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Biochemistry

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Health Science, School of Sports & Health Science, Daito Bunka University, 2Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 3Department of Health Management, School of Health Study, Tokai University

Summary

Wir beschreiben eine modifizierte kleine Extraktion und Farbmetrische Assays von Laktat und Pyruvat in die Nematoden C. Elegans. Bei der Verwendung von kommerziellen Assay Kits ist die technische Entwicklung ihrer Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig. Proteinfällung Extraktion ist der wichtigste Schritt zur quantitativen Bestimmung von intrazellulären Metaboliten.

Abstract

Laktat und Pyruvat sind wichtige Zwischenprodukte der intrazellulären Energie Stoffwechselwege. Überwachung der Laktat/Pyruvat-Verhältnis in den Zellen hilft, festzustellen, ob ein Ungleichgewicht im altersbedingten Energiestoffwechsel zwischen Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung und aerobe Glykolyse. Hier zeigen wir die Nutzung von kommerziellen farbmetrischen Assay Kits für Laktat und Pyruvat bei Modellorganismus C. Elegans. Vor kurzem wurden durch die Forschung und Entwicklung von Reagenz Herstellern durchgeführt die Empfindlichkeit und Genauigkeit der kolorimetrischen/fluorimetrischen Assay Kits stark verbessert. Die verbesserte Reagenzien ermöglichten den Einsatz von kleinen Assays mit einer 96-Well-Platte in C. Elegans. Im Allgemeinen ist eine Antikörper-Test überlegen in der Empfindlichkeit einer kolorimetrischen Assay; Allerdings ist der kolorimetrischen Ansatz besser geeignet für den Einsatz im gemeinsamen Labors. Ein weiteres wichtiges Thema in diesen Tests zur quantitativen Bestimmung ist Eiweiß Niederschlag von homogenisierten C. Elegans Proben. In unserer Eiweiß Niederschlag Methode, gemeinsame Fällungsmitteln (zB., Trichloressigsäure Säure, Perchlorsäure und Metaphosphoric Säure) dienen zur Probenvorbereitung. Eine eiweißfreie Assay-Probe wird vorbereitet, indem man direkt kalt Fällungsmittel (Endkonzentration von 5 %) während der Homogenisierung.

Introduction

Laktat und Pyruvat-Konzentrationen gelten als Zwischenprodukte des Energiestoffwechsels, und beziehen sich auf die Staaten der Glykolyse, tricarboxylic Säure (TCA) Zyklus und Elektronentransport-Kette in den Zellen der aeroben Organismen. Eine Reihe von Reaktionen in Glykolyse oxidiert Glucose zu Pyruvat, das liegt am Scheideweg metabolische und Kohlenhydrate durch Glukoneogenese, Fettsäuren und Energiestoffwechsel durch Acetyl-CoA und die Aminosäure Alanin umgewandelt werden kann. Die TCA-Zyklus tritt unter das Vorhandensein von ausreichend gelöste Sauerstoff und ist von grundlegender Bedeutung für die Umwandlung von Glukose in Energie. Vor allem, die Veränderung des sekundärstoffwechsels ist ein interessantes Phänomen in dem Glykolyse überwiegend zur Energiegewinnung verwendet wird und mitochondriale Atmung, beinhaltet die TCA-Zyklus und Elektronentransport-Kette ist herunterreguliert in Säugetieren Krebs Zellen1,2. Wir zeigten kürzlich, dass die Laktatwerte und die konsequente Laktat/Pyruvat (L/P)-Verhältnis während der Alterung bei Modellorganismus Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) abgenommen. Ebenso fanden wir, dass der Säugetier-Tumorsuppressor p53 Ortholog CEP-1 in C. Elegans eine wichtige Rolle in der altersbedingten Veränderungen des Energiestoffwechsels durch die Aktivierung von seinen transkriptionelle Ziele3hat.

