Summary
Proteiner som binder specifika RNA sekvenser spela avgörande roller i genuttryck. Detaljerad karakterisering av dessa bindande platser är avgörande för vår förståelse av genreglering. Här beskrivs en enda steg strategi för mättnad mutagenes av proteinbindning platser i RNA. Detta tillvägagångssätt är relevant för alla proteinbindning platser i RNA.
Abstract
Genreglering spelar en viktig roll i utveckling. Många DNA - och RNA-bindande proteiner binder deras mål sekvenser med hög specificitet att kontrollera genuttryck. Dessa reglerande proteiner styr genuttrycket antingen på nivån av DNA (transkription) eller på nivån av RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, förfall och översättning). Identifiering av reglerande sekvenser hjälper till att förstå inte bara hur en gen är påslagen eller avstängd, men också vilka nedströms gener regleras genom ett särskilt regelverk protein. Här beskriver vi en one-step metod som tillåter mättnad mutagenes av ett protein bindningsställe i RNA. Det handlar om dopning DNA mall med icke-vildtyp nukleotider inom bindande platsen syntes av separata RNAs med varje phosphorothioate nucleotide och isolera den bunden fraktion efter inkubation med protein. Störningar från icke-vildtyp nukleotider resulterar i deras förmånliga uteslutning från den proteinbundet fraktionen. Detta övervakas av gelelektrofores efter selektiv kemiska klyvning med jod av phosphodiester obligationer som innehåller phosphorothioates (phosphorothioate mutagenes eller PTM). Detta steg mättnad mutagenes synsätt är tillämpligt på karakterisering av någon protein bindningsställe i RNA.
Introduction
Genreglering spelar en viktig roll i biologi. Gener kan regleras i nivå med transkription, pre-mRNA splicing, 3' slutet bildandet, RNA export, översättning, mRNA lokalisering, förfall, posttranslationella modifieringen/stabilitet, etc. både DNA - och RNA-bindande proteiner spela nyckelroller i gen förordning. Medan molekylära genetiska analyser har identifierat ett flertal reglerande proteiner, endast en liten delmängd av dem har karaktäriserats fullständigt för deras cellulära funktioner eller bindande platser i vivo. Fylogenetiska analyser och mutagenes erbjuder kompletterande metoder för att karakterisera DNA - eller RNA-protein interaktioner.
RNA-bindande proteiner är viktiga utvecklingsprocesser, inklusive könsdifferentiering. Drosophila proteinet Sex-dödliga (SXL) eller sex-huvudströmbrytare proteinet är frånvarande i män, men för närvarande hos kvinnor. Det erkänner uridin-rika sekvenser eller pyrimidin-skrifter intill specifika splice platser i nedströms pre-mRNA mål (transformator, Sex-dödandeoch hane-specifika lethal2) i kroppsceller1,2 ,3,4. Dessutom reglerar det polyadenylation plats växling genom bindning till uridin-rika polyadenylation enhancer sekvenser i förstärkare av rudimentära (e(r)) Avskrift5,6. SXL sannolikt reglerar ytterligare mål i den kvinnliga könsceller som återstår vara identifierat1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Vanligtvis innebär karakterisering av ett bindningsställe mutagenes, exempelvis genom borttagande eller ersättning av enstaka eller flera nukleotider. Varje muterat bindningsställe, i förhållande till vildtyp RNA sekvensen, analyseras sedan med hjälp av en rad protein koncentrationer för att avgöra dess affinitet (K-d eller jämvikt dissociation konstant) för proteinet av intresse. Kd är proteinkoncentration krävs för att erhålla 50% RNA bindande. Detta arbetsintensiva processen för detaljerad mutagenes omfattar generation och analys av många mutanter — tre icke-vildtyp nukleotider för varje position i bindningsstället. Således finns det ett behov av en alternativ metod för snabbare, enklare och billiga mättnad mutagenes av protein bindningsställen i RNA.
