Summary
ここでは、新規イメージングのマルチ モーダルなプラットフォームを使用して大規模な視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光と OCT 網膜像を取得するためのプロトコルを提案する.システム セットアップ、配置の方法と運用のプロトコルを紹介します。In vivoイメージングが実証されると代表の結果が提供されます。
Abstract
眼科では蛍光イメージングを用い、広い視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光網膜像はまだ z 積み重ねが必要になりますので、画像診断の最新網膜における最大の課題体積データセットをコンパイルします。新しい光コヒーレンストモグラフィ (OCT) と 10 月 (OCTA) 血管造影システム三次元 (3 D) 解剖学的血管画像を提供するためにこれらの制限を克服するが、10 月の色素フリー自然漏出血管を示すために視覚化できません。機能不全。このプロトコルでは、走査レーザー眼底検査 (オスロ) 3 D 容積蛍光眼底イメージングを提供する新しい斜めについて説明します。イメージング システムのセットアップは鳩の尾のスライダーによってスキャン斜めを生成し、蛍光断面画像を検出する角度で最終的なイメージング システムを配置します。スキャン方式、レーザーが使用され、したがって、相補的な体積構造イメージング法として 10 月の容易な組み込みを使用できます。ラット網膜のin vivoイメージングを次に紹介します。フルオレセインのソリューションは、容積血管造影 (vFA) を生成する静脈内注入されます。
Introduction
眼科・視覚科学コンピューターの近代的な光学イメージング技術網膜を光で簡単にアクセスできるので恩恵を大きく。蛍光眼底イメージングは診断とどちらの主要な米国の失明の原因糖尿病網膜症 (DR) など加齢に伴う黄斑変性症 (AMD)、網脈絡膜血管の疾患の管理に不可欠なツールです。
しかし、まだ大きな視野 (FOV)、三次元 (3 D) 網膜蛍光イメージングを用いたイメージングを取得に挑戦です。眼底写真は深さを解決する機能がないと拡散光を拒否しません。結果として、異なる深さからの信号の混合と、画質が低下します。走査レーザー眼底検査 (SLO) と共焦点ゲート1を使用して拡散した光の効果を減らす共焦点 SLO (cSLO) することができます。ただし、SLO や cSLO の焦点深度の制限のため 3 D 人間の網膜像を取得することは困難です。補償光学 SLO (AOSLO) は、人間の目によって導入された波面収差を補正することにより最高の解像度とコントラストを提供できます。ただし、AOSLO 必要があります z スタッキング体積画像2。光コヒーレンス断層法 (OCT)3と 10 月血管造影 (OCTA) システムは三次元 (3 D) 解剖学的血管画像4,5,6、色素フリー自然を提供するこれらの制限を克服します。10 月の漏出血管機能不全を示すものを視覚化できません。
このプロトコルでは、3 D 容積蛍光網膜イメージング、すなわち斜め走査レーザー眼底検査 (オスロ) の新しいマルチ モーダル プラットフォームについて説明します。イメージング システム、鳩の尾スライダーによって生成される斜めスキャンと最終的なイメージング システムは断面画像クロス蛍光を検出する角度に配置されます。システムは、スキャン方法、レーザーを使用して、これらの技術補完体積構造イメージング法として OCT を使用の容易な組み込みを許可します。現在の深さ分解能はラット網膜の約 25 μ m、ビューのフィールドは 30 °。基本的に、オスロ 10 月の蛍光バージョンができ、10 月と同時に組み合わせることができます、大きな視野でオクタ。
このプロトコルではオスロ、配置と施工法、ラット網膜の生体内イメージングの方法と代表的な結果の設定を説明します。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアおよび使用委員会 (ACUC) ボストン医療センターによって承認されています。
1. システムのセットアップ
- オスロ システム
- システムの光源としてスーパーコンティ ニウム光源を使用します。
- ダイクロイック ミラー (DM1) によって高い波長 (nm 650-2000) から可視光域 (450-650 nm) を分離します。ビーム偏光ビームスプリッター (PBS) 通過後分散プリズムのペアでスペクトルを展開します。
- 励起波長範囲 (475 495 nm) を選択するスリットを配置します。プリズム対にフィルター処理されたビームを反映し、シングル モード光ファイバー (SMF 1) に光をカップルに反射ミラーを使用します。
- 分光計を使用して、シングル モード光ファイバーの出力波長選択を確認します。
