Summary
Les protéines qui se lient à des séquences d’ARN spécifiques jouent un rôle crucial dans l’expression des gènes. Une caractérisation détaillée de ces sites de liaison est cruciale pour notre compréhension de la régulation des gènes. Ici, une approche pas à pas pour la mutagénèse de saturation des sites de liaison protéique dans l’ARN est décrite. Cette approche est pertinente pour tous les sites de liaison aux protéines dans l’ARN.
Abstract
Régulation des gènes joue un rôle important dans le développement. Nombreuses protéines de liaison DNA et RNA lient hautement leur séquence cible pour contrôler l’expression des gènes. Ces protéines régulatrices contrôlent l’expression des gènes au niveau de l’ADN (transcription) ou au niveau de l’ARN (l’épissage de l’ARN pré-messager, polyadénylation, mRNA transport, décomposition et traduction). Identification des séquences régulatrices aide à comprendre non seulement comment un gène est activé ou désactivée, mais aussi quels gènes en aval sont réglementés par une protéine régulatrice particulière. Nous décrivons ici une approche une étape qui permet de mutagénèse de saturation d’un site de fixation de protéines dans l’ARN. Il s’agit de dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides non-sauvage au sein de l’accepteur, la synthèse d’ARN séparés avec chaque nucléotide phosphorothioate et l’isolation de la fraction liée après incubation avec les protéines. Interférence de nucléotides non-sauvage se traduit par leur exclusion préférentielle de la fraction liée aux protéines. Ceci est contrôlé par électrophorèse suivant un clivage chimique sélectif avec l’iode des liaisons phosphodiester contenant phosphorothioates (phosphorothioate mutagénèse ou PTM). Cette approche de mutagenèse seule étape saturation est applicable à la caractérisation de n’importe quel site de liaison des protéines dans l’ARN.
Introduction
Régulation des gènes joue un rôle important en biologie. Gènes peuvent être réglés au niveau de la transcription, épissage de l’ARN pré-messager, 3' fin formation, exportation RNA, traduction, localisation de l’ARNm, carie, modification poteau-de translation/stabilité, etc. les deux protéines de liaison à l’ADN - et l’ARN jouent un rôle clé dans le gène Règlement. Alors que les analyses de génétiques moléculaires ont identifié de nombreuses protéines régulatrices, seulement un petit sous-ensemble d’eux ont été caractérisés entièrement pour leurs fonctions cellulaires ou de sites de liaison in vivo. Mutagenèse et analyse phylogénétique séquence offrent des approches complémentaires pour caractériser les interactions ADN - ou ARN-protéine.
Protéines de liaison à l’ARN sont importants dans le processus de développement, y compris la différenciation sexuelle. La protéine de Drosophila Sex-lethal (SXL) ou la protéine sex-interrupteur général est absente dans les mâles, mais présent chez les femelles. Il reconnaît les séquences riches en uridine ou pyrimidiques adjacentes aux sites d’épissage spécifiques dans les cibles du pré-ARNm en aval (transformateur, Sex-lethalet spécifique aux mâles lethal2) dans les cellules somatiques1,2 ,3,4. En outre, il réglemente polyadénylation site commutation en se liant aux séquences enhancer riche en uridine polyadénylation dans renforceur de rudimentaires (e(r)) transcription5,6. SXL probable réglemente des cibles supplémentaires dans les cellules germinales femelles qui restent à être identifiés1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Caractérisation d’un site de liaison implique généralement, mutagenèse, par exemple, par la suppression ou la substitution d’un ou de plusieurs nucléotides. Chaque site de liaison mutant, par rapport à la séquence d’ARN sauvage, est ensuite analysée à l’aide d’une série de concentrations de protéines afin de déterminer son affinité (Kd ou équilibre de dissociation constante) pour la protéine d’intérêt ; Kd est la concentration de protéines nécessaire pour obtenir 50 % ARN contraignantes. Ce processus fastidieux de la mutagénèse détaillé implique la génération et l’analyse de nombreux mutants — trois nucléotides non-wild type pour chaque poste dans le site de liaison. Ainsi, il y a un besoin pour une approche différente pour la mutagénèse de saturation plus rapide, plus simple et peu coûteux de sites de fixation de protéines dans l’ARN.