In biologischen Tests, wie die Messung von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen in den Zellen wurden die Empfindlichkeit, Genauigkeit, Stichprobenumfang und Inkubationszeit der kolorimetrischen/fluorimetrischen Assay Kits dramatisch verbessert. Dank technologischer Innovationen können wir analysieren verschiedene Metaboliten und Fortgeschrittene Metaboliten ohne groß angelegte Kultur von C. Elegans, was angesichts seiner geringen Größe schwierig ist. Im Allgemeinen ist die Empfindlichkeit eines farbmetrischen Assays eine Größenordnung kleiner als die eines fluorimetrischen Assays; Allerdings eignet sich der kolorimetrischen Ansatz mehr im Rahmen der gemeinsamen Labors. Außerdem ist ein Extraktiontechnik, Homogenisierung und Eiweiß Niederschlag enthält für die quantitative Bestimmung von Laktat und Pyruvat Konzentrationen in C. Elegans Zellen von entscheidender Bedeutung, da diese Nematoden in ein Exoskelett eingeschlossen ist die Kutikula, im Gegensatz zu kultivierten Säugetierzellen Linien4,5genannt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu analysieren, Laktat und Pyruvat Konzentrationen mit kommerziellen farbmetrischen Assay Kits inklusive Tipps für Probe-Extraktion von C. Elegans.

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Protocol

(1) synchronisierte Kultur von C. elegans

  1. Vor der Aussaat, Kultur Escherichia coli (E. Coli) Stamm OP50 über Nacht bei 37 ° C in 300 mL Brühe Flüssigmedium Luria-Bertani (LB). Speichern der kultivierten OP50 bei-4 ° C.
    1. LB Brühe flüssiges Medium zu machen, verwenden Sie 10 g Tryptone, Hefeextrakt 5 g, 10 g NaCl und 1,5 mL 1 N NaOH und 1 L mit entionisiertem Wasser hinzufügen. Autoklaven.
      Hinweis: OP50 und C. Elegans Stämme sind aus dem Caenorhabditis Genetik Center (Universität von Minnesota, St. Paul, MN, USA) zur Verfügung.
  2. Um Nematoden Wachstum Medium (NGM) Agar zu machen, verwenden Sie 3 g NaCl, 2,5 g Pepton, 17 g Agar und 975 mL entionisiertem Wasser. Autoklaven. Cool bis 55 ° C, dann steril hinzufügen, in Ordnung, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterin in EtOH und 25 mL 1 M Kalium Phosphat pH 6.0 in 90-mm-Petrischalen.
    1. Verwenden Sie für 1 M Kalium Phosphat pH 6.0 108,3 g KH2PO4 und 46,6 g K2HPO4und fügen Sie 1 L. Autoklaven6deionisiertes Wasser hinzu.
  3. 1-2 mL der kultivierten OP50 auf der NGM Agarplatten zu verbreiten. Um eine dünne Schicht von OP50 zu machen, inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur vor dem Hinzufügen alle Nematoden.
    Hinweis: Die NGM Agarplatten, die beimpften OP50 für 2-3 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden können.
  4. Fügen Sie mindestens 100 Würmer auf einer nährbodenplatte NGM mit OP50 und Kultur bei 20 ° C bis Erwachsenen Stadium. Mindestens drei Platten sind erforderlich.
  5. Zum Sammeln von Eiern im Mutterleibübertragen trächtigen Zwitter aus den drei NGM Agarplatten jeweils mit 5 mL S Puffer in einem 15 mL konische Röhrchen, und waschen Sie die Würmer 3 Mal mit 15 mL S Puffer mit Zentrifugation bei 300 X g für 30 s bei Raumtemperatur.
    1. Damit S Puffer, 5,9 g NaCl und 50 mL 1 M Kalium Phosphat pH 6.0 verwenden, fügen Sie zu 1 L mit entionisiertem Wasser hinzu. Autoklaven-6.
  6. Lösen sich die Würmer in einer alkalischen Hypochlorit-Lösung für Axenization und bulk-Ei-Isolierung (0,5 mL frische Bleichmittel oder äquivalent: 5-6 % Natriumhypochlorit, 0,1 mL 10 M NaOH, ca. 4,5 mL S Puffer)6, und stehen die Lösung für 10-15 min bei Raumtemperatur mit dem Mischen durch invertieren.
    Hinweis: Innerhalb von 15 Minuten, sollten Erwachsene Würmer auflösen lassen eine trübe Lösung von Eiern befreit ihre Kadaver (die befreiten Eier sollten mit einem stereoskopischen Mikroskop bestätigt werden). Anstelle von 0,1 mL 10 N NaOH kann auch 0,2 mL 5 N NaOH verwendet werden.
  7. Waschen Sie nach Hypochlorit Behandlung das Ei Pellet 3 Mal mit 15 mL S Puffer, und in 5-6 mL S Puffer aufzuwirbeln. Schlüpfen Sie die freigesetzten Eier während eine Übernachtung Inkubation bei 20 ° C in S Puffer ohne E. Coli für eine Zeit-synchrone Kultur der Phase L1-Larven.
  8. Um die ungefähre Anzahl der Phase L1-Larven bestimmen, zählen Sie die Würmer eine stereoskopische Mikroskop in 10 µL Puffer S nach resuspending der Larven mindestens 3 Mal, und berechnen Sie den Mittelwert. Dann übertragen Sie die L1-Larven Bühne auf fünf NGM Agarplatten mit OP50 (1.500-3.000 Würmer pro Platte mit einer 90-mm-Petrischale) und Kultur bei 20 ° C bis sie, die jungen Erwachsenen Stadium, gewachsen sind wenn die Selbstbefruchtung beginnt und ein paar (normalerweise nach 3 d Eier Ays).