- シングル モード光ファイバーを図 2に示すように、2 つのカスケード接続された光ファイバーのカプラーに接続します。第 2 繊維のカプラーからファイバー出力ポートの 1 つはオスロ システムに光を提供します。
- オスロのシステムでレーザーをまずコリメートします。
- ガルバノ メーター ミラー (GM1) によってレーザーを偏向させます。中継 1:1 望遠鏡システムで 2 番目のガルバノ メーター ミラー (GM2) にレーザーと 3:1 望遠鏡システムによる眼の瞳に更にリレーします。
- 蛍光信号を反映する 3:1 望遠鏡システム内のダイクロイック ミラー (DM2) をインストールします。
- 光軸をオフセットし、図 3に示すように、照明をスキャン斜めにカスタマイズされた鳩の尾スライダーで 3:1 望遠鏡システムとダイクロイック ミラー (DM2) をマウントします。キャリパーを使用して、必要に応じてオフセットの長さを正確に制御します。
- 蛍光イメージング光学パス。
- ダイクロイック ミラーと遅いスキャン スキャン解除する 3 番目のガルバノ メーター ミラーへの中継による蛍光を反映してください。
- 別の 1:1 の望遠鏡システムで、イメージングの対物レンズに光を中継します。翻訳段階で上記の光学系をインストールします。
注: 3 番目のガルバノ メーター ミラー イメージングを最適化するための自由度の冗長性を提供する (GM3) 下 2 つの付加的な翻訳段階にインストールされます。
- 3 つの自由度 (回転および翻訳の 2 つの軸) は、ステージの最終的なイメージング システムをマウントします。平面のカメラを使用すると、断面の蛍光画像をキャプチャします。
- システムの光源としてスーパーコンティ ニウム光源を使用します。
- 光コヒーレンス断層撮影システム
- システムの光源として同じスーパーコンティ ニウム光源を使用します。
- 残光 (650-2000 nm) から近い赤外線 (NIR) 範囲 (650 900 nm) を別のダイクロイック ミラー (DM3) によって区切ります。ロングパス フィルターを使用して、さらに 800 〜 900 nm に帯域幅を制限します。シングル モード光ファイバー (SMF 2) にビームをカップルします。
- シングル モード光ファイバーを青いオスロ励起と結合する 2 つのカスケード接続された光ファイバーのカプラーの他の入力ポートに接続します。直接、変数減光フィルター (VNDF)、分散補償板と反射ミラーが 10 月参照アームに 2 つ目のファイバー結合器の 2 番目の出力ポートから光。
注: 参照の腕から返された光と目 2 番目の光カプラーで再結合され信号を収集する OCT 装置の開発。
- システムの光源として同じスーパーコンティ ニウム光源を使用します。
- データ集録
- LabVIEW で作成、OCTA7,8,9,10のスキャンのプロトコルから変更データ集録システム ソフトウェアを使用します。各 B-スキャン 500 ステップで歯は x を制御するアナログ出力ボード (AO1) によって出力 80% のデューティ サイクルを見た ' 高速スキャン ミラー、GM2。
- OCT のデータを取得する各ステップでライン スキャン カメラをトリガー ミラー走査方向前方の場合にのみ。17 μ s にライン スキャン カメラの露光時間を設定します。
- OCTA 信号を取得するには、同じ B スキャン場所で 5 回測定を繰り返します。
- 50 kHz では 100 kHz で AO 出力レートと 10 月、a ラインを設定します。Y を制御 ' 遅いスキャン ミラー、GM1、ランプ波形によって。解除遅いスキャンをスキャンする GM1 と重複スキャン ミラー、GM3 を同期します。
- 他のアナログ出力ボード各 y で 1 つの蛍光イメージをキャプチャする (AO2) によって平面のカメラをトリガー ' の場所。イメージのサイズをトリミングまたは bin に速度と必要に応じて感度を高めるための隣人ピクセル。
2. システムの配置
- 青色励起波長を選択するオスロ光源でスリットを調整します。分光計を使用して周りにスペクトルの範囲を監視する 475-490 nm。
- 〜 5 mm で光軸をシフトする鳩尾山スライダー調整します。これは ~1.7 mm、網膜上 ~ 15 ° の傾斜角度で生じるラット瞳孔でオフセットになります。
- 同じ 5 mm 蛍光検出光学系の翻訳段階を調整します。
- 最終的な蛍光イメージング ~ 30 ° にするシステムを調整します。
- 力計を用いた光パワーを測定します。青いオスロ励振電力が 0.2 mW と網膜の損傷を発生しません 10 月レーザー パワー 0.8 mW であることを確認します。
注: は、ANSI 規格に基づき、網膜に最大限の寛容な露出 (MPE) のレベルでは 〜 可視光域に 2 mw7,8 。Deloriらによる式によると9MPE の近赤外線は可視光に比べて約 2 倍約 4 mW。
3生体内で動物実験。
- 誘導室に 12 週間長いエバンス ラットを転送します。イソフルラン気化器によって 2 L/分の流量で 10 分間の酸素で 4.5% イソフルランとラットを麻酔します。
- すだれのピンチの中に逃避反射の欠如によって決定される麻酔の深さを確認します。
- 誘導した後に、5 軸 (x、y、z の翻訳、ヨーおよびピッチ) ホルダーにラットを配置します。加熱ステージ、循環温水毛布や長期にわたる実験で他の適切な方法の使用によって補足熱を提供します。実験の残りの部分の間に 2 リットル/分の流量で isofluorane の 1.5% で麻酔を維持します。アクティブ排気誘導室を使用していない、誘導室はバック ドラフトまたは下降テーブル上またはイソフルランを清掃するシュノーケルの下に配置必要があります。
- 2 分の 1% トロピカミド点眼液で瞳孔を散大させます。必要な場合は、追加のローカル麻酔ラットの目に 0.5% テトラカイン塩酸点眼液を適用します。実験中に少なくとも一度毎分商業人工涙液による保湿を離さない。
- フルオレセイン塩 (10%/w) や FITC を挿入 (10%/w) は滅菌生理食塩水で希釈 (0.1 0.3 mL) 1 mL で尾静脈注射器と 29 G 針。
- レーザー ソースを入れます。配置の間に青い光励起を減衰する中立的な密度のフィルターを配置します。~0.8 mW になるのに 10 月光と青い光の力を測る < 0.01 mW の白内障の形成を避けるために。
- ガルバノ スキャンと位置合わせモードを開始します。固定レーザーを角膜にスポットする目のボールの高さを調整します。~1.5 mm 程度に目の頂中央にレーザーをオフセットし、瞳孔の縁をレーザーにほぼ垂直になるようにラットの目の位置を調整します。
- さらに OCT 画像最適な品質に到達するまで動物のホルダーを調整します。X の ' 高速走査方向、断面 B スキャン画像がフラットに表示されることを確認してください。Y に切り替えるとき ' 低速走査方向、斜めの走査のために断面 B スキャン画像が傾いていることを確認します。
- 青い光励起に中立的な密度のフィルターを削除し、カメラからリアルタイムを監視します。蛍光断面画像を示す血管異なる深さで表示になります。
- 蛍光イメージング システム最適な焦点に到達するための最後のフォーカスを調整します。オスロの最適なイメージ品質に到達する横の面の目の位置の微調整を許可します。
- 整列後同時オクタと体積フルオレセイン造影 (vFA) の取得を開始します。
- OCTA の Matlab によるオスロ体積のイメージを構築します。アルゴリズムは、以前詳細10で説明します。画像の領域分割による網膜血管の深さ分解を生成します。
- イメージングを完了するとレーザーをオフにする、動物の解放、目に眼軟膏を塗ると回復ボックスに動物を配置します。
- 放置しないでください動物それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで、または施設の方針に従って。
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Representative Results
図 4 aは、ラット網膜の断面の OCT 画像を示しています。図 4b-4 cは同時取得オクタとオスロの vFA の同じ網膜の断面の画像を表示します。オスロを有効断面 FA 10 月 B-スキャンに似ています。オクタと比較してオスロ vFA の断面画像を神経線維層 (NFL) の神経節細胞層 (GCL)、血管と毛細血管外網状層 (OPL) で明確に識別します。図 4 dと4 gは、オクタとオスロの vFA イメージの浅層を示しています。異なり、オクタ、オスロ vFA イメージ (図 4 g) は蛍光発光のコントラストを利用して運動の成果物 (図 4 dの縦ストライプ) を回避できます。オスロ vFA (図 4e) および網膜の中間層内でオクタ (図 4 h) 画像を比較すると、垂直方向にダイビング船明確に示されているオスロ FA 画像 OCTA の明らかでないです。これはおそらく血の流れの速度や容器向き OCTA 信号がないオスロの蛍光のコントラストに影響しますのでです。
図 4 階と4i深い血管叢レイヤー内の画像を表示します。オスロ vFA の青い矢印で指摘した地域では、血管のオクタより良いコントラストがあります。オスロの白い矢印で指摘した動静脈血管床のサイズは OCTA のそれよりも大きいです。全体的に、オスロの vFA のイメージそれは血の流れの速度または容器の向きに依存してないので実際の血管形態に OCTA より正確に似ています。オスロとオクタから 2 つ同時に取得した体積データ セットからアン顔フライスルービデオ 1のとおりです。
図 1。システム概略します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。オスロおよび OCT 光を直接 2 つのカスケード接続された光ファイバカプラーの写真。光パスの経路が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。斜光の鳩テール マウントのセットアップ。斜光の部分 (、)、堅実な仕事のモデル。(b ・ c)拡大ビューと鳩テール マウントの別のビュー。(d) 斜照明部の実際のセットアップの写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。同時にオスロ、OCTA により獲得されるラット網膜画像。(C) と 10 月 (b) オクタ (、) 断面画像の例オスロ FA。(D) パネル、(g) はen 顔10 月浅層からオスロ FA 画像を表示します。OCTA イメージで運動の成果物は、赤い矢印で指摘されました。パネル (e) と (h) は、中間層からの結果を表示します。船は次の層に潜る場所はオスロの FA でオクタより明確である黄色の矢印によって指摘されました。パネル (f) と (私) 深い毛細血管叢層から結果が表示します。オスロのコントラストが青い矢印で指摘地域でオクタよりです。オスロの白い矢印で指摘した動静脈血管床のサイズは OCTA のそれよりも大きいです。図の棒グラフは、200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、オスロ、体内容積蛍光網膜視野 30 ° 以上でイメージングを説明しました。10 月、現在のイメージング法の眼科では、ケアの標準と比較してオスロ同様 3 D イメージング機能を提供しています、まだ蛍光コントラスト 10 月に敏感ではないことができます。オスロの利点はそれが 1 つだけラスター スキャンを必要とし、したがって構造と蛍光の体積イメージングの 2 つの相補的な技術を提供する 10 月のシームレスな組み合わせを使用できます。
このプロトコルでは良好な画像品質を取得する重要なポイントは、ネズミ目の透明度です。オスロ イメージが隠されている場合は、白内障形成があるかどうかを調べます。ケタミン ・ キシラジン麻酔、角膜乾燥、青色のライトに過剰露出などいくつかの要因は、白内障、画質大幅悪化の形成を引き起こすでしょう。白内障を防ぐためには、2 分以上の光を青に連続暴露を避ける角膜の乾燥; を防ぐために、少なくとも 1 分ごとの人工眼涙を適用します。少なくとも 30 秒間光を遮断してイメージング セクション間残りの部分に目ができます。
思い描いてオスロも大きな蛍光イメージングの臨床実践に影響を与えることができます。電源を解決する深さが外側の網膜からの信号を効果的に除去できる高コントラストな体積 FA 画像は従来の SLO を用いて得られる単一の毛細血管レベルまでを降伏私たちを示しています。劇的に改善された画像の鮮明さと血管より高感度検出と血液網膜関門混乱と網膜毛細血管漏出の定量化、DR と他の網脈絡膜のビジョンを脅かす黄斑浮腫の特徴を使用病気。
現在のシステムで CCD カメラの速度は 20 フレーム/秒につながる > 25 秒集録時間。科学的な CMOS カメラは、システムの速度を劇的に改善されます。蛍光検出は、照明から区切られた異なる光パスを持ちます。デザイン照明と検出、将来的に同じ光路を使用している場合は、システムが簡素化されます。要約すると、すなわち斜め走査レーザー眼底検査 (オスロ)、体積の眼底イメージングの新しいマルチ モーダル プラットフォームが発表されました。オスロと同時光コヒーレンストモグラフィ (OCT) を使用してラット網膜の 30 ° の視野角を生体内イメージング大きな FOV を示した。
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Disclosures
Ji 李は、オスロの保留中の特許を保持しています。他の著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
ボストン医療センターとして NIH の 5R01CA183101 からサブ契約から資金調達・ エバンス医療財団からの資金調達、1UL1TR001430、BU ジョスリン パイロット プログラムおよび BU CTSI KL2TR001411 を付与する BU CTSI パイロット。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
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