Här beskriver vi en one-step metod som tillåter mättnad mutagenes av ett protein bindningsställe i RNA. Det handlar om dopning DNA mall med icke-vildtyp nukleotider inom bindande platsen syntes av separata RNAs med varje phosphorothioate nucleotide och isolera den bunden fraktion efter inkubation med protein. Störningar från icke-vildtyp nukleotider resulterar i deras förmånliga uteslutning från den proteinbundet fraktionen. Detta övervakas av gelelektrofores efter selektiv kemiska klyvning med jod av phosphodiester obligationer som innehåller phosphorothioates (phosphorothioate mutagenes eller PTM). Detta steg mättnad mutagenes synsätt är tillämpligt på karakterisering av någon protein bindningsställe i RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Figur 1 ger en översikt över phosphorothioate mutagenes och sammanfattar viktiga steg i processen.
1. generering av ett bibliotek av mutanter — dopning DNA mall med icke-vildtyp nukleotider
- Syntetisera T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') genom kemisk syntes på en DNA-synt.
- Syntetisera en dopad oligonukleotiden (kompletterande strand) genom kemisk syntes på en DNA synt motsvarande protein bindningsstället. Använda en lämplig blandning av phosphoramidites under kemisk syntes för varje plats av dopning (X nedan) med ett ratio på 90% A som den vildtyp nukleotid och 10% T som den icke-vildtyp nukleotid (se representativa resultat för mer i detalj på detta förhållande).
Obs: Här sekvensen av den dopade oligonukleotiden är 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. Understrukna sekvensen är det omvända komplementet SXL protein bindningsställe, plus ytterligare nukleotider utanför bindningsstället som ger användbara kontroller bekräftar att inte varje förändring i RNA påverkar bindande, samt lastning kontroller för jämförelse och normalisering av nukleotider inom bindningsstället. Sekvensen SXL-bindande webbplats UUUUUGUUGUUUUUUUU, som finns i transformator pre-mRNA14,15,16,17, användes för att utforma den föreslagna metoden. Sekvensen i kursiv stil är komplement till T7 primer sekvensen och T7 promotorn för in vitro- transkription.
2. syntesen av RNA
-
Syntetisera RNA i en 20 µL transkription reaktion, som tidigare beskrivits18.
- Blanda T7 transkription buffert och 1 µM T7 oligonukleotiden, 1 µM dopade oligonukleotiden, 10 mM Ditiotreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM varje ATP, CTP, och UTP (guanosin, adenosin, cytidin och uridin trifosfat) och 2 U/µL T7 RNA-polymeras.
- Lägga till, i två separata mikrocentrifugrör, 0.167 mM α-thio ATP eller 0,05 mM α-thio UTP att införliva RNAs phosphorothioates (se scheman i figur 2).
Obs: För alternativa protokoll, lägga till 0,2 mM α-thio CTP eller 0,2 mM α-thio GTP till en lämplig transkription reaktion som innehåller en dopad oligonukleotiden för att testa de två återstående nukleotid substitutioner. - Inkubera RNA syntes reaktionsblandningen för 2 h vid 37 ° C.
- Tillsätt 2,5 µL värme-labila alkalisk fosfatas och 2,5 µL 10xphosphatase buffert RNA. Inkubera denna 25 µL reaktion under 10 – 30 minuter vid 37 ° C ta bort 5' fosfater.
- Inaktivera enzymet alkaliskt fosfatas genom uppvärmning vid 80 ° C under 2 – 5 minuter.
- Radiomärkas 5' slutet av defosforyleras RNA (5 pmole) använder 1 µL T4 polynucleotide kinase och 1 µL γ -32P ATP i en 10 µL reaktionsvolym. Inkubera reaktion mixen under 30 – 60 minuter vid 37 ° C.
- Inaktivera T4 polynucleotide kinase enzymet genom uppvärmning vid 65 ° C i 20 – 30 min.
