Summary
Las proteínas que se unen a secuencias específicas de RNA desempeñan papeles críticos en la expresión génica. Caracterización detallada de estos sitios de Unión es crucial para nuestra comprensión de la regulación génica. Aquí, se describe un enfoque solo paso para la mutagénesis de la saturación de los sitios de unión a proteínas en el ARN. Este enfoque es relevante para todos los sitios de unión a proteínas en el ARN.
Abstract
Regulación de los genes desempeña un papel importante en el desarrollo. Numerosas proteínas de unión de ADN y ARN unen sus secuencias diana con alta especificidad para el control de la expresión génica. Estas proteínas reguladoras controlan la expresión génica a nivel de ADN (transcripción) o a nivel de RNA (splicing pre-mRNA, poliadenilación, transporte del mRNA, decaimiento y traducción). Identificación de secuencias reguladoras ayudan a entender no sólo cómo un gen es activado o desactivado, sino también qué genes aguas abajo están regulados por una proteína reguladora particular. Aquí, describimos un enfoque de un paso que permite la mutagénesis de saturación de un sitio de unión de la proteína en el ARN. Se trata de dopaje de la plantilla de la DNA con wild-type de nucleótidos dentro del sitio de Unión, síntesis de RNAs separados con cada nucleótido fosfotioato y el aislamiento de la fracción unida tras incubación con proteína. Interferencia de nucleótidos wild-type resulta en su exclusión preferencial de la fracción unida a las proteínas. Esto se controla por electroforesis del gel siguiendo la hendidura química selectiva con yodo de fosfodiéster que contiene fosforotioatos (mutagénesis fosfotioato o PTM). Este enfoque de mutagénesis de saturación solo paso es aplicable a la caracterización de cualquier sitio de unión de la proteína en el ARN.
Introduction
Regulación de los genes juega un papel importante en biología. Genes pueden ser regulados a nivel de transcripción splicing pre-mRNA, 3' final de formación, exportación del RNA, traducción, localización de mRNA, decaimiento, estabilidad de modificación poste-de translación, etc. que ambos DNA y RNA-proteínas desempeñan un papel clave en la gene Reglamento. Mientras que los análisis genéticos moleculares han identificado numerosas proteínas reguladoras, solamente un subconjunto pequeño de ellos se han caracterizado completamente para sus funciones celulares o sitios de enlace en vivo. Mutagénesis y análisis filogenético de la secuencia ofrecen enfoques complementarios para caracterizar las interacciones entre proteínas DNA o RNA.
Proteínas RNA-que atan son importantes en procesos de desarrollo, incluyendo la diferenciación sexual. La proteína de Drosophila Sex-lethal (SXL) o la proteína sexo interruptor está ausente en los machos, pero presente en las hembras. Reconoce secuencias ricas en uridina o pirimidina-zonas adyacentes a sitios específicos del empalme en blancos de abajo pre-mRNA (transformador, sexo letaly lethal2 específicas del hombre) en células somáticas1,2 ,3,4. Además, regula el sitio de poliadenilación conmutación atando a las secuencias enhancer ricos en uridina poliadenilación en la transcripción potenciador de rudimentario (e)5,6. Probable de SXL regula objetivos adicionales en la línea germinal femenina que están pendientes de ser identificados1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Por lo general, caracterización de un sitio de Unión consiste en mutagénesis, por ejemplo, por eliminación o sustitución de uno o varios nucleótidos. Cada sitio de Unión mutante, en relación con la secuencia de ARN de tipo salvaje, luego se analiza mediante una serie de concentraciones de proteína para determinar su afinidad (Kd o equilibrio disociación constante) de la proteína de interés; Kd es la concentración de proteína necesaria para obtener la Unión del RNA de 50%. Este proceso requiere mucho trabajo de detallado mutagénesis implica la generación y análisis de numerosos mutantes — tres nucleótidos del tipo no salvaje para cada posición en el sitio de Unión. Así, hay una necesidad de un enfoque alternativo para la mutagénesis de la saturación más rápido, más simple y barato de sitios de unión de la proteína en el ARN.
