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Biochemistry

छोटे पैमाने पर वर्णमिति की परख Intracellular स्तनपान और पाइरूवेट में निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Health Science, School of Sports & Health Science, Daito Bunka University, 2Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 3Department of Health Management, School of Health Study, Tokai University

Summary

हम एक संशोधित छोटे पैमाने पर निष्कर्षण और निमेटोड सी एलिगेंस में स्तनपान और पाइरूवेट की वर्णमिति परख का वर्णन । जब वाणिज्यिक परख किट, उनकी संवेदनशीलता और सटीकता के तकनीकी विकास का उपयोग महत्वपूर्ण है । निष्कर्षण में प्रोटीन वर्षा intracellular चयापचयों के मात्रात्मक निर्धारण के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है ।

Abstract

स्तनपान और पाइरूवेट intracellular ऊर्जा चयापचय रास्ते के प्रमुख मध्यवर्ती हैं । कोशिकाओं में स्तनपान/पाइरूवेट अनुपात की निगरानी यह निर्धारित करने में मदद करता है कि क्या mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और एरोबिक glycolysis के बीच उम्र-संबंधित ऊर्जा चयापचय में असंतुलन है । यहां, हम मॉडल जीव सी एलिगेंसमें स्तनपान और पाइरूवेट के लिए वाणिज्यिक वर्णमिति परख किट का उपयोग दिखा । हाल ही में, संवेदनशीलता और वर्णमिति/fluorimetric परख किट की सटीकता बहुत अनुसंधान और एजेंट निर्माताओं द्वारा किए गए विकास द्वारा सुधार किया गया है । सुधार रिएजेंट एक ९६- सी एलिगेंसमें अच्छी तरह से प्लेट के साथ छोटे पैमाने पर परख के उपयोग सक्षम है । सामांय में, एक fluorimetric परख एक वर्णमिति परख के लिए संवेदनशीलता में बेहतर है; तथापि, वर्णमिति दृष्टिकोण आम प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए अधिक उपयुक्त है । मात्रात्मक निर्धारण के लिए इन परख में एक अंय महत्वपूर्ण मुद्दा homogenized सी एलिगेंस नमूनों की प्रोटीन वर्षण है । हमारे प्रोटीन वर्षण विधि में, आम precipitants (जैसे, trichloroacetic एसिड, perchloric एसिड और metaphosphoric एसिड) नमूना तैयारी के लिए उपयोग किया जाता है । एक प्रोटीन मुक्त परख नमूना सीधे शीत precipitant (5%) के homogenization के दौरान अंतिम एकाग्रता जोड़ने के द्वारा तैयार किया जाता है ।

Introduction

स्तनपान और पाइरूवेट सांद्रता व्यापक रूप से ऊर्जा चयापचय के मध्यवर्ती के रूप में माना जाता है, और glycolysis, tricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र, और एरोबिक जीवों की कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के राज्यों से संबंधित हैं । पाइरूवेट के लिए glycolysis ऑक्सीकरण ग्लूकोज में प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला है, जो एक चयापचय चौराहे पर निहित है और gluconeogenesis के माध्यम से कार्बोहाइड्रेट के लिए परिवर्तित किया जा सकता, फैटी एसिड और ऊर्जा चयापचय के माध्यम से एसिटाइल-CoA, और एमिनो एसिड alanine के लिए. टीसीए चक्र पर्याप्त भंग ऑक्सीजन की उपस्थिति के तहत होता है और ग्लूकोज के लिए ऊर्जा के रूपांतरण के लिए मौलिक है. विशेष रूप से, माध्यमिक चयापचय के परिवर्तन एक दिलचस्प घटना है जिसमें glycolysis ऊर्जा उत्पादन और एरोबिक mitochondrial श्वसन, जो टीसीए चक्र और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला शामिल है के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया जाता है, downregulated है स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं में1,2. हम हाल ही में पता चला कि स्तनपान का स्तर और फलस्वरूप स्तनपान/पाइरूवेट (एल/पी) मॉडल जीव Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) में उंर बढ़ने के दौरान अनुपात में कमी आई । इसी तरह हमने पाया कि स्तनधारी ट्यूमर शमनकर्ता p53 ortholog वयक-१ में सी. एलिगेंस ने अपने transcriptional लक्ष्य३के सक्रियण के माध्यम से ऊर्जा चयापचय के आयु संबंधी बदलावों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है.

