme énergétique à travers l’acétyl-CoA et de l’acide aminé alanine. Le cycle de Krebs se produit en présence d’oxygène dissous suffisante et est fondamental pour la conversion du glucose en énergie. En particulier, l’altération du métabolisme secondaire est un phénomène intéressant dans lequel la glycolyse est utilisée principalement pour la production d’énergie et la respiration mitochondriale aérobie, qui implique le cycle de Krebs et la chaîne de transport d’électrons, est diminuée dans le cancer chez les mammifères des cellules1,2. Récemment, nous avons montré que les concentrations de lactate et le rapport lactate/pyruvate qui en découle (L/P) diminuent au cours du vieillissement chez l’organisme modèle Caenorhabditis elegans (c. elegans). De même, nous avons constaté que le mammifère tumeur suppresseur p53 orthologues CEP-1 chez c. elegans a un rôle important dans les altérations liées au vieillissement du métabolisme énergétique par le biais de l’activation de ses cibles transcriptionnelle3.

Dans des tests biologiques, comme la mesure des concentrations de lactate et pyruvate dans les cellules, la sensibilité, précision, taille de l’échantillon et les temps d’incubation des trousses de dosage colorimétrique/fluorimétrique ont été considérablement améliorés. En raison des innovations technologiques, nous sommes maintenant en mesure d’analyser les divers métabolites et métabolites intermédiaires sans la culture à grande échelle c. elegans, qui est difficile étant donné sa petite taille. En règle générale, la sensibilité d’un test colorimétrique est un ordre de grandeur inférieur à celui d’un dosage fluorimétrique ; Toutefois, l’approche colorimétrique est plus approprié dans le cadre des laboratoires communs. En outre, une technique d’extraction contenant des précipitations d’homogénéisation et de protéine est cruciale pour la détermination quantitative des concentrations de lactate et pyruvate dans les cellules de c. elegans car ce nématode est enfermé dans un exosquelette appelé la cuticule, contrairement aux cellules de mammifères cultivées lignes4,5. Nous décrivons ici un protocole afin d’analyser les concentrations de lactate et pyruvate à l’aide de kits de dosage colorimétrique commercial notamment des conseils pour l’extraction de l’échantillon de c. elegans.

