Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att få ett stort synfält (FOV) tredimensionella (3D) fluorescens och OCT retinal bild med hjälp av en roman imaging multimodal plattform. Vi kommer att införa systeminställningarna, metoden för justering och de operativa protokoll. In vivo imaging kommer att demonstreras och representativa resultat kommer att tillhandahållas.
Abstract
Medan fluorescens imaging används ofta i oftalmologi, är ett stort synfält (FOV) tredimensionella (3D) fluorescens retinal bilden fortfarande en stor utmaning med den state-of-the-art retinal imaging villkoren eftersom de skulle kräva z-stapling till Kompilera en volymetrisk datamängd. Nyare optisk koherenstomografi (OCT) och OCT angiografi (OCTA) system övervinna dessa begränsningar för att ge tredimensionella (3D) anatomiska och vaskulär bilder, men hur dye-fri OCT kan inte visualisera läckaget vägledande av vaskulär dysfunktion. Det här protokollet beskriver en roman sned scanning laser Oftalmoskopi (oSLO) teknik som ger 3D volymetriska fluorescens retinal imaging. Inställningen av bildgivande systemet genererar den sneda skanning med en dove tail reglage och justerar den slutliga bildsystem vinkel att upptäcka fluorescerande tvärsnittsdata bilder. Systemet använder laser skanning metod, och därför kan en lätt inkorporering av OCT som en kompletterande volymetriska strukturella bildgivande modalitet. In vivo imaging på råtta näthinnan demonstreras här. Fluorescein lösning injiceras intravenöst för att producera volymetriska fluoresceinangiografi (vFA).
Introduction
Oftalmologi och vision science har stor nytta av moderna optiska bildteknik, eftersom näthinnan och kan lätt nås med ljus. Fluorescens retinal imaging är ett viktigt verktyg i diagnos och hantering av korioretinal vaskulära sjukdomar såsom diabetesretinopati (DR) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), som båda är ledande orsakerna till blindhet i USA.
Det är dock fortfarande utmanande att förvärva ett stort synfält (FOV), tredimensionella (3D) retinal imaging med hjälp av fluorescens imaging. Fundus fotografi har inte funktionen djup-lösa och avvisar inte diffust ljus. Som ett resultat, minskar blandning av signaler från olika djup bildkvaliteten. Scanning laser Oftalmoskopi (SLO) och confocal SLO (cSLO) kan minska effekten av diffust ljus med hjälp av confocal Usenets1. Det är dock svårt för SLO eller cSLO att förvärva en 3D mänskliga retinal bilden på grund av gränsen för deras skärpedjupet. Adaptiv optik SLO (AOSLO) kan ge mycket bra upplösning och kontrast genom att korrigera för de wavefront avvikelser som infördes genom det mänskliga ögat. Dock skulle AOSLO fortfarande behöva z-stapling för volymetrisk imaging2. OCT angiografi (OCTA) system och optisk koherens tomografi (ULT)3 övervinna dessa begränsningar för att ge tredimensionella (3D) anatomiska och vaskulär bilder4,5,6, men dye-fri natur av oktober kan inte visualisera läckaget vägledande av vaskulär dysfunktion.
Det här protokollet beskriver en roman multimodal plattform för 3D volymetriska fluorescens retinal imaging, nämligen sned scanning laser Oftalmoskopi (oSLO). I detta imaging system, en sned skanning genereras av en dove tail reglage och en slutlig bildsystem justeras i vinkel att upptäcka fluorescens cross sectional bilder. Systemet använder laserscanning metoder, och dessa tekniker Tillåt lätt inkorporeringen med OCT som en kompletterande volymetriska strukturella bildgivande modalitet. Den aktuella resolutionen djup är ca 25 µm i råtta näthinnan och synfältet är 30°. I huvudsak oSLO tillåter en fluorescerande version av OCT och kan samtidigt kombineras med OCT och OCTA över en stor FOV.
I detta protokoll, kommer vi att beskriva inställningen av oSLO, metoden för justering och konstruktion, metoden i vivo Imaging av råtta näthinnan och de representativa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittén (ACUC) av Boston Medical Center.
1. system Setup
- oSLO-systemet
- Använda en supercontinuum laserkälla som systemet laserkälla.
- Separata synliga ljuset intervall (450-650 nm) från högre våglängdsområdet (650-2000 nm) av en dichroic spegel (DM1). Expandera spektrumet med ett par spridande prismor efter strålen passerar genom en polarisering stråldelare (PBS).
- Placera en skåra Markera excitation våglängdsområdet (475-495 nm). Använda en reflekterande spegel att reflektera filtrerade balken tillbaka till paret Prisma och sedan par ljuset i en single-mode fiber (SMF 1).
- Använda en spektrometer för att bekräfta våglängd vid utgången av single-mode fiber.
- Anslut den single-mode fibern till två överlappande optisk fiber kopplingar som visas i figur 2. En av fiber utgångsporten från andra fiber fästet levererar ljuset till oSLO systemet.
- Collimate laser först i oSLO systemet.
- Avleda laser av en galvanometer spegel (GM1). Relä lasern till en andra galvanometer spegel (GM2) av en 1:1 teleskop systemet, och ytterligare relä till pupillen i ögat av en 3:1 teleskop system.
- Installera en dichroic spegel (DM2) inom 3:1 teleskop systemet att återspegla fluorescens signalerna.
- Montera 3:1 teleskop systemet och dikroiskt speglar (DM2) på en anpassad dove tail slider att kompensera den optiska axeln och skapa den sneda skanning belysning som visas i figur 3. Använd ett skjutmått att exakt styra offset längd som önskas.
- Fluorescens imaging optisk väg.
- Återspegla fluorescensen av dichroic spegel och relä till tredje galvanometer spegeln de Skanna långsam skanning.
- Relä ljus för en tänkbar objektiv av ett annat 1:1 teleskop system. Installera ovan optiken på en översättning scen.
Obs: Två ytterligare översättningen arrangerar installeras under den tredje galvanometer spegeln (GM3) att tillhandahålla redundans i frihetsgrader för optimering av imaging.
- Montera en sista imaging system på en scen som har tre frihetsgrader (rotation och två axel översättning). Använd en planar kamera för att fånga tvärsnittsdata fluorescens bilderna.
- Använda en supercontinuum laserkälla som systemet laserkälla.
- Optisk koherens tomografi System
- Använda samma supercontinuum laserkälla som systemet laserkälla.
- Separera den nära infrareden (NIR) spänner (650-900 nm) från resterande ljus (650-2000 nm) med en annan dichroic spegel (DM3). Använda en lång lågpassfilter för att ytterligare begränsa bandbredden till 800-900 nm. Par balken i en single-mode fiber (SMF 2).
- Anslut den single-mode fibern till andra ingående port de två överlappande optisk fiber kopplingar kombinera med blå oSLO magnetiseringen. Rikta ljuset från andra utdataport av andra fiber kopplingen till OCT referens arm, som har en variabel neutral densitet filter (VNDF), dispersion ersättning tallrikar och en reflekterande spegel.
Obs: Ljuset återvänt från referens armen och ögat rekombineras på andra optisk fiber fästet och levereras till OCT spektrometern att samla in signalen.
- Använda samma supercontinuum laserkälla som systemet laserkälla.
- Data Acquisition
- Använda en data förvärv system program skrivna i LabVIEW och modifierad från protokollet skanning av OCTA7,8,9,10. För varje B-scan, såg en 80% intermittens tand med 500 steg är produktionen av en analog utgång (AO1) att styra x' snabb skanning spegel, GM2.
- Utlösa linje scan kameran vid varje steg att skaffa data för ULT bara när spegeln är i framåt skanning riktning. Ställ in exponeringstiden för linje scan kameran vara 17 µs.
- För att förvärva OCTA signalen, upprepa mätningen 5 gånger på samma B-scan plats.
- Ange den AO output ränta på 100 kHz, och OCT A-line klassar vid 50 kHz. Styra y' långsam skanning spegel, GM1, av en ramp vågform. Synkronisera de skanning spegeln, GM3, med GM1 de Skanna långsam skanning.
- Utlösa planar kameran av en annan analog utgång ombord (AO2) att fånga en fluorescerande bild på varje y' läge. Beskär imaging storlek eller bin granne pixlar för att öka hastighet och känslighet som önskas.
2. system justering
- Justera skåran i oSLO ljuskällan att välja blå excitation våglängden. Använda en spektrometer för att övervaka det spektralområde för att vara runt 475-490 nm.
- Justera skjutreglaget dove tail mount för att skifta den optiska axeln av ~ 5 mm. Detta kommer att resultera i en förskjutning på råtta eleven av ~1.7 mm, vilket resulterar i en sned vinkel på ~ 15° på näthinnan.
- Justera översättning scenen av fluorescens upptäckt optik av samma 5 mm.
- Justera den slutliga fluorescensen imaging system för att vara ~ 30°.
- Mät den optiska effekt med hjälp av en kraftmätare. Kontrollera blå oSLO excitation kraften är ≤0.2 mW och OCT laser power ≤0.8 mW, som inte orsakar retina skador.
Obs: Baserat på ANSI-standard, den maximala tillåtande exponeringen (MPE) på näthinnan är i nivå med ~ 2mW7,8 i synliga ljuset intervall. Enligt formeln av Delori et al. 9, det största tillåtna felet för det nära infrarött ljuset är cirka två gånger högre än det synliga ljuset, på ca 4 mW.