Nous décrivons ici une approche une étape qui permet de mutagénèse de saturation d’un site de fixation de protéines dans l’ARN. Il s’agit de dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides non-sauvage au sein de l’accepteur, la synthèse d’ARN séparés avec chaque nucléotide phosphorothioate et l’isolation de la fraction liée après incubation avec les protéines. Interférence de nucléotides non-sauvage se traduit par leur exclusion préférentielle de la fraction liée aux protéines. Ceci est contrôlé par électrophorèse suivant un clivage chimique sélectif avec l’iode des liaisons phosphodiester contenant phosphorothioates (phosphorothioate mutagénèse ou PTM). Cette approche de mutagenèse seule étape saturation est applicable à la caractérisation de n’importe quel site de liaison des protéines dans l’ARN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE : Figure 1 donne un aperçu de la mutagénèse phosphorothioate et résume les étapes clés du processus.
1. génération d’une bibliothèque de Mutants — dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides Non-wild Type
- Synthétiser l’amorce T7 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') par synthèse chimique sur un synthétiseur d’ADN.
- Synthétiser un oligonucléotide dopé (brin complémentaire) par synthèse chimique sur un synthétiseur d’ADN correspondant au site de liaison des protéines. Utiliser un mélange approprié de leur au cours de la synthèse chimique pour chaque site de dopage (X ci-dessous) avec une proportion de 90 % A comme le nucléotide de type sauvage et 10 % T comme le nucléotide de type non-sauvage (voir résultats représentatifs pour plus de détails sur ce ratio).
Note : Ici, la séquence de l’oligonucléotide dopé est 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. La séquence a souligné est le complément inverse du site de liaison protéine SXL, plus des nucléotides supplémentaires en dehors du site de liaison qui fournissent des contrôles utiles confirmant que pas chaque changement dans l’ARN n’affectait contraignant, comme étant le chargement des contrôles pour comparaison et normalisation des nucléotides au sein du site de liaison. La séquence de site SXL-liaison UUUUUGUUGUUUUUUUU, qui est présent dans le transformateur pré-ARNm14,15,16,17, a été utilisée pour élaborer la méthodologie proposée. La séquence en italique est complémentaire de la séquence d’amorce T7 et le promoteur T7 pour la transcription in vitro .
2. synthèse de l’ARN
-
Synthétiser l’ARN en une réaction de transcription de 20 µL, comme précédemment décrit18.
- Tampon de transcription T7 Mix et 1 oligonucléotide de T7 µM, 1µm dopé oligonucléotide, 10 mM le dithiothréitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM de chaque ATP, CTP et UTP (uridine, adénosine, cytidine et guanosine triphosphate) et 2 U/µL ARN polymérase T7.
- Ajouter, dans les deux tubes de microcentrifuge distinct, 0,167 mM α-thio ATP ou 0,05 mM α-thio UTP à intégrer RNAs de phosphorothioates (voir schémas dans la Figure 2).
Remarque : Pour des protocoles alternatifs, ajouter 0,2 mM α-thio CTP ou 0,2 mM α-thio GTP pour contrer une réaction appropriée de transcription contenant un oligonucléotide dopé pour tester les deux autres substitutions nucléotidiques. - Incuber le mélange de réaction de synthèse de RNA pendant 2 h à 37 ° C.
- Ajouter 2,5 µL phosphatase alcaline thermolabile et 2,5 µL de tampon de 10xphosphatase à l’échantillon de RNA. Incuber à cette réaction de 25 µL à 10 – 30 min à 37 ° C pour éliminer 5' phosphates.
- Inactiver l’enzyme phosphatase alcaline par chauffage à 80 ° C pendant 2 à 5 min.
- Radiolabel l’extrémité 5' de l’ARN déphosphorylée (pmole 5) à l’aide de 1 µL T4 polynucléotide kinase et 1 µL γ -32P ATP dans un volume réactionnel de 10 µL. Incuber le mélange réactionnel durant 30 à 60 min à 37 ° C.
- Inactiver les enzymes de kinase de polynucléotide T4 par chauffage à 65 ° C pendant 20 à 30 min.