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Protocol

1. synchronisée Culture de c. elegans

  1. Avant de semer, culture l' Escherichia coli (e.coli) souche OP50 pendant une nuit à 37 ° C dans 300 mL de milieu liquide de bouillon Luria-Bertani (LB). Stocker le OP50 cultivées à-4 ° C.
    1. Pour rendre le milieu liquid du bouillon LB, utiliser 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl et 1,5 mL de NaOH N 1 et ajouter à 1 L avec de l’eau désionisée. Autoclave.
      Remarque : Les souches OP50 et c. elegans sont disponibles depuis le centre de génétique de Caenorhabditis (Université du Minnesota, St. Paul, MN, é.-u.).
  2. Pour rendre la gélose de nématode croissance moyenne (NGM), utiliser 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone, 17 g de gélose et 975 mL d’eau désionisée. Autoclave. Refroidir à 55 ° C, puis sterilely ajouter, dans l’ordre, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL en EtOH et 25 mL de 1 M potassium phosphate pH 6.0 à 90-Pétri mm.
    1. 1 M potassium phosphate pH 6.0, utilisez 108,3 KH2PO4 et 46,6 g K2HPO4et ajouter eau déionisée à 1 L. Autoclave6.
  3. Étaler 1-2 mL de la OP50 cultivé sur la gélose NGM. Pour faire une fine couche de OP50, incuber les boîtes pendant une nuit à température ambiante avant d’ajouter les nématodes.
    Remarque : Les boîtes de gélose NGM à qu'op50 inoculés peuvent être conservés la température ambiante pendant 2 à 3 semaines.
  4. Ajouter au moins 100 vers sur une gélose NGM OP50, et la culture à 20 ° C jusqu’au stade adulte. Au moins trois plaques sont nécessaires.
  5. Pour collecter les oeufs dans l’utérus, transférer des hermaphrodites gravides depuis les trois NGM géloses chaque avec 5 mL de tampon de S dans un tube conique de 15 mL et laver les vers 3 fois avec 15 mL de tampon de S par centrifugation à 300 x g pendant 30 s à température ambiante.
    1. Pour faire un tampon S utiliser 5,9 g de NaCl et 50 mL de 1 M potassium phosphate pH 6.0, ajouter à 1 L avec de l’eau désionisée. Autoclave6.
  6. Dissoudre les vers dans une solution d’hypochlorite alcalin pour axenization et en vrac oeuf isolement (0,5 mL d’eau de Javel fraîche ou équivalent : 5-6 % d’hypochlorite de sodium, 0,1 mL de NaOH de 10 M, environ 4,5 mL de tampon S)6, et reposer la solution pendant 10-15 min à température de la pièce avec le mélange en les retournant.
    Remarque : Moins de 15 min, les vers adultes devraient se dissolvent, laissant une solution brumeuse d’oeufs libérés de leurs carcasses (les oeufs libérés doivent être confirmés par un microscope stéréoscopique). Au lieu de 0,1 mL de NaOH de N 10, 0,2 mL de NaOH de N 5 peut également être utilisé.
  7. Après le traitement de l’hypochlorite, laver le culot d’oeuf 3 fois avec 15 mL de tampon de S et remettre en suspension dans 5 à 6 mL de tampon de S. Éclore les oeufs libérés au cours d’une incubation durant la nuit à 20 ° C dans un tampon sans e. coli S pour une culture de l’âge-synchrone des larves de stade L1.
  8. Pour déterminer le nombre approximatif des larves de stade L1, comptez les vers à l’aide d’un microscope stéréoscopique à 10 µL de tampon de S après resuspendant les larves au moins 3 fois et calculer la moyenne. Ensuite, transférer les larves de stade L1 à cinq boîtes de gélose NGM avec OP50 (1 500-3 000 vers par plaque à l’aide d’une boîte de Pétri 90 mm) et la culture à 20 ° C jusqu'à ce qu’ils ont grandi au stade adulte jeune, quand commence l’autofécondation et quelques oeufs sont pondus (habituellement après 3 d ays).

2. extraction de la Fraction cellulaire de c. elegans

  1. Recueillir les jeunes stade adulte (animaux âgés de 5 jours) Priapula des cinq boîtes de gélose NGM avec tampon S (Figure 1 a).
    1. Pour sélectionner seulement vers vivants à l’aide de la méthode de saccharose6 pour la flottaison sur saccharose 30 % (p/v), mélanger les vers suspendu dans 3-4 mL de tampon de S avec un volume égal de saccharose glacée de 60 % (p/v) dans un tube conique de 15 mL. Tourner le tube à 1 500 x g pendant 15 s à 4 ° C et de supprimer le flottement worms dans un nouveau tube en les déplaçant au large de la paroi de la trompe avec une pipette Pasteur.
  2. Laver les vers 3 fois avec le tampon de S par centrifugation à 1 500 g pendant 30 s à 4 ° C. Vérifiez le volume humide de worms lavés après centrifugation en utilisant un embout de micropipette 1 000 µL (Figure 1 b).
  3. Ajouter les lavés vers à un volume égal de glacé 10 % (p/v) l’acide trichloracétique (TCA ; concentration finale de 5 %) pour la précipitation des protéines (Figure 1). Au lieu de TCA, acide perchlorique (PCA) ou l’acide métaphosphorique peut être utilisé.
  4. Homogénéiser les vers avec le précipitant à l’aide de 40 coups de pilon dans un homogénéisateur de Teflon (Potter-Elvehjem Meuleuse de tissu) avec une rotation jusqu'à 1 300 tr/min sur la glace.
  5. Transférer l’homogénat dans une douce microtubes de 1,5 mL avec une pipette Pasteur et laisser agir en utilisant un homogénéisateur à ultrasons pendant 3 min (3 fois de 1 min) et un cycle de fonctionnement de 20 % sur la glace.
  6. Clarifier l’homogénat par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Neutraliser les surnageants avec 4 M KOH (volume 0,25 à 10 % TCA) pendant 20 min sur la glace et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Le surnageant (comme une prise d’essai) peut être conservé à-80 ° C jusqu'à les épreuves suivantes.

