Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Health Science, School of Sports & Health Science, Daito Bunka University, 2Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 3Department of Health Management, School of Health Study, Tokai University

Summary

Vi beskriver en modifierad småskalig utvinning och kolorimetriska analyser av laktat och pyruvat i Nematoden C. elegans. När utnyttja kommersiella assay kit, är den tekniska utvecklingen av sin känslighet och noggrannhet viktigt. Protein nederbörd i utvinning är det mest kritiska steget för kvantitativ bestämning av intracellulära metaboliter.

Abstract

Laktat och pyruvat är viktiga intermediärer av intracellulära energi metaboliska vägar. Övervakning laktat/pyruvat förhållandet i celler hjälper till att avgöra om det finns en obalans i åldersrelaterad energimetabolism mellan mitokondriell oxidativ fosforylering och aerob glykolys. Här visar vi utnyttjande av kommersiella kolorimetrisk test kit för laktat och pyruvat i modell organismen C. elegans. Nyligen, känslighet och noggrannhet av de kolorimetriska/fluorimetriskt assay Kit har förbättrats avsevärt genom forskning och utveckling som genomförs av Reagenstillverkare. Förbättrad reagenserna har aktiverat användningen av småskaliga försök med en plattan med 96 brunnar i C. elegans. I allmänhet är en fluorimetriskt analys överlägsen känslighet en kolorimetrisk test; men är den kolorimetriska metoden mer lämplig för användning i vanliga laboratorier. En annan viktig fråga i dessa analyser för kvantitativ bestämning är protein utfällning av homogeniserad C. elegans prover. I vår protein nederbörd metod, gemensamma precipitants (t.ex., triklorättiksyra, perklorsyra och metaphosphoric syra) används för provberedning. Ett protein-fria assay prov förbereds genom att direkt lägga kallt fällningsmedel (slutliga koncentration av 5%) under homogenisering.

Introduction

Laktat och pyruvat koncentrationer betraktas allmänt som intermediärer av energimetabolism, och är besläktade med påstår av glykolys, tricarboxylic syra (TCA) cykel och elektron transportkedjan i cellerna av aeroba organismer. En serie reaktioner i glykolys oxiderar glukos till Pyruvat, som ligger vid skiljevägen metabola och kan omvandlas till kolhydrater genom glukoneogenes, fettsyror och energiomsättning via acetyl-CoA och till den aminosyran alanin. TCA cykeln inträffar under närvaro av tillräckligt löst syre och är grundläggande för omvandlingen av glukos till energi. Särskilt, förändring av sekundär metabolism är ett intressant fenomen där glykolys används huvudsakligen för produktion av energi och aerob mitokondriell andning, som innebär den TCA cykeln och elektron transportkedjan, är nedreglerade i däggdjur cancer celler1,2. Vi visade nyligen att laktat nivåer och åtföljande laktat/pyruvat (L/P) förhållandet minskat under åldrandet i modell organismen Caenorhabditis elegans (C. elegans). Jämväl, Vi hittade att det däggdjur tumör suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en viktig roll i de åldersrelaterade förändringarna av energimetabolism genom aktivering av dess transkriptionell mål3.

I biologiska analyser, såsom mätning av laktat och pyruvat i celler, har den känslighet, noggrannhet, urvalsstorlek och inkubationstid av kolorimetriska/fluorimetriskt assay kit förbättrats dramatiskt. På grund av tekniska innovationer är vi nu kunna analysera olika metaboliter och mellanliggande metaboliter utan storskaliga kulturen i C. elegans, vilket är svårt med tanke på dess ringa storlek. Känsligheten hos en kolorimetrisk test är i allmänhet en storleksordning som är mindre än en fluorimetriskt analys; den kolorimetriska metoden är dock mer passande i fastställandet av gemensamma laboratorier. Dessutom är en utvinning teknik som innehåller homogenisering och protein fällning avgörande för kvantitativ bestämning av laktat och pyruvat koncentrationer i C. elegans celler eftersom denna nematod är inbakad i ett exoskelett kallas nagelband, till skillnad från odlade däggdjursceller linjerna4,5. Här beskriver vi ett protokoll för att analysera laktat och pyruvat koncentrationer med kommersiella kolorimetrisk test kit inklusive tips för provet extraktion från C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. synkroniserade kultur av C. elegans

