Summary
Proteiner der binder specifik RNA sekvenser spiller vigtige roller i genekspression. Detaljeret beskrivelse af disse bindingssteder er afgørende for vores forståelse af genet. Her, er en trinvis fremgangsmåde for mætning mutagenese af protein bindingssteder i RNA beskrevet. Denne tilgang er relevant for alle protein bindingssteder i RNA.
Abstract
RIBOREGULATION spiller en vigtig rolle i udviklingen. Talrige DNA - og RNA-bindende proteiner binder deres mål sekvenser med høj specificitet styre genekspression. Disse regulerede proteiner kontrollerer genekspression enten på niveauet af DNA (transskription) eller på niveau med RNA (præ-mRNA-splicing, polyadenylation, mRNA transport, forfald og oversættelse). Identifikation af regulerende sekvenser hjælper med at forstå, ikke kun hvordan et gen er tændt eller slukket, men også hvilke downstream gener er reguleret af en bestemt regulerende protein. Her, beskriver vi en et-trins tilgang, der giver mulighed for mætning mutagenese af en protein bindingssted i RNA. Det drejer sig om doping DNA skabelon med ikke-wild-type nukleotider i bindingssted, syntese af separate RNA'er med hver phosphorothioate nukleotid og isolering af den bundne fraktion efter inkubation med protein. Interferens fra ikke-wild-type nukleotider resulterer i deres privilegerede udelukkelse fra protein-bundne fraktion. Dette er overvåget af gelelektroforese efter selektiv kemisk spaltning med jod af fosfodiesterbindinger indeholdende phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkelt-trins mætning mutagenese tilgang kan anvendes til karakterisering af enhver protein bindingssted i RNA.
Introduction
RIBOREGULATION spiller en vigtig rolle i biologi. Gener kan reguleres på niveau med transskription, pre-mRNA-splicing, 3' enden dannelse, RNA eksport, oversættelse, mRNA lokalisering, forfald, posttranslationel modifikation/stabilitet, etc. både DNA - og RNA-bindende proteiner spiller vigtige roller i gen forordning. Mens molekylær genetiske analyser har identificeret talrige regulerede proteiner, kun en lille delmængde af dem er blevet karakteriseret fuldt ud til deres cellulære funktioner eller bindende sites in vivo. Fylogenetisk Sekvensanalyse og mutagenese tilbyde komplementære metoder til at karakterisere DNA - eller RNA-protein interaktioner.
RNA-bindende proteiner er vigtige i udviklingsprocesser, herunder seksuel orientering. Drosophila protein Sex-dødbringende (SXL) eller master sex-switch protein er fraværende i hanner, men nutid i hunner. Det genkender uridine-rige sekvenser eller pyrimidin-skrifter støder op til specifikke splice websteder i downstream pre-mRNA mål (transformer, Sex-dødbringendeog mand-specifik lethal2) i somatiske celler1,2 ,3,4. Desuden regulerer polyadenylation site skifte ved binding til uridine-rige polyadenylation forstærker sekvenser i forstærker af rudimentære (e(r)) udskrift5,6. SXL sandsynligvis regulerer yderligere mål i den kvindelige kønscelleoverførsel, der mangler for at blive identificeret1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Typisk, karakterisering af en bindingssted indebærer mutagenese, for eksempel ved sletning eller substitution af én eller flere nukleotider. Hver mutant bindingssted i forhold til wild-type RNA-sekvens, analyseres derefter ved hjælp af en række protein koncentrationer til at bestemme dets bindende affinitet (Kd eller ligevægt dissociation konstant) for protein af interesse; Kd er proteinkoncentration kræves for at opnå 50% RNA bindende. Denne arbejdskrævende proces af detaljerede mutagenese indebærer generation og analyse af talrige mutanter — tre vilde type nukleotider for hver position i bindingssted. Der er således behov for en alternativ tilgang til hurtigere, enklere og billig mætning mutagenese af protein bindingssteder i RNA.
