Summary
Qui, presentiamo un protocollo per ottenere un ampio campo visivo (FOV) tridimensionale (3D) fluorescenza e immagine retinica OCT utilizzando una nuova piattaforma di imaging multimodale. Introdurremo l'installazione del sistema, il metodo di allineamento e i protocolli operativi. In vivo imaging sarà dimostrato, e saranno forniti risultati rappresentativi.
Abstract
Mentre la formazione immagine di fluorescenza è ampiamente usata in Oftalmologia, un'immagine retinica di tridimensionale (3D) fluorescenza ampio campo visivo (FOV) è ancora una grande sfida con state-of-the-art retinico modalità di formazione immagine perché richiederebbero z-accatastamento a compilare un dataset volumetrico. Più recente tomografia a coerenza ottica (OCT) e sistemi di angiografia (OCTA) OCT superano queste restrizioni per fornire immagini anatomiche e vascolare di tridimensionali (3D), ma la natura privo di tintura di ottobre non visualizzi perdita indicativo di vascolare disfunzione. Questo protocollo descrive un romanzo obliquo scansione laser oftalmoscopia (oSLO) tecnica che fornisce immagini retiniche fluorescenza volumetrica 3D. Il programma di installazione del sistema di imaging genera la scansione di un dispositivo di scorrimento di coda colomba obliquo e allinea il sistema di imaging finale ad un angolo di rilevare immagini a sezione trasversale fluorescente. Il sistema utilizza il metodo di scansione laser e permette quindi una facile incorporazione di ottobre come una modalità di imaging volumetrica strutturale complementare. In vivo imaging su retina del ratto è dimostrato qui. Soluzione di fluorescina è iniettato per via endovenosa per produrre l'angiografia della fluorescina volumetrica (vFA).
Introduction
Oftalmologia e visione scienza beneficiare grandemente le moderne tecniche di imaging ottiche, poiché la retina è facilmente raggiungibile con la luce. L'imaging retinico di fluorescenza è uno strumento essenziale nella diagnosi e nella gestione delle malattie vascolari corioretiniche come retinopatia diabetica (Dott) e degenerazione maculare senile (AMD), entrambi i quali sono principali cause di cecità negli Stati Uniti.
Tuttavia, è ancora difficile da acquisire un ampio campo visivo (FOV), imaging mediante fluorescenza imaging tridimensionale retinico (3D). Fotografia del fondo non ha la capacità di risoluzione di profondità e non rifiuta la luce diffusa. Di conseguenza, la miscelazione dei segnali provenienti da differenti profondità riduce la qualità dell'immagine. Oftalmoscopia di scansione laser (SLO) e confocale può SLO (cSLO) ridurre l'effetto di luce diffusa mediante gating confocale1. Tuttavia, è difficile per SLO o cSLO per acquisire un'immagine della retina umana 3D a causa del limite della loro profondità di fuoco. Ottica adattiva SLO (AOSLO) attraverso la correzione per le aberrazioni di wavefront introdotte dall'occhio umano, in grado di fornire eccellente risoluzione e contrasto. Tuttavia, AOSLO avrebbe ancora bisogno z-stacking per imaging volumetrico2. Optical coherence tomography (OCT)3 e sistemi di angiografia (OCTA) OCT superano queste restrizioni per fornire tridimensionale (3D) immagini anatomiche e vascolare4,5,6, ma la natura privo di tintura di ottobre non visualizzi perdita indicativo di disfunzione vascolare.
Questo protocollo descrive una nuova piattaforma multimodale per retinica fluorescenza volumetrica 3D imaging, vale a dire obliquo scansione laser oftalmoscopia (oSLO). In questo sistema di imaging, una scansione obliqua è generata da un dispositivo di scorrimento della coda di colomba, e un sistema di imaging finale è allineato in un angolo per rilevare la fluorescenza Croce immagini sezionali. Il sistema utilizza metodi di scansione laser, e queste tecniche permettono facile incorporazione con OCT come una modalità di imaging volumetrica strutturale complementare. La risoluzione corrente di profondità è di circa 25 µm nella retina del ratto e del campo visivo è di 30°. Essenzialmente, l'oSLO permette una versione fluorescente di OCT e contemporaneamente combinabile con OCT e OCTA sopra un grande FOV.