  1. Innan sådd Sila kultur den Escherichia coli (E. coli) OP50 över natten vid 37 ° C i 300 mL Luria-Bertani (LB) buljong flytande medium. Lagra den odlade OP50 vid-4 ° C.
    1. Att göra LB buljong flytande medium, använda 10 g trypton, 5 g av jästextrakt, 10 g NaCl och 1,5 mL 1 N NaOH och Lägg till 1 L med avjoniserat vatten. Autoklav.
      Obs: Stammar OP50 och C. elegans är tillgängliga från stadens Caenorhabditis genetik (University of Minnesota, St. Paul, MN, USA).
  2. För att göra nematoder tillväxt medium (NGM) agar, använda 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 17 g agar och 975 mL avjoniserat vatten. Autoklav. Cool till 55 ° C, därefter sterilely, i ordning, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, tillsätt 1 mL av 5 mg/mL kolesterol i EtOH och 25 mL 1 M kalium fosfatbuffert pH 6.0 i 90-mm petriskålar.
    1. För 1 M kalium fosfatbuffert pH 6.0, använder 108,3 g KH2PO4 och 46,6 g K2HPO4och Tillsätt avjoniserat vatten till 1 L. autoklav6.
  3. Sprida 1-2 mL av den odlade OP50 på NGM agarplattor. För att göra ett tunt lager av OP50, inkubera plattorna över natten i rumstemperatur innan du lägger till någon nematoder.
    Obs: De NGM agarplattor inokulerade OP50 kan förvaras i rumstemperatur i 2-3 veckor.
  4. Lägg till minst 100 maskar på en NGM agarplatta med OP50 och kultur vid 20 ° C fram till vuxen scenen. Det krävs minst tre plåtar.
  5. Samla in ägg i livmodern, överföra dräktig hermafroditer från de tre NGM agarplattor varje med 5 mL S buffert i en 15 mL konisk slang och tvätta maskar 3 gånger med 15 mL S buffert med centrifugering vid 300 x g i 30 s vid rumstemperatur.
    1. För att S buffert, använda 5,9 g NaCl och 50 mL 1 M kalium fosfatbuffert pH 6.0, lägga till 1 L med avjoniserat vatten. Autoklav6.
  6. Lös upp maskar i en alkalisk hypokloritlösning för axenization och bulk ägg isolering (0,5 mL färsk blekmedel eller motsvarande: 5-6% natriumhypoklorit, 0,1 mL 10 M NaOH, cirka 4,5 mL av S buffert)6, och utmärker lösningen för 10-15 min vid rumstemperatur med blanda genom att vända.
    Obs: Inom 15 min, vuxna maskar bör lösas upp, lämnar en disig lösning av ägg befriade från deras slaktkroppar (befriade äggen bör bekräftas med stereoskopisk Mikroskop). I stället för 0,1 mL 10 N NaOH, kan 0,2 mL 5 N NaOH också användas.
  7. Efter hypoklorit behandling, tvätta ägg pelleten 3 gånger med 15 mL S buffert och resuspendera i 5-6 mL S buffert. Kläcks frisläppta äggen under en över natten inkubation vid 20 ° C i S buffert utan E. coli för en ålder-synkron kultur av L1 scenen larver.
  8. För att avgöra det ungefärliga antalet L1 scenen larver, räkna maskar med stereoskopisk Mikroskop i 10 µL S bufferten efter omblandning larverna minst 3 gånger och beräkna medelvärdet. Sedan överföra L1 scenen larverna till fem NGM agarplattor med OP50 (1.500-3.000 maskar per tallrik med en 90 mm petriskål) och kultur vid 20 ° C tills de har vuxit till unga vuxna scenen, när self-fertilization börjar och några ägg (normalt efter 3 d AYS).

2. utvinning av cellulära fraktion från C. elegans

  1. Samla de unga vuxna scenen (5 dagar gamla djur) maskar från de fem NGM agarplattor med S buffert (figur 1A).
    1. Markera endast levande maskar använder sackaros metod6 för flotation på 30% (w/v) sackaros, blanda maskar upphängd i 3-4 mL S buffert med en lika stor volym iskall 60% (w/v) sackaros i en 15 mL koniska rör. Snurra röret vid 1500 x g i 15 s vid 4 ° C och ta bort flytande maskar i en färsk röret genom att flytta dem från väggen av röret med en Pasteur-pipett.
  2. Tvätta maskar 3 gånger med S buffert genom centrifugering vid 1500 x g i 30 s vid 4 ° C. Kontrollera våta volymen av tvättade maskar efter centrifugering med en 1000 µL mikropipett spets (figur 1B).
  3. Lägga till tvättade maskar i en lika stor volym iskall 10% (w/v) triklorättiksyra (TCA; slutlig koncentration av 5%) för protein fällning (figur 1 c). Istället för TCA, kan perklorsyra (PCA) eller metaphosphoric syra användas.
  4. Homogenisera maskar med den fällningsmedel med 40 slag med en mortelstöt i en Teflon Homogenisatorer (Potter-Elvehjem vävnad kvarnen) med rotation vid upp till 1 300 rpm på is.
  5. Överför Homogenatet till en fräsch 1,5 mL mikrorör med en Pasteur-pipett och Sonikera använder ett ultraljud Homogenisatorer för 3 min (3 gånger i 1 min) med en 20% intermittens på is.
  6. Klargöra Homogenatet genom centrifugering vid 8000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Neutralisera supernatanterna med 4 M KOH (0,25 volym 10% TCA) i 20 min på is och centrifugera vid 8000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Supernatanten (som ett prov) kan lagras vid-80 ° C tills de följande analyserna.

3. laktat test med en kolorimetrisk Test-Kit

  1. Mätning av koncentrationen av laktat i proverna med en kolorimetrisk test kit (Tabell för material). Utföra dubbelsidig undersökningar för proven. Lägga till 5 eller 10 µL av proverna i en plattan med 96 brunnar och justera volymen till 50 µL per brunn med den laktat analysbuffert medföljer kitet.
  2. För laktat standardkurvan, späd 100 mM L (+)-laktat Standard till 1 mM med laktat analysbuffert. Lägg till 0, 2, 4, 6, 8 och 10 µL av 1 mM L (+)-laktat Standard, som är försedd med kit, till en serie av brunnar.
  3. Tillsätt 50 µL av reaktionsblandning (innehållande 46:2:2 laktat analysbuffert, laktat enzym Mix och laktat sond i DMSO, vattenfri; alla reagens tillhandahålls med kit) eller bakgrund kontroll Mix (innehållande 48:2 laktat analysbuffert och laktat Probe) i varje brunn och odla i rumstemperatur i 30-60 min medan proverna skyddas från ljus.
  4. Mät absorbansen hos varje brunn på 570 nm med en microplate reader och subtrahera absorbans bakgrund kontroll mixen från den reaktionsblandning absorbans.
  5. Rita laktat standardkurvan. Beräkna laktat koncentrationen av proven från laktat standardkurvan.

4. pyruvat Assay med en kolorimetrisk Test-Kit

  1. Mätning av koncentrationen av pyruvat i supernatanterna (proverna) med en kolorimetrisk test kit (Tabell för material). Utföra dubbelsidig undersökningar för proven. Tillsätt 10 µL av proven och 90 µL arbetar reagens (innehållande 94:1 enzym Mix och färgämne reagens, som medföljer satsen) i en plattan med 96 brunnar och odla i rumstemperatur i 30 min medan proverna skyddas från ljus.
  2. Mät absorbansen hos varje brunn på 570 nm med en microplate reader.
  3. Rita pyruvat standardkurvan. Beräkna pyruvat koncentrationerna av proven från pyruvat standardkurvan.