Her, beskriver vi en et-trins tilgang, der giver mulighed for mætning mutagenese af en protein bindingssted i RNA. Det drejer sig om doping DNA skabelon med ikke-wild-type nukleotider i bindingssted, syntese af separate RNA'er med hver phosphorothioate nukleotid og isolering af den bundne fraktion efter inkubation med protein. Interferens fra ikke-wild-type nukleotider resulterer i deres privilegerede udelukkelse fra protein-bundne fraktion. Dette er overvåget af gelelektroforese efter selektiv kemisk spaltning med jod af fosfodiesterbindinger indeholdende phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkelt-trins mætning mutagenese tilgang kan anvendes til karakterisering af enhver protein bindingssted i RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Figur 1 indeholder en oversigt over phosphorothioate mutagenese og en oversigt over vigtige trin i processen.
1. generation af et bibliotek af mutanter — Doping DNA skabelon med wild Type nukleotider
- Syntetisere T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') ved kemisk syntese på en DNA-synthesizer.
- Syntetisere en doteret oligonukleotid (supplerende strand) ved kemisk syntese på en DNA synthesizer svarende til protein bindingssted. Brug en passende blanding af phosphoramidites under kemisk syntese for hver site af doping (X nedenfor) med et forhold på 90% A som vildtype nukleotid og 10% T som vilde type nukleotid (Se repræsentative resultater for flere detaljer om dette forhold).
Bemærk: Her, rækkefølgen af de doteret oligonukleotid er 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. De understregede sekvens er det omvendte supplement af SXL protein bindingssted, plus yderligere nukleotider bindende site, der giver nyttige kontrol bekræfter, at ikke enhver ændring i RNA påvirker bindende, samt være lastning styringer til sammenligning og normalisering af nukleotider i bindingssted. SXL-bindende site sekvens UUUUUGUUGUUUUUUUU, som er til stede i transformer pre-mRNA14,15,16,17, blev brugt til at udarbejde den foreslåede metode. Sekvens i kursiv er komplementær til T7 primer sekvens og er T7 fortaler for in vitro- transskription.
2. syntese af RNA
-
Syntetisere RNA i en 20 µL transskription reaktion, som tidligere beskrevet18.
- Mix T7 transskription buffer og 1 µM T7 oligonukleotid, 1 µM dopede oligonukleotid, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM hver ATP, CTP, og UTP (Guanosinmonofosfat, adenosin, cytidine og uridine trifosfat) og 2 U/µL T7 RNA polymerase.
- Tilføje, i to separate microcentrifuge rør, 0.167 mM α-thio ATP eller 0,05 mM α-thio UTP at indarbejde RNA'er phosphorothioates (se skema i figur 2).
Bemærk: For alternative protokoller, tilføje 0,2 mM α-thio CTP eller 0,2 mM α-thio GTP til en passende transskription reaktion indeholdende en doteret oligonukleotid for at teste de to resterende nukleotid udskiftninger. - Inkuber RNA syntese reaktionsblandingen i 2 timer ved 37 ° C.
- Tilføje 2,5 µL varme-labil alkalisk fosfatase og 2,5 µL 10xphosphatase buffer til RNA prøven. Inkuber 25 µL reaktionen for 10-30 minutter ved 37 ° C fjerne 5' fosfater.
- Inaktivere alkalisk fosfatase enzym ved opvarmning på 80 ° C i 2-5 min.
- Radiolabel 5' slutningen af defosforyleret RNA (5 pmole) ved hjælp af 1 µL T4 polynucleotide kinase og 1 µL γ -32P ATP i en 10 µL reaktion volumen. Inkuber mastermix i 30-60 minutter ved 37 ° C.
- Inaktivere T4 polynucleotide kinase enzym ved opvarmning på 65 ° C i 20-30 min.
- Gel rense RNA ved elektroforese i en 10% denatureringen polyacrylamid gel. Find RNA på gelen ved Autoradiografi. Punktafgifter gel skive indeholdende radiolabeled RNA, knuse i et microcentrifuge rør ved at trykke mod væggene med en pipette tip, og lægges i blød i proteinase K (PK) buffer (100 mM Tris, pH 7,5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Sodium dodecyl sulfat). Rotere rør ved stuetemperatur fra 2 h til natten.
- Centrifugeres gel gylle, kassere gel og indsamle stødpudeopløsning.
- Uddrag løsningen to gange med lige saa stort volumen af phenol-chloroform og en gang med chloroform og indsamle den vandige fase.
- Tilføje til den vandige fase 0,1 volumen af 3M natriumacetat, pH 5,2, carrier tRNA eller glykogen og 2,5 volumen af ethanol. Hold prøven ved-80 ° C i 1 time.
- Der centrifugeres prøve for 5-10 min i en høj hastighed microcentrifuge henne ved 16,873 x g. Fjerne buffer/ethanol løsningen forsigtigt uden at forstyrre RNA pellet.
- Vaske pellet med 70% ethanol og centrifugeres i 2 – 5 min. Fjern ethanol omhyggeligt. Tørre pellet i luften.
- Resuspenderes i 20 – 50 µL diethyletheren pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand. Opbevares ved-20 ° C indtil brug.
Bemærk: Udfør alle trin med radiolabeled RNA ved hjælp af passende forholdsregler og plexiglas skjold til at beskytte mod radioaktivitet. I øjeblikket, er spin kolonner mere almindeligt anvendte og mere bekvemt at fjerne personlige radioaktivitet, som et alternativ til gel oprensning af RNA.
3. protein Binding reaktion og adskillelse af bundne RNA
- Udtrykke den rekombinante proteiner i og rense fra E. coli.
- Skøn af den rekombinante proteinkoncentration ved spektrofotometri eller ved at adskille i en SDS-polyacrylamid gel ved siden af et kendt protein standard, bovint serumalbumin (BSA). Visualiser protein af interesse og BSA standard ved farvning gel med Coomassie strålende blå R-250. Kvantificere protein i forhold til kendte mængder af BSA fortyndinger på samme gel.
Bemærk: Gemme rekombinante protein ved - 80 ° C indtil brug og fortyndes i 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic syre (HEPES), pH 8,0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), 0,05% NP-40, 20% glycerol. Brug af 0,5-1,0 mM protease hæmmer phenylmethane sulfonyl fluor (PMSF) er valgfri. - Udføre RNA-bindende reaktion (20-100 µL) i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0,5 enheder/µL RNase inhibitor, 0,09 µg/µL acetyleret bovint serumalbumin, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-enden radiolabeled RNA og 6 µL af passende koncentration (en koncentration som binder ~ 50% af RNA til protein) af protein.
Bemærk: Denne binding buffer virker for tre RNA-bindende proteiner (SXL, U2AF65, og PTB), men skal henfoeres til et protein af interesse. Anslå proteinkoncentration empirisk, ved hjælp af forskellige fortyndinger for en given protein forberedelse, der er nødvendige for at opnå ca. 50% RNA bindende. Denne betingelse eller Kd repræsenterer den mest følsomme del af RNA-bindende kurve. - Inkuber protein binding reaktion i 20-30 min. ved 25 ° C (eller på is).
-
Adskille protein-bundet RNA fraktion fra den ubundne fraktion ved hjælp af to metoder:
- Nitrocellulose filtrere bindende
- Anvend bindende reaktion (20-100 µL) på en nitrocellulose filter tilsluttet en vacuum manifold ved stuetemperatur.
Bemærk: Kun RNA-protein kompleks er bevaret på filteret og ubundne RNA strømme gennem filteret. Filter bindende tilgang giver mulighed for højere inddrivelse af den bundne RNA og er hurtigere og enklere, sammenlignet med gel mobilitet Skift assay. Ved at placere en DEAE membran nedenunder nitrocellulose filter er det også muligt at samle den ubundne RNA fraktion eller gratis RNA til sammenligning med den bundne fraktion. - Skåret del af filteret nitrocellulose indeholdende den beholdt radioaktive RNA i mindre stykker til at passe ind i et microcentrifuge rør, sættetid i tilstrækkelig PK buffer (300-500 µL indeholdende 10-20 µg PK) at fordybe filter stykker, og elueres RNA fra filteret i 2-3 timer eller natten over.
- Uddrag med phenol-chloroform, chloroform, og indsamle vandfasen. Tilføje natriumacetat og ethanol, og efter inkubation i fryseren, centrifugeres, vaske, tørre og resuspend RNA i DEPC-behandlet vand. Følg disse trin som beskrevet i trin 2.10 til 2.14 ovenfor.
- Anvend bindende reaktion (20-100 µL) på en nitrocellulose filter tilsluttet en vacuum manifold ved stuetemperatur.
- Gel mobilitet Skift
- Forberede og polymerisere en 5% indfødte polyacrylamid gel (60:1 Acrylamide:bis-acrylamid) i 0,5 x TBE (standard Tris-Borat-EDTA buffer) før du starter den bindende reaktion, som et alternativ til filter bindende metode.
- Pre-køre gel for 15 min ved 250 V i et koldt rum (4 ° C).
- Læg hver binding reaktion (ovenfor) i separate brønde af ovenstående pre-opstille gel.
Bemærk: Protein opbevaring buffer giver tilstrækkelig glycerol for prøven lastning i brønde. - Adskille protein-bundet RNA ved gelelektroforese i et koldt rum på 250 V i 1 til 2 timer, afhængigt af RNA størrelse og specifikke protein.
- Find placeringen af RNA-protein kompleks på gelen ved Autoradiografi. Punktafgifter gel skive indeholder RNA-protein kompleks. Elueres RNA fra gel skive ved knusning gel skive og iblødsætning i PK buffer.
- Uddrag med phenol-chloroform, chloroform, og indsamle vandfasen. tilføje natriumacetat og ethanol og efter inkubation i fryseren, centrifugeres, vaske, luft tørre, og pelleten RNA i DEPC-behandlet vand. Følg disse trin som beskrevet i trin 2.10 til 2.14 ovenfor.
- Nitrocellulose filtrere bindende
4. analyse af jod-kløvet Phosphorothioate produkter til påvisning af Mutant nukleotid positioner
- Tilføj 1 mM jod i en 20 µL DEPC-behandlet vand indeholdende op til 10 µg carrier tRNA til kløver RNA'er (bundet og samlede RNA'er) på websteder phosphorothioate vedtægter. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
Bemærk: Yderligere oplysninger om jod kavalergang med lidt anderledes betingelser — 7% (v/v) iodoethanol, varme ved 95 ° C i 3 min — kan findes i Gish & Eckstein 198819. - Bundfaldet kløvet RNA ved at tilføje natrium acetat/ethanol, som beskrevet ovenfor. Resuspend i en loading farvestof til denaturering geler. Varme og belastning prøve at adskille RNA fragmenter af elektroforese i en 15-20% denaturering polyacrylamid gel.
- Udsætte polyacrylamid gel til en X-ray film.
- Opdage bands i den bundne fraktion versus samlede pool ved hjælp af Autoradiografi.
Bemærk: Udføre alle trinene med jod i en udstødning hætte. RNA adskillelse vist her, er der ansat en kileformet gel, som er opnået ved at fordoble tykkelsen af begge afstandsstykkerne i bunden af gel pladerne ved at indsætte en ekstra tommer lange afstandsstykke i bunden af gelen. Denne form giver mere ensartede eller tættere afstand mellem kortere RNA fragmenter. Alternativt, en phosphorimager kan bruges i stedet for X-ray film til påvisning og kvantificering af radioaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Princippet om mætning mutagenese bruger doping:
For et passende molære forhold for wild-type og andre nukleotider, bruge en lige blanding af alle fire nucleotider hvis kun én position er der skal analyseres. Men hvis flere positioner analyseres samtidig, skal forholdet ikke-vildtype til vildtype nukleotider justeret, dvs, reduceret. Ellers ud over enkelt erstatninger, som ønskes, bliver der også skabeloner med flere ikke-vildtype nucleotider i et molekyle, udelukker analyse af effekten af enkelt-nukleotid udskiftninger. Således, som en tommelfingerregel, bruge en ratio af vilde type til vildtype nucleotider i 1/n, hvor n er antallet af positioner der skal analyseres. Her, vi analyseret 10 stillinger samtidigt og brugte en blanding, der indeholder 90% af vildtype nukleotid og 10% af ikke-vildtype nukleotid for doping skabelonen DNA. Separat transskription reaktioner er færdig, hvor hver transskription reaktion er udført med en af de fire phosphorothioates. Således, hver reaktion overvåger en specifik nukleotid på doteret holdninger.
Princippet om partitionering på grund af forstyrrelser:
I mutagenese tilgang præsenteres her, har RNA'er på gennemsnitligt mindre end én phosphorothioate rester pr. molekyle. I løbet af processen af bindende, RNA molekyler partition mellem protein-bundne fraktion og den ubundne fraktion. Da en bestemt nukleotidsekvens er knyttet til en phosphorothioate kobling, er spaltning af phosphorothioate rygrad koblingen en udlæsning af tilstedeværelsen af en bestemt nukleotidsekvens på denne holdning. Det forventes, at ved enhver given placering, når en nukleotidsekvens ændres det kan have enten ingen effekt på bindende eller det kan hæmme bindingen, helt eller delvist. Hvis tilstedeværelse af en bestemt nukleotidsekvens har ingen effekt på bindende vil det partition ligeligt mellem de protein-bundne og ubundne fraktioner. Men hvis en bestemt nukleotidsekvens på en given position forstyrrer protein bindende det vil fortrinsvis udelukkes fra protein-bundne fraktion. Grad af indblanding kan overvåges kvantitativt for hver af positionerne i den samme reaktion efter gelelektroforese. Dette begreb er illustreret i en skematisk (figur 3). I total RNA fraktion (lane T) er band intensitet nogenlunde ens for alle doteret positioner (bands 1, 3 – 7). I protein-bundet RNA fraktion (lane B), på positionerne 1, 4 og 7 har nukleotid ingen effekt på bindende. Men på holdninger, 3 og 6, det forstyrrer bindende og dermed er udelukket fra den bundne fraktion. Ved position 5 er interferens delvis. Således sammenligninger af fire forbundne vejbaner, T og B for hver nukleotid, giver mulighed for analyse af alle fire nucleotider. Det bør bemærkes at vildtype nukleotid for en given position afspejler effekten, hvis nogen, af svovl i RNA rygraden på protein binding.
Den ledsagende autoradiograph (figur 4) viser to par (α-thio A og α-thio U) baner fra en denaturering gel (T for samlede pool) og B for bundne fraktion. Flere observationer kan foretages ved at sammenligne intensiteten af bands på hver position mellem hvert par af baner (T og B). Først, størstedelen af signalet er på toppen af gel, dvs., uncleaved produkt, for både α-thio en lane og α-thio U lane. For det andet til α-thio A par baner er flere bands (jod spaltningsprodukter) identiske mellem bundet og de samlede RNA fraktioner f.eks bands over 1; relevante bands inden for bindingssted for α-thio en lane er nummereret for reference. For det tredje bands i bunden af gelen er mere tæt afstand (f.eks. bånd under 6) end normalt for en sekventering gel. For det fjerde flere bands er til stede i den samlede RNA fraktion men fraværende eller markant reduceret i den bundne RNA fraktion (fx bands 1, 2, 3 og 5). For det femte for α-thio U lane par er mens de fleste bands kan sammenlignes mellem de samlede og bundne baner, nogle bands relativt mindre intens i den bundne fraktion (fx bands 7 og 8).
Disse observationer give beviser for en vellykket udvikling af denne nye metode og fører til følgende konklusioner: for det første for både α-thio A par baner og α-thio U par baner, fordi de fleste af RNA er uncleaved, det giver beviser at kun en lille brøkdel af RNA indeholder modificerede eller phosphorothioate rester. Dette er vigtigt fordi det konstaterer, at RNA molekyler indeholder mere end én phosphorothioate rester. Andet, identiske eller lignende intensiteter for flere bands uden for bindingssted mellem de to baner, for både α-thio A og α-thio U, viser, at lastning sammenlignelige for begge baner, giver mulighed for nem sammenligning mellem baner. Tredje, mere tætliggende bands er opnået, for α-thio A og α-thio U, af Kileformen gel (tyndere i toppen og tykkere på bunden), hvilket giver mulighed for analyse af længere sekvens læser og tilbyder højere opløsning. Typisk er kortere fragmenter mere bredt fordelt i en gel med ensartet tykkelse. Fjerde, forsvinden eller reduceret intensiteten af visse bands i den bundne fraktion indikerer, at ikke-wild-type nukleotid fortrinsvis er udelukket fra den bundne fraktion (α-thio A). Relative intensiteter i forskellige bands inden for den bundne lane tilbyder også kvantitative oplysninger om omfanget af interferens fra vilde type rester på forskellige steder. Med andre ord interferere mutant eller ikke-vildtype nukleotider på specifikke positioner med protein binding. Endelig, teste effekten af rygraden svovl substitution (phosphorothioate) på en af de ikke-bridging oxygens (α-thio U), viser at tre positioner viser mindre effekter fra rygraden sulfurs (f.eks. 6, 7 og sig nedenstående 7). Vores kombineret resultaterne viser at flere positioner inden for bindingssted Vis præferentielle forsvinden eller reduceret intensiteter af specifikke bands i den bundne fraktion. Dette er på grund af base i stedet for rygraden substitution, der angiver protein interaktioner med specifikke baser i bindingssted (α-thio A). I mellemtiden, inkorporering af α-thio C viser et interferensmønster sammenlignes med α-thio A. Dog kun 3 – 4 α-thio G udskiftninger vise små men påviselige indblanding centreret omkring, for eksempel positioner nummererede 2 og 3 (data ikke vist). Denne metode har været brugt til at afsløre forskelle i hvordan de splejsning repressor SXL og den generelle splejsning faktor U2 snRNP hjælpeansatte faktor (U2AF65) bindes til en identisk pre-mRNA splejsning signal sekvensen (polypyrimidine-tarmkanalen) på forskellige måde,15 .
Figur 1: Flow diagram af nøglen skridt i phosphorothioate mutagenese (PTM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af en phosphorothioate kobling mellem to nukleotider, som kan være kemisk kløvet af jod. Svovl erstatter en af de ikke-bridging fosfat oxygens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: princippet om partitionering på grund af interferens. Hypotetiske RNA indeholder repræsentative α-thio nukleotider på seks positioner, herunder en protein-bindingssted. Efter protein binding, er RNA kløvet på websteder phosphorothioate vedtægter af jod. Positioner 1-7 i og omkring bindingssted nummereres vilkårligt for reference i teksten. Position 2 eller manglende band repræsenterer ingen phosphorothioate stiftelsesoverenskomst eller ikke-doped nukleotid. Lane T er total RNA og lane B er protein-bundet RNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Phosphorothioate mutagenese (PTM) tilgang tillader mætning mutagenese af en polypyrimidine-tarmkanalen/3 «splejsning websted i transformer pre-mRNA. Lane T er total RNA og lane B er protein-bundet RNA. Α-thio en repræsenterer RNA syntetiseret i overværelse af α-thio ATP og identificerer doteret positioner med α-thio adenosines i sekvensen. Tre stærke bånd svarer til adenosines i rækkefølge på disse positioner. Α-thio U repræsenterer RNA syntetiseret i overværelse af α-thio UTP og identificerer alle uridines, herunder doteret positioner i sekvensen. Lodrette linje i venstre side markerer SXL bindingssted. Stillinger 1-8 i bindingssted er nummererede til referenceformål og for at lette beskrivelse i afsnittet resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagenese har længe været anvendt til at karakterisere protein bindingssteder. Først, kan en række mutanter konstrueret og individuelt testet i bindende assays til at analysere deres virkninger på bindende affinitet. Mens en standard mutagenese tilgang tilbyder en måde at analysere flere sekvenser, flere trin involveret i standardmetoden, som opbygningen af mutanter og udfører en række bindende reaktioner for hver mutant, er besværlig og tidskrævende og kan ikke Tillad mætning mutagenese, især for længere sekvenser. For det andet en sekvens kan blive randomiseret og poolen bruges til flere cyklusser af bindende og polymerase kædereaktion (PCR) forstærkning. Disse sekvenser, der binder protein bliver nødt til at blive klonet og sekventeret for at identificere og validere en bindingssted fra konsensus sekvens. Ikke desto mindre, denne iterative bindende og forstærkning indstilling omfatter flere trin og er besværlige at identificere restkoncentrationer, der er vigtige inden for bindingssted. Desuden kan gentagne sekvens klarlægger iboende til PCR indføre sekvens bias. For det tredje kan sekvenser valgt fra en tilfældig pulje blive sekventeret ved hjælp af en hurtigere løsning af høj overførselshastighed sekventering, selvom det er forholdsvis dyrt. Derfor, for at overvinde disse begrænsninger af flere trin, besværlige og/eller dyre metoder, vi udtænkt en hurtigere, billig, og vigtigst en trinvis metode, beskrevet her, for at opnå mætningen mutagenese af en bindingssted (PTM).
De vigtigste skridt i denne tilgang omfatter identifikation eller mærkning af ikke-wild-type nukleotider. Vi brugte phosphorothioate nukleotider, hvor en af oxygens i fosfat rygraden er substitueret med svovl, som beskrevet (figur 2). Fordelen er, at jod kan bruges til kemisk kløver rygraden i phosphorothioate nukleotid. Således genererer jod kløvningen af RNA-substratet indeholdende en phosphorothioate rygrad en sekventering-type stige, hvor stedet for spaltning er en proxy eller tag for tilstedeværelsen af en af fire baser på denne holdning. En sammenligning af de ubundne og samlede fraktioner identificerer reststoffer, der fortrinsvis er udelukket fra den bundne fraktion og dermed er vigtig for protein binding. Derimod forbliver i tilfælde, ikke der er vigtige for bindende ligeligt fordelt mellem de to fraktioner. Denne fremgangsmåde kan bruges til at definere bindingssteder for et RNA-bindende protein.
I Resumé tilbyder denne et-trins mætning mutagenese tilgang, ved at kombinere doping, phosphorothioates og jod kavalergang, et kraftfuldt middel til karakterisering af enhver bindingssted i RNA. Denne tilgang kræver dog, at bindingssted er allerede kendt før mutagenese. Protein-bindende betingelser skal desuden optimeret til hvert protein. Følgende forholdsregler skal understreges. RNA haandteringsforholdsregler skal udøves, som iført handsker, forberedelse af løsninger og buffere i DEPC-behandlet vand, autoklavering pipette tips og rør, og afsætter udstyr til RNA bruges kun til at undgå RNAses. Tilsvarende er pleje der involverer radioaktive skjolde, radioaktive overvågning ved hjælp af radioaktivt materiale er afgørende, og brug af udstødning hood mens du bruger farlige kemikalier nødvendige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatteren tak National Institutes of Health til sidste finansiering og tak Michael R. Green for syntese oligonukleotider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