जैविक परख में, ऐसे स्तनपान और कोशिकाओं में पाइरूवेट सांद्रता की माप के रूप में, संवेदनशीलता, सटीकता, नमूना आकार, और वर्णमिति/fluorimetric परख किट की मशीन समय नाटकीय रूप से सुधार किया गया है । प्रौद्योगिकीय नवाचारों के कारण अब हम सी. एलिगेंसकी बड़े पैमाने पर संस्कृति के बिना विभिन्न चयापचयों और मध्यवर्ती चयापचयों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं, जो अपने छोटे आकार दिया मुश्किल है । सामांय में, एक वर्णमिति परख की संवेदनशीलता एक fluorimetric परख की तुलना में छोटे परिमाण के एक आदेश है; हालांकि, वर्णमिति दृष्टिकोण आम प्रयोगशालाओं की सेटिंग में अधिक उपयुक्त है । इसके अलावा, एक निष्कर्षण homogenization और प्रोटीन वर्षा युक्त तकनीक सी. एलिगेंस कोशिकाओं में स्तनपान और पाइरूवेट सांद्रता के मात्रात्मक निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह निमेटोड एक exoskeleton में संलग्न है छल्ली बुलाया, स्तनधारी के विपरीत प्रसंस्कृत सेल लाइनों4,5। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए स्तनपान और पाइरूवेट सी एलिगेंससे नमूना निष्कर्षण के लिए सुझावों सहित वाणिज्यिक वर्णमिति परख किट का उपयोग कर सांद्रता का विश्लेषण ।