2. Gewinnung von zellulären Anteil von C. elegans

  1. Die jungen Erwachsenen Stadium (5 Tage alte Tiere) aus den fünf NGM-Agar-Platten mit S-Puffer (Abbildung 1A) Würmer zu sammeln.
    1. Wählen Sie nur lebende Würmer mit Saccharose Methode6 für Flotation auf 30 % (w/V) Saccharose, mischen Sie die Würmer in 3-4 mL S Puffer mit ein gleiches Volumen an eiskaltem 60 % (w/V) Saccharose in einem 15 mL konische Rohr aufgehängt. Drehen Sie das Rohr auf 1.500 X g für 15 s bei 4 ° C und entfernen die schwimmende Würmer in ein frisches Gefäß indem Sie sie von der Wand des Rohres mit einer Pasteurpipette verschieben.
  2. Waschen Sie die Würmer 3 Mal mit S-Puffer durch Zentrifugation bei 1.500 X g für 30 s bei 4 ° C. Überprüfen Sie die nassen Lautstärke von gewaschenen Worms nach Zentrifugation mit einer 1.000 µL Mikropipette Spitze (Abbildung 1 b).
  3. Fügen Sie die gewaschenen Würmer auf ein gleiches Volumen an eiskaltem 10 % (w/V) Trichloressigsäure Säure (TCA; Endkonzentration von 5 %) für Proteinfällung (Abbildung 1). Anstelle von TCA kann Perchlorsäure (PCA) oder Metaphosphoric Säure verwendet werden.
  4. Die Würmer mit der Fällungsmittel mit 40 Schläge von einem Stößel in einem Teflon-Homogenisator (Potter-Elvehjem Gewebe Grinder) mit Rotation bis zu 1.300 u/min auf Eis zu homogenisieren.
  5. Das Homogenat in eine frische 1,5 mL reaktionscup mit einer Pasteurpipette übertragen und beschallen mit einem Ultraschall Homogenisator für 3 min (3 mal 1 min) mit einer Einschaltdauer von 20 % auf Eis.
  6. Klären Sie das Homogenat durch Zentrifugation bei 8.000 X g für 10 min bei 4 ° c Die Überstände mit 4 M KOH zu neutralisieren (0,25 Lautstärke auf 10 % TCA) für 20 min auf Eis und Zentrifuge bei 8.000 X g für 10 min bei 4 ° C. Der Überstand (als ein Testmuster) kann bei-80 ° C bis die folgenden Tests gespeichert werden.