In questo protocollo, descriviamo il programma di installazione di oSLO, il metodo di allineamento e di costruzione, il metodo di imaging in vivo della retina del ratto e i risultati rappresentativi.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) di Boston Medical Center.
1. impostazione sistema
- Sistema di oSLO
- Utilizzare una sorgente laser di supercontinuum come la sorgente laser di sistema.
- Separare la gamma della luce visibile (450-650 nm) da gamma di lunghezza d'onda superiore (650-2000 nm) da uno specchio dicroico (DM1). Ampliano la gamma con una coppia di prismi dispersivi dopo il fascio passa attraverso un divisore di fascio di polarizzazione (PBS).
- Posto una fessura per selezionare l'intervallo di lunghezza d'onda di eccitazione (475-495 nm). Utilizzare uno specchio riflettente per riflettere il fascio filtrato torna alla coppia prisma e quindi coppia la luce in una fibra monomodale (SMF 1).
- Utilizzare uno spettrometro per confermare la selezione di lunghezza d'onda in uscita della fibra monomodale.
- Collegare la fibra monomodale a due accoppiatori di fibra ottica in cascata come mostrato nella Figura 2. Uno della porta di uscita di fibra dalla seconda fibra accoppiatore trasporta la luce per il sistema di oSLO.
- Collimare il laser prima nel sistema di oSLO.
- Deviare il laser da uno specchio di galvanometro (GM1). Relè di un secondo specchio galvanometro (GM2) di un sistema di 1:1 telescopio il laser e ulteriormente relè alla pupilla dell'occhio di un sistema di 3:1 telescopio.
- Installare uno specchio dicroico (DM2) all'interno del sistema di telescopio di 3:1 in modo da riflettere i segnali di fluorescenza.
- Montare il sistema telescopio di 3:1 e lo specchio dicroico (DM2) su un dispositivo di scorrimento di coda colomba su misura per compensare l'asse ottico e creare l'obliquo scansione illuminazione come mostrato in Figura 3. Utilizzare una pinza per controllare con precisione la lunghezza dell'offset come desiderato.
- Percorso ottico imaging di fluorescenza.
- Riflettere la fluorescenza dallo specchio dicroico e relè per il terzo specchio galvanometro de-scansione la scansione lenta.
- Inoltro alla luce di una lente obiettiva imaging di un altro sistema di 1:1 telescopio. Installare l'ottica sopra su una fase di traduzione.
Nota: Due fasi di traduzione aggiuntivi vengono installati sotto il terzo specchio galvanometro (GM3) per fornire ridondanza nei gradi di libertà per ottimizzare l'imaging.
- Montare un sistema di imaging finale su un palco che ha tre gradi di libertà (rotazione e due assi di traduzione). Utilizzare una fotocamera planare per catturare le immagini a sezione trasversale di fluorescenza.
- Utilizzare una sorgente laser di supercontinuum come la sorgente laser di sistema.
- Sistema di tomografia ottica di coerenza
- Utilizzare la stessa sorgente laser supercontinuum come la sorgente laser di sistema.
- Separare l'intervallo vicino infrarosso (NIR) (650-900 nm) dalla luce restante (650-2000 nm) un altro specchio dicroico (DM3). Utilizzare un filtro di passaggio lungo per limitare ulteriormente la larghezza di banda a 800-900 nm. Coppia il fascio in una fibra monomodale (SMF 2).
- Collegare la fibra di singolo modo per l'altra porta di ingresso degli accoppiatori fibra ottica in cascata due da combinare con l'eccitazione di oSLO blu. Orientare la luce dalla seconda porta di uscita dell'accoppiatore della fibra secondo al braccio di riferimento OCT, che ha un filtro a densità neutra variabile (VNDF), piastre di compensazione di dispersione e uno specchio riflettente.
Nota: La luce restituito dal braccio di riferimento e l'occhio ricombina presso il secondo accoppiatore di fibra ottica e viene consegnato allo spettrometro OCT per raccogliere il segnale.
- Utilizzare la stessa sorgente laser supercontinuum come la sorgente laser di sistema.
- Acquisizione dati
- Utilizzare un software di sistema di acquisizione dei dati scritti in LabVIEW e modificata dal protocollo di scansione di OCTA7,8,9,10. Per ogni B-scan, un ciclo di dovere di 80% ha visto dente con 500 gradini è uscita da una scheda di uscita analogica (AO1) per controllare la x' veloce scansione specchio, GM2.
- Attivare la videocamera di scansione riga ad ogni passo di acquisire i dati di personalizzazione di Office solo quando lo specchio è in avanti in direzione di scansione. Impostare il tempo di esposizione per la fotocamera di scansione riga per essere 17 µs.
- Per acquisire il segnale OCTA, ripetere la misurazione 5 volte nella stessa posizione B-scan.
- Impostare la frequenza di uscita AO a 100 kHz e il tasso di a-line OCT a 50 kHz. Controllare il y' specchio scansione lento, GM1, di una forma d'onda in rampa. Sincronizzare lo specchio de-scansione, GM3, con GM1 per-analizzare la scansione lenta.
- Attivare la videocamera planare da un'altra scheda di output analogico (AO2) per acquisire una sola immagine fluorescente presso ogni y' posizione. Ritagliare le dimensioni della formazione immagine o bin i pixel vicini per aumentare la velocità e la sensibilità come desiderato.
2. sistema di allineamento
- Regolare la fessura nella sorgente di luce di oSLO per selezionare la lunghezza d'onda di eccitazione blu. Utilizzare uno spettrometro per monitorare l'intervallo spettrale per essere intorno 475-490 nm.
- Regolare il dispositivo di scorrimento Monte di coda colomba per spostare l'asse ottico di ~ 5 mm. Questo si tradurrà in un offset presso la pupilla del ratto di ~1.7 mm, risultante in un angolo obliquo di ~ 15° sulla retina.
- Regolare la fase di traduzione dell'ottica di rilevazione di fluorescenza la stessa 5 mm.
- Regolare la fluorescenza finale sistema per essere ~ 30° di imaging.
- Misurare la potenza ottica utilizzando un misuratore di potenza. Assicurarsi che il potere di eccitazione blu oSLO è ≤ 0.2 mW e l'OCT laser potenza ≤ 0,8 mW, che non causerà danni retina.
Nota: Basato sullo standard ANSI, la massima esposizione permissiva (MPE) alla retina è al livello del ~ 2mW7,8 nella gamma di luce visibile. Secondo la formula di Delori et al. 9, l'errore massimo tollerato per la luce infrarossa vicino è circa due volte superiore rispetto alla luce visibile, a circa 4 mW.
3. in Vivo esperimento sugli animali
- Trasferire un topo lungo Evans maschio 12 settimane nella camera di induzione. Anestetizzare il topo con isoflurano 4,5% in ossigeno per 10 minuti con una portata di 2 L/min di un vaporizzatore di isoflurane.
- Confermare la profondità dell'anestesia, come determinato da una mancanza del riflesso di ritiro durante un pizzico interdigital.
- Dopo l'induzione, posto il ratto su un supporto di 5 assi (x, y, traduzioni di z, imbardata e beccheggio). Fornire calore supplementare di uso di un piatto riscaldato, circolazione acqua calda coperta o altro metodo adatto in un esperimento prolungato. Mantenere l'anestesia al 1,5% di surrenalectomia con una portata di 2 litri/minuti durante la restante parte dell'esperimento. Quando non si utilizza una camera di induzione con scarico attivo, la camera di induzione dovrebbe essere posta su un tavolo backdraft o del downdraft o sotto un boccaglio per pulire isoflurano.
- Dilatare la pupilla con soluzione oftalmica di Tropicamide 1% per 2 minuti. Applicare 0,5% tetracaina HCl soluzione oftalmica sull'occhio del ratto per ulteriore anestesia locale, se necessario. Tenere l'occhio idratata con lacrime artificiali commerciali almeno una volta ogni minuto durante l'esperimento.
- Iniettare sale della fluorescina (10% w/w) o FITC (10% w/w) diluito in soluzione salina sterile (0.1-0.3 mL) attraverso la vena della coda con un 1 mL siringa e un G 29 ago.