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Protocol

1. सी. एलिगेंस की सिंक्रनाइज़ संस्कृति

  1. बोने से पहले, संस्कृति ई कोलाई (ई. कोलाई) तनाव OP50 पर रातोंरात ३७ ° c में ३०० मिलीलीटर Luria-Bertani (पौंड) शोरबा तरल मध्यम । -4 ° c पर कल्चर्ड OP50 की दुकान ।
    1. पौंड शोरबा तरल माध्यम बनाने के लिए, tryptone के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 जी, NaCl के 10 ग्राम और 1 N NaOH के १.५ मिलीलीटर का उपयोग करें, और जल के साथ 1 L में जोड़ें । आटोक्लेव.
      नोट: OP50 और सी एलिगेंस उपभेदों Caenorhabditis आनुवंशिकी केंद्र से उपलब्ध है (मिनेसोटा विश्वविद्यालय, सेंट पॉल, MN, संयुक्त राज्य अमरीका) ।
  2. निमेटोड विकास मध्यम (NGM) बनाने के लिए, आगर के NaCl, २.५ ग्राम के peptone, आगर के 17 ग्राम और ९७५ मिलीलीटर पानी के 3 ग्राम का उपयोग करें । आटोक्लेव. ठंडा करने के लिए ५५ ° c, फिर sterilely जोड़ें, क्रम में, 1 एम MgSO4की 1 मिलीलीटर, 1 मीटर CaCl2की 1 मिलीलीटर, 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल के ेतोः में, और 25 मिलीलीटर 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट पीएच ६.० में ९०-mm पेट्री व्यंजन ।
    1. 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट पीएच ६.० के लिए, का उपयोग करें १०८.३ जी के KH2PO4 और ४६.६ g के K2HPO4, और 1 L. आटोक्लेव6करने के लिए जल जोड़ने.
  3. NGM आगर प्लेट्स पर कल्चर्ड OP50 के 1-2 मिलीलीटर फैले । OP50 की एक पतली परत बनाने के लिए, किसी भी सूत्रकृमि जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर रात भर प्लेटें ।
    नोट: NGM आगर प्लेट्स inoculated OP50 2-3 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. वयस्क अवस्था तक 20 डिग्री सेल्सियस पर OP50, और संस्कृति के साथ एक NGM आगर प्लेट पर कम से १०० कीड़े जोड़ें । तीन प्लेटों की आवश्यकता होती है ।
  5. utero मेंअंडे एकत्र करने के लिए, तीन NGM आगर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एस बफर के 5 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक प्लेटों से gravid hermaphrodites हस्तांतरण, और कीड़े धो के साथ 3 बार एस बफर के ३०० एक्स जी में केंद्रापसारक का उपयोग कर 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर ।
    1. एस बफर बनाने के लिए, NaCl के ५.९ जी और 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट पीएच ६.० की ५० मिलीलीटर का उपयोग करें, जल के साथ 1 एल करने के लिए जोड़ें । आटोक्लेव6.
  6. axenization और थोक अंडा अलगाव के लिए एक alkaline हाइपोक्लोराइट समाधान में कीड़े भंग (ताजा ब्लीच या समकक्ष की ०.५ मिलीलीटर: 5-6% सोडियम हाइपोक्लोराइट, ०.१ मिलीलीटर की 10 एम NaOH, एस बफर के लगभग ४.५ मिलीलीटर)6, और पर 10-15 मिनट के लिए समाधान खड़े हो जाओ पलटने से मिश्रण के साथ कमरे के तापमान ।
    नोट: 15 मिनट के भीतर, वयस्क कीड़े भंग करना चाहिए, अपने लावे से मुक्त अंडे का एक धुंधला समाधान छोड़ने (मुक्त अंडे एक त्रिविम माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए) । इसके बजाय ०.१ एमएल के 10 एन NaOH, ०.२ एमएल के 5 एन NaOH का भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  7. हाइपोक्लोराइट उपचार के बाद, अंडे की गोली 3 बार एस बफर के 15 मिलीलीटर के साथ धोने, और एस बफर के 5-6 मिलीलीटर में resuspend । L1 स्टेज लार्वा की एक उंर के तुल्यकालिक संस्कृति के लिए ई. कोलाई के बिना एस बफर में 20 डिग्री सेल्सियस पर एक रात में मशीन के दौरान जारी अंडे हैच ।
  8. L1 स्टेज लार्वा की अनुमानित संख्या का निर्धारण करने के लिए, कीड़े कम से resuspend करने के बाद एस बफर की 10 µ एल में एक त्रिविम माइक्रोस्कोप का उपयोग कर गिनती, और औसत की गणना. इसके बाद, L1 स्टेज लार्वा को पांच NGM आगर प्लेट्स में OP50 के साथ ट्रांसफर करें (९०-mm पेट्री डिश का उपयोग कर प्लेट प्रति 1500-3000 वर्म्स), और संस्कृति 20 ° c में जब तक वे युवा वयस्क अवस्था के लिए बड़े हो गए हैं, जब स्वयं निषेचन शुरू होता है और कुछ अंडे (आमतौर पर 3 डी के बाद रखी हैं ays) ।

2. C. एलिगेंस से सेलुलर अंश का निष्कर्षण

  1. एस बफर (आंकड़ा 1a) के साथ पांच NGM आगार प्लेटों से युवा वयस्क मंच (5 दिन पुराने जानवरों) कीड़े ले लीजिए ।
    1. केवल रहने वाले कीड़े का चयन करने के लिए सुक्रोज विधि6 प्लवनशीलता के लिए 30% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज पर, मिश्रण कीड़े की एक समान मात्रा के साथ एस बफर की 3-4 मिलीलीटर में निलंबित बर्फ ठंडा ६०% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज में एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस के लिए १,५०० x g पर ट्यूब स्पिन और एक ताजा ट्यूब में अस्थायी कीड़े उन्हें एक पाश्चर पिपेट के साथ ट्यूब की दीवार से चलती द्वारा हटा दें ।
  2. कीड़े धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए १,५०० x जी पर केंद्रापसारक द्वारा एस बफर के साथ 3 बार । एक १,००० µ एल micropipette टिप (आंकड़ा 1b) का उपयोग कर केंद्रापसारक के बाद धोया कीड़े के गीले मात्रा की जांच करें ।
  3. बर्फ की एक समान मात्रा के लिए धोया कीड़े जोड़ें-शीत 10% (डब्ल्यू/वी) trichloroacetic एसिड (टीसीए; प्रोटीन वर्षण के लिए 5%) की अंतिम एकाग्रता (चित्रा 1C) । टीसीए के बजाय, perchloric एसिड (पीसीए) या metaphosphoric एसिड का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. Homogenize एक Teflon homogenizer (पॉटर Elvehjem ऊतक चक्की) में एक मूसल के ४० स्ट्रोक का उपयोग precipitant के साथ कीड़े को बर्फ पर १,३०० rpm को रोटेशन के साथ ।
  5. एक पाश्चर पिपेट के साथ एक ताजा १.५ मिलीलीटर microtube में homogenate हस्तांतरण, और sonicate 3 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक homogenizer का उपयोग कर (1 मिनट के 3 बार) बर्फ पर एक 20% शुल्क चक्र के साथ ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा homogenate स्पष्ट । 4 मीटर KOH (०.२५ वॉल्यूम के लिए 10% टीसीए) के साथ supernatants को बेअसर करें बर्फ पर 20 मिनट के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant (एक परीक्षण नमूना के रूप में) पर संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c निंनलिखित परख जब तक ।