3. dosage à l’aide d’un Kit de dosage colorimétrique du lactate

  1. Mesurer la concentration de lactate dans les échantillons d’essai à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique (Table des matières). Procéder aux examens recto verso pour les échantillons d’essai. Ajouter 5 ou 10 µL des échantillons essayés dans une plaque à 96 puits et régler le volume à 50 µL / puits avec le tampon Lactate fourni avec le kit.
  2. Pour la courbe d’étalonnage de lactate, diluer 100 mM L (+)-Lactate Standard à 1 mM avec tampon Lactate. Ajouter 0, 2, 4, 6, 8 et 10 µL de la 1 mM L (+)-Lactate Standard, qui est fourni avec le kit, en une série de puits.
  3. Ajouter 50 µL de réaction (contenant 46:2:2 de tampon Lactate, Lactate de mélange enzymatique et Lactate Probe dans le DMSO, anhydre ; tous les réactifs sont fournis avec le kit) ou combinaison de contrôle de fond (contenant 48 : 2 tampon Lactate et du Lactate Probe) dans chaque puits et laisser incuber à température ambiante pendant 30 à 60 min, tandis que les échantillons sont protégés de la lumière.
  4. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 570 nm en utilisant un lecteur de microplaques et soustraire l’absorbance du mélange fond contrôle de l’absorbance du mélange de la réaction.
  5. Tracer la courbe standard de lactate. Calculer les concentrations de lactate des échantillons essayés de la courbe standard de lactate.

4. pyruvate dosage à l’aide d’un Kit de dosage colorimétrique

  1. Mesurer la concentration de pyruvate dans les surnageants (échantillons) à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique (Table des matières). Procéder aux examens recto verso pour les échantillons d’essai. Ajouter 10 µL des échantillons essayés et 90 µL de réactif de travail (contenant 94:1 du mélange enzymatique et colorant réactif, qui sont fournis avec le kit) dans une plaque de 96 puits et incuber à température ambiante pendant 30 min, tandis que les échantillons sont protégés de la lumière.
  2. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 570 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
  3. Tracer la courbe standard de pyruvate. Calculer les concentrations des échantillons essayés de la courbe standard de pyruvate pyruvate.

5. protein Assay pour la normalisation avec la teneur en protéines

  1. Mesurer la concentration de protéines dans les surnageants (échantillons) à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique (Table des matières). Toutefois, cette étape n’est pas limitée à un kit de dosage, et autres approches peuvent être utilisées pour mesurer la concentration de protéine.
  2. Normaliser les valeurs de concentrations de lactate et pyruvate parmi les échantillons d’essai à l’aide de chaque concentration de protéines totales.
    Remarque : La concentration de protéines dans les échantillons d’essai est détectée suffisamment même après précipitation de protéines et est utilisée pour l’étape de la normalisation entre les échantillons.

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Representative Results

Avec les dosages colorimétriques pour la détermination quantitative des concentrations de lactate et pyruvate, nous avons démontré l’exactitude de ces tests par rapport aux précédents rapports dans c. elegans7,8. Ici, le processus de précipitation de protéines au cours de l’extraction de l’échantillon a été l’étape la plus cruciale pour générer des valeurs précises. Pour la précipitation de protéines, précipitants communs (e.g., TCA, APC, ou acide métaphosphorique) peut être utilisé pour préparer les échantillons d’essai (Figure 1). Chez c. elegans, cependant, il était nécessaire d’exécuter la précipitation des protéines au cours de l’homogénéisation vers (tableau 1). En plus de précision, ces tests ont été suffisamment sensibles pour mesurer les concentrations de lactate et pyruvate dans les petits échantillons et ont été en mesure de les détecter dans un court laps de temps (le temps d’incubation réactive des deux tests est au moins 30 min) ( Figure 2-3). En fait, nous avons présenté les données dans un récent rapport3. Ainsi, nous pouvons détecter des niveaux de lactate de modifications métaboliques liées à l’âge, indiquant que cellulaires et le rapport L/P qui en découle a diminué au cours du vieillissement et nous avons également montré que le métabolisme énergétique différent dans un mutant de cep-1 3.

Figure 1
Figure 1 . Processus d’extraction de métabolites cellulaires. (A) 1 500-3 000 vers ont été placés sur une gélose au NGM (90 mm boîte de Pétri). Extraction de worms sur cinq plaques suffisait pour les dosages colorimétriques. (B) vers prélevés dans les cinq boîtes de vers 3 000 et 1 500 par plaque sont indiqués à gauche et à droite du panneau, respectivement. Les deux volumes humides dans chaque tube de 15 mL sont < 0,5 mL, qui suffisaient pour la détection. Précipitation de protéines (C) à l’aide de 10 % TCA au cours de l’homogénéisation vers. Ajouter les vers en glacée 10 % TCA dans un homogénéisateur doit être effectué avant que les vers sont homogénéisés. Dans le cas contraire, pyruvate et lactate cellulaire ne peuvent pas être détectés dans des échantillons de test à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique (les données sont indiquées dans le tableau 1). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Profils colorimétriques de pigmentation des normes lactate à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique. (A) les puits de la plaque de 96 puits utilisée dans le test colorimétrique et une série de dilutions de la L (+)-norme de lactate. Augmentation de la concentration de lactate provoque une couleur rose plus intense. BG indique l’arrière-plan d’une sonde de lactate contre la série de dilution. (B) courbe standard de lactate pour le dosage colorimétrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Profils colorimétriques de pigmentation des normes pyruvate à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique. (A) le puits de la plaque de 96 puits en utilisant le dosage colorimétrique et des séries de dilutions du pyruvate standard. Augmentation de la concentration de pyruvate a entraîné dans une augmentation légère coloration rose. (B) courbe standard de pyruvate pour le dosage colorimétrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Échantillons pour essai Lactate (mM) Pyruvate (mM)
Protéine-précipité des échantillons pendant l’homogénéisation 3,07 ± 0,94 0.22 ± 0,08
Échantillons de protéines-précipité après homogénéisation ND ND
Cytosol intact après homogénéisation et ultracentrifugation * 1.12 0,06

Table 1. Effets de la précipitation de protéine horaires différents pour la détection de cellulaire lactate et pyruvate chez les animaux âgés de 5 jours de type sauvage N2. Les données indiquent les moyens + écart-type (SD) d’au moins trois déterminations. ND indique non détecté. Procédé d’extraction a été réalisé préalablement à l’aide d’ultracentrifugation sans précipitation de protéines.