3. Laktat-Test mit einer kolorimetrischen Assay Kit

  1. Messen Sie die Konzentration von Laktat in der Prüflinge mit einer kolorimetrischen Assay Kit (Table of Materials). Duplex-Untersuchungen der Prüflinge durchführen. Eine 96-Well-Platte 5 oder 10 µL der Prüflinge hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 50 µL pro Bohrloch mit dem Laktat-Assay-Puffer mit dem Kit zur Verfügung gestellt.
  2. Für die Standardkurve Laktat verdünnen 100 mM L (+)-Laktat-Standard bis 1 mM mit Testpuffer Laktat. Fügen Sie 0, 2, 4, 6, 8 und 10 µL 1 mM L (+)-Laktat-Standard, die mit dem Kit in einer Reihe von Brunnen zur Verfügung gestellt wird.
  3. Fügen Sie 50 µL Reaktion Mix (mit 46:2:2 von Laktat Testpuffer, Laktat-Enzym-Mix und Laktat-Probe in DMSO, wasserfreie; alle Reagenzien mit dem Kit bereitgestellt werden) oder Hintergrund Kontrolle Mix (mit 48:2 von Laktat Testpuffer und Laktat-Sonde) in jede Vertiefung und bei Raumtemperatur für 30-60 min inkubieren, während die Proben vor Licht geschützt sind.
  4. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 570 nm mit einer Mikrotestplatte Reader und die Extinktion des Hintergrund Kontrolle Mix aus der Extinktion der Reaktion Mischung subtrahieren.
  5. Plot der Standardkurve Laktat. Berechnen Sie die Laktat-Konzentrationen der Prüflinge aus der Standardkurve Laktat.

(4) Pyruvat Assay mit einer kolorimetrischen Assay Kit

  1. Messen Sie die Konzentration von Pyruvat in die Überstände (Prüflinge) mit einer kolorimetrischen Assay Kit (Table of Materials). Duplex-Untersuchungen der Prüflinge durchführen. Fügen Sie 10 µL der Prüflinge und 90 µL arbeiten Reagenz (mit 94:1 von Enzym-Mix und Farbstoff Reagenz, die mit dem Kit bereitgestellt werden) in eine 96-Well-Platte und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren Sie, während die Proben vor Licht geschützt sind.
  2. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 570 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
  3. Plot der Standardkurve Pyruvat. Berechnen Sie die Pyruvat-Konzentrationen der Prüflinge aus der Standardkurve Pyruvat.

5. Protein Assay für die Normalisierung mit Protein-Inhalt

  1. Messen Sie die Konzentration des Proteins in die Überstände (Prüflinge) mit einer kolorimetrischen Assay Kit (Table of Materials). Jedoch diesen Schritt beschränkt sich nicht auf ein Test-Kit, und andere Ansätze zur Messung der Konzentration des Proteins genutzt werden.
  2. Die Werte von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen unter der Prüflinge mit jeder Gesamt-Protein-Konzentration zu normalisieren.
    Hinweis: Proteinkonzentration in der Prüflinge ist ausreichend auch nach Proteinfällung erkannt und wird für die Normalisierung Schritt zwischen Proben genutzt.

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Representative Results

Die farbmetrischen Assays zeigten für die quantitative Bestimmung von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen wir die Genauigkeit dieser Tests im Vergleich zu früheren Berichten in C. Elegans7,8. Hier war der Prozess der Proteinfällung während der Probe Extraktion der wichtigste Schritt um exakte Werte zu generieren. Für Proteinfällung, gemeinsame Fällungsmitteln (zB., TCA, PCA, oder Metaphosphoric Säure) kann zur Vorbereitung der Prüflinge (Abbildung 1). In C. Eleganswar es jedoch notwendig, Proteinfällung während der Homogenisierung der Würmer (Tabelle 1) durchzuführen. Neben der Genauigkeit, diese Tests waren ausreichend empfindlich, Laktat und Pyruvat Konzentrationen in kleinen Proben zu messen und konnten sie in kurzer Zeit erkennen (die reaktiven Inkubationszeit von beiden Assays beträgt mindestens 30 min) ( Abbildung 2-3). Eigentlich haben wir die Daten in einem aktuellen Bericht3vorgestellt. So könnten wir erkennen altersbedingte Stoffwechselveränderungen, die darauf hinweist, dass zelluläre Laktat-Stufen und das konsequente L/P-Verhältnis sank während der Alterung und zeigten wir auch verschiedene Energiestoffwechsel in einem mutierten Cep-1 -3.