3. स्तनपान परख एक वर्णमिति परख किट का उपयोग

  1. एक वर्णमिति परख किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर परीक्षण नमूनों में स्तनपान कराने की एकाग्रता को मापने । परीक्षण नमूनों के लिए डुप्लेक्स परीक्षाएं जारी करना । एक ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए परीक्षण के नमूनों की 5 या 10 µ एल जोड़ें और ५० µ एल के लिए मात्रा को समायोजित स्तनपान परख किट के साथ प्रदान की बफर के साथ ।
  2. स्तनपान कराने के लिए मानक वक्र, पतला १०० mm L (+)-स्तनपान कराने की परख बफर के साथ 1 मिमी के लिए मानक । 0, 2, 4, 6, 8, और 1 मिमी एल के 10 µ एल जोड़ें (+)-स्तनपान मानक, जो किट के साथ प्रदान की जाती है, कुओं की एक श्रृंखला में.
  3. प्रतिक्रिया मिश्रण के ५० µ एल जोड़ें (स्तनपान परख बफर के 46:2:2 युक्त, DMSO, निर्जल में स्तनपान कराने वाले एंजाइम मिश्रण और स्तनपान कराने की जांच; सभी एजेंट किट के साथ प्रदान की जाती हैं) या पृष्ठभूमि नियंत्रण मिश्रण (युक्त 48:2 स्तनपान परख बफर और स्तनपान कराने की जांच) में एक अच्छी तरह से और 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन जबकि नमूनों प्रकाश से सुरक्षित हैं ।
  4. एक microplate रीडर का उपयोग कर ५७० एनएम पर एक अच्छी तरह से अवशोषण को मापने और प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण से पृष्ठभूमि नियंत्रण मिश्रण के अवशोषण घटाना.
  5. साजिश स्तनपान मानक वक्र । स्तनपान मानक वक्र से परीक्षण के नमूनों की स्तनपान सांद्रता की गणना ।

4. पाइरूवेट परख एक वर्णमिति परख किट का उपयोग

  1. supernatants (परीक्षण नमूनों) में पाइरूवेट की एकाग्रता को मापने के एक वर्णमिति परख किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर । परीक्षण नमूनों के लिए डुप्लेक्स परीक्षाएं जारी करना । परीक्षण के नमूनों की 10 µ एल जोड़ें और ९० µ एल वर्किंग एजेंट की (94:1 युक्त एंजाइम मिश्रण और डाई एजेंट, जो किट के साथ प्रदान की जाती हैं) में एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट और कमरे के तापमान पर गर्मी के लिए 30 मिनट जबकि नमूनों प्रकाश से सुरक्षित हैं.
  2. एक microplate रीडर का उपयोग कर ५७० एनएम पर एक अच्छी तरह से अवशोषण को मापने ।
  3. पाइरूवेट मानक वक्र प्लाट । पाइरूवेट मानक वक्र से परीक्षण नमूनों की पाइरूवेट सांद्रता की गणना ।

5. प्रोटीन सामग्री के साथ सामान्यीकरण के लिए प्रोटीन परख

  1. supernatants में प्रोटीन एकाग्रता उपाय (परीक्षण नमूनों) एक वर्णमिति परख किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर । हालांकि, इस कदम को एक परख किट तक ही सीमित नहीं है, और अंय दृष्टिकोण के लिए प्रोटीन एकाग्रता उपाय का उपयोग किया जा सकता है ।
  2. प्रत्येक कुल प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग परीक्षण नमूनों के बीच स्तनपान और पाइरूवेट सांद्रता के मूल्यों को सामान्य.
    नोट: प्रोटीन एकाग्रता परीक्षण के नमूनों में पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन वर्षण के बाद भी पता लगाया है और नमूनों के बीच सामान्य कदम के लिए उपयोग किया जाता है ।

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Representative Results

स्तनपान और पाइरूवेट सांद्रता के मात्रात्मक निर्धारण के लिए वर्णमिति परख का प्रयोग, हम इन परख की सटीकता सी. एलिगेंस7,8में पिछले रिपोर्ट के साथ तुलना में दिखाया । यहाँ, नमूना निष्कर्षण के दौरान प्रोटीन वर्षण की प्रक्रिया सटीक मूल्यों को उत्पन्न करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम था । प्रोटीन वर्षण के लिए, आम precipitants (जैसे, टीसीए, पीसीए, या metaphosphoric एसिड) परीक्षण नमूनों को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (चित्रा 1). C. एलिगेंसमें, तथापि, यह कीड़े (तालिका 1) के homogenization के दौरान प्रोटीन वर्षण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक था । सटीकता के अलावा, इन परख पर्याप्त रूप से छोटे पैमाने पर नमूनों में स्तनपान और पाइरूवेट सांद्रता को मापने के लिए संवेदनशील थे और उंहें समय की एक छोटी अवधि में पता लगाने में सक्षम थे (दोनों परख के प्रतिक्रियाशील समय से कम 30 मिनट है) ( चित्रा 2-3). वास्तव में, हम एक हाल ही में रिपोर्ट3में डेटा प्रस्तुत किया । इस प्रकार, हम उंर से संबंधित चयापचय परिवर्तन का संकेत है कि सेलुलर स्तनपान का स्तर और फलस्वरूप एल/पी अनुपात उंर बढ़ने के दौरान कमी आई है, और हम भी एक वयक-1 उत्परिवर्ती3में विभिंन ऊर्जा चयापचय दिखाया पता लगा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 . सेलुलर चयापचयों की निकासी के लिए प्रक्रिया । (A) 1500-3000 वर्म्स एक NGM आगर प्लेट (९०-mm पेट्री डिश) पर रखे गए थे । पांच प्लेटों पर कीड़े से निष्कर्षण वर्णमिति परख के लिए पर्याप्त था । (ख) ३,००० की पांच प्लेटों से एकत्र कीड़े और प्लेट प्रति १,५०० कीड़े क्रमशः पैनल के बाईं और दाईं ओर संकेत कर रहे हैं । दोनों प्रत्येक 15 मिलीलीटर ट्यूब में गीला मात्रा < ०.५ एमएल है, जो पता लगाने के लिए पर्याप्त थे । (ग) कीड़े के homogenization के दौरान 10% टीसीए का उपयोग कर प्रोटीन वर्षा । एक homogenizer में बर्फ-ठंडा 10% टीसीए में कीड़े जोड़ने से पहले कीड़े homogenized है प्रदर्शन किया जाना है । अंयथा, सेलुलर स्तनपान कराने और पाइरूवेट परीक्षण एक वर्णमिति परख किट का उपयोग कर नमूनों में नहीं पाया जा सकता है (डेटा 1 तालिकामें दिखाया गया है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . वर्णमिति स्तनपान कराने की एक वर्णमिति परख किट का उपयोग करमानकों के रंजकता पैटर्न। (क) ९६ के कुओं-अच्छी तरह से वर्णमिति परख में इस्तेमाल किया थाली, और एल के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला (+)-स्तनपान मानक । स्तनपान एकाग्रता में वृद्धि एक और अधिक तीव्र गुलाबी रंग के परिणामस्वरूप । बीजी कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के खिलाफ एक स्तनपान जांच की पृष्ठभूमि इंगित करता है । (ख) वर्णमिति परख के लिए स्तनपान मानक वक्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . वर्णमिति पाइरूवेट मानकों के रंजकता पैटर्न एक वर्णमिति परख किट का उपयोग कर। (क) ९६ के कुओं-अच्छी तरह से थाली वर्णमिति परख का उपयोग, और पाइरूवेट मानक के कमजोर पड़ने श्रृंखला । पाइरूवेट एकाग्रता की बढ़ती प्रकाश गुलाबी रंग में वृद्धि हुई । (ख) वर्णमिति परख के लिए पाइरूवेट मानक वक्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

परीक्षण के नमूने स्तनपान कराने वाली (मिमी) पाइरूवेट (मिमी)
homogenization के दौरान प्रोटीन से उपजी नमूने ३.०७ ± ०.९४ ०.२२ ± ०.०८
homogenization के बाद प्रोटीन से उपजी नमूने एन डी एन डी
homogenization और ultracentrifugation के बाद बरकरार cytosolic अंश * १.१२ ०.०६

तालिका 1. जंगली प्रकार N2 के 5 दिन पुराने जानवरों में सेलुलर स्तनपान कराने और पाइरूवेट का पता लगाने के लिए विभिन्न समय पर प्रोटीन वर्षण के प्रभाव । डेटा से संकेत मिलता है + मानक विचलन (SD) कम से कम तीन निर्धारणों का । ND इंगित करता है नहीं पाया गया । * निष्कर्षण प्रक्रिया प्रोटीन वर्षण के बिना ultracentrifugation का उपयोग कर preliminarily प्रदर्शन किया गया था ।

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Discussion

जब इन वर्णमिति परख किट, नमूना निष्कर्षण में सबसे महत्वपूर्ण कदम के उपयोग के लिए सेलुलर स्तनपान और पाइरूवेट सही में सी. एलिगेंस में homogenization के दौरान प्रोटीन वर्षण की प्रक्रिया है (चित्रा 1) । यह सख्ती से एक Teflon homogenizer का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है, अन्य homogenizers के रूप में (जैसे, Dounce और पतला ऊतक चक्की, या मनका मिल्स) भी कीड़े के छोटे पैमाने पर निष्कर्षण के लिए अनुकूल हैं. हम सेलुलर स्तनपान और परीक्षण नमूनों कि प्रोटीन वर्षण से पहले एक homogenizer का उपयोग कर निकाला गया में पाइरूवेट का पता नहीं लगा । इसके अलावा, दोनों स्तनपान और पाइरूवेट के स्तर cytosolic अंश में काफी कमी आई ultracentrifugation के बजाय प्रोटीन वर्षण (तालिका 1) का उपयोग कर अलग । ये सुझाव है कि नमूना निष्कर्षण एक निमेटोड सी एलिगेंसका उपयोग कर जैव रासायनिक पद्धति में सेलुलर चयापचयों का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रोटीन वर्षण के लिए, न केवल टीसीए लेकिन यह भी कई अन्य precipitants (पीसीए या metaphosphoric एसिड) जैव रासायनिक पद्धति7,9करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । एक पिछली रिपोर्ट के अनुसार, टीसीए के प्रयोग से रक्त स्तनपान और पाइरूवेट के एंजाइमी मापन में नध के लगभग 12% के गायब होने का परिणाम हुआ. इसलिए, लेखक निष्कर्ष निकाला कि 5% metaphosphoric एसिड दोनों स्तनपान और पाइरूवेट जब एंजाइमी परख9का उपयोग कर के लिए प्रोटीन precipitant के रूप में चुना जाना चाहिए । यह पता चलता है कि टीसीए आंशिक रूप से कई एंजाइमों सहित प्रोटीन स्वभाव । हालांकि, हम कोई प्रोटीन precipitants के बारे में समस्या थी जब वर्णमिति परख का उपयोग करने के लिए सेलुलर स्तनपान और पाइरूवेट का पता लगाने ।

इस अध्ययन में, हम स्तनपान और पाइरूवेट (चित्रा 2 औरचित्रा 3 ) के मात्रात्मक निर्धारण के लिए वाणिज्यिक वर्णमिति परख किट का इस्तेमाल किया । उनके संवेदनशीलता और नमूना आकार पिछले परख7किट के साथ तुलना में बेहतर थे; इसलिए, हम परीक्षण नमूने एक छोटे पैमाने पर निष्कर्षण का उपयोग कर तैयार है और सेलुलर स्तनपान और सी एलिगेंस3में पाइरूवेट सांद्रता में मतभेद की सूचना दी । हमने पाया है कि एक उंर से संबंधित कमी में स्तनपान और फलस्वरूप एल/पी अनुपात में वंय-प्रकार C. एलिगेंस और यह है कि p53/वयक-1 ने अपने transcriptional लक्ष्य के सक्रियकरण के माध्यम से ऊर्जा चयापचय के युग से संबंधित परिवर्तन में एक महत्वपूर्ण भूमिका है 2 , 3. इस प्रकार, निमेटोड C. एलिगेंस में ऊर्जा चयापचय के विश्लेषण में सुधार वर्णमिति परख किट का उपयोग करने के कारण हितकर आय, भाग में कम से कम ।

के रूप में चित्र 3 बीमें दिखाया गया है, 2 मिमी से नीचे स्तनपान एकाग्रता के लिए इस वर्णमिति परख (नहीं fluorometric परख) में वास्तव में बड़ा हो जाते हैं । इसलिए, fluorometric परख स्तनपान का एक और अधिक सटीक माप के लिए उपयुक्त हो सकता है । इन परख किट की क्षमताओं दोनों वर्णमिति और fluorometric परख का समर्थन है, ताकि परख उपयोगकर्ता की प्रयोगशाला में उपकरण के जवाब में चुना है । यह अभी भी अधिक वर्तमान वाणिज्यिक वर्णमिति परख किट का उपयोग करने के लिए मात्रात्मक सेलुलर चयापचयों की एकाग्रता निर्धारित महंगा है । हालांकि, परीक्षण पर्याप्त रूप से आम उपकरणों और एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्लेट रीडर का उपयोग कर छोटे प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है ।

अब तक, वहां अपेक्षाकृत कुछ एक मॉडल जीव सी एलिगेंस, जो आम तौर पर कीड़े की बड़े पैमाने पर संस्कृति की जरूरत में पारंपरिक जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर रिपोर्ट कर रहे हैं, आनुवंशिक अध्ययन5के साथ तुलना में । हालांकि, जैविक परख प्रणालियों की हाल ही में उल्लेखनीय प्रगति (जैसे, संवेदनशीलता और परख किट की स्थिरता के सुधार) निमेटोड C. एलिगेंस, जो छोटा है और कम से १,००० कोशिकाओं के होते है का उपयोग कर अध्ययन करता है, और अधिक प्रयोगशाला में आसानी से आकर्षक और प्रदर्शन किया । इसके बाद, प्रभावी metabolomic विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) और गैस क्रोमैटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC/एमएस) का उपयोग कर कुछ समस्याओं को कम करने में मदद कर सकते हैं, जैसे बड़े पैमाने पर संस्कृति, विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता, और विशिष्टता, और स्पष्ट करने में मदद मिलेगी उम्र बढ़ने और कैंसर सहित मानव रोगों में सेलुलर चयापचय की भूमिका10. आगे खोज, इस तरह के वर्णमिति परख किट के रूप में आसान पद्धति,, एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में प्रभावी होगा और अधिक सटीक वाद्य विश्लेषण से पहले ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम आर्थिक रूप से Daito Bunka विश्वविद्यालय से Sumino Yanase के लिए एक विशेष अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit		 BioAssay
Systems		 #EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

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References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

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जैव रसायन १४० अंक Caenorhabditis एलिगेंस ऊर्जा चयापचय स्तनपान कराने वाली पाइरूवेट आम precipitant वर्णमिति परख
छोटे पैमाने पर वर्णमिति की परख Intracellular स्तनपान और पाइरूवेट में निमेटोड <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em>
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Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N.… More

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

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