- Gel rena RNA genom elektrofores i en 10% denatureringen Polyakrylamidgelen. Leta upp RNA på gel genom autoradiografi. Punktskatt på gel segmentet som innehåller radioaktivt märkt RNA, krossa i en mikrocentrifug rör genom att trycka mot väggarna med en pipettspetsen och Blötlägg i proteinas K (PK) buffert (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Sodium dodecyl sulfate). Vrid röret från 2 h till över natten i rumstemperatur.
- Centrifugera gel slam, kassera gelen och samla in buffertlösningen.
- Extrahera lösningen två gånger med lika stor volym av fenol-kloroform och en gång med kloroform och samla vattenfasen.
- Lägg till vattenfasen 0,1 volymen av 3M natriumacetat, pH 5.2, transportören tRNA eller glykogen, och 2,5 mängden etanol. Förvara provet vid-80 ° C i 1 h.
- Centrifugera provet för 5 – 10 min i en hög hastighet mikrocentrifug vid 16 873 x g. Ta bort buffert/etanol lösningen försiktigt utan att störa pelleten RNA.
- Tvätta pelleten med 70% etanol och Centrifugera i 2 – 5 min. ta bort etanol noggrant. Torka pelleten i luften.
- Återsuspendera pelleten i 20 – 50 µL dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten. Förvaras vid-20 ° C fram till användning.
Obs: Utföra alla steg med radiomärkt RNA med lämpliga försiktighetsåtgärder och en plexiglas sköld för att skydda från radioaktivitet. För närvarande, är spin kolumner vanliga och mer praktiskt att ta bort unincorporated radioaktivitet, som ett alternativ till gel rening av RNA.
3. protein bindande reaktion och Separation av bundna RNA
- Uttrycka rekombinant protein i och rena från E. coli.
- Uppskatta rekombinant proteinkoncentration genom spektrofotometri eller avskilja i en SDS-Polyakrylamidgelen bredvid en känd protein standard, bovint serum albumin (BSA). Visualisera proteinet av intresse och BSA standard genom färgning gelen med Coomassie Brilliant Blue R-250. Kvantifiera proteinet jämfört med kända mängder BSA spädningar på samma gel.
Obs: Förvara rekombinant protein vid - 80 ° C fram till användning och späd i 20 mM 4-(2-hydroxietyl) piperazin-1-ethanesulfonic syra (HEPES), pH 8,0, 1 mM Ditiotreitol (DTT), 0,2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), 0,05% NP-40, 20% glycerol. Användning av 0,5 – 1,0 mM proteas hämmare phenylmethane sulfonyl fluor (PMSF) är valfria. - Utföra RNA-bindande reaktion (20 – 100 µL) i 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0,5 enheter/µL RNase inhibitor, 0,09 µg/µL acetylerade bovint serumalbumin, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-änden radioaktivt RNA och 6 µL av lämplig koncentration (a koncentration vid vilken ~ 50% av RNA binder till protein) av proteinet.
Obs: Denna bindande buffert fungerar för tre RNA-bindande proteiner (SXL, U2AF65, och PTB), men måste standardiseras för ett protein av intresse. Uppskatta proteinkoncentration empiriskt, använder olika spädningar för ett visst protein preparat, som krävs för att få ca 50% RNA bindande. Det här villkoret eller K-d representerar den känsligaste delen av RNA-bindande kurvan. - Inkubera protein bindande reaktionen för 20 – 30 min vid 25 ° C (eller på is).
-
Separera den proteinbundet RNA fraktionen från den obundna fraktionen på något av två sätt:
- Nitrocellulosa filtrera bindande
- Applicera den bindande reaktionen (20 – 100 µL) på ett nitrocellulosa filter anslutet till ett vakuum samlingsrör vid rumstemperatur.
Obs: Endast RNA-protein komplex behålls på filtret och obundet RNA flöden genom filtret. Bindande filtret tillåter högre återhämtning av bundna RNA och är snabbare och enklare, jämfört med gel rörlighet Skift analysen. Genom att placera ett DEAE membran under filtret nitrocellulosa är det också möjligt att samla den obundna fraktionen av RNA eller fri RNA för jämförelse med den bunden fraktionen. - Skär del av nitrocellulosa filtret med den balanserade radioaktiva RNA i mindre bitar att passa in i en mikrocentrifug rör, Blötlägg i tillräcklig PK buffert (300 – 500 µL innehållande 10 – 20 µg PK) att fördjupa filter bitar och eluera RNA från filtret för 2 – 3 h eller över natten.
- Extrahera med fenol-kloroform, kloroform, och samla vattenfasen. Lägga till natriumacetat och etanol och, efter inkubation i frysen, Centrifugera, tvätta, torka och resuspendera RNA i DEPC-behandlad vatten. Följ stegen som beskrivs i steg 2.10 till 2.14 ovan.
- Applicera den bindande reaktionen (20 – 100 µL) på ett nitrocellulosa filter anslutet till ett vakuum samlingsrör vid rumstemperatur.
- Gel rörlighet Skift
- Förbereda och polymerisera en 5% infödda polyakrylamidgel (60:1 Acrylamide:bis-akrylamid) i 0,5 x TBE (standard Tris-Borat-EDTA buffert) innan du börjar den bindande reaktionen, som ett alternativ till metoden filter bindande.
- Förväg Kör gelen i 15 min på 250 V i ett kallt rum (4 ° C).
- Fyll varje bindande reaktion (ovan) i separata brunnar i ovanstående pre kör gelen.
Obs: Protein lagring bufferten ger tillräcklig glycerol för provet lastning i brunnar. - Separata proteinbundet RNA med gelelektrofores i ett kylrum på 250 V för 1 till 2 h, beroende på RNA storlek och specifikt protein.
- Lokalisera positionen av RNA-protein komplex på gel av autoradiografi. Punktskatt på gel segmentet som innehåller RNA-protein komplex. Eluera RNA från gel segmentet genom krossning gel slice och blötläggning i PK bufferten.
- Extrahera med fenol-kloroform, kloroform, och samla vattenfasen. lägga till natriumacetat och etanol och efter inkubation i frysen, Centrifugera, tvätta, torka, och resuspendera RNA i DEPC-behandlad vatten. Följ stegen som beskrivs i steg 2.10 till 2.14 ovan.
- Nitrocellulosa filtrera bindande
4. analys av jod-klyvs Phosphorothioate produkter för detektion av mutanta Nucleotide positioner
- Lägg till 1 mM jod i en 20 μl DEPC-behandlad vatten som innehåller upp till 10 µg carrier tRNA klyva RNAs (bundna och totala RNAs) på platser phosphorothioate bolagsordning. Odla i rumstemperatur i 5 min.
Obs: Ytterligare information om jod klyvning med något annorlunda villkor — 7% (v/v) iodoethanol, värme vid 95 ° C i 3 min — kan hittas i Gish & Eckstein 198819. - Fällningen klyvs RNA genom att lägga till natrium acetat/etanol, som beskrivs ovan. Återsuspendera i ett lastning färgämne för denaturering geler. Värm och ladda provet för att separera RNA fragment genom elektrofores i en 15 – 20% denatureringen polyakrylamidgel.
- Exponera Polyakrylamidgelen till en röntgenfilm.
- Upptäcka band i den bunden fraktionen kontra totala pool använder autoradiografi.
Obs: Utföra alla steg med jod i ett avgassystem-huva. För RNA separation visas här, är en kilformade gel anställd, som uppnås genom fördubbling tjockleken på båda distanserna på botten av gel plattorna genom att infoga en extra tum lång spacer på botten av gelen. Denna form gör mer enhetlig eller närmare avstånd mellan kortare RNA fragment. Alternativt kan en phosphorimager användas snarare än X-ray filmer för upptäckt och kvantifiering av radioaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Principen om mättnad mutagenes med hjälp av doping:
För en lämplig molar förhållandet av vildtyp och andra nukleotider, Använd en lika blandning av alla fyra nukleotider om endast en ståndpunkt är att analyseras. Men om flera positioner analyseras samtidigt, förhållandet av icke-wild type för vildtyp nukleotider måste justeras, dvs minskas. Annars, förutom enstaka substitutioner, som önskas, det kommer också finnas mallar med flera icke-vildtyp nukleotider i en molekyl, utgör hinder för analys av effekten av single-nucleotide substitutioner. Således som en tumregel, använda ett förhållande av icke-wild type för vildtyp nukleotider till 1/n, där n är antalet positioner som ska analyseras. Här, vi analyserat 10 positioner samtidigt och används en blandning som innehåller 90% av de vildtyp nukleotid och 10% av de icke-vildtyp nucleotiden för dopning mallen DNA. Separat transkription reaktioner är klar, där varje transkription reaktion utförs med en av de fyra phosphorothioates. Därför övervakar varje reaktion en specifik nukleotid vid dopade positioner.
Principen om partitionering på grund av störningar:
I metoden mutagenes presenteras här har RNAs i genomsnitt färre än en phosphorothioate rester per molekyl. Under processen att bindande, RNA molekyler partition mellan proteinbundet fraktionen och den obundna fraktionen. Eftersom en viss nukleotid är kopplad till en phosphorothioate koppling, är klyvning av phosphorothioate ryggraden länkaget en avläsning av förekomsten av en specifik nukleotid på den positionen. Det förväntas att på någon given position, när en nukleotid byts det kan ha antingen ingen effekt på bindande eller det kan hämma bindningen, helt eller delvis. Om förekomsten av en specifik nukleotid har ingen effekt på bindande kommer det partitionera lika mellan protein-bundna och obundna fraktioner. Men om en specifik nukleotid på en viss position stör proteinbindning undantas det prioriterat den proteinbundna delen. Graden av störning kan övervakas kvantitativt för varje positioner i samma reaktion efter gelelektrofores. Detta begrepp illustreras i en schematisk (figur 3). I totala RNA bråkdel (lane T) är bandet intensitet ungefär lika för alla dopade positioner (band 1, 3 – 7). I proteinbundet RNA bråkdel (lane B), på position 1, 4 och 7 påverkar en nukleotid inte bindande. Dock på position 3 och 6, det stör bindande och således är uteslutna från den bunden fraktionen. På position 5 är störningar partiell. Därmed möjliggöra jämförelser av fyra ihopkopplade körfält, T- och B för varje nukleotid, analys av alla fyra nukleotider. Det bör noteras att vildtyp nucleotide för en viss ståndpunkt återspeglar effekten, om någon, av svavel i RNA ryggraden på proteinbindning.
Den medföljande autoradiograph (figur 4) visar två par (α-thio A och α-thio U) körfält från en denatureringen gel (T för totala pool) och B för bunden fraktion. Flera observationer kan göras genom att jämföra stödnivåerna band på varje position mellan varje par av körfält (T och B). Först, är majoriteten av signalen överst i gelen, dvs uncleaved produkt, för både α-thio en lane och α-thio U lane. För det andra för α-thio A par lanes är flera band (jod klyvningsprodukter) identiska mellan bunden och totalt RNA fraktioner till exempel band ovan 1; relevanta band inom bindningsstället för den α-thio ett körfält är numrerade för referens. Det tredje band längst ned på gelen är mer tätt placerade (t.ex. band under 6) än vad som är vanligt för en sekvensering gel. Fjärde, flera band är närvarande i den totala RNA-fraktionen men frånvarande eller betydligt reducerad i bundna RNA fraktionen (t.ex., band 1, 2, 3 och 5). Det femte för α-thio U lane par, medan de flesta band är jämförbara mellan de totala och bunden köer, vissa band är relativt mindre intensiv i den bunden fraktionen (t.ex. band 7 och 8).
Dessa observationer ger belägg för framgångsrik utveckling av denna nya metod och leda till följande slutsatser: för det första för både α-thio A par körfält och α-thio U par körfält, eftersom de flesta av RNA är uncleaved, den ger bevis att endast en bråkdel av RNA innehåller modified eller phosphorothioate rester. Detta är viktigt eftersom det konstaterar att RNA-molekyler innehåller inte mer än en phosphorothioate rester. Andra, identiska eller liknande stödnivåer för flera band utanför webbplatsen bindning mellan de två körfält, för både α-thio A och α-thio U, visar att lastning är jämförbara för båda körfält, möjliggör enkel jämförelse mellan körfält. Tredje, mer tätt placerade band uppnås, för α-thio A och α-thio U, Kil-formen av gelen (tunnare överst och tjockare i botten), vilket möjliggör analys av längre sekvens läsningar och erbjuder högre upplösning. Vanligtvis är kortare fragment mer allmänt fördelade i en gel med enhetlig tjocklek. Fjärde, försvinnande eller minskad intensitet av vissa band i den bunden fraktionen indikerar att den icke-wild-type-nukleotid prioriterat utesluts från den bunden fraktionen (α-thio A). Relativ intensitet av olika band inom den bundna lanen erbjuder även kvantitativ information om omfattningen av störningar från icke-vildtyp rester på olika platser. Med andra ord, störa den mutant eller icke-vildtyp nukleotider i specifika positioner proteinbindning. Slutligen, testa effekten av ryggraden svavel substitution (phosphorothioate) på en av de icke-överbrygga syreatomerna (α-thio U), visar att tre positioner mindre effekter från ryggraden sulfurs (t.ex. 6, 7 och en nedan 7). Våra kombinerade resultat visar att flera befattningar inom bindningsstället Visa förmånliga försvinner eller reduceras intensiteter av specifika band i den bunden fraktionen. Detta beror på base i stället för ryggraden substitution, som anger proteininteraktioner med specifika baser i bindningsstället (α-thio A). Under tiden, införlivandet av α-thio C visar en interferensmönstret jämförbar med α-thio A. Endast 3 – 4 α-thio G substitutioner Visa små men påvisbara störningar centrerad kring, till exempel positioner numrerade 2 och 3 (inga data anges). Denna metod har använts för att avslöja skillnader i hur den skarvning repressor SXL och den allmänna skarvning faktor U2 snRNP extra faktor (U2AF65) binder till en identisk pre-mRNA skarvning Signalera ordnar (polypyrimidine-tarmkanalen) på olika sätt15 .
Figur 1: flödesschema av viktiga steg i phosphorothioate mutagenes (PTM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk av en phosphorothioate koppling mellan två nukleotider, som kan vara kemiskt klyvs av jod. Svavel ersätter en av de icke-överbrygga fosfat syreatomerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: principen om partitionering på interferens. Hypotetiska RNA innehåller representativa α-thio nukleotider på sex positioner, inklusive en proteinbindning webbplats. Efter proteinbindning, RNA är klyvs på platser i phosphorothioate inkorporeringen av jod. Positioner 1 – 7 inom och runt bindningsstället numreras godtyckligt referens i texten. Position 2 eller saknade bandet representerar ingen phosphorothioate införlivande eller icke-dopade nukleotid. Lane T är total-RNA och lane B är proteinbundet RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Phosphorothioate mutagenes (PTM) tillvägagångssätt tillåter mättnad mutagenes av en polypyrimidine-tarmkanalen/3 ' skarva webbplats i transformator pre-mRNA. Lane T är total-RNA och lane B är proteinbundet RNA. Α-thio en representerar RNA syntetiseras i närvaro av α-thio ATP och identifierar dopade positioner med α-thio adenosines i sekvensen. Tre starka band motsvarar adenosines i sekvensen på dessa positioner. Α-thio U representerar RNA syntetiseras i närvaro av α-thio UTP och identifierar alla uridines, inklusive dopade positioner, i sekvensen. Vertikala linjen till vänster markerar SXL bindningsstället. 1 – 8 positioner inom bindningsstället numreras i referenssyfte och för att underlätta beskrivning i resultatavsnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagenes har länge använts för att karakterisera protein bindningsställen. Först, en serie av mutanter kan byggas och testas individuellt i bindande analyser att analysera deras effekter på bindande samhörighet. Medan en standard mutagenes strategi erbjuder ett sätt att analysera flera sekvenser, flera steg inblandade i standardmetoden, såsom att bygga mutanter och utföra en serie bindande reaktioner för varje mutant, är mödosam och tidskrävande och kan inte tillåta mättnad mutagenes, särskilt för längre sekvenser. Andra en sekvens kan vara randomiserad och poolen används för flera cykler av bindande och polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärkning. Dessa sekvenser som binder protein måste vara klonade och sekvenseras för att identifiera och validera ett bindningsställe i samförstånd sekvens. Trots detta iterativa bindande och förstärkning alternativ omfattar flera steg och är arbetskrävande att identifiera rester som är viktiga inom bindningsstället. Dessutom införa upprepade sekvens kompletteringar inneboende PCR sekvens bias. För det tredje, sekvenser som väljs från slumpmässiga poolen kan sekvenseras med en snabbare alternativ av hög genomströmning sekvensering, även om det är relativt dyrt. Därför, för att övervinna dessa begränsningar av flera steg, mödosam och/eller dyra metoder, utarbetade vi en snabbare, billig, och viktigast av allt en singel-steg-metoden som beskrivs här, för att åstadkomma mättnad mutagenes av ett bindningsställe (PTM).
De viktigaste stegen i den här strategin inkluderar identifiering eller taggning av den icke-wild-type-nucleotide(s). Vi använde phosphorothioate nukleotider, där en av syreatomerna i fosfatet ryggraden ersätts med svavel, som beskrivs (figur 2). Fördelen är att jod kan användas till kemiskt klyva ryggraden i den phosphorothioate nucleotiden. Således, jod klyvning av RNA substratet som innehåller en phosphorothioate ryggrad genererar en sekvensering-typ stege, där platsen för klyvning är en proxy eller tagg för förekomsten av en av fyrana baser på den positionen. En jämförelse av de obundna och totala fraktionerna identifierar restprodukter som företrädesvis är undantagna från den bunden fraktionen och således är viktiga för proteinbindning. Däremot förblir restprodukter som inte är viktiga för bindande lika fördelad mellan de två fraktionerna. Detta tillvägagångssätt kan användas för att definiera bindningsställen för alla RNA-bindande protein.
Sammanfattningsvis erbjuder detta one-step mättnad mutagenes strategi, som kombinerar dopning, phosphorothioates och jod klyvning, kraftfulla hjälpmedel för karakterisering av någon bindande webbplats i RNA. Detta tillvägagångssätt kräver dock att bindningsstället är redan känt före mutagenes. Protein – bindande villkor behöver dessutom optimerad för varje protein. Följande försiktighetsåtgärder behöver betonas. Försiktighetsmått för RNA hantering måste utövas, såsom handskar, beredning av lösningar och buffertar i DEPC-behandlad vatten, autoklavering pipettspetsar och rör, och dedicera utrustning för RNA använder bara för att undvika RNaser. Vård som omfattar radioaktiva sköldar, radioaktiva övervakning medan med radioaktivt material är viktigt, och användning av avgaser huven medan du använder farliga kemikalier är likaså nödvändigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författaren tack den National Institutes of Health för tidigare finansiering och tack Michael R. Green för syntetisera oligonukleotider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