Aquí, describimos un enfoque de un paso que permite la mutagénesis de saturación de un sitio de unión de la proteína en el ARN. Se trata de dopaje de la plantilla de la DNA con wild-type de nucleótidos dentro del sitio de Unión, síntesis de RNAs separados con cada nucleótido fosfotioato y el aislamiento de la fracción unida tras incubación con proteína. Interferencia de nucleótidos wild-type resulta en su exclusión preferencial de la fracción unida a las proteínas. Esto se controla por electroforesis del gel siguiendo la hendidura química selectiva con yodo de fosfodiéster que contiene fosforotioatos (mutagénesis fosfotioato o PTM). Este enfoque de mutagénesis de saturación solo paso es aplicable a la caracterización de cualquier sitio de unión de la proteína en el ARN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Figura 1 ofrece una visión general del fosfotioato mutagénesis y resume los pasos clave en el proceso.
1. generación de una biblioteca de mutantes: dopaje en la plantilla de la DNA con nucleótidos no wild Type
- Sintetizar T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') por síntesis química en un sintetizador de ADN.
- Sintetizar un oligonucleótido dopado (filamento complementario) por síntesis química en un sintetizador de ADN correspondiente al sitio de unión de la proteína. Utilizar una mezcla apropiada de phosphoramidites durante la síntesis química para cada sitio de dopaje (X abajo) con una proporción de 90% A como el nucleótido de tipo salvaje y el 10% T como el tipo no salvaje nucleótido (ver resultados representativos para más detalles sobre esta relación).
Nota: Aquí, la secuencia de los oligonucleótidos dopado es 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. La secuencia subrayada es el complemento reverso de sitio de unión de la proteína SXL, más nucleótidos adicionales fuera del sitio de enlace que proporcionan útiles controles confirma que no todos los cambios en el ARN afectan vinculante, así como controles de carga para comparación y la normalización de los nucleótidos en el sitio de Unión. La secuencia del sitio de SXL-enlace UUUUUGUUGUUUUUUUU, que está presente en el transformador de pre-mRNA14,15,16,17, se utilizó para diseñar la metodología propuesta. La secuencia en cursiva es complementaria a la secuencia de primer T7 y es el promotor de T7 en vitro de la transcripción.
2. síntesis del ARN
-
Sintetizar el RNA en una reacción de transcripción de 20 μl, como se describió anteriormente18.
- Transcripción de T7 mezcla buffer y oligonucleótidos de T7 de 1 μm, 1 μm dopado oligonucleótidos, 10 mM Ditiotreitol (DTT), GTP, de 2 mM 1 mM ATP, CTP y UTP (trifosfato de guanosina, adenosina, citidina y uridina) y 2 U/μl T7 ARN polimerasa.
- Añadir en dos tubos de microcentrífuga separado, 0,167 mM α-thio ATP o 0,05 mM α-thio UTP incorporar fosforotioatos (ver esquemas en figura 2) de RNAs.
Nota: Para protocolos alternativos, agregar 0,2 mM α-thio CTP o 0,2 mM α-thio GTP en una reacción adecuada transcripción que contiene un oligonucleótido dopado para probar las dos substituciones del nucleótido. - Incubar la mezcla de reacción de síntesis de RNA por 2 h a 37 ° C.
- Añadir 2,5 μl termolábil la fosfatasa alcalina y 2,5 μl de tampón de 10xphosphatase a la muestra de RNA. Incubar esta reacción 25 μl 10-30 min a 37 ° C para eliminar 5' fosfatos.
- Inactivar la enzima fosfatasa alcalina por calentamiento a 80 ° C 2 – 5 minutos.
- Radiolabel el extremo 5' del ARN desfosforilatado (5 pmole) usando 1 μl T4 Polinucleótido la cinasa y 1 μl γ -32P ATP en un volumen de reacción de 10 μl. Incubar la mezcla de reacción durante 30 – 60 min a 37 ° C.
- Inactivar la enzima de T4 Polinucleótido kinasa por calentamiento a 65 ° C durante 20-30 minutos.
- Gel de purificar el RNA por electroforesis en un gel de poliacrilamida que desnaturaliza el 10%. Ubicar el RNA en el gel por autorradiografía. Suprimir el trozo de gel que contiene RNA radiactivo, machacar en un tubo de microcentrífuga presionando contra las paredes con una punta de pipeta y remoje en buffer de proteinasa K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% dodecil sulfato de sodio). Gire el tubo a temperatura ambiente desde 2 h hasta toda la noche.
- Centrifugar la mezcla de gel, deseche el gel y recoger la solución tampón.
- Extraer la solución dos veces con un volumen igual de fenol-cloroformo y una vez con cloroformo y recoger la fase acuosa.
- Añadir el volumen de fase acuosa 0.1 de 3M acetato de sodio, pH 5.2, portador de la tRNA o glucógeno y 2.5 volumen de etanol. Mantener la muestra a-80 ° C durante 1 h.
- Centrifugar la muestra durante 5 – 10 minutos en una microcentrífuga de alta velocidad a 16.873 x g. Retire con cuidado la solución tampón y etanol sin perturbar el pellet de RNA.
- Lavar el pellet con etanol 70% y centrifugar durante 2 – 5 minutos Retire etanol cuidadosamente. Secar el precipitado en el aire.
- Resuspender el precipitado en 20 – 50 μl dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada. Almacenar a-20 ° C hasta su uso.
Nota: Realice todos los pasos con ARN radiactivo utilizando las precauciones apropiadas y una pantalla de plexiglás para proteger de la radiactividad. En la actualidad, columnas de spin son más utilizado y más conveniente para eliminar radioactividad no constituidas en sociedad, como alternativa a la purificación del gel del ARN.
3. proteína vinculante la reacción y la separación del ARN dependiente
- Expresar la proteína recombinante y purificar de e. coli.
- Estimar la concentración de la proteína recombinante por espectrofotometría o por separación en un gel de SDS-poliacrilamida junto a una conocida proteína bovina, estándar albúmina sérica (BSA). Visualizar la proteína de interés y del estándar de BSA por tinción del gel con azul brillante de Coomassie R-250. Cuantificar la proteína en comparación con cantidades conocidas de diluciones de BSA en el mismo gel.
Nota: Almacenar proteína recombinante a - 80 ° C hasta su uso y diluir en 20 mM 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido el ácido (HEPES), pH 8.0, 1 mM Ditiotreitol (DTT), 0,2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0.05% NP-40, 20% de glicerol. Uso de 0.5 – 1.0 el mM proteasa inhibidor fenilmetano sulfonil fluoruro (PMSF) es opcional. - Realizar la reacción de unión de ARN (20-100 μL) de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM TDT, 50 mM KCl, inhibidor de Rnasa de 0,5 unidades/μl 0.09 μg/μl acetilado albúmina de suero bovino, 1 mM EDTA, 0.15 μg/μl tRNA, RNA 5'-end radiactiva y 6 μl de concentración adecuada (un concentración en que ~ 50% de ARN se une a proteína) de la proteína.
Nota: Este buffer de enlace trabaja para tres proteínas RNA-que atan (SXL, U2AF65y PTB), pero debe ser estandarizado para una proteína de interés. Estimar la concentración de proteína empíricamente, utilizando varias diluciones para una preparación determinada proteína, que es necesaria para obtener aproximadamente el 50% obligatorio de RNA. Esta condición o Kd representa la parte más sensible de la curva de unión de ARN. - Incubar la reacción de unión de proteína para 20-30 min a 25 ° C (o hielo).
-
Separar la fracción proteína unida al RNA de la fracción no unida utilizando uno de dos enfoques:
- Atascamiento del filtro de nitrocelulosa
- Aplicar la reacción de unión (20-100 μL) sobre un filtro de nitrocelulosa conectado a un colector de vacío a temperatura ambiente.
Nota: Sólo el complejo RNA-proteína se retiene en el filtro y desatado RNA fluye a través del filtro. El enfoque de atascamiento del filtro permite mayor recuperación del RNA encuadernado y es más rápido y más sencillo, en comparación con el ensayo de cambio de movilidad de gel. Colocando una membrana DEAE debajo del filtro de nitrocelulosa también es posible recoger la fracción no unida de RNA o libre de RNA para la comparación con la fracción unida. - Cortar la parte del filtro de nitrocelulosa que contiene la retención RNA radiactivo en trozos más pequeños para caber en un tubo de microcentrífuga, remojar en suficiente buffer PK (300 – 500 μl conteniendo 10-20 μg/paq) para la inmersión de las piezas del filtro y eluir el RNA del filtro para 2-3 h o durante la noche.
- Extracción con fenol-cloroformo, cloroformo y recoger la fase acuosa. Agregue etanol y acetato de sodio y, después de incubación en el congelador, centrifugar, lavar, secar y resuspender el RNA en agua tratada con DEPC. Siga estos pasos como se indica en pasos 2.10 a 2.14 por encima.
- Aplicar la reacción de unión (20-100 μL) sobre un filtro de nitrocelulosa conectado a un colector de vacío a temperatura ambiente.
- Cambio de movilidad de gel
- Preparar y polimerizar un gel de poliacrilamida nativo de 5% (60: 1 Acrylamide:bis-acrilamida) en 0.5 x TBE (tampón de borato-Tris-EDTA estándar) antes de iniciar la reacción de enlace, como una alternativa para el método de atascamiento del filtro.
- Funcionamiento previo el gel durante 15 min en 250 V en una cámara fría (4 ° C).
- Carga de cada reacción de enlace (arriba) en pocillos separados del gel la ejecución anterior.
Nota: El buffer de almacenamiento de información de proteína proporciona suficiente glicerol para la carga de la muestra en los pocillos. - Separar el ARN unida a las proteínas por electroforesis en gel en una cámara fría a 250 V para 1 a 2 h, dependiendo del tamaño de RNA y proteínas específicas.
- Localizar la posición del complejo RNA-proteína en el gel por autorradiografía. Suprimir el trozo de gel que contiene el complejo ARN-proteína. Eluir el RNA de la rebanada de gel por aplastar la rebanada de gel y sumergirse en el búfer de PK.
- Extracción con fenol-cloroformo, cloroformo y recoger la fase acuosa. Añadir etanol y acetato de sodio, después de incubación en el congelador, centrífuga, lave, seque y vuelva a suspender el RNA en agua tratada con DEPC. Siga estos pasos como se indica en pasos 2.10 a 2.14 por encima.
- Atascamiento del filtro de nitrocelulosa
4. Análisis de productos fosfotioato troceados de yodo para la detección de las posiciones del nucleótido mutado
- Añadir yodo de 1 mM en una 20 μl de agua tratada con DEPC hasta 10 μg portador tRNA que hiende RNAs (RNAs del consolidados y total) en los sitios del fosfotioato incorporación. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Nota: Más detalles sobre el escote de yodo con condiciones ligeramente diferentes, iodoethanol del 7% (v/v), calentamiento a 95 ° C por 3 min, puede encontrarse en Gish y Eckstein 198819. - Precipitar la RNA exfoliado mediante la adición de acetato de sodio y etanol, como se describe anteriormente. Resuspender en un tinte de carga para geles de desnaturalización. Calor y la muestra para separar fragmentos de ARN por electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalización de 15 – 20% de la carga.
- Exponer el gel de poliacrilamida a una película de rayos x.
- Detectar bandas en la fracción unida frente piscina total mediante autorradiografía.
Nota: Realice todos los pasos con yodo en versión aspirante. Para la separación de RNA que se muestra a continuación, se emplea un gel en forma de cuña, que se consigue duplicando el espesor de los espaciadores de ambos en la parte inferior de las placas de gel insertando un espaciador extra largo en la parte inferior del gel. Esta forma permite más uniforme o más espaciado entre fragmentos de ARN más cortas. Alternativamente, puede utilizarse un phosphorimager en lugar de las películas de radiografía para la detección y cuantificación de la radiactividad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Principio de mutagénesis de saturación con el dopaje:
Si sólo una posición debe ser analizado para una adecuada relación molar de tipo salvaje y otros nucleótidos, use una mezcla de los cuatro nucleótidos. Sin embargo, si varias posiciones son analizadas al mismo tiempo, debe ajustarse la relación de tipo no salvaje a tipo salvaje nucleótidos, es decir, reducido. De lo contrario, además de simple sustitución, que se desea, también habrá plantillas con múltiples de tipo no salvaje de nucleótidos en una molécula, que el análisis del efecto de sustituciones de nucleótido. Por lo tanto, como regla general, utilizan una relación de tipo no salvaje a nucleótidos de tipo salvaje de 1/n, donde n es el número de puestos a analizar. Aquí, se analizaron 10 posiciones al mismo tiempo y utiliza una mezcla que contiene 90% de los nucleótidos de tipo salvaje y el 10% del nucleótido de tipo no salvaje por dopaje en la plantilla de la DNA. Se realizan reacciones de transcripción independiente, en el que cada reacción de transcripción se realiza con uno de los cuatro fosforotioatos. Así, cada reacción controla un nucleótido específico en las posiciones de dopado.
Principio de partición debido a la interferencia:
En el enfoque de mutagénesis presentado aquí, RNAs tienen en promedio menos de una fosfotioato residuos por molécula. Durante el proceso de encuadernación, partición de moléculas de RNA entre la fracción unida a las proteínas y la fracción no unida. Puesto que un nucleótido particular está vinculado a un acoplamiento fosfotioato, ruptura de los vínculos de red troncal fosfotioato es una lectura de la presencia de un nucleótido específico en esa posición. Se espera que en cualquier posición dada, cuando se cambia un nucleótido no puede tener o efecto en Unión o puede inhibir la Unión, total o parcialmente. Si la presencia de un nucleótido específico no tiene ningún efecto en la Unión se partición igualmente entre las fracciones unida a las proteínas y no consolidadas. Sin embargo, si un nucleótido específico en una determinada posición interfiere con el atascamiento de la proteína lo será preferentemente excluido de la fracción unida a las proteínas. El grado de interferencia cuantitativo controlables para cada una de las posiciones en la misma reacción después de electroforesis en gel. Este concepto se ilustra en un esquema (figura 3). En fracción de RNA total (carril de T), la intensidad de la banda es aproximadamente igual para todas las posiciones dopadas (bandas 1, 3-7). En proteínas fracción unida al RNA (carril B), en las posiciones 1, 4 y 7, el nucleótido no tiene ningún efecto sobre la Unión. Sin embargo, en las posiciones 3 y 6, interfiere con el atascamiento y por lo tanto se excluye de la fracción unida. En la posición 5, la interferencia es parcial. Por lo tanto, las comparaciones de la cuatro carriles emparejados, T y B para cada nucleótido, permiten para el análisis de los cuatro nucleótidos. Debe ser observado que nucleótido de tipo salvaje para una determinada posición refleja el efecto de azufre en la columna vertebral de la RNA en la Unión a proteínas.
El acompañamiento autoradiograph (figura 4) muestra dos pares (α-tio A y α-thio U) de los carriles de un gel de desnaturalización (T para piscina Total) y B de la fracción unida. Varias observaciones se pueden hacer comparando las intensidades de las bandas en cada posición en cada par de carriles (T y B). En primer lugar, la mayoría de la señal es en la parte superior del gel, es decir, uncleaved producto, por tanto α-tio un carril U carril y α-thio. En segundo lugar, para carriles de par A α-thio, varias bandas (productos del clivaje de yodo) son idénticos entre el límite y las fracciones de RNA total por ejemplo, bandas superiores a 1; bandas relevantes en el sitio de unión de la α-tio un carril se numeran para la referencia. En tercer lugar, las bandas en la parte inferior del gel son más estrechamente espaciadas (por ejemplo, bandas por debajo de 6) que es generalmente para un gel de secuenciación. En cuarto lugar, varios grupos están presentes en la fracción total del RNA pero ausente o una reducción significativa en la fracción del RNA dependiente (por ejemplo, bandas 1, 2, 3 y 5). En quinto lugar, para el par de carril U α-thio, mientras bandas más son comparables entre los carriles total y encuadernados, algunas bandas son relativamente menos intensas en la fracción unida (p. ej., bandas 7 y 8).
Estas observaciones proporcionan la evidencia para el desarrollo exitoso de este nuevo método y conducen a las siguientes conclusiones: en primer lugar, para carriles de par A thio α y α-thio U par de carriles, porque la mayor parte del ARN es uncleaved, proporciona evidencia que sólo una pequeña fracción de el ARN contiene modificado o fosfotioato residuos. Esto es importante porque comprueba que las moléculas de ARN contienen no más de un residuo del fosfotioato. Intensidades de segunda, idénticos o similares para varias bandas fuera del sitio de unión entre los dos carriles, tanto A de thio α y α-thio U, demuestran la carga comparable para ambos carriles, lo que permite la comparación fácil entre carriles. Se consiguen bandas en tercer lugar, más espaciadas, para α-tio A y α-thio U, por la forma de cuña del gel (más delgada en la parte superior y más gruesa en la parte inferior), así permitiendo análisis de lecturas de secuencia más larga y ofrece una resolución más alta. Por lo general, fragmentos más cortos se espacian más extensamente en un gel con espesor uniforme. En cuarto lugar, desaparición o intensidad reducida de ciertas bandas de la fracción unida indica que el nucleótido de wild-type preferencial está excluido de la fracción unida (α-tio A). Intensidades relativas de diferentes bandas dentro del carril consolidado también ofrecen información cuantitativa sobre el grado de interferencia de tipo no salvaje residuos en lugares diferentes. En otras palabras, el mutante o tipo no salvaje nucleótidos en las posiciones específicas interfieren con el atascamiento de la proteína. Finalmente, prueba el efecto de la sustitución del azufre de columna vertebral (fosfotioato) en uno de los oxígenos no puente (α-thio U), muestra que tres posiciones muestran efectos menores de sulfuros de la columna vertebral (por ejemplo, 6, 7 y la otra debajo de 7). Nuestros resultados combinados muestran que varios puestos en el sitio de Unión muestran desaparición preferencial o reducción intensidad de bandas específicas de la fracción unida. Esto es debido a la sustitución de la base en lugar de columna vertebral, indicando las interacciones de proteínas con bases específicas en el sitio de unión (α-tio A). Mientras tanto, incorporación de α-tio C muestra un patrón de interferencia comparable a α-thio. Sin embargo, sólo sustituciones G 3-4 α-thio muestran pequeñas pero interferencia detectable en torno, por ejemplo, las posiciones numeradas 2 y 3 (datos no mostrados). Este método se ha utilizado para revelar las diferencias en cómo el represor que empalma SXL y el empalme general factor U2 RNPnp Factor auxiliar (U2AF65) enlazar a una secuencia de señal splicing pre-mRNA idéntico (polypyrimidine-tracto) de manera distinta15 .
Figura 1: Diagrama de flujo de clave pasos en fosfotioato mutagénesis (PTM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema de un acoplamiento del fosfotioato entre dos nucleótidos, que pueden ser químicamente divididos por el yodo. Azufre reemplaza uno de los oxygens de fosfato sin puente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: principio de partición debido a la interferencia. RNA hipotético contiene nucleótidos α-thio representante en seis posiciones, incluido un sitio de unión a proteínas. Tras la Unión a proteínas, RNA es hendida en sitios del fosfotioato incorporación por el yodo. Posiciones 1-7 dentro y alrededor del sitio de Unión se numeran arbitrariamente para referencia en el texto. Posición 2 o banda que falta no representa ninguna incorporación fosfotioato o nucleótido no dopado. Lane es ARN total y carril B está unida a las proteínas RNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fosfotioato mutagénesis (PTM) permite mutagénesis de saturación de un polypyrimidine-vías/3 ' empalme el sitio presente en el transformador de pre-mRNA. Lane es ARN total y carril B está unida a las proteínas RNA. Α-tio un RNA representa sintetizados en presencia de α-thio ATP e identifica posiciones dopados con α-tio adenosines en la secuencia. Tres bandas fuertes corresponden a adenosines en la secuencia en esas posiciones. Α-thio U representa RNA sintetizado en presencia de α-thio UTP e identifica todos uridinas, incluyendo posiciones dopadas, en la secuencia. Línea vertical de la izquierda marca el sitio de unión de SXL. Posiciones 1 – 8 en el sitio de Unión están contados para propósitos de referencia y para facilitar la descripción en la sección de resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagénesis durante mucho tiempo se ha utilizado para caracterizar sitios de unión de la proteína. En primer lugar, una serie de mutantes puede y de prueba individualmente en ensayos para analizar sus efectos sobre la afinidad de enlace de enlace. Mientras que un enfoque de mutagénesis estándar ofrece una forma de analizar varias secuencias, varios pasos involucrados en el enfoque estándar, tales como construcción de mutantes y realizar una serie de reacciones para cada mutante de atar, es laborioso y consume tiempo y puede no permita que la mutagénesis de saturación, especialmente para secuencias más largas. En segundo lugar, una secuencia puede ser al azar y la piscina utilizada para varios ciclos de reacción en cadena de Unión y de la polimerasa amplificación (PCR). Estas secuencias que se unen a la proteína debe ser clonado y secuenciado para identificar y validar un sitio obligatorio de la secuencia de consenso. Sin embargo, esta opción de encuadernación y amplificación iterativa implica varios pasos y es laboriosa en la identificación de los residuos que son importantes en el sitio de Unión. Por otra parte, inherente a la PCR de secuencia repetida amplificaciones pueden introducir sesgo de secuencia. En tercer lugar, secuencias de la piscina al azar pueden secuenciadas utilizando una opción más rápida de secuenciación de alto rendimiento, aunque es relativamente caro. Por lo tanto, para superar las limitaciones de pasos múltiples, laboriosos y costosos métodos, ideamos un rápido, barato y lo más importante un método single-step, descrito aquí, para realizar mutagénesis de saturación de un sitio de unión (PTM).
Los pasos claves de este enfoque incluyen la identificación o el marcaje de la nucleótido wild-type (s). Utilizamos fosfotioato nucleótidos, en que uno de los oxígenos en el fosfato columna vertebral se sustituye con el sulfuro, como descrito (figura 2). La ventaja es que puede utilizarse yodo químicamente hender la espina dorsal de la nucleótido fosfotioato. Por lo tanto, escote de yodo del sustrato de RNA que contiene una columna vertebral fosfotioato genera una escala de tipo de secuencia, donde el sitio de la hendidura es un proxy o etiqueta para la presencia de una de las cuatro bases en esa posición. Una comparación de las fracciones no Unidas y total identifica residuos que preferentemente están excluidos de la fracción unida y por lo tanto son importantes para la Unión a proteínas. En contraste, los residuos que no son importantes para la Unión siguen siendo igualmente distribuidos entre las dos fracciones. Este enfoque puede utilizarse para definir los sitios de Unión para cualquier proteína de unión a RNA.
En Resumen, este enfoque de mutagénesis de saturación de un solo paso, combinando el dopaje, fosforotioatos y escote de yodo, ofrece un medio poderoso para la caracterización de cualquier sitio de Unión en el ARN. Sin embargo, este enfoque requiere que el sitio de Unión ya es conocido antes de la mutagénesis. Además, las condiciones de la Unión a proteínas – necesitan optimizado para cada proteína. Las siguientes precauciones que deba destacarse. Precauciones para manejo de RNA deben ejercerse, como guantes, preparación de soluciones y buffers en agua tratada con DEPC, puntas de pipeta autoclave y tubos y dedicando equipos RNA sólo para librarse de RNasas. Del mismo modo, cuidado con escudos radioactivos, radioactivos seguimiento mientras que el uso de material radiactivo es esencial y el uso de campana de extracción durante el uso de productos químicos peligrosos son necesarios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El autor no declara a competencia intereses financieros.
Acknowledgments
El autor agradece a los institutos nacionales de salud para la financiación de los últimos y gracias a Michael R. Green por síntesis de oligonucleótidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