3. in Vivo djurförsök
- Överföra en 12-veckor manliga lång Evans råtta in i induktion kammaren. Söva råtta med 4,5% isofluran i syre i 10 minuter med flöde 2 L/min av en isofluran spridare.
- Bekräfta djup anestesi som bestäms av en avsaknad av tillbakadragande reflexen under en interdigital nypa.
- Efter induktion, placera råtta på en 5-axel (x, y, z översättningar, gir och pitch) hållare. Ge extra värme genom användning av en uppvärmd scenen, cirkulerande varmt vatten filt eller annan lämplig metod i en långvarig experiment. Upprätthålla anestesi på 1,5% av isofluorane med en flödeshastighet av 2 liter/minuter under resterande del av experimentet. När du inte använder en induktion kammare med aktiva avgassystem, bör induktion kammaren placeras på en backdraft eller utsugsbord tabell eller under en snorkel till rensa isofluran.
- Vidgas pupillen med 1% Tropikamid ophthalmic lösning i 2 minuter. Applicera 0,5% HCl tetrakain ögondroppar på råttans öga för ytterligare lokalbedövning, om det behövs. Håll ögat återfuktad med kommersiella konstgjorda tårar minst en gång varje minut under experimentet.
- Injicera fluorescein salt (10% w/w) eller FITC (10% w/w) utspätt i steril koksaltlösning (0,1-0,3 mL) genom svans med en 1 mL spruta och en 29G nål.
- Slå på laserkällan. Placera en neutral densitet filter för att dämpa den blå ljusa magnetiseringen under justering. Mäta kraften i OCT ljus för att ~0.8 mW, och det blå ljuset < 0,01 mW att undvika bildandet av grå starr.
- Starta galvanometer skanning och justering läge. Justera höjden på ögat bollen för att göra en stationär laser plats på hornhinnan. Justera råtta öga position för att göra kanten av eleven ungefär vinkelrätt mot laser, och kompensera lasern till apikala mitten av ögat om ~1.5 mm.
- Ytterligare justera hållaren djur tills OCT bilder når optimal kvalitet. I x' snabb skanning riktning, kontrollera att tvärsnittsstudier B-scan bilden visas platta. När du växlar till y' långsam skanning riktning, kontrollera tvärsnitt B-scan bilden visas lutande, på grund av sneda skanning.
- Ta bort neutral densitet filter till blå ljus magnetiseringen och övervaka i realtid foder från kameran. Cross sectional fluorescerande bild bör visas visar blodkärl som förekommer i olika djup.
- Justera fokus för den slutliga fluorescensen imaging system för att nå optimal fokus. Tillåta finjusteringar av öga position i laterala planet för att nå optimal bildkvalitet i oSLO.
- Efter justeringen, börja förvärva samtidiga OCTA och volymetriska fluoresceinangiografi (vFA).
- Konstruera de volymetriska bilderna för både OCTA och oSLO av Matlab. Algoritmerna är tidigare beskrivits i detalj10. Generera djup-löst retinal vasculatures av bild segmentering.
- Efter avslutad av imaging, stänga av lasern, släppa djuret och tillämpa vissa oftalmiska salva på ögonen och sedan placera djuret i en återhämtning låda.
- Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning eller per institutionella politiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4a visar en tvärsnitts OCT-bild av en råtta näthinnan. Figur 4b -4 c Visa samma retinal tvärsnittsdata bilder av OCTA och oSLO vFA förvärvade samtidigt. OSLO gör tvärsnittsdata FA analogt till OCT B-scan. I jämförelse med OCTA identifierar oSLO vFA tvärsnittsdata bilden tydligt fartyg i nerv fiberskiktet (NFL) och ganglion celllagrar (GCL) och kapillärer i yttre plexiform lagret (OPL). Figur 4 d och 4 g visar det ytliga lagret av OCTA och oSLO vFA bild. Till skillnad från OCTA undviker oSLO vFA bilden (figur 4 g) rörelse artefakter (vertikala ränder i figur 4 d) genom att utnyttja fluorescens utsläpp kontrast. Genom att jämföra de oSLO vFA (figur 4e) och OCTA (figur 4 h) bilder inom retinal mellanliggande lager, visas tydligt vertikalt dykning fartyg i oSLO FA bilden men inte framgår i OCTA. Detta beror förmodligen på blod flöde hastighet eller fartyget orientering kommer att påverka OCTA signalen men inte oSLO fluorescens kontrasten.
Figur 4f och 4i visar bilderna inom djupt kapillär plexus lager. De regioner som påpekats av blå pilarna i oSLO vFA har en bättre kontrast än OCTA i kärlsystemet. Storleken på den venule som påpekats av vita pilarna i oSLO är större än i OCTA. Sammantaget liknar oSLO vFA bilden riktiga vaskulär morfologi exaktare än OCTA, eftersom det inte är beroende av blod flöde hastighet eller fartyget orientering. En fluga-through i sv ansikte från två samtidigt förvärvade volymetriska datauppsättning från oSLO och OCTA visas i Video 1.
Figur 1. Systemet Schematisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fotografiet av de två överlappande fiber-kopplare som direkt oSLO och ULT ljus. Rutter för lätta passet är märkta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Inställningen av dove tail fästet för sned belysning. (en) det gedigna arbetet modell för sned belysning delen. (b-c) Den inzoomade vyn, och separat vy av dove tail berget. (d) fotografi av den riktiga installationen för sned belysning del. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Rat retinal bild förvärvats av oSLO och OCTA samtidigt. Till exempel av (en) tvärsnitts bilden av OCT (b), OCTA och (c) oSLO FA. Paneler (d) och (g) visar sv ansikte OCT och oSLO FA bilder från det ytliga lagret. De rörelse artefakterna i OCTA bild påpekades av röda pilar. Panelen (e) och (h) visar resultaten från det mellanliggande skiktet. De platser där fartygen dyka i nästa lager pekades ut av gula pilar, som är tydligare på oSLO FA än OCTA. Paneler (f) och (jag) visar resultaten från det djupt kapillär plexuses lagret. Kontrasten i oSLO är bättre än OCTA i regionen påpekade med blå pilar. Storleken på den venule som påpekats av vita pilarna i oSLO är större än i OCTA. Barer i figuren är 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit oSLO, en i vivo volymetriska fluorescerande retinal imaging teknik med en FOV över 30 °. Jämfört med oktober, en nuvarande standardbehandling imaging metod i oftalmologi, oSLO erbjuder en liknande 3D imaging förmåga ändå tillåter fluorescens kontrast som OCT inte är känslig för. Fördelen med oSLO är att det kräver endast en raster scan, och således ger en sömlös kombination av ULT, som ger två kompletterande tekniker för strukturella och fluorescerande volymetriska imaging.
I detta protokoll är det viktiga att få bra bildkvalitet tydligheten i råtta ögat. Om oSLO bilden döljs, undersöka om det finns starr. Flera faktorer såsom ketamin/xylazin anestesi, hornhinnan torkning och överexponering för blått ljus kommer att orsaka bildandet av grå starr, som skulle avsevärt försämras bildkvaliteten. För att förhindra den grå starr, undvika kontinuerlig exponering för blått ljus i mer än 2 minuter. tillämpa konstgjord ögat tår åtminstone en gång i minuten för att förhindra hornhinnan torkas; och låt ögat att vila i minst 30 sekunder mellan imaging sektioner genom att blockera ljuset.
Vi ser framför oss att oSLO avsevärt kan påverka klinisk praxis för fluorescens imaging. Vi har visat att djupet upplösningsförmåga effektivt kan eliminera signalen från den yttersta retinal, vilket ger bilder med hög kontrast volymetriska FA ner till enskild kapillär nivå, som är ouppnåelig med traditionella SLO. Dramatiskt förbättrad bild klarheten skulle möjliggöra mer känslig detektion och kvantifiering av blod-retina barriär störningar och retinal kapillär läckage, kännetecknet för vision-hotande makulaödem i DR och andra korioretinal vaskulär sjukdomar.
I det nuvarande systemet, hastigheten på CCD kameran är 20 bilder per sekund, vilket leder till > 25 andra gånger förvärv. En vetenskaplig CMOS-kamera kommer att dramatiskt förbättra systemet hastighet. Fluorescens upptäckt har en annan optisk väg separerade från belysningen. Det kommer att förenkla systemet om med samma optisk väg för belysning och upptäckt i framtiden utformar. Sammanfattningsvis presenterades en roman multimodal plattform för volymetrisk retinal imaging, nämligen sned scanning laser Oftalmoskopi (oSLO). Den stora FOV i vivo imaging över en 30 ° vinkel av råtta näthinnan med oSLO och samtidiga optisk koherenstomografi (OCT) visades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ji Yi innehar ett väntande patent för oSLO. Andra författare förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
BU-CTSI pilot medel är Evans Medical foundation finansiering från Boston Medical Center samt ett sub kontrakt från NIH 5R01CA183101 från, och bevilja 1UL1TR001430, BU-Joslin pilotprogram och BU-CTSI KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
- Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. Confocal scanning laser ophthalmoscope. Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).
- Roorda, A., et al. Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
- Jia, Y., et al. Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).
- Chen, C. -L., Wang, R. K. Optical coherence tomography based angiography [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).
- Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).
- Zhang, X. Y., et al. Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer. Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).
- Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).
- Zhang, L., et al. Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO). Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).