Figure 1
Abbildung 1 . Prozess zur Gewinnung von zellulären Metaboliten. (A) 1.500-3.000 Würmer wurden auf einer nährbodenplatte NGM (90-mm-Petrischale) gesetzt. Extraktion von Würmern auf fünf Platten war ausreichend für die farbmetrischen Assays. (B) Würmer gesammelt von den fünf Platten von 3.000 und 1.500 Würmer pro Platte sind jeweils auf der linken und rechten Seite des Panels, angegeben. Beide die nassen Bände in jedem 15-mL-Röhrchen sind < 0,5 mL, die reichten für die Erkennung. (C) Proteinfällung mit 10 % TCA während der Homogenisierung der Würmer. Hinzufügen von den Würmern ins eiskalte 10 % muss TCA in einem Homogenisator durchgeführt werden, bevor die Würmer homogenisiert werden. Andernfalls können zelluläre Laktat und Pyruvat in Proben mit einer kolorimetrischen Assay Kit (Daten sind in Tabelle 1dargestellt) erkannt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Farbmetrische Pigmentierung Muster der Laktat-Standards mittels einer kolorimetrischen Assay Kit. (A) Brunnen der 96-Well-Platte in die kolorimetrischen Probe und eine Verdünnungsreihe von L (+) verwendet-Laktat-Standard. Erhöhung der Laktatkonzentration führte zu einer intensiveren rosa Farbe. BG zeigt den Hintergrund einer Laktat-Sonde gegen die Verdünnungsreihe. (B) Laktat Standardkurve für die kolorimetrischen Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Farbmetrische Pigmentierung Muster der Pyruvat Standards mittels einer kolorimetrischen Assay Kit. (A) Brunnen der 96-Well-Platte mit der kolorimetrischen Assay und Verdünnungsreihen von Pyruvat standard. Erhöhung der Konzentration Pyruvat führte zu erhöhten leicht rosa Färbung. (B) Pyruvat Standardkurve für die kolorimetrischen Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Prüfmuster Laktat (mM) Pyruvat (mM)
Protein ausgefällt Proben während der Homogenisierung 3,07 ± 0,94 0,22 ± 0,08
Protein ausgefällt Proben nach der Homogenisierung ND ND
Intakte cytosolische Fraktion nach der Homogenisierung und Ultrazentrifugation * 1.12 0,06

Tabelle 1. Auswirkungen der Proteinfällung auf unterschiedliche Zeiten für den Nachweis der zellulären Laktat und Pyruvat in 5 Tage alten Tieren von Wildtyp N2. Daten zeigen Mittel + Standardabweichung (SD) mindestens drei Bestimmungen. ND zeigt nicht erkannte. * Die Extraktion erfolgte vorläufig mittels Ultrazentrifugation ohne Eiweiß Niederschlag.

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Discussion

Wenn Sie diese farbmetrischen Assay Kits verwenden, ist der wichtigste Schritt in der Probengewinnung zellulärer Laktat zu erkennen und Pyruvat genau in C. Elegans der Prozess der Proteinfällung während der Homogenisierung (Abbildung 1). Es ist nicht unbedingt notwendig, eine Teflon-Homogenisator als andere Homogenisatoren zu verwenden (zB., Dounce und konisch Gewebe Schleifmaschinen oder Wulst Mühlen) eignen sich auch für die kleinen Extraktion von Würmern. Wir nicht zelluläre Laktat und Pyruvat in Proben erkennen, die mit einem Homogenisator vor Proteinfällung extrahiert wurden. Darüber hinaus verringerte Laktat und Pyruvat drastisch in die cytosolische Fraktion durch Ultrazentrifugation statt Proteinfällung (Tabelle 1) getrennt. Diese legen nahe, dass die Probe-Extraktion entscheidend ist für die zellulären Metaboliten in biochemischen Methoden verwenden ein Fadenwurm C. Eleganszu erkennen. Für Proteinfällung können nicht nur TCA, sondern auch mehrere andere Fällungsmitteln (PCA oder Metaphosphoric Säure), die biochemische Methode7,9genutzt werden. Nach einem vorherigen Bericht führte die Verwendungvon TCA das Verschwinden von rund 12 % des NADH in die enzymatische Messung von Blut Laktat und Pyruvat. Daher schlossen die Autoren, dass 5 % Metaphosphoric Säure als Fällungsmittel für Laktat und Pyruvat Protein gewählt werden sollte, wenn mit enzymatischen9 Assays. Sie suggeriert, dass TCA teilweise einschließlich vieler Enzyme Proteine denaturiert. Allerdings hatten wir keine Probleme in Bezug auf das Protein Fällungsmitteln bei farbmetrischen Tests zur Erkennung von zellulären Laktat und Pyruvat.