- Gel de purifier l’ARN par électrophorèse dans un 10 % dénaturante sur gel de polyacrylamide. Repérez les RNA sur le gel par autoradiographie. La tranche de gel contenant des ARN radioactif de l’accise, écraser dans un tube de microcentrifuge en appuyant contre les murs avec un embout de la pipette et tremper dans le tampon de protéinase K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, dodécyl sulfate de Sodium 1 %). Tourner le tube à la température ambiante de 2 h à une nuit.
- Centrifuger la gel de boue, jeter le gel et recueillir la solution tampon.
- Extraire la solution deux fois avec un volume égal de phénol-chloroforme et une fois avec du chloroforme et recueillir la phase aqueuse.
- Ajouter du volume de la phase aqueuse 0,1 de 3M acétate de Sodium, pH 5,2, porteur d’ARNt ou glycogène et 2,5 volume d’éthanol. Conserver l’échantillon à-80 ° C pendant 1 h.
- Centrifuger l’échantillon pendant 5 – 10 min dans une microcentrifugeuse haute vitesse à 16 873 x g. Retirez soigneusement la solution tampon/éthanol sans déranger le culot de RNA.
- Laver le culot avec 70 % d’éthanol et centrifuger pendant 2 à 5 min. Retirez l’éthanol soigneusement. Sécher le culot dans l’air.
- Resuspendre le culot dans 20 à 50 µL diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-l’eau traitée. Conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
Remarque : Effectuez toutes les étapes avec ARN radioactif en utilisant les précautions appropriées et un bouclier de plexiglass pour protéger contre la radioactivité. Actuellement, colonnes à centrifuger sont plus couramment utilisée et plus facile à enlever la radioactivité non constituées en société, comme une alternative au gel de purification de l’ARN.
3. fixation de réaction et la séparation de l’ARN lié aux protéines
- Exprimer la protéine recombinante dans et purifier d’e. coli.
- Estimer la concentration de la protéine recombinante en spectrophotométrie ou en séparant dans un gel SDS-polyacrylamide à côté d’une albumine de sérum protéiques connus standard, bovine (BSA). Visualiser la protéine d’intérêt et la BSA standard par coloration du gel avec le bleu de Coomassie brillant bleu R-250. Quantifier la protéine en comparaison des quantités connues de dilutions de BSA sur le même gel.
NOTE : Stocker la protéine recombinante à - 80 ° C jusqu'à l’utilisation et diluer dans 20 mM 4-(2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-ethanesulfonic d’acide (HEPES), pH 8,0, 1 mM le dithiothréitol (DTT), 0,2 mM acide tétraacétique (EDTA), 0,05 % NP-40, 20 % de glycérol. Utilisation de 0,5 à 1,0 mM protéase inhibiteur phenylmethane fluorure (PMSF) est facultatif. - Effectuer la réaction (20 à 100 µL) de liaison à l’ARN en 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimètre DTT, 50 mM KCl, inhibiteur de RNase 0,5 unités/µL, 0,09 µg/µL acétylé albumine sérique bovine, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL ARNt, l’extrémité 5'-radiomarquée ARN et 6 µL de concentration appropriée (une concentration au cours de laquelle environ 50 % de l’ARN se lie aux protéines) de la protéine.
Remarque : Ce tampon de liaison travaille pour trois protéines ARN-contraignantes (SXL, U2AF65et PTB), mais doit être normalisée pour une protéine d’intérêt. Estimer la concentration de protéines empiriquement, à l’aide de diverses dilutions pour une préparation de protéine donnée, qui est tenue d’obtenir environ 50 % ARN contraignantes. Cette condition ou Kd représente la partie la plus sensible de la courbe de liaison à l’ARN. - Incubez la réaction de liaison protéique pendant 20 à 30 min à 25 ° C (ou sur la glace).
-
Séparer la fraction d’ARN protéinique de la fraction non liée à l’aide d’une des deux approches :
- Liaison de filtre de nitrocellulose
- Appliquez la réaction de liaison (20 à 100 µL) sur un filtre de nitrocellulose relié à un collecteur sous vide à température ambiante.
Remarque : Uniquement le complexe ARN-protéine est piégé dans le filtre et non consolidé des flux de RNA à travers le filtre. L’approche de liaison filtre permet une récupération plus élevée de l’ARN dépendant et est plus rapide et plus simple, par rapport à l’analyse de décalage de mobilité de gel. En plaçant une membrane DEAE sous le filtre de nitrocellulose, il est également possible de recueillir la fraction de RNA libre ou gratuit RNA pour comparaison avec la fraction liée. - Couper la partie du filtre de nitrocellulose contenant la rétention ARN radioactive en petits morceaux pour s’insérer dans un tube de microcentrifuge, tremper dans la mémoire tampon PK suffisante (300 – 500 µL contenant 10 à 20 µg PK) de plonger les morceaux de filtre et éluer l’ARN du filtre pour 2 à 3 h ou toute une nuit.
- Extrait avec du phénol-chloroforme, chloroforme et recueillir la phase aqueuse. Ajouter de l’éthanol et acétate de sodium et, après incubation dans le congélateur, centrifuger, laver, sécher et remettre en suspension les ARN dans l’eau traitée DEPC. Procédez comme indiqué dans les étapes 2.10 à 2.14 ci-dessus.
- Appliquez la réaction de liaison (20 à 100 µL) sur un filtre de nitrocellulose relié à un collecteur sous vide à température ambiante.
- Décalage de mobilité de gel
- Préparer et polymériser un gel de polyacrylamide native de 5 % (60 : 1 Acrylamide:bis-acrylamide) à 0,5 x TBE (tampon Tris-Borate-EDTA étalon) avant de démarrer la réaction de liaison, comme une alternative à la méthode de fixation du filtre.
- Courir avant le gel pendant 15 min à 250 V dans une chambre froide (4 ° C).
- Chargez chaque réaction de liaison (voir ci-dessus) dans des puits séparés du gel avant exécution ci-dessus.
Remarque : Le tampon de conservation des protéines offre glycérol suffisante pour le chargement de l’échantillon dans les puits. - Séparer l’ARN liés aux protéines par électrophorèse sur gel dans une chambre froide à 250 V pendant 1 à 2 h, selon la taille de RNA et la protéine spécifique.
- Localiser la position du complexe ARN-protéine sur le gel par autoradiographie. La tranche de gel contenant le complexe ARN-protéine de l’accise. Éluer l’ARN de la tranche de gel en écrasant la tranche de gel et de trempage dans le tampon de PK.
- Extrait avec du phénol-chloroforme, chloroforme et recueillir la phase aqueuse. Ajouter de l’éthanol et acétate de Sodium et, après incubation dans le congélateur, centrifuger, laver, sécher, à l’air et remettre en suspension les ARN dans l’eau traitée DEPC. Procédez comme indiqué dans les étapes 2.10 à 2.14 ci-dessus.
- Liaison de filtre de nitrocellulose
4. analyse des produits Phosphorothioate clivée iode pour la détection des Positions nucléotidiques Mutant
- Ajouter iode 1 mM dans une eau traitée DEPC contenant jusqu'à 10 µg transporteur de 20 µL ARNt pour cliver l’ARN (ARN dépendant et total) sur les sites d’incorporation phosphorothioate. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
Remarque : De plus amples renseignements sur le clivage de l’iode avec des conditions légèrement différentes — iodoethanol de 7 % (v/v), chauffage à 95 ° C pendant 3 min, se trouvent à Gish & Eckstein 198819. - Précipiter RNA clivé par l’ajout de sodium acétate/éthanol, tel que décrit ci-dessus. Resuspendre dans une teinture de chargement pour dénaturation des gels. Faire chauffer et charger l’échantillon afin de séparer les fragments d’ARN par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide dénaturisation de 15 à 20 %.
- Exposer le gel de polyacrylamide à une radiographie.
- Détecter les bandes dans la fraction liée par rapport à la masse totale par autoradiographie.
Remarque : Effectuez toutes les étapes avec de l’iode dans un conduit d’évacuation. Pour la séparation de RNA ci-contre, un gel en forme de coin est employé, qui est réalisé en doublant l’épaisseur des deux entretoises en bas des plaques de gel en insérant une entretoise supplémentaire pouces de long au fond du gel. Cette forme permet plus uniforme et plus proche espacement plus courts fragments d’ARN. Alternativement, un phosphorimager peut être utilisé au lieu de films radiographiques pour la détection et la quantification de la radioactivité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Principe de la mutagénèse de saturation à l’aide de dopage :
Pour un ratio molaire approprié de type sauvage et autres nucléotides, utilisez un mélange égal de tous les quatre nucléotides si seulement une position doit être analysé. Toutefois, si plusieurs positions sont analysées en même temps, il faut régler le ratio de type non sauvage aux nucléotides de type sauvage, c'est-à-dire réduite. Sinon, outre les substitutions simples, qui est souhaité, il y aura aussi des modèles avec plusieurs nucléotides non typé sauvage dans une molécule, excluant l’analyse de l’effet des substitutions mononucléotidiques. Ainsi, une règle, utilisez un rapport de type non sauvage aux nucléotides sauvage de 1/n, où n est le nombre de postes à analyser. Ici, nous avons analysé les 10 postes simultanément et utilisé un mélange contenant 90 % du nucléotide sauvage et 10 % du nucléotide sans type sauvage pour dopage la matrice d’ADN. Réactions de transcription distinctes sont faites, dans lequel chaque réaction de transcription est effectuée avec l’un des quatre phosphorothioates. Ainsi, chaque réaction surveille un nucléotide spécifique aux positions dopés.
Principe de partitionnement à cause d’interférences :
Dans l’approche de mutagenèse présentée ici, ARN ont en moyenne moins d’un résidu phosphorothioate par molécule. Au cours du processus de liaison, séparation de molécules de RNA entre la fraction liée aux protéines et la fraction libre. Un nucléotide particulier est lié à une liaison phosphorothioate, clivage de la liaison de colonne vertébrale phosphorothioate est une indication de la présence d’un nucléotide spécifique à cette position. Il est prévu qu’à une position donnée, lorsqu’un nucléotide est modifié il peut avoir soit sans effet sur la liaison ou il peut inhiber la liaison, partiellement ou complètement. Si présence d’un nucléotide spécifique n’a aucun effet sur la liaison il sera tout aussi partition entre les fractions protéinique et indépendantes. Toutefois, si un nucléotide spécifique à une position donnée interfère avec la liaison aux protéines il sera préférentiellement exclue de la fraction liée aux protéines. Le degré d’interférence peut être quantitativement surveillé pour chacune des positions dans la même réaction après électrophorèse sur gel. Ce concept est illustré par un schéma (Figure 3). Dans la fraction d’ARN totale (voie T), intensité de la bande est approximativement égale pour tous les postes dopés (groupes 1, 3-7). Dans la fraction d’ARN protéinique (voie B), aux positions 1, 4 et 7, le nucléotide n’a aucun effet sur la liaison. Toutefois, dans les positions 3 et 6, il interfère avec la liaison et ainsi est exclu de la fraction liée. À la position 5, interférence est partielle. Ainsi, la comparaison des quatre voies appariés, T et B pour chaque nucléotide, permettre pour l’analyse de tous les quatre nucléotides. Il devrait être noté que nucléotides sauvage pour une position donnée reflète l’effet, le cas échéant, du soufre dans le squelette de RNA sur la liaison aux protéines.
L’accompagnement autoradiogramme (Figure 4) montre deux paires (α-thio A et α-thio U) de voies d’un gel dénaturant (T pour l’ensemble) et B pour la fraction liée. Plusieurs observations peuvent être faites en comparant les intensités des bandes à chaque position entre chaque paire de voies (T et B). Tout d’abord, la majorité du signal est en haut du gel, c'est-à-dire, clivés produit, pour les deux α-thio une voie U lane et α-thio. En second lieu, des voies α-thio A paire, plusieurs bandes (produits de clivage d’iode) sont identiques entre la limite et les fractions de RNA totales par exemple, les bandes supérieures à 1 ; bandes pertinentes au sein du site de liaison de le α-thio une voie sont numérotées pour référence. Troisièmement, les bandes en bas du gel sont plus rapprochées (p. ex. des bandes inférieur à 6) que d’habitude pour un gel de séquençage. Quatrièmement, plusieurs groupes sont présents dans la fraction d’ARN totale mais absent ou significativement réduite dans la fraction dépendante de l’ARN (p. ex. des bandes 1, 2, 3 et 5). Cinquièmement, pour la paire de voies U α-thio, tandis que la plupart des bandes sont comparables entre les voies des totales et liés, certaines bandes sont relativement moins intenses dans la fraction liée (par exemple, les groupes 7 et 8).