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Discussion

Lorsque vous utilisez ces trousses de dosage colorimétrique, l’étape la plus critique dans l’extraction de l’échantillon pour détecter les cellulaire lactate et pyruvate avec précision chez c. elegans sont le processus de précipitation de protéines au cours de l’homogénéisation (Figure 1). Il n’est pas strictement nécessaire d’utiliser un homogénéisateur de téflon, autres homogénéisateurs (e.g., Dounce et coniques broyeurs de tissu, ou usines de perle) sont également adaptés à l’extraction artisanale de worms. On n’a pas détecté cellulaire lactate et pyruvate dans les échantillons de test qui ont été extraits à l’aide d’un homogénéisateur avant la précipitation des protéines. En outre, les lactate et pyruvate baissé drastiquement dans le cytosol séparé par ultracentrifugation au lieu de précipitation de protéines (tableau 1). Elles donnent à penser que l’extraction de l’échantillon est essentielle détecter des métabolites cellulaires en méthodologie biochimique à l’aide d’un nématode c. elegans. Pour la précipitation de protéines, non seulement TCA, mais aussi plusieurs autres précipitants (APC ou acide métaphosphorique) peuvent être utilisés pour la méthodologie biochimique7,9. Selon un rapport précédent, l’utilisation de TCA a entraîné la disparition d’environ 12 % du NADH dans la mesure enzymatique du pyruvate et de lactate sanguin. Par conséquent, les auteurs ont conclu que l’acide métaphosphorique 5 % doit être sélectionné comme la protéine precipitant pour le lactate et pyruvate quand utilisant enzymatique des analyses de9. Il suggère que TCA partiellement dénature les protéines, y compris de nombreuses enzymes. Cependant, nous avons n’eu aucun problème concernant les protéine précipitants lors de l’utilisation des dosages colorimétriques pour détecter de pyruvate et lactate cellulaire.

Dans cette étude, nous avons utilisé des trousses commerciales Dosage colorimétrique pour le dosage du lactate et pyruvate (Figure 2 etFigure 3 ). Leurs sensibilités et la taille des échantillons est supérieure par rapport aux trousses de dosage précédent7; C’est pourquoi, nous avons préparé les échantillons testés par extraction à une plus petite échelle et signalé les différences entre les concentrations de lactate et pyruvate cellulaires dans c. elegans3. Nous détecté une baisse liée à l’âge ratio L/P lactate et conséquente dans sauvage c. elegans et trouvé que la p53/CEP-1 a un rôle important dans l’altération liée à l’âge du métabolisme énergétique par le biais de l’activation de ses cibles transcriptionnelles 2 , 3. ainsi, l’analyse du métabolisme énergétique chez le nématode c. elegans produit avantageusement en raison d’utiliser les kits de dosage colorimétrique améliorée, au moins en partie.

Comme le montre la Figure 3 b, la concentration de lactate au-dessous de 2 mM ont tendance à être en effet plus importante dans ce dosage colorimétrique (pas le dosage fluorimétrique). Par conséquent, le dosage fluorimétrique peut convenir pour une mesure plus précise du lactate. Les capacités de ces trousses de dosage prend en charge les dosages colorimétriques et fluorimétrique, afin que le dosage est activée en réponse à l’appareil au laboratoire de l’utilisateur. C’est encore plus cher utiliser les kits de dosage colorimétrique commerciaux présents pour déterminer quantitativement la concentration des métabolites cellulaires. Cependant, essais peuvent être exécutées adéquatement dans les plus petits laboratoires à l’aide d’instruments communs et un lecteur spectrophotométrique.

Jusqu'à présent, il y a relativement peu de rapports en utilisant des approches biochimiques conventionnels dans un organisme modèle c. elegans, qui en général ont besoin de la culture à grande échelle de worms, comparée à celle des études génétiques5. Toutefois, les récents progrès remarquables des systèmes de dosage biologique (p. ex.., amélioration de la sensibilité et de la stabilité des trousses de dosage) rend les études utilisant le nématode c. elegans, qui est petit et se compose de moins de 1 000 cellules, plus attrayant et interprété facilement en laboratoire. Dorénavant, analyse métabolomique efficace à l’aide de la spectrométrie de masse (MS) et la chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (GC/MS) peut contribuer à réduire certains problèmes, tels que la culture à grande échelle, la sensibilité analytique et spécificité et aidera à élucider le rôle du métabolisme cellulaire des maladies humaines et vieillissement, y compris cancer10. À l’avenir, une méthodologie plus facile, comme les trousses de dosage colorimétrique, serait efficace comme outil de dépistage avant les analyses instrumentales plus précis.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention spéciale de recherche de l’Université Daito Bunka à Sumino Yanase.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit		 BioAssay
Systems		 #EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

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References

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