Summary
Proteine che legano specifiche sequenze di RNA giocano un ruolo critico nell'espressione genica. Caratterizzazione dettagliata di questi siti di legame è cruciale per la nostra comprensione della regolazione genica. Qui, è descritto un approccio passo-passo per mutagenesi di saturazione dei siti di legame delle proteine nel RNA. Questo approccio è rilevante per tutti i siti di legame delle proteine nel RNA.
Abstract
Regolazione genica svolge un ruolo importante nello sviluppo. Numerose proteine DNA e RNA-associazione legano loro sequenze bersaglio con elevata specificità per controllare l'espressione genica. Queste proteine regolatrici controllano l'espressione genica a livello del DNA (trascrizione) o a livello di RNA (pre-mRNA che impiomba, poliadenilazione, trasporto del mRNA, decadimento e traduzione). Identificazione di sequenze regolatrici aiuta a capire non solo come un gene è acceso o spento, ma anche quali geni a valle sono regolati da una particolare proteina regolatrice. Qui, descriviamo un approccio one-step che consente la mutagenesi di saturazione di un sito di legame della proteina nel RNA. Si tratta di doping mascherina del DNA con non-selvaggio-tipo nucleotidi all'interno del sito di legame, sintesi di RNA separata con ogni nucleotide fosforotioato e l'isolamento della frazione legata dopo incubazione con proteine. Interferenze da parte di non-selvaggio-tipo nucleotidi provoca loro esclusione preferenziale dalla frazione legata alle proteine. Questo è monitorato mediante elettroforesi in gel dopo fenditura chimica selettiva con iodio di legami fosfodiesterei contenente fosforotioati (mutagenesi fosforotioato o PTM). Questo approccio di mutagenesi passo singolo saturazione è applicabile per la caratterizzazione di qualsiasi sito di legame della proteina nel RNA.
Introduction
Regolazione genica svolge un ruolo importante nella biologia. Geni possono essere regolati a livello di trascrizione, impionbatura pre-mRNA, 3' fine formazione, esportazione di RNA, traduzione, localizzazione di mRNA, decadimento, modificazione post-traduzionale/stabilità, ecc che entrambe le proteine DNA e RNA-associazione giocano un ruolo chiave nel gene regolamento. Mentre le analisi genetiche molecolari hanno identificato numerose proteine regolatorie, solo un piccolo sottoinsieme di esse sono state caratterizzate completamente per loro funzioni cellulari o associazione siti in vivo. Mutagenesi e l'analisi di sequenza filogenetica offrire approcci complementari per caratterizzare le interazioni DNA o RNA-proteina.
Le proteine RNA-leganti sono importanti nei processi di sviluppo, tra cui la differenziazione sessuale. La proteina di Drosophila Sex-lethal (SXL) o la proteina di sesso-interruttore generale è assente nei maschi, ma presente nelle femmine. Essa riconosce sequenze ricche uridina o pirimidina-tratti adiacenti ai luoghi specifici della giuntura in a valle pre-mRNA bersaglio (trasformatore, sesso-letalee maschio-specific lethal2) in cellule somatiche1,2 ,3,4. Inoltre, esso regola sito di poliadenilazione commutazione legandosi alle sequenze di enhancer poliadenilazione uridina-ricco in trascrizione rinforzatore di rudimentali (e(r))5,6. SXL probabile regola obiettivi supplementari sulla linea germinale femminile che devono ancora per essere identificati1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Caratterizzazione di un sito di legame coinvolge tipicamente, mutagenesi, ad esempio, per l'eliminazione o sostituzione di uno o più nucleotidi. Ogni sito di legame mutante, riguardante la sequenza di RNA wild-type, viene poi analizzata utilizzando una serie di concentrazioni di proteina per determinare la sua affinità di legame (dissociazioneKd o equilibrio costante) per la proteina di interesse; Kd è la concentrazione di proteine necessaria per ottenere 50% legame al RNA. Questo processo laborioso di mutagenesi dettagliata comporta generazione e analisi di numerosi mutanti — tre nucleotidi non-wild type per ogni posizione nel sito di legame. Così, c'è la necessità di un approccio alternativo per mutagenesi di saturazione più veloce, più semplice ed economica di siti di legame della proteina nel RNA.
Qui, descriviamo un approccio one-step che consente la mutagenesi di saturazione di un sito di legame della proteina nel RNA. Si tratta di doping mascherina del DNA con non-selvaggio-tipo nucleotidi all'interno del sito di legame, sintesi di RNA separata con ogni nucleotide fosforotioato e l'isolamento della frazione legata dopo incubazione con proteine. Interferenze da parte di non-selvaggio-tipo nucleotidi provoca loro esclusione preferenziale dalla frazione legata alle proteine. Questo è monitorato mediante elettroforesi in gel dopo fenditura chimica selettiva con iodio di legami fosfodiesterei contenente fosforotioati (mutagenesi fosforotioato o PTM). Questo approccio di mutagenesi passo singolo saturazione è applicabile per la caratterizzazione di qualsiasi sito di legame della proteina nel RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Nella figura 1 viene fornita una panoramica di mutagenesi fosforotioato e riassume i passaggi chiave nel processo.
1. generazione di una libreria di mutanti — Doping mascherina del DNA con nucleotidi Non di tipo selvaggio
- Sintetizzare T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') di sintesi chimica su un sintetizzatore di DNA.
- Sintetizzare un oligonucleotide drogato (filamento complementare) di sintesi chimica su un sintetizzatore di DNA corrispondente al sito di legame della proteina. Utilizzare una miscela appropriata di phosphoramidites durante la sintesi chimica per ogni sito di doping (X qui sotto) con un rapporto di 90% A come il nucleotide di selvaggio-tipo e 10% T come il nucleotide di tipo non-wild (Vedi risultati rappresentativi per maggiori dettagli su questo rapporto).
Nota: Qui, la sequenza dell'oligonucleotide drogato è 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. La sequenza sottolineata è il complemento inverso del sito di legame della proteina SXL, oltre a ulteriori nucleotidi all'esterno del sito di associazione che forniscono utili controlli confermando che non ogni cambiamento nel RNA effetti vincolanti, nonché controlli di caricamento per confronto e la normalizzazione dei nucleotidi all'interno del sito dell'associazione. La sequenza del sito di SXL-associazione UUUUUGUUGUUUUUUUU, che è presente in trasformatore pre-mRNA14,15,16,17, è stata utilizzata per elaborare la metodologia proposta. La sequenza in corsivo è complementare alla sequenza del primer T7 ed è il promotore T7 per trascrizione in vitro .
2. sintesi di RNA
-
Sintetizzare il RNA in una reazione di trascrizione di 20 µ l, come descritto in precedenza18.
- Buffer della trascrizione mix T7 e oligonucleotide di T7 1 µM, 1 µM drogato del oligonucleotide, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2mm GTP, 1 mM ogni ATP, CTP e UTP (guanosina, adenosina, citidina e uridina trifosfato) e 2 U / µ l T7 RNA polimerasi.
- Aggiungere, in due separati per microcentrifuga, 0,167 mM α-thio ATP o 0,05 mM α-thio UTP incorporare RNAs fosforotioati (Vedi schemi nella Figura 2).
Nota: Per protocolli alternativi, aggiungere 0,2 mM α-thio CTP o 0,2 mM α-thio GTP ad una reazione di trascrizione appropriata contenente un oligonucleotide drogato per testare i due rimanenti sostituzioni nucleotidiche. - Incubare la miscela di reazione di sintesi di RNA per 2 ore a 37 ° C.
- Aggiungere 2,5 µ l fosfatasi alcalina termolabile e 2,5 µ l di tampone di 10xphosphatase al campione di RNA. Incubare la reazione 25 µ l per 10-30 min a 37 ° C per rimuovere 5' fosfati.
- Inattivare l'enzima fosfatasi alcalina mediante riscaldamento a 80 ° C per 2 – 5 min.
- Si l'estremità 5' del RNA defosforilato (5 pmole) utilizzando 1 µ l T4 polinucleotide chinasi e 1 µ l γ -32P ATP in un volume di reazione di 10 µ l. Incubare il mix di reazione per 30 – 60 min a 37 ° C.
- Inattivare l'enzima della chinasi di polinucleotide T4 da riscaldamento a 65 ° C per 20-30 min.
- Gel di purificare il RNA mediante elettroforesi in un 10% di denaturare i gel di poliacrilammide. Individuare RNA sul gel mediante autoradiografia. Asportare la fetta di gel contenente RNA radioattivo, schiacciare in un tubo del microcentrifuge premendo contro le pareti con un puntale e immergere nel buffer di proteinasi K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% sodio dodecil solfato). Ruotare il tubo a temperatura da 2 h a tutta la notte.
- Centrifugare i residui di gel, scartare il gel e raccogliere la soluzione tampone.
- Estrarre la soluzione due volte con un volume uguale del fenolo-cloroformio e una volta con cloroformio e raccogliere la fase acquosa.
- Aggiungere il volume della fase acquosa 0,1 3M di acetato di sodio, pH 5.2, vettore tRNA o glicogeno e 2,5 volume di etanolo. Conservare il campione a-80 ° C per 1 h.
- Centrifugare il campione per 5 – 10 min in una microcentrifuga ad alta velocità a 16.873 x g. Rimuovere con attenzione la soluzione tampone/etanolo senza disturbare il pellet di RNA.
- Lavare la pallina con etanolo al 70% e centrifugare per 2 – 5 min Rimuovi etanolo con attenzione. Asciugare la pallina in aria.
- Risospendere il pellet in 20 – 50 µ l dietil pirocarbonato (DEPC)-acqua trattata. Conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Eseguire tutti i passaggi con RNA radioattivo utilizzando opportune precauzioni e uno scudo in plexiglass per proteggere da radioattività. Attualmente, colonne di spin sono più comunemente utilizzati e più conveniente per rimuovere radioattività prive di personalità giuridica, come alternativa alla purificazione del gel del RNA.
3. legame di reazione e la separazione di RNA legato alle proteine
- Esprimere la proteina ricombinante in e purificare da e. coli.
- Stimare la concentrazione di proteina ricombinante mediante spettrofotometria o separando in un gel di SDS-poliacrilammide vicino ad un'albumina di siero proteina nota standard, bovina (BSA). Visualizzare la proteina di interesse e la BSA standard macchiando il gel con Coomassie Brilliant Blue R-250. Quantificare la proteina rispetto alle quantità note di diluizioni di BSA sullo stesso gel.
Nota: Conservare la proteina ricombinante a - 80 ° C fino all'utilizzo e diluire in 20 mM 4-(2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico l'acido (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,05% NP-40, 20% glicerolo. Uso di 0,5 – 1,0 mM proteasi inibitore fenilmetano sulfonil fluoruro (PMSF) è facoltativo. - Eseguire la reazione di RNA-binding (20 – 100 µ l) in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimetro DTT, 50 mM KCl, inibitore di RNAsi 0,5 unità / µ l, 0.09 µ g / µ l acetilato albumina di siero bovino, 1 mM EDTA, 0.15 µ g / µ l tRNA, RNA 5'-fine radiomarcate e 6 µ l di concentrazione appropriata (un concentrazione in cui ~ 50% di RNA si lega alla proteina) della proteina.
Nota: Questo buffer di associazione lavora per tre proteine RNA-leganti (SXL, U2AF65e PTB), ma deve essere standardizzato per una proteina di interesse. Stimare la concentrazione nella proteina empiricamente, utilizzando varie diluizioni per una preparazione data proteina, che è necessaria per ottenere circa il 50% legame al RNA. Questa condizione o Kd rappresenta la parte più sensibile della curva RNA-binding. - Incubare la reazione di legame proteina per 20 – 30 minuti a 25 ° C (o ghiaccio).
-
Separare la frazione di RNA proteina legata dalla frazione non associata utilizzando uno dei due approcci:
- Associazione del filtro di nitrocellulosa
- Applicare la reazione di associazione (20 – 100 µ l) su un filtro di nitrocellulosa collegato ad un collettore sottovuoto a temperatura ambiente.
Nota: Solo il complesso della RNA-proteina viene mantenuto sul filtro e non associati flussi di RNA attraverso il filtro. L'approccio di associazione di filtro permette di recupero superiore del RNA associato ed è più veloce e più semplice, rispetto per l'analisi dello spostamento di mobilità gel. Ponendo una membrana DEAE sotto il filtro di nitrocellulosa è anche possibile raccogliere la frazione non legata di RNA o RNA i gratuiti per confronto con la frazione legata. - Tagliare la parte del filtro di nitrocellulosa contenenti mantenuto RNA radioattivo in pezzi più piccoli per adattarsi in un tubo del microcentrifuge, ammollo in buffer sufficiente PK (300 – 500 µ l contenente 10 – 20 µ g PK) per immergere i pezzi di filtro ed eluire RNA dal filtro per 2 – 3 h o durante la notte.
- Estrarre con fenolo-cloroformio, cloroformio e raccogliere la fase acquosa. Aggiungere etanolo e acetato di sodio e, dopo incubazione in congelatore, centrifugare, lavare, asciugare e risospendere RNA in acqua trattata con DEPC. Seguire questi passaggi come descritto in procedura 2.10 a 2.14 sopra.
- Applicare la reazione di associazione (20 – 100 µ l) su un filtro di nitrocellulosa collegato ad un collettore sottovuoto a temperatura ambiente.
- Spostamento di mobilità del gel
- Preparare e polimerizzare un gel di poliacrilammide nativo di 5% (60: 1 Acrylamide:bis-acrilammide) in 0,5 x TBE (tampone Tris-Borato-EDTA standard) prima di iniziare la reazione di associazione, come un'alternativa per il metodo di associazione di filtro.
- Pre-corsa il gel per 15 min a 250 V in una camera fredda (4 ° C).
- Caricare ogni reazione obbligatoria (sopra) in pozzetti separati del gel pre-esecuzione sopra.
Nota: Il buffer di deposito di proteine fornisce sufficiente glicerolo per caricamento dei campioni nei pozzetti. - Separare il RNA legato alle proteine mediante elettroforesi su gel in una stanza fredda 250 V per 1 o 2 h, a seconda della dimensione del RNA e proteina specifica.
- Individuare la posizione del complesso della RNA-proteina sul gel mediante autoradiografia. Asportare la fetta di gel contenenti il complesso della RNA-proteina. Eluire il RNA dal gel slice di schiacciare la fetta di gel e ammollo nel buffer di PK.
- Estrarre con fenolo-cloroformio, cloroformio e raccogliere la fase acquosa. aggiungere etanolo e acetato di sodio e, dopo incubazione in congelatore, centrifugare, lavare, asciugare e risospendere RNA in acqua trattata con DEPC. Seguire questi passaggi come descritto in procedura 2.10 a 2.14 sopra.
- Associazione del filtro di nitrocellulosa
4. analisi di iodio-spaccati fosforotioato prodotti per il rilevamento delle posizioni del Nucleotide mutante
- Aggiungere lo iodio 1 mM in un 20 µ l di acqua trattata con DEPC contenente fino a 10 µ g vettore tRNA fendere il RNA (RNA totale e non associato) presso i siti di fosforotioato incorporazione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
Nota: Ulteriori dettagli sulla fenditura di iodio con condizioni leggermente diverse — iodoethanol 7% (v/v), riscaldamento a 95 ° C per 3 min — possono essere trovati a Gish & Eckstein 198819. - Precipitato spaccati RNA aggiungendo sodio acetato/etanolo, come descritto in precedenza. Risospendere in una tintura di caricamento per denaturare i gel. Calore e caricare l'esempio per separare frammenti di RNA mediante elettroforesi in un gel di poliacrilammide denaturante di 15 – 20%.
- Esporre il gel di poliacrilammide ad una pellicola di raggi x.
- Individuare bande nella frazione legata contro pool totale mediante autoradiografia.
Nota: Eseguire tutti i passaggi con iodio in una cappa di scarico. Per la separazione di RNA mostrato qui, è impiegato un gel a forma di Cuneo, che si ottiene raddoppiando lo spessore di entrambi i distanziali nella parte inferiore delle piastre gel inserendo un distanziale extra pollice-lungo nella parte inferiore del gel. Questa forma permette maggiore spaziatura uniforme o più vicino tra più brevi frammenti di RNA. In alternativa, può essere utilizzato un phosphorimager piuttosto che pellicole di raggi x per la rilevazione e quantificazione della radioattività.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Principio di mutagenesi di saturazione mediante doping:
Per un adeguato rapporto molare di wild-type e altri nucleotidi, è necessario utilizzare una miscela uguale di tutti i quattro nucleotidi se solo una posizione è da analizzare. Tuttavia, se posizioni multiple sono analizzati simultaneamente, il rapporto di tipo selvaggio ai nucleotidi di selvaggio-tipo deve essere regolato, cioè, ridotto. In caso contrario, oltre a singole sostituzioni, che è desiderato, ci sarà anche modelli con più non di tipo wild nucleotidi in una molecola, precludendo l'analisi dell'effetto del singolo-nucleotide sostituzioni. Pertanto, come regola generale, utilizzare un rapporto di tipo selvaggio ai nucleotidi di selvaggio-tipo di 1/n, dove n è il numero di posizioni per essere analizzati. Qui, abbiamo analizzato 10 posizioni simultaneamente e utilizzato una miscela contenente 90% del nucleotide selvaggio-tipo e il 10% del nucleotide non-wild type per il modello del DNA di doping. Reazioni di trascrizione separata sono fatto, in cui ciascuna reazione di trascrizione viene eseguita con uno dei quattro fosforotioati. Così, ogni reazione monitora un nucleotide specifico alle posizioni drogati.
Principio di partizionamento a causa di interferenze:
L'approccio di mutagenesi presentato qui, RNAs hanno in media meno di un residuo di fosforotioato per molecola. Durante il processo di associazione, partizione di molecole di RNA tra la frazione legata alle proteine e la frazione libera. Poiché un nucleotide particolare è collegato a un sollevatore fosforotioato, fenditura del collegamento spina dorsale fosforotioato è una lettura della presenza di un nucleotide specifico in quella posizione. Si prevede che in una determinata posizione, quando viene modificato un nucleotide non può avere entrambi alcun effetto sull'associazione o associazione, può inibire parzialmente o completamente. Se la presenza di un nucleotide specifico non ha alcun effetto sull'associazione suddividerà ugualmente fra le frazioni legato alle proteine e non associate. Tuttavia, se un nucleotide specifico in una determinata posizione interferisce con il legame proteico sarà preferenzialmente escluso dalla frazione legata alle proteine. È possibile monitorare quantitativamente il grado di interferenza per ciascuna delle posizioni nella stessa reazione dopo l'elettroforesi del gel. Questo concetto è illustrato in uno schema (Figura 3). Nella frazione di RNA totale (corsia T), intensità di banda è approssimativamente uguale per tutte le posizioni di drogati (bande 1, 3 – 7). Nella frazione di RNA legato alle proteine (corsia B), alle posizioni 1, 4 e 7, il nucleotide non ha alcun effetto sull'associazione. Tuttavia, nelle posizioni 3 e 6, interferisce con l'associazione e pertanto viene escluso dalla frazione legata. In posizione 5, interferenza è parziale. Pertanto, i confronti di quattro corsie accoppiati, T e B per ogni nucleotide, consentono di analisi di tutti i quattro nucleotidi. Dovrebbe essere notato quello del nucleotide di selvaggio-tipo per una determinata posizione riflette l'effetto, se del caso, di zolfo nel backbone RNA il legame con le proteine.
L'accompagnamento autoradiograph (Figura 4) Mostra due coppie (α-thio A e U α-thio) delle corsie da un gel denaturante (T per pool totale) e B per frazione legata. Parecchie osservazioni possono essere effettuate confrontando le intensità delle bande in ciascuna posizione tra ogni coppia di corsie (T e B). In primo luogo, la maggior parte del segnale è nella parte superiore del gel, cioè, ApoAlert prodotto, per entrambi α-thio una corsia di U lane e α-thio. In secondo luogo, per i vicoli di coppia A α-thio, parecchie fasce (prodotti di scissione di iodio) sono identici tra il limite e le frazioni di RNA totale, ad esempio, fasce superiore a 1; bande di rilevanti all'interno del sito di legame per il α-thio una corsia sono numerati per riferimento. In terzo luogo, bande nella parte inferiore del gel sono più ravvicinati (ad es., bande sotto 6) rispetto al solito per un gel di sequenziamento. In quarto luogo, alcune band sono presenti nella frazione di RNA totale ma assenti o significativamente ridotto nella frazione di RNA associata (ad es., bande 1, 2, 3 e 5). In quinto luogo, per la coppia di corsia U α-thio, mentre la maggior parte delle bande sono comparabili tra le corsie di totale e rilegate, alcune bande sono relativamente meno intense nella frazione legata (ad es., bande 7 e 8).
Queste osservazioni forniscono la prova per lo sviluppo di questo nuovo metodo e piombo alle seguenti conclusioni: in primo luogo, per sia α-thio A coppia corsie e α-thio U coppia corsie, perché la maggior parte del RNA è ApoAlert, fornisce la prova che solo una piccola frazione di il RNA contiene per volta o fosforotioato residui. Questo è importante perché accerta che molecole di RNA contengono non più di un fosforotioato residuo. Intensità di seconda, identici o simili per diverse band di fuori del sito di legame tra le due corsie, per entrambe le α-thio A e U α-thio, dimostrano che il caricamento è paragonabile per entrambe le corsie, permettendo un confronto semplice fra i vicoli. Terzi, più ravvicinate bande si ottengono, per α-thio A e U α-thio, dalla forma a Cuneo del gel (più sottile nella parte superiore e più spessa nella parte inferiore), così permettendo l'analisi di più lunga sequenza letture e offrendo maggiore risoluzione. In genere, più brevi frammenti sono più distanziati in un gel con spessore uniforme. In quarto luogo, scomparsa o ad intensità ridotta di determinate bande nella frazione legata indica che il nucleotide selvaggio-tipo non è preferenzialmente esclusa dalla frazione legata (A α-thio). Le intensità relative di diverse bande entro la corsia associata offrono anche informazioni quantitative circa l'entità dell'interferenza da residui di tipo non-wild alle posizioni differenti. In altre parole, il mutante o non di tipo wild nucleotidi alle posizioni specifiche interferiscano con il legame alle proteine. Infine, prova l'effetto della sostituzione di spina dorsale dello zolfo (fosforotioato) presso uno degli ossigeni non-bridging (α-thio U), Mostra che tre posizioni mostrano effetti minori da solfuri di spina dorsale (ad es., 6, 7 e quello inferiore a 7). I nostri risultati combinati mostrano che diverse posizioni all'interno del sito di legame Visualizza preferenziale scomparsa o riduzione delle intensità delle bande specifiche nella frazione legata. Questo è dovuto a sostituzione di base piuttosto che la spina dorsale, che indica interazioni della proteina con basi specifiche nel sito di legame (A α-thio). Nel frattempo, incorporazione di α-thio C Mostra un modello di interferenza paragonabile ad A. α-thio Tuttavia, solo 3 – 4 le sostituzioni di G α-thio mostrano piccole ma rilevabile interferenza centrato intorno, ad esempio, posizioni numerate 2 e 3 (dati non mostrati). Questo metodo è stato utilizzato per rivelare differenze in come il repressore d'impionbatura SXL e il generale d'impionbatura snRNP U2 di fattore fattore ausiliario (U2AF65) si legano in una sequenza di segnale d'impionbatura pre-mRNA identico (polipirimidinico-tratto) in modo distinto15 .
Figura 1: diagramma di flusso della chiave passi in fosforotioato mutagenesi (PTM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schematico di un sollevatore fosforotioato tra due nucleotidi, che può essere chimicamente spaccati da iodio. Zolfo sostituisce uno degli ossigeni di fosfato non-gettare un ponte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: principio di partizionamento a causa di interferenze. Ipotetico RNA contiene rappresentante α-thio nucleotidi a sei posizioni, tra cui un sito di legame delle proteine. A seguito di legame alle proteine, RNA viene scisso in siti di incorporazione fosforotioato da iodio. Posizioni 1 – 7 all'interno e intorno al sito di legame sono arbitrariamente numerate per riferimento nel testo. Posizione 2 o mancante band non rappresenta nessun fosforotioato incorporazione o dei nucleotidi non drogati. T di Lane è RNA totale e corsia B è legato alle proteine RNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: fosforotioato mutagenesi (PTM) approccio permette di mutagenesi di saturazione di un polipirimidinico-tratto/3 ' sito presente nel trasformatore pre-mRNA di giuntura. T di Lane è RNA totale e corsia B è legato alle proteine RNA. Α-thio un RNA rappresenta sintetizzati in presenza di ATP di α-thio e identifica posizioni drogate con α-thio adenosines nella sequenza. Tre bande forte corrispondono a adenosines nella sequenza in quelle posizioni. Α-thio U rappresenta RNA sintetizzato in presenza di α-thio UTP e identifica tutti i uridines, comprese le posizioni drogati, nella sequenza. Linea verticale a sinistra segna il sito di legame di SXL. 1-8 di posizioni all'interno del sito di legame sono numerati per gli scopi di riferimento e per la facilità di descrizione nella sezione risultati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagenesi lungo è stata utilizzata per caratterizzare i siti di legame proteico. In primo luogo, una serie di mutanti può essere costruita e testata singolarmente nelle analisi per analizzare i loro effetti sull'affinità di legame di associazione. Mentre un approccio di mutagenesi standard offre un modo per analizzare diverse sequenze, più passaggi coinvolti nell'approccio standard, quali costruzione di mutanti e l'esecuzione di una serie di reazioni per ogni mutante di associazione, è laboriosa e richiede tempo e non può consentire la mutagenesi di saturazione, soprattutto per le sequenze più lunghe. In secondo luogo, una sequenza possa essere randomizzata e lo stagno usato per più cicli di reazione a catena della polimerasi e della associazione amplificazione (PCR). Queste sequenze che legano proteine dovrà essere clonati e sequenziati per identificare e convalidare un sito di legame della sequenza di consenso. Tuttavia, questa opzione di associazione e amplificazione iterativa prevede più passaggi ed è laboriosa nell'identificare i residui che sono importanti all'interno del sito dell'associazione. Inoltre, sequenza ripetuta amplificazioni inerente alla PCR possono introdurre la sequenza polarizzazione. In terzo luogo, sequenze scelte dalla piscina casuale possono essere sequenziate utilizzando un'opzione più veloce di sequenziamento throughput elevato, anche se è relativamente costoso. Pertanto, per superare queste limitazioni di più passaggi, laboriosi e/o costosi metodi, abbiamo pensato ad un più veloce, economico e soprattutto un metodo a passo singolo, descritta qui, per compire la mutagenesi di saturazione di un sito di legame (PTM).
I passaggi chiavi di questo approccio includono codifica dei nucleotidi non-wild-type o identificazione. Abbiamo usato fosforotioato nucleotidi, in cui uno degli ossigeni nel fosfato spina dorsale viene sostituito con zolfo, come descritto (Figura 2). Il vantaggio è che lo iodio può essere utilizzato per fendere chimicamente la spina dorsale del nucleotide fosforotioato. Così, fenditura di iodio di RNA substrato contenente un backbone fosforotioato genera una scaletta di sequenziamento-tipo, dove il sito di clivaggio è un proxy o tag per la presenza di una delle quattro basi in quella posizione. Un confronto tra le frazioni non associate e totale identifica residui che sono preferenzialmente esclusi dalla frazione legata e sono così importanti per il legame alle proteine. Al contrario, residui che non sono importanti per l'associazione rimangono ugualmente distribuite tra le due frazioni. Questo approccio può essere utilizzato per definire i siti di legame per proteine RNA-leganti.
In sintesi, questo approccio One-Step saturazione mutagenesi, combinando il doping, fosforotioati e la fenditura di iodio, offre un potente mezzo per la caratterizzazione di qualsiasi sito di legame nel RNA. Tuttavia, questo approccio richiede che il sito di legame è già noto prima della mutagenesi. Inoltre, il legame alle proteine – condizioni necessario ottimizzato per ogni proteina. Le seguenti precauzioni devono essere sottolineato. Precauzioni per la manipolazione di RNA devono essere esercitati, come guanti, preparazione di soluzioni e buffer in acqua trattata con DEPC, puntali di sterilizzazione in autoclave e tubi e dedicando attrezzature per RNA utilizzare solo per evitare RNasi. Analogamente, la cura che coinvolgono radioattivi scudi, radioattivi monitoraggio durante l'utilizzo di materiale radioattivo è essenziale e l'uso della cappa di scarico durante l'utilizzo di sostanze chimiche pericolose sono necessarie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L'autore non dichiara concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
L'autore ringrazia il National Institutes of Health per il finanziamento di passato e grazie Michael R. Green per la sintesi di oligonucleotidi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
