Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Health Science, School of Sports & Health Science, Daito Bunka University, 2Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 3Department of Health Management, School of Health Study, Tokai University

Summary

Vi beskriver en modifisert småskala utvinning og kolorimetrisk analyser av laktat og pyruvate i Rundormer C. elegans. Når utnytte kommersiell analyse kits, er den tekniske utviklingen av deres følsomhet og nøyaktighet viktig. Protein nedbør i utvinning er det viktigste steget for kvantitative fastsettelse av intracellulær metabolitter.

Abstract

Laktat og pyruvate er viktige intermediates av intracellulær energi metabolske veier. Overvåking laktat/pyruvate forholdet i celler bidrar til å avgjøre om det er en ubalanse i alder-relaterte energi metabolism mellom mitokondrie oxidative fosforylering og aerobic Glykolysen. Her viser vi utnyttelsen av kommersielle kolorimetrisk analysen kits for laktat og pyruvate i modellen organismen C. elegans. Nylig forbedret den sensitivitet og nøyaktigheten av kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits mye av forskning og utvikling utført av reagens produsenter. Forbedret reagensene har aktivert bruk av småskala analyser med en 96-brønns plate i C. elegans. Generelt, er en fluorimetric analysen overlegen i følsomhet en kolorimetrisk analysen; Imidlertid er kolorimetrisk tilnærmingen mer egnet for bruk i vanlige laboratorier. I disse analyser for kvantitative besluttsomhet er protein utfelling av homogenisert C. elegans prøver. I vår protein nedbør metode, felles precipitants (f.eks., Trekloredikksyre, perchloric syre og metaphosphoric syre) brukes for eksempel forberedelse. En protein-fri analysen prøven er utarbeidet av direkte legge kaldt precipitant (siste konsentrasjon på 5%) under homogenisering.

Introduction

Laktat og pyruvate konsentrasjoner er ansett som intermediates av energi metabolism, og er knyttet til USA Glykolysen, tricarboxylic syre (TCA) syklus og elektronet transportkjeden i cellene i aerobic organismer. En rekke reaksjoner i Glykolysen oksidere glukose til pyruvate, som ligger ved en metabolsk veiskille og kan konverteres karbohydrater gjennom Glukoneogenesen, fettsyrer og energi metabolisme gjennom acetyl-CoA og aminosyre alanin. TCA syklus oppstår under tilstedeværelsen av tilstrekkelig oppløst oksygen og er grunnleggende for konvertering av glukose til energi. Spesielt, endring av sekundær metabolismen er et interessant fenomen der Glykolysen brukes hovedsakelig for energiproduksjon og aerobic mitokondrie åndedrett, som innebærer TCA syklus og elektronet transportkjeden, er downregulated i pattedyr kreft celler1,2. Vi viste nylig at laktat nivåer og påfølgende laktat/pyruvate (L/P) forholdet minket i aldring i modellen organismen Caenorhabditis elegans (C. elegans). Likeledes, vi fant at pattedyr tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en viktig rolle i alder-relaterte endringer av energi metabolism gjennom aktivering av det transcriptional mål3.

I biologiske metoder, for eksempel måling av laktat og pyruvate konsentrasjoner i celler, forbedret følsomhet, nøyaktighet, utvalgsstørrelsen og inkubasjon tid kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits dramatisk. På grunn av teknologiske nyvinninger er vi nå kjøpedyktig analysere ulike metabolitter og mellomliggende metabolitter uten store kultur C. elegans, som er vanskelig gitt sin lille størrelse. Vanligvis er følsomheten til en kolorimetrisk analysen en størrelsesorden som er mindre enn en fluorimetric analysen; kolorimetrisk tilnærming er imidlertid mer egnet i innstilling felles laboratorier. Videre er en utvinning teknikk som inneholder homogenisering og protein nedbør avgjørende for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate konsentrasjoner i C. elegans celler fordi denne Rundormer er omsluttet av en ytre skjelett kalt cuticle, i motsetning til pattedyr kulturperler cellen linjer4,5. Her beskriver vi en protokoll for å analysere laktat og pyruvate konsentrasjoner bruke kommersielle kolorimetrisk analysen prosjektpakker inkludert tips for eksempel utvinning fra C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. synkronisert kultur C. elegans