In dieser Studie haben wir kommerzielle farbmetrischen Assay Kits zur quantitativen Bestimmung von Laktat und Pyruvat (Abbildung 2 undAbbildung 3 ). Ihre Befindlichkeiten und Stichprobengrößen waren im Vergleich zu früheren Assay Kits7überlegen; Daher wir der Prüflinge mit einem kleineren Maßstab Extraktion vorbereitet und die Unterschiede in den zellulären Laktat und Pyruvat Konzentrationen in C. Elegans3berichtet. Wir eine altersbedingte Abnahme der Laktat und daraus resultierende L/P-Verhältnis in Wildtyp C. Elegans entdeckt und festgestellt, dass p53/CEP-1 eine wichtige Rolle in der altersbedingten Veränderung des Energiestoffwechsels durch die Aktivierung der transkriptionellen Ziele hat 2 , 3. so die Analyse des Energiestoffwechsels im Fadenwurm C. Elegans vorteilhafterweise erfolgt durch die verbesserte farbmetrischen Assay Kits, mindestens im Teil mit.

Wie in Abbildung 3 bgezeigt, Laktatkonzentration unter 2 mM sind in der Tat grösser in dieser farbmetrischen Assay (nicht der fluorometrischen Assays). Daher kann der fluorometrischen Assays für eine genauere Messung von Laktat geeignet. Die Leistungsfähigkeit dieser Assay Kits unterstützen kolorimetrischen und fluorometrischen Assays, so dass der Test als Reaktion auf den Einsatz im Labor der Benutzer ausgewählt ist. Es ist immer noch teurer, die gegenwärtigen kommerziellen farbmetrischen Assay Kits zu verwenden, um quantitativ zu bestimmen, die Konzentration der zellulären Metaboliten. Jedoch können angemessen in kleineren Laboren mit gemeinsamer Instrumente und eine photometrische Platte Leser erprobt werden.

Bisher gibt es relativ wenige Berichte mit konventionellen biochemischen Ansätzen bei Modellorganismus C. Elegans, die in der Regel groß angelegte Kultur von Würmern, verglichen mit genetischen Studien5benötigen. Jedoch bemerkenswerte Fortschritte des biologischen Test Systeme (zB., Verbesserung der Sensibilität und Stabilität der Assay Kits) Studien mit der Fadenwurm C. Elegans, die ist klein und besteht aus weniger als 1.000 Zellen mehr macht attraktiv und leicht im Labor durchgeführt. Von nun an effektiven Metabolomic Analyse mittels Massenspektrometrie (MS) und Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) kann helfen, um bestimmte Probleme, wie groß angelegte Kultur, analytische Sensitivität und Spezifität, zu reduzieren und wird dazu beitragen, aufzuklären die Rolle des zellulären Stoffwechsels bei Alterung und menschliche Krankheiten einschließlich Krebs10. Mit Blick auf die Zukunft wäre einfacher Methodik, wie farbmetrischen Assay Kits, wirksam als Screening-Instrument vor präziser instrumental Analysen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch eine spezielle Research Grant Daito Bunka Universität zu Sumino Yanase finanziell unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit		 BioAssay
Systems		 #EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

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References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

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Biochemie Ausgabe 140 Caenorhabditis Elegans Energiestoffwechsel Laktat Pyruvat gemeinsame Fällungsmittel farbmetrische assay
Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

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