Summary
هنا يصف لنا طريقة "مجموعة النسخ المتماثلة"، ونهج لقياس كمي C. ايليجانس عمر/البقاء وهيلثسبان بطريقة الفائق وقوية، مما يتيح فحص ظروف كثيرة دون التضحية بجودة البيانات. هذا البروتوكول تفاصيل الاستراتيجية ويوفر أداة حاسوبية لتحليل البيانات "مجموعة النسخ المتماثلة".
Abstract
الأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" نهج لقياس عمر أو البقاء على قيد الحياة من الديدان الخيطية ايليجانس كاينورهابديتيس كمياً بطريقة الفائق، مما يسمح لمحقق واحد الشاشة أكثر العلاجات أو شروط على نفس القدر من الوقت دون فقدان جودة البيانات. الأسلوب يتطلب المعدات المشتركة التي وجدت في معظم المختبرات العاملة مع C. ايليجانس وهكذا بسيط لاعتماد. مراكز النهج على فحص عينات مستقلة من عدد السكان في كل نقطة مراقبة، بدلاً من عينة واحدة على مر الزمن مع الطرق الطولية التقليدية. سجل يستلزم إضافة السائل إلى الآبار للوحة متعددة جيدا، الذي يحفز C. ايليجانس للانتقال ويسهل تحديد التغيرات في هيلثسبان. وتشمل الفوائد الأخرى الرئيسية أسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" خفض التعرض للأسطح أجار للملوثات المحمولة جوا (مثل العفن أو الفطريات)، الحد الأدنى من التعامل مع الحيوانات، ومتانة لسوء التهديف متفرقة (مثل استدعاء حيوان كالميت عند فإنه لا يزال على قيد الحياة). بشكل مناسب تحليل ووضع تصور للبيانات من تجربة نمط "مجموعة النسخ المتماثلة"، وضعت أيضا أداة برمجية مخصصة. وتشمل القدرات الحالية للبرنامج رسم منحنيات البقاء على قيد الحياة لكل "مجموعة النسخ المتماثلة" والتقليدية (كابلان-ماير) تجارب،، فضلا عن التحليل الإحصائي "مجموعة النسخ المتماثلة". البروتوكولات المقدمة هنا وصف النهج التجريبي التقليدي والأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة"، فضلا عن لمحة عامة عن تحليل بيانات المقابلة.
Introduction
كان من بين التقدم التكنولوجي معظم التحويلية نحو فهم الأساس الجيني للشيخوخة تطوير القائم على تغذية [رني] في ايليجانس جيم-1؛ قبل استخدام تجريبي [رني]، لم تكن تعمل العديد من الشيخوخة وراثيا أصعب. [رني] على أساس التغذية ويتحقق من خلال إنتاج دسرنا داخل كولاي التي تطابق الذاتية مرناً C. ايليجانس : إيبتج يدفع النسخ ثنائي الاتجاه عبر إدراج كدنا C. ايليجانس أما أو جزء من فتح إطار القراءة داخل بلازميد2. عندما C. ايليجانس آر عند سليمة دسرنا كولاي، التي تنتجها البكتيريا المنقولة من التجويف داخل الخلايا المعوية عن طريق البروتين transmembrane SID-23، وثم توزع من خلال ما تبقى من هذا الحيوان عن طريق سيد-14. داخل كل خلية، دسرنا خارجية تتم معالجتها بواسطة ديسير المعقدة في siRNA، التي تتفاعل مع مرناً ناضجة عن طريق إقران قاعدة مكملة لإنشاء جديد مزدوج siRNA مرناً. هذا الاتجاه هو الاعتراف بالمجمع RISC والمشقوق، وبالتالي اللاإنسانية مرناً الذاتية5. وهكذا، بمجرد تغيير إدراج بلازميد، أحد يمكن إلغاء تنشيط وظيفة تقريبا أي الجينات داخل الجينوم C. ايليجانس . هذا الاكتشاف أدى إلى خلق عدة كبيرة على أساس التغذية [رني] مجموعات المكتبات لتحويل الأرصدة كولاي التي يمكن دمجها لتحقيق تغطية حوالي 86 في المائة من المعروف، C. ايليجانس الجينات6 7.
منذ النهوض [رني] على أساس التغذية، شاشات شاملة في C. ايليجانس أدت إلى اكتشاف الجينات أكثر من 900 أن يغير عمر عند إبطال (كما يتضح من رابطات النمط الظاهري [رني] رعاية في وورمباسي)، الذي نشير إليه إلى كما جرجنس. تم اكتشاف دور لأغلبية جرجنس في السيطرة على طول العمر من خلال [رني] على أساس التغذية في عدد قليل من التقارير المنوي (انظر الشكل 1A و تكميلية الملف 1 لمزيد من التفاصيل). وقد حددت هذه جرجنس في بعض الحالات، استناداً إلى قياس الجدوى في واحدة أو عدد قليل من النقاط الزمنية، التي لا توفر مقياسا قابلة للقياس الكمي للتغيير في عمر مع العلاج [رني]. وفي حالات أخرى، احتسبت هذه الجينات كمياً للتغييرات في عمر، فضلا عن تعمل الإضافية المرتبطة بالعمر. على سبيل المثال، حددنا سابقا 159 الجينات التي كانت ضرورية لعمر الحيوانات مع انخفاض الأنسولين/منتدى إدارة الإنترنت-1 الإشارات العادية وزيادة، وقياس التغيرات في هيلثسبان. هذه، تسفر 103 الجينات إيناكتيفيشنز النمط الظاهري بروجيريك، كما أدى إلى خسارة في واحد أو أكثر من علامات الشيخوخة المبكرة8.
وبينما ارتبطت بعض جيروجينيس مع الدراسات 100 أو أكثر (مثل daf-16، داف-2، سيدي-2.1)، قد جيروجينيس ما يزيد على 400 الاستشهادات 10 أو أقل (الشكل 1B، و تكميلية ملف 2). وهكذا، حين اكتشف شاشات [رني] على أساس التغذية الشاملة واتفاقيتا تتميز مئات جرجنس المفترضة، كيف هذه وظيفة الجينات في السيطرة على طول العمر، والعلاقات الوراثية بين هذه المنتجات الجينات تظل سيئة درس. التحليل الكامل الطولي لتعمل المرتبطة بالعمر شرط أساسي لتحديد التفاعلات الجينية بين جرجنس (مثلاً epistatic التفاعلات، التفاعلات أسينثيتيك، إلخ.). اكتساب نظرة ثاقبة أعمق العلاقات الوراثية بين جرجنس يتطلب أسلوب كمي الفائق، الذي كما وروافع المزايا [رني] على أساس التغذية.
هذا الإجراء البديل الأكثر شيوعاً للشيخوخة عمر. النهج التقليدي لقياس معدل وفيات C. ايليجانس المسارات وفاة الحيوانات الفردية على مر الزمن داخل عينة صغيرة من سكان. ويلي على مر الزمن عدد صغير نسبيا من الحيوانات ودوريا بلطف محثوث بسلك البلاتين أو جفن، مع الحركة كمؤشر للبقاء (الشكل 2A). هذا الأسلوب قد استخدمت على نطاق واسع، كما أنها توفر قياسات مباشرة، مباشرة من المتوسط وعمر الحد الأقصى. ومع ذلك، هذا الأسلوب التقليدي مضيعة للوقت ونسبيا منخفضة الإنتاجية، مما يحد من عدد الحيوانات والظروف التي يمكن أن يقاس في نفس الوقت بطريقة الخاضعة للرقابة. ووجدت دراسة محاكاة مؤخرا أن العديد من الدراسات عمر C. ايليجانس الاعتداء ليس عددا كبيرا بدرجة كافية من الحيوانات لتكون قادرة على كشف التغيرات الصغيرة بين ظروف9موثوق. وعلاوة على ذلك، يتضمن هذا الأسلوب التقليدي مرارا وتكرارا التعامل مع نفس مجموعة الحيوانات على مر الزمن، والتي بدورها يمكن أن يعرض التلوث، ويمكن أن الضرر أو قتل الحيوانات تزداد ضعفا، الذين تتراوح أعمارهم بين.
قمنا بتطوير منهجية بديلة "مجموعة النسخ المتماثلة" لقياس عمر C. ايليجانس . تحقيقا لهذه الغاية، وعدد كبير من الحيوانات مزامنة العصر، وأسوي تنقسم إلى عدد السكان صغيرة (أو النسخ المتماثلة). يتم إنشاء عينات متماثلة ما يكفي لتغطية كل نقطة الوقت في التجربة المزمعة. على كل نقطة مراقبة الوقت، هو أحد النسخ المتماثلة وسجل عدد من الحي الميت ويتم التخلص من الحيوانات الخاضعة للرقابة، ثم الحيوانات داخل تكرار ذلك. وهكذا، أكثر من العمر المتوقع للسكان ككل، سلسلة من الفئات السكانية الفرعية المستقلة يتم دورياً عينات (الشكل 2). باستخدام مجموعات النسخ المتماثلة هناك لا الحث المتكرر للحيوانات ولا التعرض المتكرر للتلوث البيئي المحتمل. صلاحية ولاحظ عند نقطة مرة واحدة مستقلة تماما عن كل المراقبة الأخرى، مما يقلل من مناولة ويزيد الإنتاجية بضخامة على الأقل. وهذا أتاح لنا أن كوانتيتاتي التغيرات في عمر لاستنساخ مئات من [رني] في نفس الوقت8،10.
نقدم هنا بروتوكولات مفصلة لإجراء عمر C. ايليجانس عبر "مجموعة النسخ المتماثلة" والأساليب التقليدية للتهديف C. ايليجانس طول العمر. علينا أن نظهر أن يتم الحصول على نتائج مماثلة بين الأساليب. لدينا البرامج المتقدمة للمساعدة في تحليل رسومي لعمر البيانات التي تم إنشاؤها عن طريق أما النهج الذي نقدم بحرية تحت ترخيص GPL V3 (انظر الجدول للمواد). "وورمليفي" هو مكتوب في ص11، ويتضمن واجهة مستخدم رسومية (GUI) لرسم البيانات، التي تم اختبارها في نظام التشغيل Mac OS و Linux. وأخيراً، نحن مقارنة وعلى النقيض من القيود المفروضة على كل أسلوب وتسليط الضوء على الاعتبارات الأخرى عند اختيار بين نهج لقياس التغيرات الكمية في عمر C. ايليجانس .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الأسلوب التقليدية لسجل C. ايليجانس طول العمر
- إعداد الكواشف
- تحديد الجينات يتم إلغاء تنشيطه عبر [رني] على أساس التغذية. شراء الأرصدة المحولة HT115 كولاي2 يحتوي على الاستنساخ [رني] للفائدة. وبدلاً من ذلك، سوبكلون كدنا الجينات من الفائدة في موقع مولتيكلونينج بلازميد L4440.
ملاحظة: HT115 هو عبئا ثالثا-نقص رناسي كولاي بنشاط بوليميريز T7 إيبتج-إيندوسيبلي، والذي يستخدم لمنع تدهور دسرنا داخل البكتيريا. عمر الدراسات التي لا تستخدم [رني] على أساس التغذية، يمكن أن تكون أما HT115 أو OP50 كولاي على لوحات NGM القياسية المستخدمة. - إعداد لوحات [رني] كل شرط الاختبار (3 ملف تكميلية للوصفة) 6 سم 3 – 6 (أو أكثر). تخزين لوحات [رني] في 4 درجات مئوية قبل البذر مع البكتيريا لتصل إلى عدة أشهر.
- تنمو تحول كولاي بين عشية وضحاها (16-20 ساعة، 37 درجة مئوية تهز الحاضنة 180 – 220 لفة في الدقيقة).
ملاحظة: HT115 كولاي تزرع في رطل مع الأمبيسلّين (50 ملغم/مل). معيار OP50 كولاي ليست مقاومة للمضادات الحيوية، وتزرع دون الأمبيسلّين. حجم الثقافة يعتمد على # للوحات، ولكن يتم عادة بين 8 و 100 مل من رطل، اعتماداً على التصميم التجريبي.- تركز البكتيريا بالطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 15 – 20 دقيقة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. نضح المادة طافية، وإعادة تعليق بيليه في 1/10 ابتداء من وحدة التخزين (أي 10 x) في رطل مع الأمبيسلّين HT115 (أو دون الأمبيسلّين لمعيار OP50).
- وتتركز ميليلتر 200 الكوة من البكتيريا x 10 لكل لوحة 6 سم. إعداد replicates 3 – 4 كل شرط الاختبار، مع لوحات إضافية احتياطية 2، لاستخدامها في حالة حدوث تلوث. عند إعداد لوحات، تسمية لهم حتى المجرب التهديف في التحليل أعمى للظروف التجريبية، باستخدام رمز اللون أو نظام الترميز مماثلة. تأكد من أن يتم تسجيل التعليمة البرمجية.
- السماح بفتح لوحات الجاف في بيئة نظيفة مثل مقعد الاندفاق الصفحي حتى قد تم استيعاب جميع السائل أو السماح لوحات مغطاة الجاف على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها. مراقبة لوحات أثناء عملية التجفيف للتأكد من أن أجار الجافة دون الإفراط في التجفيف.
ملاحظة: الإفراط في تجفيف اللوحات يؤدي إلى تكسير لاجار التي سوف تسبب C. ايليجانس تحفر في أجار. ويت أيضا تعزيز أسطح أجار تختبئ.
- تخزين لوحات المجففة داخل مربع دودة بين عشية وضحاها (تصل إلى 24 ساعة) في درجة حرارة الغرفة للسماح بتنظيم دورات تعريفية لإنتاج دسرنا. بعد يوم واحد على RT، تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لتصل إلى 2 أسابيع في كيس مختوم قفل الرمز بريدي (لمنع الجفاف) لوحات. قبل الاستخدام، إعادة لوحات لدرجة حرارة الغرفة داخل كيس قفل الرمز البريدي لمنع التكثيف من إدخال الملوثات الفطرية المحمولة جوا.
- تحديد الجينات يتم إلغاء تنشيطه عبر [رني] على أساس التغذية. شراء الأرصدة المحولة HT115 كولاي2 يحتوي على الاستنساخ [رني] للفائدة. وبدلاً من ذلك، سوبكلون كدنا الجينات من الفائدة في موقع مولتيكلونينج بلازميد L4440.
- تزامن C. ايليجانس مع العلاج تحت كلوريت
ملاحظة: انظر 3 ملف تكميلية لوصفات الحل M9 وتحت كلوريت.- جمع الحيوانات الكبار جرابيد مع M9. استخدام ماصة زجاجية توصيله الانتقال إلى أنابيب 2 × 15 مل.
- تدور أنابيب ل 30 "~ 2,000 لفة في الدقيقة. تحقق من وجود تجمع في الديدان الخيطية في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح المادة طافية. تغسل مرتين مع الحل M9، تكرار تدور وتطلع.
- إعادة تعليق C. ايليجانس في 4 مل M9. إضافة 2 مل من محلول هيبوكلوريت. فورا من دوامة لمدة دقيقة ~ 3، مع اهتزاز قوية الدوري. وبعد 3 دقائق، ابحث عن سحابة من البيض تحت مجهر تشريح. S دوامة 10 – 20 إضافية إذا لم تم الإفراج عن البيض بعد 3 دقائق.
ملاحظة: توقيت العلاج تحت كلوريت ضروري. البيض ضمن الكبار جرابيد هي ما العلاج البقاء على قيد الحياة. بعد دقيقة ~ 3 بالغين جرابيد كسر مفتوح وانسكاب البيض خارجاً. ومع ذلك، إذا كان البيض في الحل تحت كلوريت طويلاً بعد الإفراج عن سيموتون. على العكس من ذلك، إذا كان لا يتم ترك الكبار جرابيد في الحل تحت كلوريت طويلة بما يكفي، سيتم الإفراج عنهم لا البيض. - تغسل بسرعة مع الحل M9 مرتين كما في الخطوة 2.1.2.
- إعادة تعليق C. ايليجانس البيض بيليه في 3 مل M9 ونقل إلى أنبوب 15 مل جديدة. السماح للأجنة التظليل بين عشية وضحاها في 3 مل من محلول M9 بالتناوب في 20 درجة مئوية.
- حساب كثافة الحيوانات L1 (أو الأجنة) كل ميليلتر بإسقاط 10 ميليلتر من حل L1 3 x 6 سم لوحة والعد عدد الحيوانات L1 لحساب متوسط عدد L1s/ميليلتر.
ملاحظة: سوف تستقر الحيوانات L1 مع مرور الوقت. ولذلك، ينبغي أن تكون مختلطة حلول L1 دورياً. - الحيوانات L1 البذور 50 للوحة الواحدة. عكس لوحات وختم مع شريط المطاطي. وضع لوحات في مربع دودة بلاستيكية. ختم المربع في كيس كبير قفل الرمز بريدي. الانتقال إلى حاضنة 20 درجة مئوية.
- منع إنتاج ذرية بإضافة 5-مخفضات-2 '--ديوكسيوريديني (فودر)
- تنمو الحيوانات حتى مرحلة L4 في 20 درجة مئوية. تحقق لمعرفة ما إذا كانت تتم مزامنة الحيوانات تطورت إلى L4 حوالي 40 ح بعد البذر (الخطوة 2.1.7).
ملاحظة: تتنوعC. ايليجانس التنموية الوقت في درجات حرارة مختلفة يجب اختبار12 ومعدلات النمو للحيوانات المسخ الذي لا تتسم معدلات تجريبيا.- إضافة 160 ميليلتر من 50 x FUdR لكل لوحة 6 سم مع الحيوانات L4.
ملاحظة: من الضروري إضافة فودر في مرحلة L4. للراحة، جعل مخزونات x 1,000 فودر بتذويب ز 1 فودر في 10 مل ح عالي النقاوة2تعقيم O. تصفية الأسهم فودر مع فلتر 0.2 ميكرون وحقنه 10 سم مكعب. الكوة ~ 1 مل من المخزون في أنابيب معقمة 1.5 مل. تجميد وتخزين في-20 درجة مئوية.
- إضافة 160 ميليلتر من 50 x FUdR لكل لوحة 6 سم مع الحيوانات L4.
- فحص الصفائح لوجود أنثى C. ايليجانس. قم بإزالة جميع الذكور.
ملاحظة: عمر يقاس عادة للمنحرفين ولا من الذكور. المنحرفين ورفيقه يعيشون أقصر من الحيوانات المجنحات، حتى بحضور فودر13. الذكور هي أصغر وأرق ثم المنحرفين، ويمكن بسهولة تحديد ذيل معلق مميز14. - وضع مربع مرة أخرى في كيس قفل الرمز البريدي. العودة إلى حاضنة 20 درجة مئوية.
- تنمو الحيوانات حتى مرحلة L4 في 20 درجة مئوية. تحقق لمعرفة ما إذا كانت تتم مزامنة الحيوانات تطورت إلى L4 حوالي 40 ح بعد البذر (الخطوة 2.1.7).
- سجل السلامة
- نقاط صلاحية يوميا بلطف لمس الحيوان على رأسه بسلك البلاتين أو جفن. نقاط الحيوانات التي تعجز عن التحرك كالميت وإزالتها من اللوحة (الشكل 2A). سجل عدد لاحظ ميتا لكل شرط لكل نقطة مراقبة الوقت.
ملاحظة: للحد من خطر التهديف التحيز، المجرب يجب أن تظل أعمى للظروف التجريبية وبالمثل يجب أن لا الرجوع إلى النتائج من النقاط الزمنية السابقة أثناء التسجيل. - الرقيب الحيوانات التي تمزق، يموت من العيوب الواضحة التنمية الأخرى، أو الزحف حتى على جانب الطبق: إزالة هذه الحيوانات وسجل لاحظ العدد في كل مرة نقطة للنظر في التحليل الإحصائي. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم العثور على الذكور، بإزالتها وسجل عدد لاحظ.
- كرر الخطوة 1.4.1 يوميا حتى الحيوانات لا تظل على قيد الحياة.
ملاحظة: ينبغي أن العشب كولاي تقلل إلى حد كبير أو يبدأ الفطريات تنمو على اللوحة، ونقل جميع الحيوانات المتبقية إلى لوحة جديدة بمناسبة [رني] وفودر.
- نقاط صلاحية يوميا بلطف لمس الحيوان على رأسه بسلك البلاتين أو جفن. نقاط الحيوانات التي تعجز عن التحرك كالميت وإزالتها من اللوحة (الشكل 2A). سجل عدد لاحظ ميتا لكل شرط لكل نقطة مراقبة الوقت.
- التآمر--تحليل البيانات والإحصاءات
- الإدخال أو بيانات رصد مسجل المفتوحة في برامج دعم تحليل البقاء على قيد الحياة بغير حدودي كابلان-ماير مقدر15 ورتبة سجل اختبار16 (انظر الملف الإضافي 3). تأكد من تضمين الحيوانات الخاضعة للرقابة. لا تقم بتضمين الذكور التي لوحظت، أن وجدت.
ملاحظة: قد تختلف تنسيقات البيانات بين البرامج، ولكن صيغة مشتركة لتسجيل كل الحيوانات الفردية لاحظ على سطر منفصل. تيميبوينت التجريبي الذي لوحظ حيوان كالميت الوقت "الحدث". إذا كان للرقابة، هو الوقت "الحدث" تيميبوينت الذي كان للرقابة الحيوانية. عادة ما يكون هناك حقل أو مربع الاختيار للإشارة إلى ملاحظات مختصرة. - رسم منحنيات البقاء على قيد الحياة كابلان-ماير. حدد أقل من ستة شروط للحصول على قطعة واحدة إذا كانت جزيئي العديد من الشروط لتحسين إمكانية القراءة.
- التحقق من وجود قضايا البيانات بصريا الظاهر-الملاحظات المفقودة، ونتائج غير متوقعة من التحكم، إلخ -وتعالج هذه قبل التحليل الإحصائي.
- استخدم الدالة رتبة سجل اختبار في البرامج الخاصة بك لأداء بيرويس المقارنات الإحصائية. التأكد من أن أي من الخيارات المتاحة لمعالجة نتائج الرقابة يتم تعيين بشكل مناسب للبيانات للرقابة الحق.
- الإدخال أو بيانات رصد مسجل المفتوحة في برامج دعم تحليل البقاء على قيد الحياة بغير حدودي كابلان-ماير مقدر15 ورتبة سجل اختبار16 (انظر الملف الإضافي 3). تأكد من تضمين الحيوانات الخاضعة للرقابة. لا تقم بتضمين الذكور التي لوحظت، أن وجدت.
2-النسخة المتماثلة تعيين أسلوب لسجل C. ايليجانس طول العمر
ملاحظة: بينما الطريقة التقليدية يتطلب 3 – 6 لوحات كل حالة (انظر 1.1.2. أعلاه)، يتطلب أسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" أكبر بكثير (راجع الخطوة 2-2-2 أدناه). يتبع الطريقة التقليدية الحيوانات على اللوحة نفسها في جميع أنحاء تجربة (الشكل 2A). وفي المقابل، مع "مجموعة النسخ المتماثلة" الحيوانات فقط وسجل مرة واحدة: replicates مماثلة كثيرة تم إعدادها في بداية التجربة حيث أن تكرار واحد وهو سجل في كل نقطة الوقت (للمحاكمة) (الشكل 2).
- مكتبة الإعداد.
ملاحظة: تفاصيل إضافية حول تسليم الحيوانات المستنسخة [رني] يتم تغطيتها هنا، "مجموعة النسخ المتماثلة" البروتوكول قابلة للتسجيل المتزامن للكثير من [رني] استنساخ، ويمكن تحجيمها إلى ما يزيد عن 100 من الحيوانات المستنسخة في وقت. يتم الحفاظ على مجموعات من الحيوانات المستنسخة [رني] كمخزون والغليسيرول للاحتفاظ بها في لوحة تنسيق 96-جيدا. النسخة المتماثلة مجموعة تجارب استخدام لوحات 24-جيدا. كذلك كل هو شرط اختبار مختلفة، التي قد تتوافق مع مجموعة من الحيوانات المستنسخة [رني] وعلاجات كيميائية مختلفة، والسلالات الحيوانية، وهكذا.- تجميع تخطيط سوبليبراري لمجموعات من الحيوانات المستنسخة [رني], مثل أن يتم استيفاء الشروط التالية:
- ضمان أن A1 جيدا داخل مجموعة 96، حسنا، عنصر سلبي متجه فارغة.
- إدراج عنصر تحكم ناقل فارغة إضافية عشوائياً داخل كل الآبار 24.
- تقسيم اللوحة 96-جيدا إلى كتل من الآبار 24، حيث أن كل لوحة 24-جيدا في أحد عشوائياً أدخلت مراقبة سلبية (الشكل 2).
- إدراج عنصر تحكم إيجابية عشوائياً داخل كل مجموعة ال 24-الآبار (الشكل 2).
ملاحظة: عنصر إيجابي فيعتمد على مسألة تجريبية. على سبيل المثال، عند النظر في مجموعة من [رني] استنساخ ذلك زيادة عمر، daf-2(RNAi) كثيرا ما تدرج. على العكس من ذلك، عندما ننظر إلى تقصير عمر، كثيرا ما يستخدم daf-16(RNAi) .
- تجميع تخطيط سوبليبراري لمجموعات من الحيوانات المستنسخة [رني], مثل أن يتم استيفاء الشروط التالية:
- إعداد مجموعات النسخ المتماثلة
ملاحظة: عدد replicates حاجة يساوي الحد الأدنى لعدد من النقاط الزمنية (الشكل 2). واحد يجب أن تعرف اللاحق كم من الوقت لقياس عمر قبل البدء بالتجربة، فضلا عن سجل التردد (مثل تجربة مجموعة النسخ متماثلة بتشغيل 40 يوما مع كل أخرى يوم سجل يتطلب إعداد الحد أدنى لمجموعات النسخ المتماثلة 20 كل شرط في بداية التجربة). فمن المستحسن جعل ~ 5 مجموعات النسخ الاحتياطي الإضافية (انظر 2.2.2 و 2.2.2.3 أدناه).- لإنشاء طابع جديد من سوبليبراري [رني]، تطعيم 200 ميليلتر رطل + أمبير كل جيدا في شكل جيد 96 (600 ميليلتر اللوحات) استخدام لوحة دبوس 96 وحدة النسخ متماثل بالخطوات التالية:
- تعقيم دبوس 96 لوحة النسخ المتماثل بالتتابع غمر الدبابيس في التبييض 50%، ح2س عالي النقاوة والايثانول. الاحتفاظ بدبابيس مغمورة لمالا يقل عن 30 ثانية للتبييض بالخطوات الإيثانول. بعد الانغماس في الإيثانول، لهب النصائح بإيجاز. كرر.
ملاحظة: يجب التأكد من شطف جميع التبييض، وعدم ترك دبابيس يتعرضون للتبييض لفترات طويلة، كما يمكن أن تتآكل التبييض دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ. - بعناية إزالة غطاء رقائق لاصقة من لوحة مكتبة المخزون المجمد 96-جيدا والغليسيرول ولطف ولكن بشدة طحن نصائح من وحدة النسخ المتماثل تعقيم لوحة في آبار الأرصدة المجمدة لا يزال والغليسيرول. تطعيم 200 ميليلتر رطل + ثقافات أمبير وختم لوحة الملقحين بغشاء منفذ. السماح للثقافات أن تنمو بين عشية وضحاها في benchtop.
- تعقيم لوحة وحدة النسخ المتماثل كما هو الحال في الخطوة 2.1.1، بعناية إزالة الختم من لوحة الثقافة السائل بعد النمو بين عشية وضحاها وتزج نصائح أطراف النسخ المتماثل. تطبيق النصائح مع الضغط حتى لامبير رطل مستطيلة + لوحة أجار تيت، ونقل البكتيريا من السنون الموجودة على لوحة بلطف بحركة دائرية صغيرة، ضمان أن يتم ترك مساحة كافية بين المواقع المتاخمة. السماح للمستعمرات تنمو بين عشية وضحاها على لوحة أجار عند 37 درجة مئوية. انظر 3 ملف إضافي لإعداد رطل + أمبير/Tet لوحات.
- قبل الشروع في الاستخدام، تخزين لوحة أجار في 4 درجات مئوية مقلوب (غطاء الجانب الأسفل)، ملفوفة في الفيلم البارافين.
ملاحظة: تخزين الجانب غطاء المستعمرات سيسمح التكثيف عبر تلويث استنساخ [رني]! يمكن تخزين المستعمرات كولاي 2 – 8 أسابيع عند 4 درجة مئوية، اعتماداً على خاصة [رني] استنساخ، كاستنساخ [رني] الاحتفاظ بفعالية في حمل دسرنا بعد إيبتج التعريفي لفترات زمنية متغيرة. لمجموعات صغيرة من الحيوانات المستنسخة [رني]، [رني] الكفاءة تجريبيا يحدد RT-qPCR تأكيد ضربة قاضية.
- تعقيم دبوس 96 لوحة النسخ المتماثل بالتتابع غمر الدبابيس في التبييض 50%، ح2س عالي النقاوة والايثانول. الاحتفاظ بدبابيس مغمورة لمالا يقل عن 30 ثانية للتبييض بالخطوات الإيثانول. بعد الانغماس في الإيثانول، لهب النصائح بإيجاز. كرر.
- حساب الحد الأدنى لعدد 24-جيدا لوحات اللازمة لمحاكمة واحدة للتجربة: (# اللوحات في مجموعة النسخ المتماثلة) x (النقاط الزمنية المتوقعة #). التأكد من وجود عدد قليل من مجموعات النسخ المتماثلة إضافية مضمنة لمعالجة قضايا من قبيل التلوث (الشكل 2).
ملاحظة: العدد الإجمالي للنسخ [رني] تحديد عدد اللوحات 24-جيدا لجعل مجموعة واحدة من النسخ المتماثلة لكل نقطة الوقت (الشكل 2).- إعداد لوحات 24-جيدا، كخطوة 1.1.2 (3 ملف تكميلية للوصفة). سوف تكون لوحات التسمية عند إعداد منهم ذلك المجرب التهديف المقايسة الأعمى للظروف التجريبية، باستخدام رمز اللون أو نظام الترميز مماثلة.
- تلقيح مجموعة واحدة من 1.5 مل رطل + ثقافات أمبير لكل النسخ المتماثلة 10 (انظر 2.2.2). تلقيح ثقافات في 96 لوحات الآبار العميقة باستخدام لوحة النسخ المتماثل (كما هو الحال في 2.1.3) والمستعمرات البكتيرية من 2.1.4 (الشكل 2، يسار). ختم بغشاء تنفس، تنمو ح 20 (37 درجة مئوية) مع الهز.
- البذور ميليلتر 120 ثقافة بين عشية وضحاها لكل لوح باستخدام ماصة الأقنية 6-جيدا مع تلميح للتعديل التباعد (الشكل 2، يمين). الجاف للوحات التي اكتشفت في غطاء الاندفاق الصفحي حتى قد تم استيعاب جميع السائل. لا جاف الإفراط. تخزين لوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- لإنشاء طابع جديد من سوبليبراري [رني]، تطعيم 200 ميليلتر رطل + أمبير كل جيدا في شكل جيد 96 (600 ميليلتر اللوحات) استخدام لوحة دبوس 96 وحدة النسخ متماثل بالخطوات التالية:
- تزامن C. ايليجانس استخدام العلاج تحت كلوريت
- حساب الحد الأدنى لعدد الحيوانات اللازمة للتجربة: # الحد الأدنى من L1s المطلوبة = (15-20 الحيوانات/جيد) (24 بئرا في اللوحة) (X مجموعة لوحات/النسخ المتماثلة)(Y replica sets).
ملاحظة: ويتطلب الأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" الحيوانات أكثر من الطريقة التقليدية. يمكن أن توفر اللوحة 10 سم واحدة كاملة من الديدان gravid 20,000 – 50,000 L1 الحيوانات اعتماداً على كثافة جرافيد الكبار. وبالمثل، تسفر عن عشرين سم 6 لوحات حول الحيوانات L1 ~ 30,000. خطة لإعداد إعداد بيض أن يضاعف الحد الأدنى لعدد الحيوانات اللازمة. إذا كان قد تفتقر إلى السكان في الإعداد، إعادة تغذية أو القطعة إلى لوحة جديدة والسماح على الأقل ثلاثة أجيال في الغذاء قبل أبوابها17،18. يجب التأكد من تجميد L1s بقايا مرة أخرى. - اتبع الخطوات 1، 2 ل 1.2.6 كما هو الحال في الطريقة التقليدية للحصول على مزامنة L1 الحيوانات. البذور 15 – 20 L1 الحيوانات في كل جيدا باستخدام 6-جيدا ضبط تباعد ماصة وكاشف خزان، مماثلة ل 1.2.7. دوري مزيج L1 الحل منع تسوية للحيوانات.
- حساب الحد الأدنى لعدد الحيوانات اللازمة للتجربة: # الحد الأدنى من L1s المطلوبة = (15-20 الحيوانات/جيد) (24 بئرا في اللوحة) (X مجموعة لوحات/النسخ المتماثلة)(Y replica sets).
- منع إنتاج ذرية بإضافة 5-مخفضات-2 '--ديوكسيوريديني (فودر)
- اتبع الخطوة 1.3.1. إعداد 50 العقيمة × الأسهم فودر (راجع الخطوة 1.3.1.1).
- عند وصول الحيوانات L4، إضافة 25 ميليلتر من 50 لوحة x FUDR لكل بئر من 24-فضلا عن استخدام ماصة قابل للتعديل تباعد 6-قناة.
- صلاحية النقاط
- إزالة مجموعة واحدة من لوحات نسخ متماثل والفيضانات في الآبار مع الحل M9، سجل الحيوانات مجموع كل بئر، وثم بلطف لمس الحيوانات غير المتحركة على رأسه مع اختيار دودة (الشكل 2). وسجل الحيوانات عاجزة عن التحرك كالميت. تجاهل سجل اللوحات. صلاحية السجل يوميا.
ملاحظة: الحيوانات التي تمزق، إظهار عيوب المورفولوجية الإجمالي، أخفقت في وضع، أو الزحف حتى على جانب البئر يكون للرقابة اقصائهن عن كلا من قيم الميت ومجموع.- سجل عدد الحيوانات التي تخضع للرقابة داخل كل بئر في كل نقطة الوقت بشكل منفصل من القيم الأخرى.
- لا نقاط الآبار التي لا تملك الغذاء أو الملوثة (مثل الفطريات أو الوحل)؛ وتعتبر هذه الآبار للرقابة. فرض رقابة جيدا أيضا، إذا كان كل من الحيوانات عرض العيوب الشكلية أو الإنمائية. سجل مراقبة الحدث لهذا [رني] استنساخ/جيدا في هذه المرحلة الزمنية.
- بعد سجل لوحة نسخ متماثل، وتجاهل ذلك. مواصلة التهديف تكرار جديدة تعيين كل يوم حتى مات بجميع الحيوانات عبر جميع الآبار. للحد من خطر التهديف التحيز، يجب أن تظل الأعمى للظروف التجريبية المجرب وبالمثل يجب أن لا الرجوع إلى النتائج من النقاط الزمنية السابقة أثناء التسجيل.
- إذا كانت جميع الحيوانات داخل بئر كانت قتيلا في نقطة زمنية معينة، ثم بعد ذلك اليوم التهديف، بحث ما إذا كانت سجلت جميع الحيوانات كالميت لنقطتين مرة متتالية لنظرا جيدا. إذا كان الأمر كذلك، سجل السلامة لم يعد مطلوباً لذلك جيدا في النقاط الزمنية اللاحقة.
- إجراء محاكمات تجربة مستقلة إضافية. تتبع نتائج التجارب المتعاقبة بشكل منفصل عن تلك الموجودة في التجارب السابقة، مع عدد المحاكمات ولاحظ.
- إزالة مجموعة واحدة من لوحات نسخ متماثل والفيضانات في الآبار مع الحل M9، سجل الحيوانات مجموع كل بئر، وثم بلطف لمس الحيوانات غير المتحركة على رأسه مع اختيار دودة (الشكل 2). وسجل الحيوانات عاجزة عن التحرك كالميت. تجاهل سجل اللوحات. صلاحية السجل يوميا.
3. بيانات الرسم البياني
ملاحظة: مع "مجموعة النسخ المتماثلة" هو تطبيق الأسلوب تناسب منحنى لتقريب يعني والعمر كحد أقصى. معايير لتقييم معدل الوفيات C. ايليجانس تناسب منحنى اللوغاريتمي19. كما لا تدعم معظم بقاء أدوات ملائمة منحنى اللوغاريتمية، وضع برنامج جديد لرسم المنحنيات اللوغاريتمية (لمجموعة النسخ المتماثلة)؛ ويدعم أيضا منحنيات كابلان-ماير (للطريقة التقليدية).
- البدء مع البرنامج. تحميل ملف مضغوط الإصدار للنسخة الحالية (انظر قسم المواد). استخراج ملف مضغوط إلى مجلد. راجع "الملف التمهيدي" الملف في المجلد المستخرج للحصول على إرشادات التثبيت إضافية.
- بدء تشغيل واجهة التآمر. العثور على موقع الدليل "التعليمات البرمجية" في المجلد استخراج من ملف مضغوط (مثلاً "/المستخدمين/اسم المستخدم/Desktop/وورمليفي/رمز").
- أدخل الأوامر التالية في وحدة البحث والتطوير، الاستعاضة عن مسار المجلد وحدد فقط. اضغط إدخال أو العودة بعد كل إدخال سطر: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code")، 2) source("plotGUI.R")، 3) openMain().
- إتاحة الوقت للواجهة للتحميل في نافذة جديدة، تنشئة الشاشة الافتراضية كما هو موضح في الشكل 3 ألف. واسمحوا R تشغيل في الخلفية.
- تنسيق البيانات كقيمة مفصولة بفاصلة (CSV) أو ملفات قيمة مفصولة بعلامات جدولة (TSV). لتحديد الأعمدة وأسماء، اعتماداً على نوع التحليل. انظر 4 ملف إضافي (مجموعة النسخ المتماثلة) وتكميلية الملف 5 (التقليدية/كابلان-ماير) لبيانات المثال مهيأ مسبقاً.
ملاحظة: يجب تحديد البيانات في تنسيق "طويلة"، أي صف واحد لكل سلالة/معاملة كل نقطة مرة كل محاكمة. وأوصت ملفات CSV لأفضل من التوافق بين الأنظمة الأساسية.- إزالة الصفوف المطابقة للملاحظات التي تم تخطي أو للرقابة. التحقق من عدم وجود القيم المفقودة أو غير رقمية، كما أنه قد يؤدي إلى حدوث خطأ عند استيراد البيانات.
- لتحليل نمط كابلان-ماير التقليدية، لا تجمع بيانات من مؤامرة محاكمات مستقلة لها كل على حدة. لتحليل "مجموعة النسخ المتماثلة"، تجمع البيانات من عدة محاكمات، والتحقيق ثم استخدام وظيفة "تريالفيو" (انظر 6.3.3.4).
- استخدام واجهة التآمر
- تحميل ملف بيانات ("استيراد" ضمن القائمة "ملف") باستخدام مربع الحوار. لفتح ملفات ".csv"، تغيير نوع ملف في القائمة وصولاً إلى "csv." (الافتراضي هو ".txt/.tsv")، انتقل إلى المجلد مع ملف البيانات. هنا هو الملف بيانات المثال "مجموعة النسخ المتماثلة" (4 ملف إضافي).
ملاحظة: عند استيراد ملف عند مجموعة بيانات مفتوحة بالفعل ستحل محل مجموعة البيانات الحالية. - حدد ملف لاستيراد لتشغيل معالج الاستيراد، الذي يسير من خلال تحديد أعمدة الملف المحدد (S1A الشكل لمجموعة النسخ المتماثلة). إذا كانت البيانات المدخلة يناظر تجربة مجموعة النسخ المتماثلة، اختر "اللوغاريتمية" لنوع الدراسة.
ملاحظة: يختلف استيراد سير العمل بين مجموعة النسخ المتماثلة (S1 الشكلA) والتقليدية (كابلان-ماير) (S1 الشكلب). - "رسم البيانات". حدد "إضافة بند" للبدء في رسم البيانات. (خط يتوافق مع مجموعة واحدة من الشروط. هناك ميزات للمساعدة مع التجارب حيث تم اختبار العديد من الشروط).
- ارسم مراقبة الظروف-في حالة البيانات المثال N2 (WT) مع L4440 (متجه فارغة) [رني] المناسبة. حدد "إضافة بند" ضمن القائمة "الرسوم البيانية" لبدء معالج "إضافة سطر": حدد الشرط للأرض والمعلمات رسومية تمثل الخط.
- لإضافة منحنى لشرط آخر يدوياً، كرر الخطوات في 3.3.3.1
- لتغيير لون أو ارسم الرمز لخط، حدد "تعديل سطر" تحت قائمة "الرسم البياني".
- لإزالة خط دون مسح كافة الخطوط، حدد "حذف السطر" تحت قائمة "الرسم البياني".
- لمسح كافة الأسطر في المؤامرة الحالية، حدد "خط واضح" تحت قائمة "الرسم البياني".
- لتجاوز قيمة المحور القصوى المحددة تلقائياً (الوقت)، استخدام "جدول مجموعة X" تحت قائمة "الرسم البياني".
ملاحظة: المحور الصادي (كسر الباقين على قيد الحياة) يعرض دائماً 100 ٪ (أعلى) إلى 0% (أسفل) في زيادات بمقدار 20%. دائماً يتم عرض المحور السيني في زيادات بمقدار 5. لا يتم رسمها تسميات المحور لتمكين المرونة في وضع العلامات بعد حفظ صور الأرض.
- لحفظ صور بتنسيق JPEG من الأرض المعروضة حاليا، استخدم الخيار "حفظ الأرض" في القائمة "ملف"؛ يتم حفظ هذه المؤامرة الحالية فقط.
- لخلق المؤامرات الفردية للعديد من الظروف المختلفة في تجربة واحدة، يسمح البرنامج تحديد والتآمر "سلسلة".
ملاحظة: تنفيذ مفهوم سلسلة يحسن الكفاءة عند العمل مع تجارب كبيرة.- إذا بدأت مع مساحة الأرض فارغة، أضف الأسطر المطابقة لشروط المراقبة أن يجب أن تكون متسقة عبر جميع المؤامرات في السلسلة (انظر 3.3.3.1).
- تعريف هذه السلسلة بسلسلة "تعريف" في قائمة الرسوم البيانية. حدد شرط المقابلة للخط لعرض أول مرة في هذه السلسلة؛ يمكن اختيار واحد فقط. اختر معلمات رسومية (خط لون وارسم الرمز) للسطر، كما هو الحال في 3.3.3.1.
- استعراض المؤامرات لشروط الاختبار المختلفة. تبديل عرض السطر "سلسلة" بين شروط استخدام زري السهمين لليسار/اليمين وجدت على جانبي النافذة مؤامرة الرئيسية وكذلك في أعلى القائمة بار (الشكل 3 أ-ج).
ملاحظة: إذا كان السطر السلسلة المحددة هو نفس الشرط كأحد خطوط التحكم/المرجع المضاف سابقا، قد يظهر السطر الجديد متراكبة. - تحديد سلسلة لجعل بعض الوظائف الأخرى المتاحة (حفظ سلسلة المؤامرات وتريالفيو--انظر 3.3.3.4 لهذا الأخير). بعد تحديد مجموعة، استخدم الخيار "حفظ سلسلة المؤامرات" من القائمة "ملف" لحفظ ملفات الصور بالأرض الفردية لكل قطعة في هذه السلسلة في مجلد جديد.
- تريالفيو – تصور النتائج من التجارب المستقلة لتجربة "مجموعة النسخ المتماثلة". إذا تم تشغيل عدة محاكمات لواحد أو أكثر من مجموعات العينة، ارسم المعطيات من التجارب الفردية والبيانات المجمعة من جميع المحاكمات بشكل منفصل لتقييم الاتساق بين التجارب المستقلة (انظر الشكل 3D).
- إعداد سلسلة كما هو موضح في 3.3.3.3. سيتم رسم محاكمات مختلفة لكل مجموعة من مجموعات العينة "متفاوتة" في صورة مختلفة خلال المحاكمات الخاصة بكل منها للعينات المرجعية/عنصر التحكم المحدد.
- لحفظ الصور تريالفيو، انتقل إلى "تريالفيوس الطباعة" في قائمة البيانات؛ صورة بتنسيق JPEG سيكون الناتج لكل قطعة في هذه السلسلة.
ملاحظة: نتائج المثال في الشكل 3D لحالة مع هاتين التجربتين.
- ارسم مراقبة الظروف-في حالة البيانات المثال N2 (WT) مع L4440 (متجه فارغة) [رني] المناسبة. حدد "إضافة بند" ضمن القائمة "الرسوم البيانية" لبدء معالج "إضافة سطر": حدد الشرط للأرض والمعلمات رسومية تمثل الخط.
- متوسط عمر جدول ملخص لبيانات "مجموعة النسخ المتماثلة". بصريا فحص المنحنيات لضمان تناسب معقول من البيانات، ثم حدد الجدول الموجز "" الخيار في القائمة بيانات لحفظ جدول القيم متوسط عمر (الوقت في البقاء على قيد الحياة 50% على المنحنى اللوغاريتمي) لكل نوع العينة.
- تحميل ملف بيانات ("استيراد" ضمن القائمة "ملف") باستخدام مربع الحوار. لفتح ملفات ".csv"، تغيير نوع ملف في القائمة وصولاً إلى "csv." (الافتراضي هو ".txt/.tsv")، انتقل إلى المجلد مع ملف البيانات. هنا هو الملف بيانات المثال "مجموعة النسخ المتماثلة" (4 ملف إضافي).
- التقييم الإحصائي للبيانات التي تم إنشاؤها عن طريق الأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة"
- بالنسبة للتحليل الإحصائي بين مجموعتين من تجربة "مجموعة النسخ المتماثلة"، تعديل وتشغيل البرنامج نصي R، المقدمة في ملف zip الإصدار (انظر "وورمليفي التحليل الإحصائي قالب البرنامج النصي. R ").
ملاحظة: الكفاءة في البحث والتطوير غير مطلوب لتشغيل البرنامج النصي. وثائق إضافية من التعليقات في الملف. البرنامج النصي على استعداد لتحليل البيانات "مجموعة النسخ المتماثلة" على سبيل المثال. المستخدم لتوليد البيانات بالشكل المناسب (انظر تكميلية الملف 4) يمكن أيضا أن تحلل.- فتح ملف البرنامج النصي في البحث والتطوير (R واجهة المستخدم الرسومية أو رستوديو).
ملاحظة: سيتم عرض البرنامج النصي دون تشغيله. - تعديل مواقع الملفات اللازمة لمطابقة الموقع على جهاز الكمبيوتر الخاص بك.
ملاحظة: يجب أن تكون هذه المسارات الملف "مؤهل بالكامل" (ينبغي أن تتضمن أي موقع الملف بالكامل، بما في ذلك المجلدات).- تعديل المسارات (مواقع الملفات/المجلدات) "ولدير" (موقع الدليل) "مكان آخر" (مجموعة النسخ المتماثلة لملف البيانات لتحليل)، "كومبفيلي" (مواصفات مقارنات لتشغيل، إذا كان ذلك ينطبق) و "أووتبوتباث" (الموقع حيث سيتم كتابة ملفات النتيجة إلى).
- تعيين أسماء الأعمدة في القسم "تحديد الأعمدة في ملف البيانات" إذا كانت مختلفة من المثال ملف أسماء الأعمدة الموجودة في الملف ليتم تحليلها. تحديد عمود لكل معلمة. إذا كانت دراسة سلالات متعددة، ولكن لا يوجد [رني] (أو غيره من ضروب المعاملة) تضمين عمود في ملف البيانات مع إدخالات فارغة أو نفس لكافة الصفوف (مثل "no_treatment"، و ما إلى ذلك).
- تعيين المعلمة "كومبفيلي". إذا تم تعيين المعلمة "كومبفيلي" إلى نا، ثم سيتم تشغيل جميع المقارنات العشوائية الممكنة للمجموعات.
ملاحظة: يتم تعريف مجموعة من المزيج من سلالة/النمط الوراثي والعلاج، وهي متسلسلة وعرض ك "strain_treatment". أكبر من الدراسات مع العديد من المجموعات، ويمكن توفير ملف CSV تحديد المقارنات. راجع المثال ملف "comps_rsm_example.csv". - تعيين عدد مرات التكرار لاختزال مونتي كارلو ("k.resamp"، القيمة الافتراضية هي 1000).
ملاحظة: قد يتم إرجاع القيم ف 0 عندما يتم تنفيذ تكرارات قليلة جداً؛ في مثل هذه الحالات المناسب لتقرير "ف < 0.01" (إذا كان k.resamp = 100)، أو "ف < 0.001" (إذا كان k.resamp = 1.000)، إلخ - تشغيل البرنامج النصي: زر "المصدر" في رستوديو (أعلى يمين نافذة تحرير) أو "المستند المصدر" في القائمة "تحرير" في واجهة المستخدم الرسومية R. (التنفيذ قد يستغرق بعض الوقت).
- عندما لم يعد يتم عرض مؤشر "مشغول" R، فتح الإخراج سيكون هناك دليل جدول مع نتائج كل مقارنة (متوسط البقاء على قيد الحياة، فالقيم، وتغير متوسط عمر %).
- فتح ملف البرنامج النصي في البحث والتطوير (R واجهة المستخدم الرسومية أو رستوديو).
- بالنسبة للتحليل الإحصائي بين مجموعتين من تجربة "مجموعة النسخ المتماثلة"، تعديل وتشغيل البرنامج نصي R، المقدمة في ملف zip الإصدار (انظر "وورمليفي التحليل الإحصائي قالب البرنامج النصي. R ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تطور أي منهجية جديدة، لا بد أن الأسلوب الجديد يلخص النتائج المقبولة من النهج السابقة ويفي بمعيار داخل حقل. لقد بينا سابقا تجريبيا أن "مجموعة النسخ المتماثلة" والأساليب التقليدية للمعايرة عمر C. ايليجانس تنتج نتائج مماثلة20. ويعيش البرية من نوع C. ايليجانس (N2) الإبقاء على 20 درجة مئوية عادة ما بين 20 و 25 يوما، الذي لاحظنا مع نهج "مجموعة النسخ المتماثلة" (الشكل 4 باء، الأسود) والتقليدية (الشكل 4A، خط أسود). وهكذا، كلتا الطريقتين التقريبية معقول عمر البرية من نوع. من الضروري أيضا أن أسلوب جديد قد القرار دقة قياس التغييرات بين ظروف الاختبار والقوة الإحصائية للكشف عن تغييرات كبيرة. في دراستنا السابقة، اكتشفنا أن حركة الأسرة من عوامل النسخ هي المحددات C. ايليجانس طول العمر. mml-1 و 2-مكسل ترميز homologs C. ايليجانس من الثدييات موندو/عنصر "الكربوهيدرات استجابة" ملزمة البروتين (تشريبب) وملكس، على التوالي. C. ايليجانس والثدييات، وهذه هيتيروديميريزي أعضاء حركة الأسرة لتنظيم النسخ. ووجدنا أن فقدان mml-1 أو 2 مكسل يقلل بشكل ملحوظ العمر العادي، مقيسة أما مقايسة عمر تقليدية أو بواسطة "مجموعة النسخ المتماثلة" (الشكل 4A-بوأصفر وأحمر داكن). وعلى النقيض من مجمع MML-1::MXL-2، وجدنا أن فقدان mdl-1 (مثلى بجنون الثدييات) أو مكسل-1 (كحد أقصى) زيادة كبيرة في عمر C. ايليجانس التي تقاس أما المنهجية (الشكل 4 الأرجواني والأزرق، على التوالي، في كلا الفريقين).
قيداً خطيرا على النهج التقليدي لقياس طول العمر هو الإنتاجية. كلا أساليب تعتمد على الحركة الكلمة إذا كان حيوان على قيد الحياة أو ميتة، التي تزداد صعوبة تقييم. صغار الحيوانات سوف تتحرك في جميع أنحاء صفيحة في غياب المحفزات وهكذا سهلة لنقاط. الشيخوخة C. ايليجانس أصبح بصورة متزايدة سيستجيب للمسة خفيفة في الرأس المستقرة ولكن بعكس اتجاه حركة على لوحة. بيد الحيوانات أصبح كبار السن القدرة على الانتقال إلى الخلف يقلل ويصبح على نحو متزايد غير منسقة. في نهاية المطاف الحيوانات أصبحت مشلولة، النمط الظاهري بقوة تشبه ساركوبينيا، وعندما سجل عبر جدوى الطريقة التقليدية لا يمكن تحديده إلا عن طريق مراقبة نشل خفية على الحافة الأمامية المتطرفة للحيوان. على النقيض من ذلك، عندما سجل السلامة عن طريق الأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة"، وتتم إضافة السائل إلى البئر، الذي يعمل بمثابة حافز الذي يولد استجابة thrashing التي يمكن قياسها كمياً كقراءات هيالثسبان8. حركة في السائل أسهل لمراقبة لكبار السن حتى الحيوانات: الحيوانات متهالكة زمنياً العمر مطابقة إنتاج حركات الرأس خفية على ألواح جافة ولكن أكثر وضوحاً (وأن كان بطيئا) ثني الجسم في السائل. أخيرا، عندما سجل "مجموعة النسخ المتماثلة"، البئر كله ضمن مجال الرؤية (~1.1 سم) وجميع الحيوانات في تعليق-المراقبة مما يسمح لجميع الحيوانات في وقت واحد. على النقيض من ذلك، عندما سجل لوحة 6 سم عن طريق الأسلوب التقليدي، واحد يجب أن تفحص عبر الكامل لوحة--البحث عن طريق العشب الجرثومي وعلى طول الحواف للحيوانات. النتيجة الصافية لهذه الفروق هو أن سرعة النقل عند استخدام الأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" على الأقل أمر من حجم أكبر من النهج التقليدي، مما يجعل من الممكن لقياس التغيرات في عمر في نفس الوقت عبر أكثر من 100 الشروط في تجربة واحدة مع محقق واحد. على سبيل المثال، من شاشة [رني] على أساس التغذية على نطاق جينوم حددنا سابقا 159 الجينات التي كانت ضرورية لزيادة عمر تمنحها انخفض داف-2/مثل الأنسولين مما يشير إلى8. وفي هذا التحليل، نحن كمياً التغييرات في عمر في البرية من نوع ومتحولة معمرة daf-2(e1370) ، و لم تدم طويلاً daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) مزدوجة متحولة الحيوانات (الشكل 5A)، التي سمحت لنا بفك الوراثية العلاقات بين إشارات مثل الأنسولين وما يزيد على 100 جين بروجيريك إيناكتيفيشنز. علاوة على ذلك، قمنا بتقييم كيف غيرت هذه الجينات بروجيريك إيناكتيفيشنز هيلثسبان (في الوقت يسمى "أكتيفيسبان") بملاحظة الانخفاض في C. ايليجانس الضربة عبر replicates على مر الزمن (الشكل 5 (ب)).
رقم 1: ظهور تغذية على أساس [رني] يؤدي إلى عصر اكتشاف الجينات في بحوث الشيخوخة، ومع ذلك تظل جرجنس معظم درس سيئة- (أ) اكتشفت جرجنس كثيرة في البداية من شاشات الجينوم وظيفية واسعة النطاق. جرجنس C. ايليجانس أكثر من 900 اكتشفت حتى الآن، حددت العديد من استخدام [رني] على أساس التغذية، تسليط الضوء على قيمة النهج الجينوم الوظيفي في اكتشاف الجينات. يظهر الرسم البياني عدد جرجنس اكتشفت كل مخطوطة باستخدام [رني]، يقوم على النمط الظاهري الشرح (انظر الجدول للمواد) للنمط الظاهري علم الوجود وبشروط تمديد فترة الحياة، تقصير مدى الحياة، والحياة تمتد البديل. انظر تكميلية الملف 1 لقائمة كاملة من الدراسات التي اكتشفت جرجنس. (ب) تظل جرجنس معظم درس سيئة. وفي المقابل جرجنس إلى مدروسة مثل daf-16/FOXO (السهم)، الذي لديه أكثر من 800 مراجع، أغلبية جرجنس لها مراجع أقل من 10 (العام مرجع-عدم تركز بالضرورة على عمر). الأساليب الموثوقة الفائق سيكون أساسيا لاشتقاق أعمق العلاقات بين الوكالات الجينية بين جيروجينيس. الرسم البياني يستند على التعيينات بين المنشورات في مجلات وجرجنس C.elegans اكتشفت من تعمل [رني]. انظر تكميلية ملف 2 لقائمة كاملة من جيروجينيس وعدد من الدراسات المرتبطة بكل منها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: التقليدية وأسلوب تعيين النسخة المتماثلة للتهديف C.elegans عمر (A). "الطريقة التقليدية" للتهديف عمر C. ايليجانس . وتتبع عدة السكان المتزامنة الصغيرة من الحيوانات اسوي كل شرط على مر الزمن. ويتبع نفس السكان الحيوانات طوال فترة الدراسة. ويتم تقييم الجدوى بالحركة، التي يمكن أن تحفزها بالحث لطيف. الحيوانات التي تعجز عن التحرك وسجل كالميت وهي إزالة (تطلع سيظهر) حتى تبقى لا الحيوانات قابلة للحياة. (ب). "النسخة المتماثلة تعيين أسلوب" للتهديف عمر C. ايليجانس . وتوزع عدد كبير من الحيوانات اسوي مزامنة العمر عبر عدد من اللوحات تكرار متطابقة. في كل نقطة من الزمن، وهو سجل تكرار واحد: إضافة حل مخزنة خفيفة (M9)، مما يحفز حركة. الحيوانات التي لا تتحرك تلقائياً بعد أن يتم تقييم الآبار الفيضانات أيضا عن طريق اللمس التحفيز. يتم تحديد مدة التسجيل للتجربة قبل البدء. كل الحيوانات وهو سجل مرة واحدة فقط، وطول العمر للسكان أكبر مشتق من العديد من الملاحظات مستقلة. (ج). نهج "مجموعة النسخ المتماثلة" طريقة إنتاجية عالية لقياس كمي عمر C. ايليجانس . يمكن تعقب استنساخ [رني] 100 أو أكثر استقلالاً في وقت واحد. ويرد HT115 كولاي معربا عن دسرنا لاستنساخ [رني] معين. عمليا، تنقسم كل العينات 24 من لوحة 96-جيدا في لوحة 24-بئر واحدة. كل لوحة 24-جيدا الناتجة سلبي (أي متجه فارغة، الأحمر جيدا) ومراقبة إيجابية (الأخضر جيدا) موزعة بشكل عشوائي ضمن مجموعة من الحيوانات المستنسخة [رني] (الآبار الأصفر). عادة، تحتوي البئر الأولى (A1) في مجموعة على موجه فارغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: واجهة المستخدم الرسومية (GUI). (أ)- مؤامرة الرئيسية نافذة واجهة عرض شاشة الترحيب الافتراضية. وهذا ما يتم عرضه عند فتح البرنامج. ينبغي أن تكون الاختلافات في المظهر بين الأنظمة الأساسية الحد الأدنى نظراً لاستخدام مجموعة أدوات عمل إطارات منصة مستقلة. (ب)- نظرة عامة على خيارات القائمة، للقوائم المنسدلة المتاحة من إطار مؤامرة الرئيسية. (ج)- إخراج الأرض مثال "مجموعة النسخ المتماثلة" كل نمط (يسار) والبيانات (يمين) نمط كابلان-ماير التقليدية. وجمعت البيانات المعروضة في تجارب مستقلة. قطع المصدرة لا تتضمن تسميات المحاور المرسومة مسبقاً، لأقصى قدر من المرونة في إضافة مثل هذه التسميات. ولتسهيل ذلك، تنقسم المحاور دائماً إلى زيادات بنسبة 20% للمحور الصادي، وزيادات بمقدار 5 المحور س. في هذا المثال، أضيفت تسميات المحور وخط (سلالة/العلاج) إلى قطع المحفوظة، استخدام صورة بسيطة جداً ومشتركة أداة تحرير. (د)- مثال على الإخراج من وظيفة "تريالفيو"، مما يسمح للمقارنة البصرية بين نتائج التجارب المستقلة "مجموعة النسخ المتماثلة" على نمط مجموعات البيانات. هذه المؤامرة تظهر النتيجة بين محاكمتين مختلفة والنتائج المجمعة المناظرة ل داف-2 EV(RNAi) (الدوائر المغلقة، والأزرق)، N2 EV ([رني]) (دوائر سوداء، مغلقة)، و داف-2 مع داف-16 ([رني]) (الماس الأحمر، مفتوحة). تريالفيو يسمح بالتحقق بسرعة للمسائل المتعلقة بالبيانات الخاصة بالمحاكمة التي قد تؤثر على نوعية تناسب مجموعة البيانات المجمعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الأساليب التقليدية ومجموعة النسخ المتماثلة إلى نتائج مماثلة- أما عنصر هيتيروديمير MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) الخسارة يزيد عمر. وفي المقابل، أما عنصر MML 1-الخسارة (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) إنقاص عمر هو طبع هذا الرقم من مرجع20 مع الإذن عن طريق ترخيص "الإسناد المشاعات الإبداعية" (نسخة بواسطة) (انظر المواد). (أ)- نتائج كابلان-ماير بالطريقة التقليدية. (ب). المنحنى اللوغاريتمي تناسب استخدام أسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: مجموعة النسخ المتماثلة يمكن فك أسلوب التفاعلات الجينية استناداً إلى التغييرات في عمر (A) والتعديلات في هيلثسبان (ب) لما يزيد على 100 استنساخ [رني] في وقت واحد. وهذا الرقم هو طبع من8 مع إذن تحت الإبداعي لجنة الإسناد غير تجارية 4.0 الدولية الترخيص (نسخة من NC) (انظر المواد). (أ) تحليل عمر الوراثية الجينات بروجيريك إيناكتيفيشنز في سياق انخفاض الأنسولين مثل الإشارات (ILS) (daf-2، المحور س)، وفي غياب/FoxO داف-16(المحور الصادي)، المستجيب النسخي مركزية من ILS21 . إيناكتيفيشنز الجينات مع وظائف مماثلة ك daf-16 ليس كذلك تقصير عمر في غياب daf-16 (النقاط السوداء). إيناكتيفيشنز الجينات مع وظائف مستقلة تماما عن داف-16 تقصير كل الخلفيات الوراثية وبالمثل (رمادي). إيناكتيفيشنز الجينات حيث التأثير السلبي على عمر داف- 2 > داف-2؛ وداف-16، وتقترح وظيفة بالتوازي (أبيض). (ب) التغييرات في معدلات سحق مع مرور الوقت يمكن أن تجنيها هيلثسبان متوسط للعديد من الاضطرابات الوراثية (س) أثناء تقييم التغييرات في عمر المحور (ص). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل S1: مهام سير العمل في وورمليفي- شكل توضيحي لخطوات بعض تسترشد مهام سير العمل (التي تسمى أحياناً "المعالجات"). في كل حالة من هذه الحالات، بعد آخر خطوة في سير العمل، يتم إرجاع التركيز إلى إطار مؤامرة الرئيسية. (أ) استيراد البيانات سير العمل "مجموعة النسخ المتماثلة" نمط datasets (ب) البيانات استيراد سير العمل "كابلان ماير" التقليدية على غرار مجموعات البيانات. (ج) سير العمل لإضافة بنود إلى مؤامرة "مجموعة النسخ المتماثلة" على نمط مجموعات البيانات. (د) سير العمل لإضافة بنود إلى مؤامرة "كابلان ماير" التقليدية على غرار مجموعات البيانات. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية ملف 1: الدراسات التي حددت جرجنس. ظهور [رني] على أساس التغذية أدى إلى عصر اكتشاف الجينات لتعمل أن لم تكن تتسم بالوراثة إلى الأمام، بما في ذلك الشيخوخة. المذكورة، حسب ترتيب عدد جرجنس اكتشافها، هي الدراسات المستقلة التي حددت الجينات التي غيرت نشاطها عمر. لاحظ أن الدراسة التي حددت أكثر من جرجنس تستخدم أسلوب تعيين تكرار8. طبيعة كيف تتم الإشارة أيضا إلى عمر إيناكتيفيشنز تغيير الجينات: طول العمر والجينات بروجيريك هي تلك التي تزيد أو تنقص عمر عند إلغاء تنشيطه، على التوالي. "البديل مدى الحياة" تشير إلى حالات حيث اتجاهية للتغيير (أي زيادة أو انخفاض عمر) لم يتم تحديد أو ليس قد تم تنسيق. نتائج البيانات من وورمباسي WS262 (كانون الثاني/يناير عام 2018) (انظر المواد)، بالإضافة إلى عمر [رني]-العلاج من مرجع10، التي لم تدرج بعد في جمع المنسق تعمل وورمباسي [رني]. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية ملف 2: عدد الدراسات المرتبطة بكل جيرجين. يتم دراسة جرجنس معظم سيئة. في حين كانت بعض الجينات، مثل/FoxO داف-16، موضوع الكثير من الاهتمام للبحث، قد جرجنس أكثر من 400 المنشورات المرتبطة بها أقل من 10. نتائج البيانات من وورمباسي WS262 (كانون الثاني/يناير 2018)، بالإضافة إلى عمر [رني]-العلاج من10 والتي لم تدرج بعد في جمع المنسق تعمل وورمباسي [رني]. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الملف 3: إعداد الكواشف الشائعة ل C. ايليجانس التجارب. (أ)- وصفه لمعيار لوحات NGM و [رني]. (ب)- وصفه لحل المخزن المؤقت وتحت كلوريت M9. (ج)- "إعداد رطل" + لوحات أمبير/تيت. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية ملف 4: "مجموعة النسخ المتماثلة" بيانات المثال. Dataset مثال من تجربة عمر "مجموعة النسخ المتماثلة". هذا dataset مهيأ بالفعل أن تكون مناسبة للاستيراد والتحليل. ويشمل تجربتان كل شرط (خليط من سلالة/النمط الوراثي و [رني]). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الملف 5: بيانات المثال الطولية التقليدية- تنسيق dataset مثال من تجربة عمر طولية تقليدية، مع حق الرقابة، لاستعداد الاستيراد/التحليل باستخدام وظيفة الأرض بقاء كابلان-ماير. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أساليب تعيين التقليدية والنسخة المتماثلة تتطلب مزامنة الحيوانات زمنياً عاماً. نحن تتضمن أسلوب يقوم بمزامنة استخدام العلاج تحت كلوريت جرابيد من الكبار، حيث البقاء فقط من البيض المخصب مع الكبار جرابيد معاملة الحيوانات. هذه الأجنة هاتش في التعليق السائل واعتقال تنمويا في مرحلة اليرقات الأولى (L1). بعد البذر L1 الحيوانات على الغذاء (مثل كولاي تعرب عن دسرنا لجينات للفائدة)، استئناف الحيوانات التنمية. مزامنة الحيوانات L1 بالعلاج تحت كلوريت البالغين جرابيد له ميزة أن بقايا الحيوانات L1 المصنف يمكن تجميدها وتخزينها إلى أجل غير مسمى في النتروجين السائل أو ثلاجة-80 درجة مئوية. وبهذه الطريقة، يتم الاحتفاظ بعينه من كل سلالة في وقت الإعداد التجريبية، إنشاء موردا قيماً للدراسات المستقبلية، وتحسين إمكانية تكرار نتائج. ومع ذلك، بينما تحت كلوريت معاملة الحيوانات الكبار جرابيد وسيلة شائعة للحصول على الحيوانات متزامنة ل بحوث الشيخوخة22، القبض على L1 استجابة مجاعة. وهكذا، تفضل بعض المختبرات أما للسماح الفقس تحدث على لوحات، أو التخلي عن العلاج تحت كلوريت تماما وتسمح للبالغين جرابيد قليلة لوضع البيض لعدة ساعات (أي البيض إرساء). وفي الحالة الأخيرة، يتم إزالة الآباء ويتبع عمر ذرية. أفضل معرفتنا، لم يبلغ أي فروق واضحة في عمر بين الحيوانات التي تم مزامنتها في M9، دبرت على لوحات، أو ذرية من وضع بيض. ومع ذلك، نظراً لأن التغييرات في توافر المغذيات ترتبط ارتباطاً وثيقا بالتغيرات في عمر، هناك أسبقية أن الخلفيات الوراثية المحددة يمكن أن تنتج نتائج مختلفة بين هذين النهجين المزامنة. مطلوب إجراء تحليل أكثر دقة لحل هذا الشاغل النظري.
بغض النظر عن الأسلوب المستخدم لمزامنة السكان البدء، يجب اتخاذ خطوات لمنع إنتاج ذرية أما أو لفصل السكان انطلاق متزامنة من ذرية مستقبلا. في البروتوكول، ولدينا نحن الخطوط العريضة لكيفية استخدام فودر لمنع إنتاج ذرية، كفصل الحيوانات ليس خياراً قابلاً للتطبيق لمجموعة النسخ المتماثلة الأسلوب. من الممكن أيضا لمنع إنتاج ذرية وراثيا عن طريق استخدام خلفية وراثية تأنيث (مثل fer-15(b26);fem-1(hc17)، وهو سلالة عقيمة تعتمد على درجة حرارة23). ومع ذلك، لا يخلو من أوجه القصور: استخدام الخلفيات الوراثية يمكن أن يؤدي إلى تعقيد التحليل اللاحق، وفي بعض الخلفيات الوراثية فودر يمكن تغيير طول العمر24،،من2526.
كبديل لمنع النسل يعني الإنتاج من خلال المواد الكيميائية أو الوراثية، يمكن نقل الحيوانات الكبار دورياً إلى جديدة [رني] لوحات عزلها من ذريتهم. يبسط هذا الأمر اعتبارات الخلفية على حساب الإنتاجية. وقد نقل الحيوانات بشكل دوري للمواد الغذائية الطازجة مزايا إضافية للحيلولة دون المجاعة المحتملة وتجديد التعرض إلى دسرنا. ومع ذلك، بعض التفاعلات الجينية التي تؤثر على عمر تم اكتشاف فقط عندما كانت تحول دون إنتاج ذرية: اختتمت التحليل المبكر لمسار TGFβ للنمط الظاهري عمر خطأ أن TGFβ انخفض مما يشير إلى تأثر ايليجانس جيم تشكيل داوير لكن لا الشيخوخة27،28. ومع ذلك، كشفت متابعة الدراسة التي تستخدم فودر التي انخفضت TGFβ مما يشير إلى زيادة العمر المتوقع عن طريق الأنسولين مما يشير إلى29. لماذا فشلت الدراسات السابقة لمعرفة عمر زيادة في الحيوانات المسخ TGFβ؟ الطفرات مسار TGFβ إنتاج بيض طفيف زرع عيب (أجل) وتمديد طول العمر الإنجابية، الذي يسبب الفقس الداخلية من ذرية في وقت لاحق في الحياة أن يقتل أحد الوالدين. ومن المرجح أن الحيوانات المسخ TGFβ المعمرة على ما يبدو أن يكون عمر طبيعي بسبب النمط الظاهري أجل قتل الحيوانات حول الوقت عندما يموت عادة الحيوانات البرية من نوع. هذا قد تكون ذات صلة أخرى مسارات الوراثية مرتبطة بالدكتور، كما الحيوانات البرية من نوع المتعطشة واضح أيضا أجل النمط الظاهري، ربما كميزة بقاء تكيفية لذرية تحت ظروف من الأغذية منخفضة. وهذا يسلط الضوء على تعقيد الكامنة في الاستجابات التكيفية الخضوع الحيوانات تحت ظروف الإجهاد، والحاجة إلى تحليل دقيق والنظر فيها عند تصميم تجارب عمر.
من المهم في تصميم وإجراء تجارب عمر بأي من الطريقتين لتجنب التحيز. يجب أن يكون إجراء التجارب بطريقة مزدوجة التعمية: كيف كانت سابقا سجل العينات في النقاط الزمنية السابقة وهوية شرط الاختبار يجب أن يكون غير معروف المجرب. وعلاوة على ذلك، من الضروري دائماً أن تتضمن عناصر إيجابية وسلبية على السواء؛ في حالة الأسلوب مجموعة النسخ المتماثلة، هذه تندس عشوائياً في لوحة 24-جيدا. كولاي معربا عن بلازميد يحتوي على إدراج تسلسل المقابلة إلى C. ايليجانس الجينوم هو عنصر التحكم السلبي متجه فارغة (أي "L4440"-انظر المواد). ضوابط تعتمد على الطبيعة الخاصة لتجربة إيجابية. على سبيل المثال، داف-2 ترميز مستقبلات الأنسولين/منتدى إدارة الإنترنت-1 C. ايليجانس ، والمنظمة داف-2 عن طريق [رني] على أساس التغذية يزيد من قوة عمر على الأقل شقين في الحيوانات البرية من نوع27. وهكذا قد تكون daf-2(RNAi) عنصر تحكم إيجابية عندما تبحث عن إيناكتيفيشنز الجينات التي تزيد من عمر. على العكس من ذلك، ترميز daf-16 أورثولوجوي عامل النسخ فوكسو30. DAF-16 عنصرا أساسيا في العديد من نماذج طول العمر والحيوانات البرية من نوع (N2) تعامل مع daf-16(RNAi) هي اختصار عاش وتظهر علامات بروجيريا31.
المزايا الأساسية لنهج عمر الطولية التقليدية هي أن ثبت جيدا، وتجارب سهلة لإقامة. هناك حاجة إلى عدد قليل نسبيا من الحيوانات على لوحات قليلة فقط لكل حالة اختبار. وهكذا، يمكن بسهولة اختبار السلالات التي تنمو بشكل سيئ أو تتطلب الموازنون للنشر. النهج التقليدي هو القدرة على التكيف، ويمكن استخدامها مع أي واحدة من الأساليب المتاحة للتعامل مع إنتاج ذرية، بما في ذلك المعاملة مع فودر، يعبرون إلى خلفية وراثية تأنيث، أو دورياً نقل الحيوانات الكبار للوحات الجديدة وخلال فترة وضع البيض. بينما نقل الحيوانات إلى حد كبير يقلل من إنتاجية، العامل مع خلفية متحولة ابدأ مثالي، وعلى الرغم من أن فودر لا يغير من الحياة البرية من نوع32،،من3334، ويمكن أن تؤثر على عمر والعمر تعمل ذات الصلة في بعض الخلفيات الوراثية35،،من2526. علما بأن وجود الذكور، حتى مع استخدام فودر، إلى حد كبير سوف يقصر عمر خنثي13، وهكذا طبق يحتوي على الذكور بعد التوصل المنحرفين L4 غير قابل للاستخدام. وبالمثل، التحليل عن طريق مقدر كابلان-ماير والمنحنيات المرتبطة بها، والاختبار، ورتبة سجل راسخ لبيانات الوفيات. ومع ذلك، هناك عدة عيوب في تحليل عمر التقليدية. تكرار التعامل مع لوحات (أي تعريض اللوحات للهواء) يسهل الأخذ بتلوث الهواء الفطرية. بالإضافة إلى ذلك، كررت دس يمكن إتلاف أو قتل الحيوانات، وبخاصة السكان التقدم في السن وتصبح هشة. كبار السن الحيوانات أصبحت مشلولة إلى حد بعيد وغارقة في كولاي، بينما يصبح كولاي مسببات الأمراض انتهازية (استعمار التجويف والتعبئة البلعوم)36. يمكن فقط تحديد الحيوانات الحية القديمة جداً بحركات الرأس خفية. وهكذا، فمن السهل تصنيف الحيوانات حية المتداعية كالميت. وأخيراً، النهج التقليدي يحد من الإنتاجية.
أسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" إنتاجية عالية والكمية. ومن سيئات هذا الأسلوب غير استثماراً أكبر من الوقت والموارد في الأولى إعداد. تجربة كبيرة معتدلة لفحص 100 [رني] استنساخ النقاط الزمنية ما يزيد على 20 يتطلب 30,000 الحيوانات L1 (حيث يتم فحص الحيوانات حوالي 15 كل استنساخ [رني] كل الوقت نقطة)، الذي حين سهلة لمعظم السلالات، يمكن أن يكون مشكلة في بعض الحالات. على سبيل المثال، دون سلالات أرز الجسيمات الكبيرة ("فارز دودة") يجب الاحتفاظ بها مع الموازنون أو خطوط المحورة وراثيا تحمل مجموعة كروموسومية خارج منقولة سيئة لا يمكن بسهولة دراسة بهذا الأسلوب. عيب ثاني أن يجب أن تعوق إنتاج ذرية، الأمر الذي يتطلب استخدام فودر أو خلفية وراثية تأنيث. أخيرا، واحد يجب أن تعرف طول الفترة الزمنية التي سيتم تشغيل المقايسة، كأحد يجب أن تعد نسخة متماثلة تعيين لكل نقطة الوقت في البداية التجربة. ومع ذلك، تتعدد مزايا هذا الأسلوب. قبل كل شيء، سجل السلامة أسرع بكثير وواحد يمكن بسهولة تتبع الحيوانات على مدى 100 ظروف الاختبار في وقت واحد (أي استنساخ [رني]). نظراً لمجموعة النسخ متماثلة فقط سجل مرة واحدة ثم التخلص منها، لا يوجد أي معالجة متكررة من لوحات أو دس للحيوانات، الأمر الذي يقلل من احتمال التلوث بالفطريات ويقضي على الوفيات الناجمة عن الحث الخام أحياناً مع دودة بيك. وعلاوة على ذلك، يسهل إضافة السائل إلى البئر إلى حد كبير التهديف. تحرير الحيوانات القديمة من اللوحة والمحيطة بالبكتيريا ويساعد في السماح لحركات الرأس خفية تكون أكثر سهولة وسجل. بالإضافة للسائل كما يوفر الفرصة لقياس معدلات سحق كمقياس للياقة البدنية (مثل هيلثسبان،من837).
الشيخوخة ظاهرة معقدة تتضمن الآليات السببية المتعددة التي تتطلب استخدام نهج النظم البيولوجية لكشف. هذه النهج غالباً ما تتضمن النمذجة تعتمد على البيانات، واستخدام كميات كبيرة من بيانات الجينوم/ترانسكريبتوميك، وتتطلب أساليب قوية وعالية الإنتاجية التكميلية لقياس عمر وهيلثسبان. سيسمح الأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" الفائق مقارنة للكثير من [رني] استنساخ طوليا، مع التقليل من الآثار دفعة والأخطاء الفنية، مما يسهل تطوير النماذج الديناميكية التي يمكن الاستدلال التفاعلات بين مسارات سببية في طريقة كمية. بالإضافة إلى ذلك، دمج عدة نهج على نطاق الجينوم علم الجينوم مع أسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" عمليا نظراً لعدد كبير من الحيوانات مزامنة العمر ينقسم إلى عدد صغير من السكان.
أساليب أخرى قد وضعت سابقا لتحسين إنتاجية تجارب عمر C. ايليجانس ، غالباً ما تركز على تكييف النهج الطولي التقليدي (أي اتباع نفس المجموعة من الحيوانات على مر الزمن) إلى الآلي مراقبة وتسجيل استخدام الماسحات الضوئية المسطحة الشائعة38،39، أو معدات أكثر تخصصا مثل لوحات موائع جزيئية40. أن النهج القائم على الماسح الضوئي استخدام الضوء كحافز ومقارنة الصور الملتقطة تسلسلياً لتحديد الحالة على قيد الحياة/قتيلا استناداً إلى الحركة من أجل لوحات متعددة في وقت واحد؛ بينما لا تتطلب مثل هذه النهج الأجهزة العلمية الملكية، قد يكون الوقت تشارك في إعداد مهام سير العمل كبيرا تبعاً للحجم المطلوب. بدلاً من ذلك، تسمح تجارب عمر في أجهزة موائع جزيئية مخصص لتوصيف المظهرية متعمقة للحيوانات وحيدة على مر الزمن، ودون علاج منع النسل، ولكن يتطلب تصنيع لوحات موائع جزيئية واقتناء مضخات موائع جزيئية المرتبطة بها ومعدات التصوير. في المقابل، يسمح أسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة"، بالاقتران مع برامج مفصلة هنا، الإنتاجية تحسنا كبيرا باستخدام الأدوات الموجودة بالفعل مشترك في المختبرات التي تعمل مع C. ايليجانس.
البرنامج وورمليفي سيتحسن في المستقبل توفير سهولة الوصول إلى مقارنة إحصائية، والتوافق مع منصات إضافية. يمكن الاطلاع على الوثائق الأكثر حداثة للبرنامج في صفحة GitHub، بما في ذلك إرشادات التثبيت للمنصات التي تم اختبار البرنامج. كما ستوضع نسخة على شبكة الإنترنت لتمكين سهولة الوصول دون الحاجة إلى تثبيت أي برنامج.
وباختصار، المزيج من الأسلوب "مجموعة النسخ المتماثلة" والبرمجيات المتاحة بحرية مفصلة هنا يوفر منصة قوية لتحسين الإنتاجية ومتانة تجارب عمر وطائفة واسعة من الاختبارات المستندة إلى البقاء على قيد الحياة (مثل التأكيد على التسامح، ودراسات علم السموم، هيلثسبان، إلخ.) خاصة عندما تقترن بالجينوم الوظيفي، هذا النهج روافع العديد من الفوائد من النظام النموذجي الاستراحة C. ايليجانس لفك رموز العديد التفاعلات الجينية التي تسهم في تطور الشيخوخة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
التمويل اللازم لهذا العمل الموصوف في هذه المخطوطة وقدم: مكتب جامعة روتشستر "قائد الشرطة العسكرية" وكلية الطب وطب الأسنان عميد مكتب عبر مركز العلوم الصحية للابتكار الحسابية (هسكسي)؛ أليسون الطبية مؤسسة جديدة العلماء في "زمالة الشيخوخة" (AG-NS-0681-10) الممولين بأي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