Ces observations prouvent au succès du développement de cette nouvelle méthode et plomb aux conclusions suivantes : tout d’abord, pour les α-thio A paire ruelles et α-thio U paire lanes, parce que la plupart de l’ARN sont clivés, il fournit une preuve que seule une infime partie de l’ARN contient modifiés ou résidus phosphorothioate. Ceci est important car il constate que les molécules d’ARN contiennent pas plus d’un résidu phosphorothioate. Intensités deuxième, identiques ou similaires pour plusieurs bandes en dehors du site de liaison entre les deux voies, à α-thio-A et U α-thio, démontrent que le chargement est comparable pour les deux voies, permettant une comparaison facile entre les voies. Troisièmement, plus rapprochées des bandes sont atteints, pour α-thio A et α-thio U, par la forme en coin du gel (plus mince dans la partie supérieure et plus épais en bas), permettant ainsi une analyse de la plus longue séquence lectures et offrant une résolution plus élevée. En général, fragments plus courts sont plus largement espacées dans un gel d’épaisseur uniforme. Quatrièmement, disparition ou diminution d’intensité de certaines bandes de la fraction liée indique que les nucléotides non-sauvage est préférentiellement exclu de la fraction liée (α-thio A). Les intensités relatives des différents groupes au sein de la voie liée offrent également des informations quantitatives sur l’étendue du brouillage causé par les résidus sans type sauvage des lieux différents. En d’autres termes, le mutant ou nucléotides sans type sauvage à des positions spécifiques interfèrent avec la liaison aux protéines. Enfin, tester l’effet de la substitution de soufre épine dorsale (thiophosphate) à l’un des oxygènes non-transition (α-thio U), montre que les trois positions montrent des effets mineurs des atomes de soufre du squelette (par exemple, 6, 7 et celui inférieur à 7). Nos résultats montrent que plusieurs postes au sein de l’accepteur Voir la disparition préférentielle ou réduit l’intensité des bandes spécifiques dans la fraction liée. C’est en raison de la substitution de base plutôt que d’épine dorsale, indiquant des interactions des protéines avec des bases spécifiques dans le site de liaison (α-thio A). Pendant ce temps, incorporation de α-thio C montre une figure d’interférence comparables α-thio a. Cependant, seulement 3-4 α-thio substitutions de G Voir la petites, mais aussi détectable interférence autour, par exemple, numérotée 2 et 3 (données non présentées). Cette méthode a été utilisée pour révéler des différences dans Comment le répresseur épissage SXL et le général snRNP U2 épissage de facteur facteur auxiliaire (U2AF65) se lient à une séquence de signaux épissage pré-ARNm identique (polypyrimidine-tract) de manière distincte15 .
Figure 1 : organigramme de clé intervient phosphorothioate mutagenèse (PTM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : schéma d’un lien de phosphorothioate entre deux nucléotides, qui peut être clivé chimiquement par l’iode. Soufre remplace un des oxygènes non-transition phosphate. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : principe de partitionnement à cause d’interférences. RNA hypothétique contient représentant α-thio nucléotides à six postes, y compris un site la liaison aux protéines. Suite à la liaison aux protéines, RNA est clivé à sites phosphorothioate constitutifs par l’iode. Positions 1 à 7 dans et autour du site de liaison sont numérotées arbitrairement pour référence dans le texte. Position 2 ou manquant de bande ne représente aucun phosphorothioate incorporation ou nucléotides non dopé. Lane T ARN total et voie B est RNA protéinique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : approche de mutagenèse (PTM) Phosphorothioate permet de mutagénèse de saturation d’un tractus polypyrimidine/3 ' splice site présent dans le transformateur pré-ARNm. Lane T ARN total et voie B est RNA protéinique. Α-thio un ARN représente synthétisé en présence d’ATP α-thio et identifie les postes dopés avec α-thio adenosines dans la séquence. Trois bandes fortes correspondent à adenosines dans la succession à ces postes. Α-thio U représente l’ARN synthétisé en présence de α-thio UTP et identifie tous les uridines, y compris les positions dopées, dans la séquence. Une ligne verticale sur la gauche marque le site de liaison SXL. Positions 1 à 8 dans le site de liaison sont numérotées pour fins de référence et pour faciliter la description dans la section résultats. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagenèse a longtemps été utilisé pour caractériser les sites de fixation des protéines. Tout d’abord, une série de mutants peut être construite et testée individuellement en tests d’analyser leurs effets sur l’affinité de liaison. Alors qu’une approche de mutagenèse standard offre la possibilité d’analyser plusieurs séquences, plusieurs étapes impliquées dans l’approche standard, comme construire des mutants et exécutent une série de réactions pour chaque mutant de liaison, est laborieux et prend du temps et ne peut pas permettre la mutagénèse de saturation, surtout pour des séquences plus longues. Deuxièmement, une séquence peut être aléatoire et la piscine utilisée pour plusieurs cycles de liaison et la polymérase PCR amplification (PCR). Ces séquences qui lient les protéines devront être cloné et séquencé pour identifier et valider un site de liaison de la séquence consensus. Néanmoins, cette option itérative de liaison et l’amplification fait en plusieurs étapes et est laborieuse pour identifier les résidus qui sont importants au sein du site de liaison. En outre, séquence répétée des amplifications inhérente à la PCR peuvent introduire un biais de séquence. En troisième lieu, séquences sélectionnées de la piscine au hasard peuvent être séquencés en utilisant une option plus rapide de le séquençage à haut débit, même si c’est relativement cher. Par conséquent, pour surmonter ces limites de plusieurs étapes, méthodes laborieux et coûteux, nous avons conçu un plus rapide, peu coûteux et surtout une méthode pas à pas, décrite ici, pour accomplir la mutagénèse de saturation d’un site de fixation (PTM).
Les étapes clés de cette approche comprennent l’identification ou le marquage de la nucléotides non-sauvage. Nous avons utilisé le phosphorothioate nucléotides, dans lequel un des oxygènes dans le phosphate d’épine dorsale est substitué avec du soufre, comme décrit (Figure 2). L’avantage est qu’iode peut servir à attacher chimiquement l’épine dorsale du nucléotide phosphorothioate. Ainsi, un clivage iode du substrat RNA contenant un squelette phosphorothioate génère une séquençage de type échelle, où le site de clivage est un proxy ou balise pour la présence de l’une des quatre bases à cette position. Une comparaison des fractions non reliées et totales identifie les résidus qui sont préférentiellement exclus de la fraction liée et sont donc importants pour la liaison aux protéines. En revanche, les résidus qui ne sont pas importants pour la liaison demeurent également répartis entre les deux fractions. Cette approche peut être utilisée pour définir les sites de liaison pour toute protéine de liaison à l’ARN.
En résumé, cette approche de mutagenèse de saturation en une seule étape, combinant le dopage, phosphorothioates et le clivage de l’iode, offre un moyen puissant pour la caractérisation d’un site de liaison dans l’ARN. Toutefois, cette approche nécessite que l’accepteur est déjà connu avant la mutagénèse. En outre, la liaison aux protéines – conditions doivent optimisé pour chaque protéine. Les précautions suivantes doivent être soulignés. Précautions pour la manipulation de RNA doivent être exercées, comme avec des gants, préparation de solutions et tampons dans l’eau traitée DEPC, tubes et embouts de pipette de passage à l’autoclave et consacrant l’équipement pour l’ARN utilisent uniquement pour éviter les RNAses. De même, les soins prodigués par des boucliers radioactifs, radioactifs surveillance en utilisant des matières radioactives est essentielle et l’utilisation de hotte d’aspiration lors de l’utilisation de produits chimiques dangereux sont nécessaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L’auteur déclare sans intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
L’auteur remercie les National Institutes of Health, le financement passé et Merci Michael R. Green pour la synthèse d’oligonucléotides.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