- Accendere la sorgente laser. Posto un filtro a densità neutra per attenuare la luce blu di eccitazione durante l'allineamento. Misurare la potenza della luce OCT per essere ~0.8 mW e la luce blu < 0.01 mW per evitare la formazione di cataratte.
- Avviare la modalità di scansione e allineamento del galvanometro. Regolare l'altezza della palla dell'occhio per rendere un laser fissi spot sulla cornea. Regolare la posizione dell'occhio del ratto per rendere il cerchio della pupilla approssimativamente perpendicolare al laser e compensare il laser al centro apicale dell'occhio per circa ~1.5 mm.
- Regolare ulteriormente il titolare animale finché non immagini di ottobre raggiungono una qualità ottimale. In x' direzione di scansione veloce, assicurarsi che l'immagine di B-scan trasversale appare piatto. Quando si passa alla y' lento direzione scansione, assicurarsi che l'immagine di B-scan a sezione trasversale appare inclinata, a causa della scansione obliqua.
- Rimuovere il filtro a densità neutra per l'eccitazione di luce blu e monitorare il tempo reale feed dalla fotocamera. Immagine fluorescente sezionale trasversale dovrebbe apparire visualizzando vasi sanguigni che appaiono in diverse profondità.
- Regolare la messa a fuoco della fluorescenza finale sistema per raggiungere la messa a fuoco ottima di imaging. Consentire una regolazione fine della posizione dell'occhio nel piano laterale per raggiungere una qualità immagine ottimale oSLO.
- Dopo l'allineamento, iniziare ad acquisire OCTA simultanea e l'angiografia della fluorescina volumetrica (vFA).
- Costruire immagini volumetriche per OCTA e oSLO in Matlab. Gli algoritmi sono precedentemente descritto in dettaglio10. Generare vasculatures retinica risolta in profondità di segmentazione di immagini.
- Dopo aver completato l'imaging, disattivare il laser, rilasciare l'animale e applicare una pomata oftalmica sugli occhi e poi metti l'animale in una scatola di recupero.
- Non lasciare l'animale incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale o come per politica istituzionale.
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Representative Results
Figura 4a Mostra un'immagine di OCT a sezione trasversale di una retina di ratto. Figura 4b c -4 mostrano le stesse immagini a sezione trasversale della retina di vFA OCTA e oSLO acquisito allo stesso tempo. L'oSLO consente a sezione trasversale FA analoga a OCT B-scan. In confronto a OCTA, l'immagine della sezione trasversale di oSLO vFA identifica chiaramente i vasi strato delle fibre nervose (NFL) e strato delle cellule del ganglio (GCL) e capillari in strato plexiform esterno (OPL). Figura 4 d e 4 g Visualizza lo strato superficiale dell'immagine vFA OCTA e oSLO. A differenza di OCTA, l'immagine di vFA oSLO (Figura 4 g) evita gli artefatti di movimento (strisce verticali nella Figura 4 d) utilizzando contrasto di emissione di fluorescenza. Confrontando i oSLO vFA (Figura 4e) e le immagini OCTA (Figura 4 h) all'interno dello strato intermedio della retina, i vasi verticalmente immersioni sono indicati chiaramente nell'immagine FA oSLO ma non ravvisabile in OCTA. Questo è presumibilmente perché la velocità di flusso di sangue o l'orientamento della nave influenzerà il segnale OCTA ma non il contrasto di fluorescenza di oSLO.
Figura 4f e 4i mostrare le immagini all'interno dello strato profondo capillare del plesso. Le regioni indicate dalle frecce blu in oSLO vFA hanno un migliore contrasto rispetto OCTA nel sistema vascolare. La dimensione della venula sottolineato da frecce bianche a oSLO è più grande di quello in OCTA. Nel complesso, l'immagine di vFA oSLO assomiglia la reale morfologia vascolare con più precisione OCTA, dato che non è dipendente da velocità di flusso di anima o l'orientamento della nave. Un fly-through face it da due set di dati volumetrici contemporaneamente acquisite da oSLO e OCTA sono mostrati nel Video 1.
Figura 1. Il sistema schematico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La fotografia degli accoppiatori fibra in cascata due che diretto oSLO e luce OCT. Le rotte del passo leggero sono etichettate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'installazione del supporto del coda di colomba per illuminazione obliqua. (un) il lavoro solido modello per la parte di illuminazione obliqua. (b-c) La visualizzazione ingrandita e la vista del Monte coda colomba separata. (d) la fotografia dell'installazione effettivo per la parte di illuminazione obliqua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Immagine retinica ratto acquisita da oSLO e OCTA allo stesso tempo. L'esempio di (un) l'immagine della sezione trasversale dell'OCT (b) OCTA e (c) FA di oSLO. Pannelli (d) e (g) mostrare face it OCT e FA immagini di oSLO dello strato superficiale. Gli artefatti di movimento nell'immagine OCTA è stato sottolineato dalle frecce rosse. Pannello (e) e (h) Visualizza i risultati da livello intermedio. Le posizioni dove i vasi tuffarsi giù nel livello successivo sono state precisate da frecce gialle, che sono più chiare su oSLO FA di OCTA. Pannelli (f) e (mi) Visualizza i risultati dallo strato profondo capillare dei plessi. Il contrasto di oSLO è meglio di OCTA nella regione indicata dalle frecce blu. La dimensione della venula sottolineato da frecce bianche a oSLO è più grande di quello in OCTA. Bar nella figura è 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto oSLO, una in vivo volumetrico fluorescente imaging retinico tecnica con un FOV oltre 30 °. Rispetto al ott, un attuale standard di cura imaging metodo in Oftalmologia, oSLO offre una simile capacità di imaging 3D ancora permette di contrasto di fluorescenza che OCT non è sensibile a. Il vantaggio di oSLO è che richiede solo una scansione raster e così permette la perfetta combinazione di OCT, fornendo due tecniche complementari per imaging volumetrico strutturale e fluorescente.
In questo protocollo, il punto chiave per ottenere immagini di buona qualità è la chiarezza dell'occhio del ratto. Se l'immagine di oSLO è oscurata, esaminare se c'è la formazione della cataratta. Diversi fattori quali la chetamina/xilazina anestesia, secchezza della cornea e sovraesposizione alla luce blu causerà la formazione di cataratte, che peggiorerebbe sensibilmente la qualità dell'immagine. Per prevenire la cataratta, evitare l'esposizione continua alla luce blu per più di 2 minuti; applicare la lacrima occhio artificiale almeno una volta ogni minuto per prevenire la secchezza cornea; e consentire l'occhio per almeno 30 secondi di riposo tra le sezioni imaging bloccando la luce.
Noi immaginiamo che oSLO possa influenzare notevolmente la pratica clinica di formazione immagine di fluorescenza. Abbiamo dimostrato che il potere risolutivo di profondità può eliminare efficacemente il segnale dall'esterno retinico, producendo immagini volumetriche di FA ad alto contrasto fino al singolo livello capillare, che è impossibile da ottenere con SLO convenzionale. La chiarezza di immagine notevolmente migliorata consentirebbe di rilevazione più sensibile e quantificazione di perdita capillare rottura e retinico di barriera emato-retinica, il segno distintivo della visione-minacciare l'edema macular in DR e altri coroidoretinica vascolare malattie.
Nel sistema attuale, la velocità della telecamera CCD è 20 fotogrammi al secondo, che porta a > 25 secondo tempi di acquisizione. Una fotocamera CMOS scientifica miglioreranno drammaticamente la velocità del sistema. La rilevazione di fluorescenza ha un diverso percorso ottico separato dall'illuminazione. Semplifica il sistema se utilizzando lo stesso percorso ottico per il rilevamento in futuro e illuminazione di design. In sintesi, una nuova piattaforma multimodale per volumetrico imaging retinico, vale a dire obliquo scansione laser oftalmoscopia (oSLO), è stata presentata. L'ampia FOV in vivo imaging sopra un angolo di 30 ° visione della retina del ratto utilizzando oSLO e tomografia a coerenza ottica simultanea (OCT) è stata dimostrata.
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Disclosures
Ji Yi detiene un brevetto in sospeso per oSLO. Altri autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Finanziamento è da Evans Medical foundation finanziamenti dal Boston Medical Center così come un sub-contratto da NIH 5R01CA183101, pilota di BU-CTSI concedere 1UL1TR001430, BU-Joslin programma pilota e BU-CTSI KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
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