  1. Før Såing, kultur Escherichia coli (E. coli) belastning OP50 over natten på 37 ° C i 300 mL av Luria-Bertani (LB) kjøttkraft flytende medium. Lagre den kultiverte OP50 på-4 ° C.
    1. For å være LB kjøttkraft flytende medium, bruk 10 g av tryptone, 5 g av gjærekstrakt, 10 g av NaCl og 1,5 mL 1 N NaOH, og legge til 1 L med deionisert vann. Autoclave.
      Merk: OP50 og C. elegans stammer er tilgjengelig fra Caenorhabditis genetikk Center (University of Minnesota, St. Paul, MN, USA).
  2. For å gjøre Rundormer vekst medium (NGM) agar, bruke 3 g av NaCl, 2.5 g av pepton, 17 g agar og 975 mL deionisert vann. Autoclave. Cool til 55 ° C, deretter sterilely legge til, i rekkefølge, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol i EtOH, og 25 mL 1 M kalium fosfat pH 6.0 i 90-mm Petri retter.
    1. For 1 M kalium fosfat pH 6.0, bruke 108.3 g KH2PO4 og 46,6 g K2HPO4og legge deionisert vann til 1 L. autoklav6.
  3. Spre 1-2 mL kulturperler OP50 på NGM agar plater. For å gjøre et tynt lag av OP50, ruge platene over natten i romtemperatur før du legger noen nematoder.
    Merk: NGM agar platene inokulerte OP50 kan lagres ved romtemperatur for 2-3 uker.
  4. Legg til minst 100 ormer på en NGM agar plate med OP50 og kultur ved 20 ° C til det voksne stadiet. Det kreves minst tre plater.
  5. For å samle egg i utero, overføre gravid hermafroditter fra tre NGM agar plater hver med 5 mL S buffer i et 15-mL konisk rør og vaske ormer 3 ganger med 15 mL S buffer ved hjelp sentrifugering på 300 x g for 30 s ved romtemperatur.
    1. For å gjøre S buffer, bruker 5.9 g NaCl og 50 mL 1 M kalium fosfat pH 6.0, kan du legge til 1 L med deionisert vann. Autoklav6.
  6. Oppløse ormer i et alkalisk hypokloritt løsning for axenization og bulk egg isolasjon (0,5 mL av fersk blekemiddel eller tilsvarende: 5-6% natriumhypokloritt, 0.1 mL 10 M NaOH, ca 4,5 mL S buffer)6, og stå løsningen for 10-15 minutter til romtemperatur med blande ved å snu.
    Merk: Innen 15 min, voksen ormer skal løses, forlate en disig løsning av egg frigjort fra sine skrotter (frigjort eggene skal bli bekreftet med stereoskopisk mikroskop). I stedet for 0,1 mL 10 N NaOH, kan 0,2 mL 5 N NaOH også brukes.
  7. Hypokloritt behandling, vaske egg pellet 3 ganger med 15 mL S buffer og resuspend i 5-6 mL S bufferen. Klekkes eggene utgitt under en overnatting inkubasjonen ved 20 ° C i S buffer uten E. coli for en alder-synkron kultur av L1 scenen larver.
  8. For å bestemme antall L1 scenen larver, teller ormer bruke stereoskopisk mikroskop i 10 µL S bufferen etter resuspending Larvene minst 3 ganger, og beregne gjennomsnittet. Deretter overføre L1 scenen Larvene til fem NGM agar plater med OP50 (1500-3000 ormer per plate med en 90 mm Petriskål) og kultur ved 20 ° C før de har vokst til ung voksen scenen, når self-fertilization begynner og noen egg lagt (vanligvis etter 3 d måter stå).

2. utvinning av mobilnettet brøkdel fra C. elegans

  1. Samle de unge voksne stadiet (5 dager gamle dyr) ormer fra fem NGM agar platene med S buffer (figur 1A).
    1. For å velge bare levende ormer bruke sukrose metode6 for flotasjon på 30% (w/v) sukrose, bland ormer suspendert i 3-4 mL S bufferen med en lik mengde iskald 60% (w/v) sukrose i et 15-mL konisk rør. Spin røret på 1500 x g 15 s på 4 ° C og fjerne flytende ormer i en fersk rør ved å flytte dem ut av røret med en Pasteur pipette.
  2. Vask ormer 3 ganger med S buffer med sentrifugering 1500 x g for 30 s på 4 ° C. Sjekk våt volumet av vasket etter sentrifugering bruker et 1000 µL brønnene tips (figur 1B).
  3. Legge til vasket ormer en lik mengde iskald 10% (w/v) Trekloredikksyre (TCA, siste konsentrasjon på 5%) for protein nedbør (figur 1 c). I stedet for TCA, kan perchloric syre (PCA) eller metaphosphoric syre brukes.
  4. Homogenize ormer med precipitant bruker 40 strøk med en støter på en Teflon homogenizer (Potter-Elvehjem vev jeksel) med rotasjon på opptil 1300 rpm på is.
  5. Overføre til homogenate i en fersk 1.5-mL microtube med en Pasteur pipette, og sonicate bruker en ultralyd homogenizer for 3 min (3 ganger i 1 min) med en 20% driftssyklus på is.
  6. Avklare homogenate med sentrifugering 8000 x g i 10 min på 4 ° C. Nøytralisere supernatants med 4 M KOH (0,25 volum 10% TCA) for 20 min på is og sentrifuge 8000 x g for 10 min på 4 ° C. Nedbryting (som en test prøve) kan lagres ved-80 ° C før de følgende analyser.

3. laktat analysen ved hjelp av en kolorimetrisk analysen Kit

  1. Måle konsentrasjonen av laktat i testprøvene bruker en kolorimetrisk analysen kit (Tabell for materiale). Utføre dobbeltsidig eksamen for testprøvene. Legg til 5 eller 10 µL for testprøvene til en 96-brønns plate og juster volumet til 50 µL per brønn med analysebuffer laktat følger med kit.
  2. For laktat standardkurven, fortynne 100 mM L (+)-laktat Standard 1 mm med laktat analysebuffer. 0, 2, 4, 6, 8 og 10 µL av 1 mM L (+)-laktat Standard, som følger med settet, i en rekke brønner.
  3. Legge til 50 µL av reaksjonen blanding (som inneholder 46:2:2 av laktat analysebuffer, laktat enzym Mix og laktat sonde i DMSO vannfri; reagenser gis med kit) eller bakgrunn kontroll blanding (som inneholder 48:2 av laktat analysebuffer og laktat sonde) i hver brønn og ruge ved romtemperatur for 30-60 minutter mens prøvene er beskyttet mot lyset.
  4. Måle absorbansen av hver brønn på 570 nm likner en microplate og trekke absorbansen bakgrunn kontroll Mix fra absorbansen av reaksjonen blanding.
  5. Tegne laktat standardkurven. Beregne laktat konsentrasjonen av testprøvene fra laktat standardkurven.

4. pyruvate analysen ved hjelp av en kolorimetrisk analysen Kit

  1. Måle konsentrasjonen av pyruvate i supernatants (test prøver) bruker en kolorimetrisk analysen kit (Tabell for materiale). Utføre dobbeltsidig eksamen for testprøvene. Legg 10 µL for testprøvene og 90 µL av arbeider reagensen (inneholder 94:1 enzym blanding og fargestoff reagens, som tilbys med kit) inn i en 96-brønns plate og ruge ved romtemperatur for 30 min mens prøvene er beskyttet mot lyset.
  2. Måle absorbansen av hver brønn på 570 nm likner en microplate.
  3. Plot pyruvate standardkurven. Beregne pyruvate konsentrasjonen av testprøvene fra pyruvate standardkurven.

5. protein analysen for normalisering med proteininnhold

  1. Måle protein konsentrasjonen i supernatants (test prøver) bruker en kolorimetrisk analysen kit (Tabell for materiale). Men dette trinnet er ikke begrenset til en analysen kit, og andre tilnærminger kan utnyttes for å måle protein konsentrasjonen.
  2. Normalisere verdiene for laktat og pyruvate blant testprøvene bruker hver totale protein konsentrasjon.
    Merk: Protein konsentrasjon i testprøvene oppdages tilstrekkelig selv etter protein nedbør og benyttes for normalisering trinn blant prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruker de kolorimetrisk analyser for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate konsentrasjoner, viste vi nøyaktigheten av disse analyser sammenlignet med tidligere rapporter i C. elegans7,8. Her var prosessen med protein nedbør i prøven utvinning det mest avgjørende skrittet å generere nøyaktige verdier. For protein nedbør, felles precipitants (f.eks., TCA, PCA, eller metaphosphoric acid) kan brukes til å forberede testprøvene (figur 1). I C. elegans, men var det nødvendig å utføre protein nedbør i løpet homogenisering av ormene (tabell 1). I tillegg til nøyaktighet, disse analyser var tilstrekkelig følsom å måle laktat og pyruvate konsentrasjoner i småskala prøver og klarte å oppdage dem i en kort periode (reaktive inkubasjon da begge analyser er minst 30 min) ( Figur 2-3). Faktisk, vi presentert dataene i en fersk rapport3. Dermed finner vi alder-relaterte metabolske forandringer som indikerer at mobilnettet laktat nivåer og påfølgende L/P forholdet minket i aldring og vi viste også forskjellige energi metabolism i en cep-1 mutant3.

Figure 1
Figur 1 . Prosessen for utvinning av mobilnettet metabolitter. (A) 1500-3000 ormer ble plassert på en NGM agar plate (90 mm Petriskål). Utvinning fra ormer på fem platene var tilstrekkelig for de kolorimetrisk analyser. (B) ormer fra fem platene av 3000 og 1500 per plate er angitt på venstre og høyre side av panelet, henholdsvis. Både våt volumene i hver 15-mL tube er < 0,5 mL, noe som var nødvendig for gjenkjenning. (C) Protein nedbør bruker 10% TCA i løpet homogenisering av ormene. Legge ormer i iskalde 10% må TCA i en homogenizer utføres før ormer er homogenisert. Ellers kan ikke mobilnettet laktat og pyruvate oppdages i test prøver ved hjelp av en kolorimetrisk analysen kit (data er vist i tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Kolorimetrisk pigmentering mønstre av laktat bruker en kolorimetrisk analysen kit. (A) brønner i 96-brønnen platen brukes i kolorimetrisk analysen og en fortynning rekke L (+)-laktat-standarden. Øker laktat konsentrasjonen resulterte i en mer intens rosa farge. BG angir bakgrunnen av en laktat sonde mot fortynning serien. (B) laktat standardkurven for kolorimetrisk analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Kolorimetrisk pigmentering mønstre av pyruvate bruker en kolorimetrisk analysen kit. (A) Wells av 96-brønns plate kolorimetrisk analysen og fortynning rekke pyruvate standard. Øke pyruvate konsentrasjon resultert i økt lys rosa farge. (B) pyruvate standardkurven for kolorimetrisk analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Test prøver Laktat (mM) Pyruvate (mM)
Protein-igangsatte prøvene i løpet homogenisering 3.07 ± 0,94 0.22 ± 0,08
Protein-igangsatte prøver etter homogenisering ND ND
Intakt cytosolic brøkdel etter homogenisering og ultracentrifugation * 1.12 0,06