5. protein analysmetod för normalisering med proteinhalt

  1. Mät koncentrationen av protein i supernatanterna (proverna) med en kolorimetrisk test kit (Tabell för material). Dock detta steg är inte begränsad till en assay kit, och andra metoder kan användas för att mäta proteinkoncentration.
  2. Normalisera värdena av laktat och pyruvat koncentrationer bland proverna med varje total proteinkoncentration.
    Obs: Proteinkoncentration i testproverna upptäcks tillräckligt även efter protein fällning och utnyttjas för normalisering steg bland proverna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Använda de kolorimetriska analyserna för kvantitativ bestämning av laktat och pyruvat koncentrationer, visade vi riktigheten av dessa analyser jämfört med tidigare rapporter i C. elegans7,8. Här var processen av protein nederbörd under prov extraktionen det mest avgörande steget att generera korrekta värden. För protein fällning, gemensamma precipitants (t.ex., TCA, PCA, eller metaphosphoric syra) kan användas för att förbereda testproverna (figur 1). I C. elegans, men var det nödvändigt att utföra protein nederbörd under homogenisering av avmaskar (tabell 1). Utöver noggrannhet, dessa analyser var tillräckligt känsliga att mäta laktat och pyruvat koncentrationer i småskaliga prover och kunna upptäcka dem i en kort tidsperiod (reaktiv inkubationstiden för båda analyser är minst 30 min) ( Figur 2-3). Faktiskt, vi presenterade data i en senaste rapport3. Således kan vi upptäcka åldersrelaterade metabola förändringar som indikerar att cellular laktat nivåer och åtföljande L/P förhållandet minskade under åldrandet, och vi visade också olika energiomsättning i cep-1 mutant3.

Figure 1
Figur 1 . Process för utvinning av cellulära metaboliter. (A) 1.500-3.000 maskar placerades på en NGM agarplatta (90-mm petriskål). Utvinning från maskar på fem plattor var tillräckligt för kolorimetrisk analyserna. (B) maskar som samlas in från de fem plattorna av 3000 och 1.500 maskar per platta indikeras på vänster och höger sida av panelen, respektive. Båda de våta volymerna i varje 15-mL-röret är < 0.5 mL, som var tillräcklig för att upptäcka. (C) Protein nederbörd med 10% TCA under homogenisering av maskar. Lägga till maskar i iskall 10% måste TCA i en Homogenisatorer utföras innan maskarna är homogeniserad. Annars, cellulära laktat och pyruvat kan inte upptäckas i prover med en kolorimetrisk test kit (data visas i tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Kolorimetriska pigmentering mönster av laktat standarder med en kolorimetrisk test-kit. (A) brunnar i den plattan med 96 brunnar används för den kolorimetriska analysen och en utspädning serie av L (+)-laktat standard. Ökad laktat koncentrationen resulterade i en mer intensiv färg. BG visar bakgrunden av en laktat sond mot spädningsserien. (B) laktat standardkurvan för kolorimetrisk analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Kolorimetriska pigmentering mönster av pyruvat standarder med en kolorimetrisk test-kit. (A) brunnar i den plattan med 96 brunnar med kolorimetriska analys och utspädning serie av pyruvat standard. Ökande av pyruvat koncentrationen resulterade i ökad ljus rosa färg. (B) pyruvat standardkurvan för kolorimetrisk analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Testa prover Laktat (mM) Pyruvat (mM)
Protein-fällt prover under homogenisering 3,07 ± 0,94 0.22 ± 0,08
Protein-fällt prover efter homogenisering ND ND
Intakt cytosoliska bråk efter homogenisering och ultracentrifugering * 1.12 0,06

Tabell 1. Effekter av protein nederbörd på olika tidsinställningar för detektion av cellulära laktat och pyruvat i 5 dagar gamla djur av vildtyp N2. Data indikerar medel + standardavvikelsen (SD) minst tre bestämningar. ND anger inte upptäcks. * Extraktionen utfördes preliminärt med ultracentrifugering utan protein nederbörd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

När utnyttja dessa kolorimetriska assay kit, är det mest kritiska steget i provet utvinning att upptäcka cellulära laktat och pyruvat korrekt i C. elegans en process av protein nederbörd under homogenisering (figur 1). Det är inte absolut nödvändigt att använda en Teflon Homogenisatorer, som andra Homogenisatorer (t.ex., Dounce och avsmalnande vävnad slipmaskiner eller pärla mills) är också lämpade för småskalig utvinning av maskar. Vi upptäcka inte cellulära laktat och pyruvat i prover som extraherades med hjälp av en Homogenisatorer innan protein nederbörd. Dessutom både laktat och pyruvat minskat drastiskt i cytosoliskt fraktionen separerade med ultracentrifugering istället för protein nederbörd (tabell 1). Dessa tyder på att prov extraktionen är avgörande för att upptäcka de cellulära metaboliterna i biokemisk metodik med en Nematoden C. elegans. För protein fällning, inte bara TCA men också flera andra precipitants (PCA eller metaphosphoric syra) kan utnyttjas till biokemisk metodik7,9. Enligt en tidigare rapport resulterade användning av TCA i försvinnandet av cirka 12% av NADH i enzymatisk mätning av blod laktat och pyruvat. Författarna fann därför att 5% metaphosphoric syra bör väljas som protein fällningsmedel för både laktat och pyruvat när med hjälp av enzymatisk analyser9. Det antyder att TCA delvis denaturerar proteiner inklusive många enzymer. Vi hade dock inga problem angående de protein precipitants när kolorimetriska analyser för att identifiera cellulära laktat och pyruvat.

I denna studie använde vi kommersiella kolorimetrisk test kit för kvantitativ bestämning av laktat och pyruvat (figur 2 ochfigur 3 ). Deras känslighet och urvalsstorlekar var överlägsen i jämförelse med tidigare assay kit7; därför vi beredda proverna med hjälp av en mindre skala utvinning och rapporterade skillnaderna i cellulära laktat och pyruvat koncentrationerna i C. elegans3. Vi upptäckte en åldersrelaterad minskning av laktat och därav L/P förhållandet i vildtyp C. elegans och fann att den p53/CEP-1 har en viktig roll i den åldersrelaterade förändringen av energimetabolism genom aktivering av dess transkriptionell mål 2 , 3. således analysen av energimetabolism i Nematoden C. elegans med fördel intäkter på grund av de förbättra kolorimetriska assay kit, åtminstone i del.

Som visas i figur 3B, laktat koncentrationen under 2 mM tenderar att vara faktiskt större i denna kolorimetriska analys (inte fluorometric analysen). Fluorometric analysen kan därför lämplig för en mer exakt mätning av laktat. Funktionerna i dessa assay kit stöder både färgläge och fluorometric analyser, så att analysen är markerad som svar på apparaten i laboratorium av användaren. Är det fortfarande dyrare att använda den nuvarande kommersiella kolorimetriska analys-kit att kvantitativt bestämma koncentrationen av cellulära metaboliter. Prövningar kan dock utföras tillräckligt i mindre laboratorier som använder gemensamma instrument och en spektrofotometrisk Plattläsare.

Hittills finns det relativt få rapporter med hjälp av konventionella biokemiska metoder i modellorganism C. elegans, som vanligtvis måste den storskaliga kulturen av maskar, jämfört med genetiska studier5. Men den senaste anmärkningsvärda framstegen av biologiska test system (t.ex., förbättring av känslighet och stabilitet av assay Kit) gör studier med hjälp av Nematoden C. elegans, som är liten och består av färre än 1 000 celler, mer attraktiva och utförs enkelt i laboratoriet. Hädanefter, effektiva metabolomiska analys med hjälp av masspektrometri (MS) och gaskromatografi/masspektrometri (GC/MS) kan bidra till att minska vissa problem, såsom storskaliga kultur, Analytisk känslighet och specificitet, och hjälper till att belysa cellulär metabolism i åldrande och mänskliga sjukdomar inklusive cancer10roll. Blickar framåt, skulle enklare metod, såsom kolorimetriska assay kit, vara effektiv som en screeningmetod före exaktare instrumentella analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes ekonomiskt av en särskild forskningsanslag från Daito Bunka universitet till Sumino Yanase.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit		 BioAssay
Systems		 #EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

Tags

Biokemi fråga 140 Caenorhabditis elegans Energiomsättning laktat pyruvat gemensamma fällningsmedel kolorimetriska analys
Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N.… More

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter