Summary
Her presenterer vi en protokoll for å få en stor synsfelt (FOV) tredimensjonale (3D) fluorescens og OCT retinal bildet ved hjelp av en roman tenkelig flere plattform. Vi vil introdusere systemoppsettet, metoden for justering og operative protokollene. I vivo bildebehandling vil bli demonstrert og representant resultatene vil bli gitt.
Abstract
Mens fluorescens imaging er mye brukt i Oftalmologi, er en stor synsfelt (FOV) tredimensjonale (3D) fluorescens retinal bildet fortsatt en stor utfordring med state-of-the-art retinal imaging modaliteter fordi de ville kreve z-stabling til kompilere volumetriske dataset. Nyere optical coherence tomografi (OCT) og OCT angiography (OCTA) systemer overvinne begrensningene for å gi tredimensjonale (3D) anatomiske og vaskulær bilder, men fargestoff-fri natur OCT kan ikke visualisere lekkasje indikativ av vaskulære dysfunksjon. Denne protokollen beskriver en roman skrå skanning laser ophthalmoscopy (oSLO)-teknikk som gir 3D volumetriske fluorescens retinal imaging. Oppsettet av tenkelig systemet genererer skrå skanning av en due hale skyveknapp og justerer det endelige tenkelig systemet i vinkel å oppdage fluorescerende cross-sectional bilder. Systemet bruker laser skanning metoden, og derfor gir en enkel inkorporering av OCT som en komplementær volumetriske strukturelle tenkelig modalitet. I vivo bildebehandling på rotte netthinnen er vist her. Fluorescein løsning injiseres intravenøst for å produsere volumetriske fluorescein angiography (vFA).
Introduction
Oftalmologi og visjon stor nytte de moderne optisk tenkelig teknikkene, siden netthinnen kan enkelt nås med lys. Fluorescens retinal imaging er et viktig verktøy i diagnostisering og behandling av chorioretinal vascular sykdommer som diabetisk retinopati (DR) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), begge er viktigste årsakene til blindhet i USA.
Det er imidlertid fortsatt utfordrende å erverve en stor synsfelt (FOV), tredimensjonale (3D) retinal imaging ved hjelp av fluorescens bildebehandling. Fundus photography har ikke dybden-løse evne og avviser ikke diffust lys. Resultatet reduserer blanding av signaler fra forskjellige dybde bildekvaliteten. Skanning laser ophthalmoscopy (SLO) og AC confocal SLO (cSLO) kan redusere effekten av lys ved hjelp av AC confocal gating1. Det er imidlertid vanskelig for SLO eller cSLO å kjøpe en 3D menneskelig retinal bildet på grunn av begrensning av deres dybde av fokus. Adaptive optikk SLO (AOSLO) gir suveren oppløsning og kontrast ved å korrigere for wavefront misforståelsene introdusert av øyet. Men må AOSLO fortsatt z-stabling for volumetriske tenkelig2. Optical coherence tomografi (OCT)3 og OCT angiography (OCTA) systemer overvinne begrensningene for å gi tredimensjonale (3D) anatomiske og vaskulær bilder4,5,6, men hvilken farge-fri av OCT kan ikke visualisere lekkasje indikativ av vaskulær dysfunksjon.
Denne protokollen beskriver en roman flere plattform for 3D volumetriske fluorescens retinal imaging, nemlig skrå skanning laser ophthalmoscopy (oSLO). I denne tenkelig system, en skrå skanning er generert av en due hale glidebryter og en siste tenkelig system er justert i en vinkel å oppdage fluorescens kryss seksjon bilder. Systemet bruker laserskanning metoder, og disse teknikkene tillater enkel inkorporering med OCT som en komplementær volumetriske strukturelle tenkelig modalitet. Nåværende dybde oppløsningen er ca 25 µm i rotte netthinnen synsfelt er 30°. Hovedsak, oSLO lar en fluorescerende versjon av OCT og samtidig kan kombineres med OCT og OCTA over en stor FOV.
I denne protokollen, vil vi beskrive oppsettet av oSLO, justering og konstruksjon, metoden i vivo avbilding av rotte netthinnen og representant resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk Committee (ACUC) av Bostons.
1. systemoppsett
- oSLO System
- Bruk en supercontinuum laser kilde som systemet laser kilde.
- Skill synlig lys området (450-650 nm) fra høyere bølgelengdeområde (650-2000 nm) med en dichroic speil (DM1). Utvide spekteret med et par dispersiv prismer etter strålen passerer gjennom en polarisering strålen splitter (PBS).
- Sted et slit å velge bølgelengdeområde eksitasjon (475-495 nm). Bruk et reflekterende speil til å reflektere filtrerte strålen tilbake til prisme paret og deretter par lyset i en enkelt modus fiber (SMF 1).
- Bruk et spektrometer for å bekrefte bølgelengde på utgangen av single-modus fiber.
- Koble single-modus fiber til to overlappende optisk fiber koblinger som vist i figur 2. En av fiber utgang fra andre fiber kabelendene leverer lyset i oSLO-systemet.
- Collimate laser først i oSLO systemet.
- Bøye laser av et galvanometer speil (GM1). Videresending av laser til en andre galvanometer speil (GM2) av 1:1 teleskop og ytterligere relé til eleven på øyet av 3:1 teleskop.
- Installere en dichroic speil (DM2) innenfor 3:1 teleskop systemet å reflektere fluorescens signaler.
- Monter 3:1 teleskop systemet og det dichroic speilet (DM2) på en tilpasset Due hale glider oppveie den optiske aksen og lage skrå skanning belysning som vist i Figur 3. Bruk en tykkelse for å kontrollere nøyaktig hvor offset som ønsket.
- Fluorescens imaging optisk bane.
- Gjenspeile fluorescens dichroic speil og videresending til tredje galvanometer speilet de skanne langsom skanning.
- Videresende en tenkelig linsen lyset av en 1:1 teleskop. Installere over optikk på en oversettelse scene.
Merk: To ekstra oversettelse dagsetapper installeres under tredje galvanometer speilet (GM3) å gi redundans i grader av frihet for å optimalisere avbilding.
- Montere en siste tenkelig system på et stadium som har tre grader av frihet (rotasjon og to akse av oversettelse). Bruke et planar kamera for å fange cross-sectional fluorescens bildene.
- Bruk en supercontinuum laser kilde som systemet laser kilde.
- Optical Coherence tomografi System
- Bruk samme supercontinuum laser kilde som systemet laser kilde.
- Skill nær infrarød (NIR) området (650-900 nm) fra gjenværende light (650-2000 nm) med et annet dichroic speil (DM3). Bruk en lang-pass filter begrense båndbredden til 800-900 nm. Par strålen i en enkelt modus fiber (SMF 2).
- Koble single-modus fiber til andre inn porten på de to overlappende optisk fiber koblinger å kombinere med blå oSLO magnetisering. Direkte lys fra andre utdataporten av andre fiber kabelendene med OCT referanse armen, som har en variabel Nøytralfilter (VNDF), spredning kompensasjon plater og reflekterende speil.
Merk: Lyset returnert fra referanse armen og recombines på den andre optisk fiber coupler og leveres til OCT spectrometer å hente signal.
- Bruk samme supercontinuum laser kilde som systemet laser kilde.
- Datainnsamling
- Bruke en data oppkjøpet systemprogramvare skrevet i LabVIEW og endret fra skanning protokollen OCTA7,8,9,10. Hver B-skanning, en 80% driftssyklus så tann med 500 trinn er ut av en analog utgang (AO1) til å kontrollere x' rask skanning speil, GM2.
- Utløse linje skanning kameraet på hvert trinn å skaffe data for Tilpasningsverktøy bare når speilet er i boksen Videresend skanning retning. Angi eksponeringstid for linje skanning kameraet skal 17 µs.
- For å erverve OCTA signalet, gjenta målingen 5 ganger på samme B-scan sted.
- Angi AO utgang hastigheten 100 kHz og OCT A-line prisen på 50 kHz. Kontrollere y' langsom skanning speil, GM1, av en gradvis bølgeform. Synkronisere de skanning speilet, GM3, med GM1 de skanne langsom skanning.
- Utløse planar kameraet en analog utgang (AO2) å fange fluorescerende bilde om hver y' plasseringen. Beskjære tenkelig størrelsen eller bin nabo piksler for å øke hastigheten og følsomhet som ønsket.
2. system justering
- Justere spalten i oSLO lyskilden velge blå eksitasjon bølgelengde. Bruke et spektrometer overvåke spectral området å være rundt 475-490 nm.
- Juster skyvekontrollen Due hale fjellet for å skifte den optiske aksen av ~ 5 mm. Dette vil resultere i en forskyvning på rotte eleven av ~1.7 mm, noe som resulterer i en skrå vinkel på ~ 15° på netthinnen.
- Juster prosjektstadium oversettelse fluorescens oppdagelsen optikk av samme 5 mm.
- Juster den endelige fluorescensen tenkelig system skal ~ 30°.
- Måle optisk makt bruker en strømmåleren. Kontroller at blå oSLO eksitasjon makt er ≤0.2 mW og OCT laser makt ≤0.8 mW, som ikke vil føre netthinnen skade.
Merk: Basert på ANSI-standarden, maksimal ettergivende eksponering (OED) på netthinnen er på nivå med ~ 2mW7,8 i synlig lys område. Formelen av Delori et al. 9, OED for nær infrarødt lys er omtrent to ganger høyere enn i synlig lys, på ca 4 mW.
3. i Vivo dyr eksperiment
- Overføre en 12-ukers mannlig lang Evans rotten i induksjon kammeret. Bedøve rotte med 4,5% isoflurane i oksygen i 10 minutter med en flow rate på 2 L/min av en isoflurane fordamper.
- Bekreft dybde bedøvelse som bestemmes av en mangel på uttak refleks under en interdigital knipe.
- Etter induksjon, sett rotta på en 5-aksen (x, y, z oversettelser, yaw og pitch). Gir ekstra varme ved bruk av et oppvarmet stadium sirkulerende vann teppe eller andre egnet metode i et langvarig eksperiment. Vedlikehold av bedøvelsen på 1,5% av isofluorane med en strømningshastighet på 2 liter/minutter under den gjenværende delen av eksperimentet. Når du ikke bruker en induksjon kammer med aktive eksos, plasseres induksjon kammer på en backdraft eller downdraft tabell eller under en snorkel åtseleter isoflurane.
- Dilate elevene med 1% Tropicamide ophthalmica løsning i 2 minutter. Bruk 0,5% Tetracaine HCl ophthalmica løsning rottas øye for ekstra lokalbedøvelse, om nødvendig. Hold øyet fuktet med kommersielle artificial tårer minst én gang hvert minutt under eksperimentet.
- Injisere fluorescein salt (10% w/w) eller FITC (10% w/w) fortynnet i sterilt saltvann (0.1-0.3 mL) gjennom halen åre med en 1 mL sprøyte og en 29G p.
- Slå på laser kilden. Sted en Nøytralfilter å attenuere blå lys magnetisering under justering. Måle OCT lyset skal ~0.8 mW, og blått lys < 0,01 mW å unngå dannelse av cataracts.
- Starte galvanometer skanning og justering modus. Juste høyden på øyet ballen gjøre en stillestående laser spot på hornhinnen. Juster rotte øyet posisjon slik at kanten av eleven omtrent vinkelrett laser og forskyvning laser apikale midten av øyet til om ~1.5 mm.
- Videre justere dyr abonnenten til OCT bilder kommer optimal kvalitet. I x' rask skanning retning, kontroller at cross-sectional B-scan bildet vises flat. Når du bytter til y' treg skanning retning, kontroller for tverrsnitt B-scan bildet vises skråstilt, på grunn av skrå skanning.
- Fjern Nøytralfilter til blå lys magnetisering og overvåke sanntid fra kameraet. Kors flerdelte fluorescerende bilde skal vises viser blodkar i ulike dybder.
- Justere fokus for den endelige fluorescensen tenkelig system for å oppnå optimal fokus. Tillate finjusteringer av øyet posisjon i laterale flyet til optimal bildekvalitet i oSLO.
- Etter justering, begynne å erverve samtidige OCTA og volumetriske fluorescein angiography (vFA).
- Konstruere volumetriske bildene for både OCTA og ved Matlab. Algoritmer er tidligere beskrevet i detalj10. Generere dybde-løst retinal vasculatures av bildesegmentering.
- Etter endt avbilding, slå av laser, slipper dyret og bruke noen ophthalmica salve på øynene og deretter plassere dyret i en utvinning.
- Ikke la dyret uovervåket før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency eller som per institusjonelle politikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4a viser en cross-sectional OCT bilde av en rotte netthinnen. Figur 4b 4 c viser de samme retinal cross-sectional bildene av OCTA og oSLO vFA kjøpte samtidig. OSLO kan cross-sectional FA analogt til OCT B-skanningen. I forhold til OCTA identifiserer oSLO vFA tverrsnitt bildet fartøyene i nerve fiber (NFL) og ganglion celle lag (GCL), og blodkar i ytre plexiform lag (OPL). Figur 4 d og 4 g Vis overfladisk laget av OCTA og oSLO vFA. I motsetning til OCTA unngår oSLO vFA bildet (Figur 4 g) bevegelse gjenstander (loddrette striper i Figur 4 d) ved å benytte fluorescens utslipp kontrast. Ved å sammenligne den oSLO vFA (figur 4e) og OCTA (Figur 4 h) bilder i netthinnen mellomliggende laget, vises tydelig loddrett dykking fartøyene i oSLO FA bildet, men ikke tydelig i OCTA. Dette er antagelig fordi blod strømmen fart eller fartøy retningen påvirker OCTA signalet men ikke oSLO fluorescens kontrasten.
Figur 4f og 4i viser avbildningene i dypt kapillær plexus laget. Regionene påpekt av blå piler i oSLO vFA har en bedre kontrast enn OCTA er blodkar. Størrelsen på venule påpekt av hvite pilene i oSLO er større enn i OCTA. Total, oSLO vFA bildet ligner faktiske vaskulær morfologi mer nøyaktig enn OCTA, siden det ikke er avhengig av blod trafikkflyten fart eller fartøy retningen. Et eget ansikt Gli gjennom fra to samtidig ervervet volumetriske datasett fra oSLO og OCTA vises i Video 1.
Figur 1. Systemet skjematisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fotografiet av de to overlappende fiber koblinger som direkte oSLO og OCT lys. Rutene av lys pass er merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Oppsettet av due hale fjellet for skrå belysning. (en) det solide arbeidet modell for delen skrå belysning. (ABC) Zoomet inn visningen og visningen separat av due hale fjellet. (d) fotografiet av faktiske oppsettet for skrå belysning del. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Rotte retinal bildet kjøpt av oSLO og OCTA samtidig. Eksempel (en) cross-sectional bildet OCT (b) OCTA og (c) oSLO FA. Paneler (d) og (g) viser en ansikt OCT og oSLO FA bilder fra overfladisk laget. Bevegelse gjenstander i OCTA bilde ble påpekt med røde piler. Viser resultatene fra mellomliggende laget panelet (e) og (h). Stedene der fartøyene dykke ned til neste lag ble påpekt av gule piler, som er klarere på oSLO FA enn OCTA. Viser resultatene fra dypt kapillært plexuses laget paneler (f) og (jeg). Kontrasten i oSLO er bedre enn OCTA i regionen påpekt av blå piler. Størrelsen på venule påpekt av hvite pilene i oSLO er større enn i OCTA. Barer i figuren er 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet oSLO, en i vivo volumetriske fluorescerende retinal imaging teknikken med en FOV over 30 °. Sammenlignet med oktober, en gjeldende standarden på omsorg imaging metode i Oftalmologi, oSLO tilbyr en lignende 3D bildeprodukter evnen men lar fluorescens kontrast som OCT ikke er følsom for. Fordelen med oSLO er at det krever bare en raster skanning, og dermed gir en sømløs kombinasjon av oktober, gir to utfyllende teknikker for strukturelle og fluorescerende volumetriske bildebehandling.
I denne protokollen er sentrale punkt for å få god bildekvalitet klarhet i rotte øyet. Hvis oSLO bildet er skjult, kan du undersøke om det er cataract formasjon. Flere faktorer som ketamin/xylazine anestesi, hornhinnen tørking og over-eksponering til blått lys vil føre til dannelse av cataracts, som vil betydelig svekkes bildekvaliteten. For å hindre de grå stær, unngå kontinuerlig eksponering til blått lys i mer enn 2 minutter; bruke kunstige øyet slitasje minst en gang hvert minutt for å hindre hornhinnen tørking; og la øynene hvile minst 30 sekunder mellom tenkelig blokkerer lyset.
Vi ser at oSLO kan betydelig påvirke den klinisk praksisen av fluorescens imaging. Vi har vist at dybden oppløsningsevne effektivt kan eliminere signalet fra den ytre retinal, gir høy kontrast volumetriske FA bilder ned enkelt kapillære nivå, som er unobtainable med konvensjonelle SLO. Du dramatisk forbedret bildeskarphet ville tillate for mer følsomme gjenkjenning og kvantifisering av blod-netthinnen barriere avbrudd og retinal kapillær lekkasje, kjennemerket på visjon-truende macula ødem i DR og andre chorioretinal vaskulære sykdommer.
I dagens system, hastigheten på CCD kameraet er 20 bilder per sekund, noe som fører til > 25 andre oppkjøpet ganger. En vitenskapelig CMOS kameraet vil dramatisk forbedre systemhastigheten. Fluorescens deteksjon har en annen optisk bane atskilt fra belysning. Det vil forenkle systemet hvis bruker samme optisk bane for belysning og gjenkjenning i fremtiden design. Oppsummert, ble en roman flere plattform for volumetriske netthinnen bildebehandling, nemlig skrå skanning laser ophthalmoscopy (oSLO), presentert. Store FOV i vivo avbilding over en 30 ° visningsvinkelen på rotte netthinnen oSLO og samtidige optical coherence tomografi (OCT) ble demonstrert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ji Yi har ventende patent oSLO. Andre forfatteren/forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Finansiering er fra Evans medisinsk foundation finansiering fra Bostons samt en sub-kontrakt fra NIH 5R01CA183101, BU-CTSI pilot gi 1UL1TR001430 og BU-Joslin pilotprogram BU-CTSI KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
- Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. Confocal scanning laser ophthalmoscope. Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).
- Roorda, A., et al. Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
- Jia, Y., et al. Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).
- Chen, C. -L., Wang, R. K. Optical coherence tomography based angiography [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).
- Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).
- Zhang, X. Y., et al. Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer. Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).
- Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).
- Zhang, L., et al. Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO). Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).