Tabell 1. Effekter av protein nedbør på forskjellige timings for påvisning av mobilnettet laktat og pyruvate i 5 dager gamle dyr av vill-type N2. Data indikerer betyr + standardavviket (SD) for minst tre bestemmelser. ND angir ikke registrert. * Utpakkingen ble utført foreløpig ultracentrifugation uten protein nedbør.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når utnytte disse kolorimetrisk analysen kits, er det viktigste trinnet i prøven utvinning å oppdage mobilnettet laktat og pyruvate nøyaktig i C. elegans prosessen med protein nedbør i løpet homogenisering (figur 1). Det er ikke strengt nødvendig å bruke en Teflon homogenizer, som andre homogenizers (f.eks., Dounce og konisk vev kverner eller perle mills) er også egnet til småskala utvinning av ormer. Vi gjorde ikke merker mobilnettet laktat og pyruvate i test prøver som ble utvunnet ved hjelp av en homogenizer før protein nedbør. Videre både laktat og pyruvate sunket drastisk i cytosolic fraksjonen atskilt med ultracentrifugation i stedet for protein nedbør (tabell 1). Dette tyder på at prøven er avgjørende å oppdage mobilnettet metabolitter i biokjemiske metodikk med et Rundormer C. elegans. For protein nedbør, ikke bare TCA, men også flere andre precipitants (PCA eller metaphosphoric acid) kan benyttes til biokjemiske metode7,9. Ifølge en tidligere rapport resulterte bruk av TCA i forsvinningen av ca 12% av NADH i enzymatisk måling av blod laktat og pyruvate. Derfor forfatterne konkluderte med at 5% metaphosphoric syre må velges som protein precipitant for både laktat og pyruvate når benytter enzymatisk søk9. Det antyder at TCA delvis denatures proteiner inkludert mange enzymer. Men hadde vi ingen problemer vedrørende protein precipitants ved kolorimetrisk analyser for å oppdage mobilnettet laktat og pyruvate.

I denne studien brukte vi kommersielle kolorimetrisk analysen kits for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate (figur 2 ogFigur 3 ). Deres følsomhet og utvalgene var overlegne i forhold til forrige analysen kits7; Derfor vi forberedt testprøvene bruker en mindre skala utvinning og rapporterte forskjellene i mobilnettet laktat og pyruvate konsentrasjonen i C. elegans3. Vi fant en alder-relaterte reduksjon i laktat og påfølgende L/P forholdet i vill-type C. elegans og fant at p53/CEP-1 har en viktig rolle i alder-relaterte endring av energi metabolism gjennom aktivering av sine transcriptional mål 2 , 3. dermed analyse av energi metabolism i Rundormer C. elegans advantageously fortsetter på grunn av det forbedrede kolorimetrisk analysen kits, minst i delen.

Som vist i figur 3B, laktat konsentrasjon under 2 mM pleier å være faktisk større i denne kolorimetrisk analysen (ikke fluorometric analysen). Derfor kan fluorometric analysen være passende for en mer nøyaktig måling av laktat. Egenskapene til disse analysen pakkene støtter både kolorimetrisk og fluorometric analyser, slik at analysen er valgt som svar på apparatet i laboratorium for brukeren. Det er fortsatt dyrere å bruke den nåværende kommersielle kolorimetrisk analyse kits for å bestemme kvantitativt konsentrasjonen av mobilnettet metabolitter. Men kan studier tilstrekkelig utføres i mindre laboratorier med vanlige instrumenter og en Spektrofotometri plate leser.

Hittil, det er relativt få rapporter ved hjelp av konvensjonelle biokjemiske tilnærminger i en modell organisme C. elegans, som vanligvis må ormer, sammenlignet med genetisk studier5store kultur. Men den siste bemerkelsesverdig fremgangen av biologiske analysen systemer (f.eks., forbedring av følsomhet og stabilitet av analysen kits) gjør studier med Rundormer C. elegans, som er små og består av færre enn 1000 celler, mer attraktivt og utført i laboratoriet. Heretter, effektiv metabolomic analyse massespektrometri (MS) og gass kromatografi/massespektrometri (GC/MS) kan bidra til å redusere visse problemer, som store kultur, analytiske sensitivitet og spesifisitet, og vil bidra til å belyse rollen av cellenes stoffskifte i aldring og menneskelige sykdommer, inkludert kreft10. Ser fram, ville enklere methodology, som kolorimetrisk analysen kits, være effektiv som en screening verktøyet før mer presis instrumental analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av en spesiell forskningsstipend fra Daito Bunka University til Sumino Yanase.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit		 BioAssay
Systems		 #EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

Tags

Biokjemi problemet 140 Caenorhabditis elegans energi metabolisme laktat pyruvate vanlig precipitant kolorimetrisk analysen
Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N.… More

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter