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Genetics

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Summary

Qui descriviamo il metodo del Set di repliche, un approccio misurare quantitativamente elegans del c. durata della vita/sopravvivenza e healthspan in un modo ad alta velocità e robusto, permettendo così lo screening di molte condizioni senza sacrificare la qualità dei dati. Questo protocollo dettagli la strategia e fornisce uno strumento software per l'analisi dei dati del Set di repliche.

Abstract

Il metodo del Set di repliche è un approccio per misurare quantitativamente la durata della vita o la sopravvivenza di Caenorhabditis elegans nematodi in un modo ad alta velocità, permettendo così un singolo investigatore per ulteriori trattamenti o condizioni schermo sopra la stessa quantità di tempo senza perdita di qualità dei dati. Il metodo richiede attrezzature comuni che si trovano nella maggior parte dei laboratori che lavorano con c. elegans , è così semplice da adottare. L'approccio incentrato su analizzando campioni indipendenti di una popolazione in ogni punto di osservazione, piuttosto che un singolo campione nel corso del tempo come con i metodi tradizionali longitudinali. Segnando comporta l'aggiunta di liquido nei pozzetti di una piastra multi-pozzetto, che stimola la c. elegans per spostare e facilita quantificare cambiamenti in healthspan. Altri vantaggi principali del metodo del Set di repliche includono ridotta esposizione delle superfici di agar da contaminanti trasportati dall'aria (ad es. muffe o funghi), minima manipolazione degli animali e robustezza al sporadici mis-gol (come chiamare un animale morto, quando è ancora vivo). Per adeguatamente analizzare e visualizzare i dati da un esperimento di stile del Set di repliche, uno strumento software personalizzato è stato anche sviluppato. Capacità attuale del software includono tracciare delle curve di sopravvivenza per sia del Set di repliche e tradizionale (Kaplan-Meier) esperimenti, nonché analisi statistiche per Set di repliche. I protocolli forniti qui descrivono il tradizionale approccio sperimentale e il metodo del Set di repliche, come pure una panoramica dell'analisi di dati corrispondente.

Introduction

Uno del maggior parte di trasformazione avanzamenti tecnologici verso la comprensione delle basi genetiche di invecchiamento è stato lo sviluppo di alimentazione-basata di RNAi nei elegans del c.1; prima l'uso sperimentale di RNAi, molti fenotipi di invecchiamento non erano geneticamente trattabili. Alimentazione-basata RNAi è raggiunto attraverso la produzione di dsRNA all'interno di e. coli che corrisponde a un endogeno mRNA di c. elegans : IPTG induce la trascrizione di bidirezionale attraverso un inserto di cDNA di c. elegans sia o una porzione di un telaio di lettura aperto all'interno di un plasmide2. Quando c. elegans nutrirsi intatto dsRNA di e. coli, prodotta dai batteri è trasportato dal lume intestinale cellule tramite la proteina transmembrana di SID-23e poi distribuito attraverso il resto dell'animale tramite SID-14. All'interno di ogni cella, dsRNA esogeno viene elaborato dalla cubettatrice complessa in siRNA, che interagiscono con un mRNA maturo tramite appaiamento complementare per creare un nuovo duplex siRNA-mRNA. Questo duplex è riconosciuto dal complesso RISC e spaccato, quindi degradare l' mRNA endogena5. Così, semplicemente cambiando l'inserto di plasmide, uno può inattivare la funzione di quasi qualsiasi gene all'interno del genoma di c. elegans . Questa scoperta ha portata alla creazione di più grande alimentazione-basata RNAi trasformato librerie-collezioni di stock di e. coli che possono essere combinati per ottenere una copertura di circa l'86% del noto di c. elegans geni6, 7.

Dall'avanzamento della RNAi basate su alimentazione, schermi completi in c. elegans hanno portato alla scoperta di più di 900 geni che alterano la durata quando inattivato (come testimoniano le associazioni di RNAi-fenotipo curate in WormBase), cui ci riferiamo a come gerogenes. Un ruolo per la maggior parte dei gerogenes nel controllo di longevità è stata scoperta attraverso alimentazione-basata di RNAi nei pochi rapporti seminale (Vedi Figura 1A e 1 File supplementare per i dettagli). In alcuni casi, questi gerogenes sono stati identificati basato su misura la redditività in un singolo o pochi punti di tempo, che non riesce a fornire una misura quantificabile del cambiamento nella durata della vita con trattamento RNAi. In altri casi, questi geni sono stati valutati quantitativamente per cambiamenti nella durata della vita, come pure altri fenotipi età-collegato. Per esempio, precedentemente abbiamo identificato 159 geni che erano necessarie per normale e una maggiore durata della vita degli animali con la segnalazione dell'insulina/IGF-1 in diminuzione e quantificate le modifiche in healthspan. Di questi, 103 inattivazioni gene comportano un fenotipo progeric, di perdita è provocato da uno o più segni di invecchiamento precoce8.

Mentre alcuni gerogenes sono stati associati con 100 o più studi (ad es. daf-16, daf-2, sir-2.1), oltre 400 gerogenes hanno citazioni 10 o meno (Figura 1Be supplementare File 2). Così, mentre completa basata su alimentazione RNAi schermi hanno scoperto e superficialmente caratterizzato centinaia di presunti gerogenes, come questi geni in funzione nel controllo di longevità e le correlazioni genetiche tra questi prodotti genici rimangono scarsamente ha studiato. Analisi completa longitudinale per età-collegata di fenotipi è un prerequisito per l'identificazione di interazioni genetiche tra gerogenes (ad es. interazioni epistatiche, interazioni asintetiche, ecc.). Guadagnando più approfondite le correlazioni genetiche tra gerogenes richiede un metodo quantitativo di alto-rendimento, che sfrutta anche i vantaggi dell'alimentazione basato su RNAi.

La più comune misura di surrogato di invecchiamento è durata della vita. L'approccio tradizionale per misurare la mortalità di c. elegans traccia le morti degli animali individuali nel tempo all'interno di un campione di popolazione piccola. Un numero relativamente piccolo di animali è seguito nel tempo e periodicamente è spronato delicatamente con un filo di platino o ciglia, con movimento come un indicatore della redditività (Figura 2A). Questo metodo è stato ampiamente utilizzato, in quanto fornisce misurazioni semplici, diretti della media e la massima durata. Tuttavia, questo metodo tradizionale è che richiede tempo e relativamente basso-velocità di trasmissione, che limita il numero di animali e condizioni che possono essere misurate simultaneamente in modo controllato. Un recente studio di simulazione trovato che molti studi di durata della vita di c. elegans non analisi di un numero sufficiente di animali per essere in grado di rilevare in modo affidabile piccole modifiche tra circostanze9. Inoltre, questo metodo tradizionale comporta la manipolazione ripetutamente la stessa coorte degli animali nel corso del tempo, che a sua volta può introdurre contaminazione e possono danneggiare o uccidere animali sempre più fragili, invecchiati.

Abbiamo sviluppato una metodologia alternativa "Replica Set" per misurare la durata della vita di c. elegans . A tal fine, una grande popolazione di età-sincronizzato, isogeniche animali sono divisi in una serie di piccole popolazioni (o repliche). Numero sufficiente di campioni replica vengono generati per coprire ogni punto del tempo nell'esperimento pianificato. In ogni punto del tempo di osservazione, una delle repliche è segnata per il numero di morti viventi e animali censurati, poi gli animali all'interno di replicati vengono scartati. Così, oltre la durata prevista della popolazione nel suo complesso, una serie di sottopopolazioni indipendenti sono periodicamente campionate (Figura 2B). Utilizzando il set di repliche non c'è nessun incitamento ripetute degli animali e senza l'esposizione ripetuta a potenziale contaminazione ambientale. L'attuabilità osservato al punto una tantum è completamente indipendente da ogni altra osservazione, che riduce al minimo la gestione e aumenta la velocità effettiva di almeno un ordine di grandezza. Questo ci ha permesso di quantificare i cambiamenti nella durata della vita per centinaia di RNAi cloni contemporaneamente8,10.

Qui presentiamo protocolli dettagliati per lo svolgimento di durata della vita di c. elegans via del Set di repliche e metodi tradizionali per la segnatura di c. elegans longevità. Dimostriamo che si ottengono risultati simili tra i metodi. Abbiamo sviluppato software per facilitare l'analisi grafica dei dati di durata della vita generati attraverso entrambi gli approcci, che forniamo liberamente sotto una licenza GPL V3 (Vedi tabella materiali). "WormLife" è scritto in R11e include un'interfaccia utente grafica (GUI) per la rappresentazione dei dati, che sono stati testati in Mac OS e Linux. Infine, confrontiamo e le limitazioni di ciascun metodo di contrasto ed evidenziare altre considerazioni quando si sceglie tra gli approcci per misurare variazioni quantitative nella durata della vita di c. elegans .

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Protocol

1. tradizionale metodo per la longevità di c. elegans di Scoring

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Identificare i geni a essere inattivato tramite RNAi alimentazione-basata. Acquisto di scorte trasformate di HT115 e. coli2 contenente il clone di RNAi di interesse. In alternativa, subclone il cDNA del gene di interesse nel sito multicloning del plasmide L4440.
      Nota: HT115 è un ceppo di RNAsi III-carenti e. coli con attività della polimerasi T7 IPTG-inducibile, che viene utilizzato per impedire la degradazione di dsRNA all'interno i batteri. Per gli studi di durata della vita che non utilizzano alimentazione-basata di RNAi, HT115 o OP50 Escherichia coli su piastre NGM standard possa essere usate.
    2. Preparare 3 – 6 (o più) 6cm RNAi piastre a condizione di test (Supplemental File 3 per ricetta). Conservare RNAi piastre a 4 ° C prima della semina con batteri per fino a parecchi mesi.
    3. Crescere trasformato Escherichia coli durante la notte (16 – 20 h, 37 ° C in agitazione incubatore a 180 – 220 giri/min).
      Nota: HT115 e. coli è coltivato in LB con ampicillina (50 mg/mL). Standard OP50 Escherichia coli non è resistente agli antibiotici e viene coltivato senza ampicillina. Volume di cultura dipende dal numero di piastre, ma è in genere tra 8 e 100 mL di libbra, a seconda del design sperimentale.
      1. Concentrare i batteri mediante centrifugazione a 3.000 x g per 15 – 20 minuti in una centrifuga da banco. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1/10 di volume iniziale (cioè 10 x) in LB con ampicillina per HT115 (o senza ampicillina per OP50 standard).
      2. Aliquotare 200 µ l di concentrato 10 batteri x ad ogni piastra di 6 cm. Preparare 3-4 ripetizioni per condizione di test, con 2 piastre extra backup, da utilizzare in caso di contaminazione. Nella preparazione di piatti, etichettarli in modo lo sperimentatore segnando il dosaggio è cieco alle condizioni sperimentali, utilizzando un codice di colore o un simile schema di codifica. Assicurarsi che il codice viene registrato.
      3. Lasciate aperte piastre asciugare in un ambiente pulito come un flusso laminare da banco fino a quando tutto il liquido è stato assorbito o consentire coperti lastre a secco in panchina durante la notte. Monitor piatti durante l'asciugatura per garantire che l'agar è asciutto senza sovra.
        Nota: Sovra le piastre conduce alla fessurazione dell'agar che causerà c. elegans di scavare dentro l'agar. Bagnate che le superfici dell'agar promuovono anche scavando.
    4. Conservare secchi placche all'interno di una scatola di vite senza fine durante la notte (fino a 24 h) a temperatura ambiente per consentire l'induzione della produzione di dsRNA. Dopo 1 giorno a RT, memorizzare piastre a 4 ° C fino a 2 settimane in un sacchetto a chiusura lampo sigillato (a piastre impediscono l'essiccazione). Prima dell'uso, restituire piastre a temperatura ambiente all'interno del sacchetto di chiusura lampo per evitare la condensa dall'introdurre contaminanti fungini.
  2. Sincronizzazione di c. elegans con trattamento di ipoclorito
    Nota: Vedere Supplemental File 3 per ricette di soluzione M9 e ipoclorito.
    1. Raccogliere gli animali adulti gravid con M9. Utilizzare una pipetta di vetro tappato per spostare in provette da 2 x 15 mL.
    2. Gira tubi per 30" a ~ 2.000 giri/min. Verifica per una piscina di nematodi nella parte inferiore del tubo. Aspirare il supernatante. Lavare due volte con soluzione di M9, ripetendo spin e aspirazione.
    3. Risospendere c. elegans in 4 mL di M9. Aggiungere 2 mL di soluzione di ipoclorito. Immediatamente vortice per ~ 3 min, con agitazione vigorosa periodica. Dopo 3 min, cercare una nuvola di uova sotto un microscopio per dissezione. Vortice un ulteriore 10 – 20 s se le uova non sono state rilasciate dopo 3 min.
      Nota: Il trattamento di ipoclorito i tempi è essenziale. Le uova all'interno degli adulti gravid sono ciò che sopravvivono al trattamento. Dopo ~ 3 min adulti gravid rompono aperti e fuoriuscire le uova. Tuttavia, se le uova sono in soluzione di ipoclorito troppo a lungo dopo il rilascio moriranno. Al contrario, se gli adulti gravid non sono lasciati in una soluzione di ipoclorito abbastanza a lungo, non sarà rilasciato uova.
    4. Lavare rapidamente con M9 soluzione due volte come descritto al punto 2.1.2.
    5. Risospendere il pellet di uovo di c. elegans in 3ml M9 e trasferirlo in una provetta da 15 mL nuovo. Consentire gli embrioni a covare una notte in 3 mL di soluzione di M9 con rotazione a 20 ° C.
    6. Calcolare la densità di animali L1 (o embrioni) per µ l facendo cadere 10 µ l di soluzione L1 3 x su una piastra di 6 cm e contare il numero di animali di L1 per calcolare il numero medio di L1s / µ l.
      Nota: Gli animali L1 si depositerà nel corso del tempo. Di conseguenza, soluzioni L1 devono essere periodicamente mescolati.
    7. Animali del seme 50 L1 per piastra. Capovolgere le piastre e sigillare con un elastico. Posizionare le piastre in una scatola di plastica vite senza fine. Contenitore in un sacchetto grande chiusura lampo. Spostare un incubatore di 20 ° C.
  3. Prevenire la produzione di progenie con l'aggiunta di 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Crescita di animali fino allo stadio L4 a 20 ° C. Controllare per vedere se sincronizzati gli animali hanno sviluppato a L4 circa 40 h dopo la semina (punto 2.1.7).
      Nota: Tempo inerente allo sviluppodi c. elegans varierà a temperature diverse tariffe12 e crescita di animali mutanti per i quali non sono state caratterizzate le tariffe devono essere testate empiricamente.
      1. Aggiungere 160 µ l di 50 x FUdR ad ogni piastra di 6 cm con animali di L4.
        Nota: È fondamentale per aggiungere FUdR nella fase di L4. Per comodità, fanno 1.000 x scorte di FUdR sciogliendo 1 g FUdR in 10 mL ultrapura H2O. filtro-sterilizzare stock FUdR con un filtro di 0,2 µm e una siringa da 10 cc. Aliquotare ~ 1 mL di brodo in provette sterili da 1,5 mL. Congelare e conservare a-20 ° C.
    2. Ispezionare le piastre per la presenza di uomo elegans del c. Rimuovere tutti i maschi.
      Nota: durata della vita è in genere misurata per ermafroditi e non i maschi. Ermafroditi che si accoppiano vivono più breve di spaiato animali, anche in presenza di FUdR13. I maschi sono più piccolo e più sottile quindi ermafroditi e possono essere facilmente identificati da un distintivo di coda adunco14.
    3. Rimettere casella il sacchetto a chiusura lampo. Ritorno a incubatore di 20 ° C.
  4. Segnando la redditività
    1. Punteggio ottenuto vitalità ogni giorno toccando delicatamente l'animale sulla testa con un filo di platino o ciglia. Punteggio di animali che non riescono a muoversi come morto e rimuoverli dalla piastra (Figura 2A). Registrare il numero osservato morto per ogni condizione per ogni punto del tempo di osservazione.
      Nota: Per ridurre il rischio di bias di punteggio, lo sperimentatore deve rimanere cieco delle condizioni sperimentali e allo stesso modo non deve fare riferimento i risultati dai precedenti punti di tempo durante il punteggio.
    2. Animali di censore che rompersi, muoiono da altri difetti di sviluppo ovvio, o ricerca per indicizzazione fino sul lato piatto: Rimuovi questi animali e record di osservare il numero ad ogni tempo punto per considerazione nell'analisi statistica. Inoltre, se i maschi vengono trovati, rimuoverli e registrare il numero osservato.
    3. Ripetere dal passo 1.4.1 ogni giorno fino a quando non gli animali rimangono vivi.
      Nota: Dovrebbe il prato di e. coli diminuire significativamente o fungo comincia a crescere sulla lastra, trasferire tutti gli animali restanti per un piatto fresco con l'appropriato RNAi e FUdR.
  5. Analisi - stampa di dati e statistiche
    1. Ingresso o dati di osservazione registrata aperta nel software che supporta l'analisi di sopravvivenza con il non-parametrici per la stima di Kaplan-Meier15 e log-rank test16 (Vedi File supplementare 3). Assicurarsi di includere animali censurati. Non includono i maschi che sono stati osservati, se presente.
      Nota: formati di dati possono variare tra software, ma un formato comune è quello di registrare ogni singolo animale osservato su una riga separata. Timepoint sperimentale in cui un animale è stato osservato come morto è la volta di "evento". Se censurato, il tempo di "evento" è il timepoint in cui l'animale è stato censurato. Solito c'è un campo o la casella di controllo per indicare osservazioni censurate.
    2. Tracciare le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier. Selezionare meno di sei condizioni per un unico appezzamento se molte condizioni sono state analizzate per migliorare la leggibilità.
      1. Verificare problemi di dati che sono visivamente apparente - osservazioni mancanti, controllo imprevisto risultati, ecc. — e affrontarle prima analisi statistica.
    3. Utilizzare la funzione di test log-rank nel vostro software per eseguire pairwise confronti statistici. Assicurarsi che tutte le opzioni disponibili per il trattamento di censurato risultati siano impostate in modo appropriato per i dati di diritto-censurato.

2. il metodo Set replica di Scoring di c. elegans longevità

Nota: mentre il metodo tradizionale richiede 3 – 6 piastre per patologia (Vedi 1.1.2. sopra), il metodo del Set di repliche richiede molti altri (Vedi punto 2.2.2 qui sotto). Il metodo tradizionale segue gli animali nello stesso piatto in tutto un esperimento (Figura 2A). Al contrario, con Replica Set animali sono segnati solo una volta: molte repliche identiche sono impostati all'inizio dell'esperimento, così che una replica è segnato in ogni punto di tempo (per prova) (Figura 2B).

  1. Configurazione Catalogo multimediale.
    Nota: Ulteriori dettagli sulla consegna RNAi cloni sono coperto qui, come il protocollo è favorevole al Punteggio simultanea di molti cloni di RNAi, del Set di repliche e possono essere scalata a oltre 100 cloni in un momento. Collezioni di RNAi cloni sono conservati come glicerolo scorte mantenute in un piatto formato da 96 pozzetti. Esperimenti di Set di replica utilizzano piastre da 24 pozzetti. Ogni bene è una condizione di test differenti, che può corrispondere a un insieme di cloni RNAi, diversi trattamenti chimici, ceppi di animali e così via.
    1. Assemblare il layout di sublibrary per le collezioni di cloni di RNAi, tale che sono soddisfatte le seguenti condizioni:
      1. Assicurarsi che all'interno di una raccolta di 96 pozzetti, pozzetto A1 sia un controllo negativo vettore vuoto.
      2. Inserire un controllo aggiuntivo vettore vuoto in modo casuale all'interno di ogni 24 pozzetti.
      3. Dividere la piastra a 96 pozzetti in blocchi di 24 pozzetti, tale che ogni piastra a 24 pozzetti ha a uno casualmente inserito controllo negativo (Figura 2).
      4. Inserire un controllo positivo in modo casuale all'interno di ogni gruppo di 24-pozzi (Figura 2).
        Nota: Il controllo positivo è dipenda sulla questione sperimentale. Ad esempio, quando guardando una collezione di RNAi cloni che aumento di durata della vita, daf-2(RNAi) è spesso incluso. Al contrario, quando guardando ridotta durata della vita, la daf-16(RNAi) è frequente.
  2. Preparazione del set di repliche
    Nota: il numero delle ripetizioni necessarie è uguale al numero minimo di punti di tempo (Figura 2B). Uno deve sapere a posteriori quanto tempo per misurare la durata della vita prima dell'inizio dell'esperimento, come pure segnando frequenza (ad es. un esperimento di set di replica in esecuzione 40 giorni con ogni giorno segnando richiede la preparazione di un minimo di set di 20 repliche per ogni condizione all'inizio dell'esperimento). Si consiglia di fare ~ 5 set di backup supplementare (Vedi 2.2.2 e 2.2.2.3 qui sotto).
    1. Per creare un timbro fresco di sublibrary il RNAi, inoculare LB + Amp per 200 µ l per pozzetto in un formato a 96 pozzetti (600 tavole µ l) utilizzando un replicatore 96-pin piatto mediante le seguenti fasi:
      1. Sterilizzare 96 replicatore di piastra perno immergendo in sequenza i perni in 50% candeggina, H2O ultrapura ed etanolo. Tenere i perni immersi per almeno 30 s per i passaggi di candeggina ed etanolo.  Dopo l'immersione in etanolo, fiamma brevemente le punte. Ripetere l'operazione.
        Nota: assicuratevi di risciacquare tutti candeggina e non lasciare i perni esposti per candeggiare per lunghi periodi, come candeggina possa corrodere i perni in acciaio inox.
      2. Rimuovere con cautela la copertura foglio adesivo dalla congelati 96 pozzetti glicerolo Libreria supporti piastra e delicatamente ma saldamente macinare suggerimenti di replicator piastra sterilizzata nei pozzetti delle scorte ancora congelati glicerolo. Inoculare 200 µ l LB + culture Amp e sigillare la piastra inoculata con una membrana permeabile. Consentire colture a crescere durante la notte sul banco.
      3. Sterilizzare il replicatore di piastra come descritto al punto 2.1.1, attentamente rimuovere la guarnizione dalla piastra di coltura liquida dopo una notte crescita e immergere le punte dei perni replicator. Applicare le punte con pressione uniforme a un amplificatore LB rettangolare + piastra di agar di tet e trasferimento batteri dai perni alla piastra delicatamente con piccoli movimenti circolari, assicurando che sia adeguato spazio tra punti adiacenti. Permettere le colonie a crescere durante la notte sulla piastra di agar a 37 ° C. Vedere Supplemental File 3 per la preparazione di LB + Amp/Tet piastre.
      4. Prima dell'uso, conservare piastra di agar a 4 ° C invertito (lato coperchio verso il basso), avvolti in film di paraffina.
        Nota: Accumulando lato coperchio colonie permetterà di condensazione di croce-contaminare RNAi cloni! Colonie di e. coli possono essere conservati per 2 – 8 settimane a 4 ° C, a seconda di particolari cloni di RNAi, come RNAi cloni mantengono l'efficacia nell'induzione di dsRNA dopo induzione di IPTG per lunghezze variabili di tempo. Per piccole collezioni di cloni di RNAi, RNAi efficienza deve essere determinata empiricamente da RT-qPCR per confermare atterramento.
    2. Calcolare il numero minimo di 24 pozzetti necessari per una prova dell'esperimento: (piastre # al set di repliche) x (punti di tempo previsto #). Garantire che alcuni set di repliche supplementari sono incluse per gestire i problemi come la contaminazione (Figura 2B).
      Nota: Il numero totale di RNAi cloni determina il numero di piastre da 24 pozzetti per fare un set di repliche per ogni punto di tempo (Figura 2).
      1. Preparare piastre da 24 pozzetti, come passo 1.1.2 (Supplemental File 3 per ricetta). Targhette di identificazione quando li prepara così lo sperimentatore segnando il dosaggio sarà ciechi alle condizioni sperimentali, utilizzando un codice di colore o un simile schema di codifica.
      2. Inoculare un set di 1,5 mL LB + culture Amp per ogni 10 repliche (cfr. 2.2.2). Inoculare culture in 96 ben profondo pozzetti utilizzando il replicatore di piastra (come 2.1.3) e colonie batteriche da 2.1.4 (Figura 2, a sinistra). Guarnizione con membrana traspirante, crescere 20h (37 ° C) con agitazione.
      3. Semi di 120 µ l di una cultura durante la notte per ogni piastra usando una pipetta multicanale 6 pozzetti con punta regolabile spaziatura (Figura 2, destra). Asciugare piatti scoperti in una cappa a flusso laminare, fino a quando tutto il liquido è stato assorbito. Non asciugare troppo. Conservare le piastre durante la notte a temperatura ambiente.
  3. Sincronizzazione di c. elegans utilizzando ipoclorito trattamento
    1. Calcolare il numero minimo di animali necessari per l'esperimento: n # minimo di L1s necessari = (15-20 animali/pozzetto) (24 pozzetti/piastra) (X set di piastre/repliche)(Y replica sets).
      Nota: il metodo del Set di repliche richiede più animali rispetto al metodo tradizionale. Una piastra di 10 cm piena di vermi gravid può fornire 20.000 – 50.000 animali di L1 a seconda della densità degli adulti gravid. Allo stesso modo, venti piatti da 6 cm resa intorno ~ 30.000 L1 animali. Intenzione di preparare una preparazione di uovo che raddoppia il numero minimo di animali necessari. Se ha fame la popolazione in preparazione, ri-alimentare o pezzo di una nuova piastra e consentire almeno tre generazioni il cibo prima di proceding17,18. Essere sicuri di congelare L1s rimasto indietro.
    2. Seguire i passaggi 1.2 a 1.2.6 come nel metodo tradizionale per ottenere sincronizzati L1 animali. 15 – 20 L1 animali del seme in ogni pozzetto usando un 6 pozzetti interasse regolabile pipetta e reagente serbatoio, simile a 1.2.7. Mescolare periodicamente L1 soluzione impedisce la sedimentazione degli animali.
  4. Prevenzione della produzione di progenie con l'aggiunta di 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Seguire il passaggio 1.3.1.  Preparare sterile 50 x FUdR stock (Vedi punto 1.3.1.1).
    2. Quando raggiungere animali L4, aggiungere 25 µ l di 50 x FUDR in ciascun pozzetto di un 24-pozzo piastra usando una pipetta di interasse regolabile 6 canali.
  5. Punteggio di vitalità
    1. Rimuovere un set di piastre di replicare e alluvione pozzi con la soluzione di M9, animali record totale per bene e poi delicatamente toccare animali non in movimento sulla testa con un plettro di vite senza fine (Figura 2B). Non riuscendo a spostare gli animali sono stati segnati come morto. Scartare le piastre ha ottenuti. Record vitalità ogni giorno.
      Nota: Gli animali che rottura, Vedi difetti morfologici lordo, non è riuscito a sviluppare, o strisciato sul lato del pozzo sono di essere censurato escludendoli da entrambi i valori morti e totali.
      1. Registrare il numero di animali che sono censurati all'interno di ciascun pozzetto a ciascun punto di tempo separatamente dagli altri valori.
      2. Non segnano pozzi che non hanno cibo o sono contaminati (ad es. fungo o melma); tali pozzi sono considerati censurato. Inoltre, censurare un pozzo se tutti gli animali visualizzare difetti morfologici o inerente allo sviluppo. Registrare l'evento censura per questo RNAi clone/pozzetto in questo momento.
      3. Dopo aver segnato un piatto replica, eliminarlo. Continuare a segnare una nuova replica impostato ogni giorno fino a quando tutti gli animali in tutti i pozzetti sono morti. Per ridurre il rischio di bias di punteggio, lo sperimentatore deve rimanere cieco delle condizioni sperimentali e allo stesso modo non deve fare riferimento i risultati dai precedenti punti di tempo durante il punteggio.
      4. Se tutti gli animali all'interno di un pozzo erano morti in un punto dato tempo, quindi dopo aver segnato quel giorno, esaminare, se tutti gli animali sono stati segnati come morto per due punti di volta consecutiva per un dato bene. Se è così, segnando la redditività non è più necessario per quel pozzo in intervalli di tempo successivi.
      5. Esperimento indipendente ulteriori sperimentazioni. Monitorare i risultati delle prove successive separatamente da quelli nelle prove precedenti, con il prova numero annotato.

3. grafico dati

Nota: Con il Set di repliche metodo una misura della curva viene applicato per approssimare la media e la massima durata. I parametri per valutare la mortalità di c. elegans montare un logit curva19.  Come la maggior parte degli strumenti di sopravvivenza non supportano logit di adattamento della curva, un nuovo programma è stato sviluppato per tracciare curve logit (per Set di repliche); Sono supportate anche le curve di Kaplan-Meier (per il metodo tradizionale).

  1. Iniziare con il software. Scarica il file zip di rilascio per la versione corrente (vedere la Sezione materiali). Estrarre il file zip in una cartella. Vedere il file "Leggimi" nella cartella estratta per istruzioni di installazione aggiuntive.
  1. Avviare l'interfaccia di stampa. Trovare il percorso della directory "codice" nella cartella estratta dal file zip (per esempio.  "/ Utenti/nome utente/desktop/WormLife/codice").
    1. Immettere i seguenti comandi nella console di R, sostituendo il percorso della cartella appena individuato. Premere INVIO o return dopo ogni entrata linea: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), source("plotGUI.R") 2), 3) openMain().
    2. Attendere che l'interfaccia caricare in una nuova finestra, portando la schermata predefinita, come mostrato in Figura 3A. Lasciate che la R eseguito in background.
  2. Formattare i dati come valori separati da virgola (CSV) o file di valori separati da tabulazione (TSV). Specificare le colonne e i nomi, dipendenti dal tipo di analisi. Per esempio pre-formattati dati, vedere Supplemental File 4 (Set di repliche) e supplementare 5 File (tradizionale/Kaplan-Meier).
    Nota: dati devono essere specificati in un formato "lungo", cioè una riga per ogni ceppo trattamenti al punto di tempo per ogni prova. I file CSV sono raccomandati per una migliore compatibilità tra piattaforme.
    1. Rimuovere righe, corrispondenti alle osservazioni che sono state ignorate o censurate. Verificare l'assenza di valori mancanti o non numerici, come può provocare un errore quando i dati vengono importati.
    2. Per analisi di stile tradizionale Kaplan-Meier, piscina non dati da prove indipendente-trama loro separatamente. Per l'analisi del Set di repliche, i dati dalle prove multiple della piscina e poi indagare utilizzando la funzionalità di "TrialView" (Vedi 6.3.3.4).
  3. Tramite l'interfaccia di stampa
    1. Caricare un file di dati ("importazione" sotto il menu "File") nella finestra di dialogo. Per aprire i file ". csv", modificare il tipo di file nel menu a discesa per "CSV" (il valore predefinito è ".txt/.tsv"), passare alla cartella con il file di dati. Ecco il file i dati di esempio del Set di repliche (Supplemental File 4).
      Nota: L'importazione di un file quando un oggetto dataset è già aperto sostituirà il dataset corrente.
    2. Selezionare un file da importare per avviare l'importazione guidata, che guiderà identificando le colonne del file selezionato (Figura S1A per Set di repliche). Se i dati di input corrispondano a un esperimento di set di repliche, è possibile scegliere "Logit" per tipo di studio.
      Nota: Il flusso di lavoro di importazione è diverso tra il Set di repliche (Figura S1A) e tradizionale (Kaplan-Meier) (S1 figuraB).
    3. "Traccia dati". Selezionare "Add Line" per iniziare la rappresentazione dei dati. (Una linea corrisponde ad un insieme di condizioni. Ci sono caratteristiche per aiutare con gli esperimenti dove molte condizioni sono state testate).
      1. Tracciare le condizioni di controllo-nel caso i dati di esempio N2 (WT) con L4440 (vettore vuoto) RNAi sono appropriati. Selezionare "Add Line" sotto il menu "Grafici" per avviare la procedura guidata Aggiungi linea: selezionare la condizione da trama e i parametri grafici per rappresentare la linea.
        1. Per aggiungere manualmente una curva per una condizione diversa, ripetere i passaggi in 3.3.3.1
        2. Per cambiare colore o simbolo per una linea di stampa, selezionare "Modificare linea" sotto il menu"grafico".
        3. Per rimuovere una riga senza cancellare tutte le linee, selezionare "Elimina riga" sotto il menu"grafico".
        4. Per cancellare tutte le linee nella trama corrente, selezionare "Linea chiara" sotto il menu"grafico".
        5. Per ignorare il valore selezionato automaticamente massima asse x (tempo), utilizzare "Set X scala" sotto il menu"grafico".
          Nota: l'asse y (frazione di sopravvissuti) Visualizza sempre il 100% (in alto) a 0% (in basso) con incrementi di 20%. L'asse x viene sempre visualizzato in incrementi di 5. Etichette dell'asse non vengono tracciate per consentire una flessibilità nell'etichettatura dopo il salvataggio di immagini di trama.
      2. Per salvare le immagini in formato JPEG della trama attualmente visualizzata, utilizzare l'opzione "Salva trama" nel menu"File"; viene salvato solo il grafico corrente.
      3. Per la creazione di lotti individuali per molte condizioni diverse in un esperimento, il software consente di definire e tracciare una "serie".
        Nota: L'implementazione del concetto di serie migliora l'efficienza quando si lavora con grandi esperimenti.
        1. Se a partire da un'area di lavoro vuota trama, aggiungere righe corrispondenti alle condizioni di controllo che devono essere coerente in tutte le trame della serie (Vedi 3.3.3.1).
        2. Definire la serie con "Definire serie" nel menu di grafici. Selezionare una condizione corrispondente alla linea da visualizzare prima della serie; solo uno può essere selezionato. Scegliere parametri grafici (linea colore e trama simbolo) per la linea, come in 3.3.3.1.
        3. Esaminare le trame per le condizioni di prova diverse. Cambiare la visualizzazione della linea"serie" tra condizioni utilizzando i tasti freccia sinistra/destra trovati ai lati della finestra del grafico principale, così come nel menu in alto barra (Figura 3A-C).
          Nota: Se la linea di serie selezionata è la stessa condizione come una delle linee di riferimento/controllo aggiunto in precedenza, la nuova linea può apparire sovrapposta.
        4. Definire la serie per rendere determinate altre funzioni disponibili (salvare serie trame e Trialview-vedere 3.3.3.4 per quest'ultimo). Dopo aver definito una serie, è possibile utilizzare l'opzione "Salva serie trame" dal menu "File" per salvare i file di immagine di trama individuali per ogni trama della serie in una nuova cartella.
      4. Trialview — visualizzando risultati da prove indipendenti di un esperimento del Set di repliche. Se per uno o più dei gruppi campione sono stati eseguiti test multipli, tracciare i dati da prove individuali e i dati riuniti da tutte le prove separatamente per valutare la coerenza tra prove indipendenti (Vedi Figura 3D).
        1. Impostare una serie come descritto in 3.3.3.3. Diverse prove verranno tracciate per ciascuno dei gruppi campione "variabile" in un'altra immagine sopra le rispettive prove per i campioni di riferimento/controllo specificato.
        2. Per salvare le immagini di TrialView, andare a "TrialViews di stampa" nel menu di dati; un'immagine JPEG sarà uscita per ogni trama della serie.
          Nota: I risultati di esempio in Figura 3D è per un caso con due prove.
    4. Durata della vita mediana tabella riassuntiva per i dati del Set di repliche. Visivamente ispezionare le curve per garantire la misura ragionevole dei dati, quindi selezionare la tabella riassuntiva "" opzione nel menu dati per salvare una tabella di valori di durata della vita mediana (tempo di sopravvivenza del 50% sulla curva di logit) per ciascun tipo di campione.
  4. Valutazione statistica dei dati generati tramite il metodo del Set di repliche
    1. Per l'analisi statistica tra i due gruppi da un esperimento del Set di repliche, modificare ed eseguire uno script di R, fornito nel file zip rilascio (vedere "WormLife script del modello di analisi statistica. R").
      Nota: Non è necessario eseguire lo script di competenza in R. Ulteriore documentazione è nei commenti nel file. Lo script è pronto per l'analisi dell'esempio dati del Set di repliche. Dati generati dall'utente nel formato appropriato (vedere Supplemental File 4) possono anche essere analizzati.
      1. Aprire il file di script in R (R GUI o RStudio).
        Nota: Questo verrà visualizzato lo script senza eseguirlo.
      2. Modificare i percorsi di file necessari per abbinare la posizione sul tuo computer.
        Nota: Questi percorsi di file devono essere "completi" (cioè deve includere il percorso completo del file, incluse le cartelle).
        1. Modificare i percorsi (percorsi di file/cartella) per "wlDir" (percorso della directory), "dataFile" (il file dei dati del Set di repliche per analizzare), "compFile" (specifica dei confronti per eseguire, se del caso) e "outputPath" (posizione in cui verranno scritti i file risultato a).
      3. Se i nomi di colonna nel file per essere analizzati sono diversi dal file di esempio, impostare i nomi di colonna nella sezione "Specificare le colonne nel file di dati". Specificare una colonna per ogni parametro. Se uno studio ha più ceppi, ma nessun RNAi (o altro trattamento) include una colonna nel file di dati con voci vuote o lo stesso per tutte le righe (ad esempio "no_treatment", ecc.).
      4. Impostare il parametro "compFile". Se il parametro "compFile" è impostato su NA, sarà possibile eseguire tutti i possibili confronti a coppie di gruppi.
        Nota: Un gruppo è definito dalla combinazione di ceppo/genotipo e trattamento, che sono concatenati e visualizzato come "strain_treatment". Per i più grandi studi con molti gruppi, può essere fornito un file CSV specificando i confronti. Vedere il file di esempio "comps_rsm_example.csv".
      5. Impostare il numero di iterazioni per Montecarlo ricampionamento ("k.resamp", il valore predefinito è 1.000).
        Nota: P-valori pari a 0 possono essere restituiti quando vengono eseguite anche alcune iterazioni; in tali casi è opportuno rapporto "p < 0.01" (se k.resamp = 100), o "p < 0,001" (se k.resamp = 1.000), ecc.
      6. Eseguire lo script: tasto "source" in RStudio (in alto a destra della finestra modifica) o "source document" nel menu "modifica" nella GUI di R. (Esecuzione può richiedere molto tempo).
      7. Quando l'indicatore di "occupato" R non è visualizzata, aprire l'output directory-ci sarà una tabella con i risultati di ogni confronto (sopravvivenza mediana, valori di p, variazione % durata della vita mediana).

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Representative Results

Nello sviluppo di qualsiasi nuova metodologia, è imperativo che il nuovo metodo ricapitola i risultati accettati da precedenti approcci e soddisfa lo standard all'interno di un campo. Abbiamo precedentemente dimostrato empiricamente che il Set di repliche e metodi tradizionali per diluire la durata della vita di c. elegans producano simili risultati20. Selvaggio-tipo di c. elegans (N2) mantenuta a 20 ° C in genere vivono tra 20 e 25 giorni, che abbiamo osservato con il tradizionale (Figura 4A, linea nera) e l'approccio del Set di repliche (Figura 4B, nero). Così, entrambi i metodi ragionevolmente approssimano selvaggio-tipo di durata della vita. È anche essenziale che un nuovo metodo ha la risoluzione di quantificare con precisione i cambiamenti tra le condizioni di test e la potenza statistica per rilevare cambiamenti significativi. Nel nostro studio precedente, abbiamo scoperto che la famiglia Myc di fattori di trascrizione è fattori determinanti della longevità di c. elegans . MML-1 e mxl-2 codificare i c. elegans omologhi di mammifero Mondo A / elemento di risposta del carboidrato binding protein (ChREBP) e Mlx, rispettivamente. In c. elegans e mammiferi, questi eterodimerizzare di membri di famiglia Myc per regolare la trascrizione. Abbiamo trovato che perdita di mml-1 o mxl-2 riduce significativamente la durata della vita normale, come misurato da entrambi un'analisi durata tradizionale o di Set di repliche (fig. 4A-B, giallo e marrone). In contrasto con il complesso di MML-1::MXL-2, abbiamo trovato che perdita di mdl-1 (omologo di mammiferi Mad) o mxl-1 (Max) aumentato significativamente la durata della vita di c. elegans come misurato da una metodologia (Figura 4 viola e blu, rispettivamente, in entrambi i pannelli).

Una seria limitazione all'approccio tradizionale per misurare la longevità è la velocità effettiva. Entrambi i metodi si basano sul movimento di chiamare se un animale è vivo o morto, che diventa sempre più difficile da valutare. Gli animali giovani si sposteranno in tutto un piatto in assenza di stimoli e sono così facili da Punteggio ottenuto. Invecchiamento di c. elegans diventano sempre più sedentario ma risponderà ad un leggero tocco alla testa di un movimento di inversione su un piatto. Tuttavia, come gli animali diventano più anziani la possibilità di spostarsi all'indietro diminuisce e diventa sempre più scoordinata. In definitiva animali diventano paralizzati, un fenotipo simile a sarcopenia e quando segnando via la vitalità del metodo tradizionale possono essere determinati solo osservando twitch sottile all'estremità anteriore dell'animale. Al contrario, quando segnando vitalità attraverso il metodo del Set di repliche, il liquido viene aggiunto al pozzo, che agisce come uno stimolo che genera una risposta di botte che possa essere quantificata come una lettura di healthspan8. Movimento nel liquido è più facile da osservare per anche più vecchi animali: cronologicamente pari età decrepiti animali producono sottili movimenti della testa su piastre asciutti ma un più pronunciato (seppur lento) curvatura del corpo in un liquido. Infine, quando il punteggio del Set di repliche, il pozzo intero è all'interno del campo visivo (~1.1 cm di diametro) e tutti gli animali sono in sospensione - osservazione permettendo di tutti gli animali contemporaneamente. Al contrario, quando segnando una lastra di 6 cm tramite il metodo tradizionale, uno deve analizzare attraverso l'intero piatto - ricerca attraverso il prato batterico e lungo i bordi per gli animali. La conseguenza netta di queste differenze è che la velocità effettiva quando si utilizza il metodo del Set di repliche è almeno un ordine di grandezza maggiore rispetto all'approccio tradizionale, che permette di quantificare contemporaneamente i cambiamenti nella durata della vita in tutto più di 100 condizioni in un singolo esperimento con un investigatore. Ad esempio, da un genoma alimentazione schermo basato su RNAi precedentemente abbiamo identificato 159 geni che erano necessari per la durata della vita aumentata conferito dal diminuito daf-2 /insulino-simile segnalazione8. In tale analisi, abbiamo quantificato i cambiamenti nella durata della vita nel selvaggio-tipo, un mutante longevo daf-2(e1370) e breve durata daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) doppio mutante animali (Figura 5A), che ci ha permesso di decifrare la genetica relazioni tra insulino-simile di segnalazione e oltre 100 inattivazioni gene progeric. Inoltre, abbiamo valutato come questi inattivazioni progeric gene alterato healthspan (all'epoca chiamato "activespan") osservando il declino in c. elegans thrashing attraverso replicati nel tempo (figura 5B).

Figure 1
Figura 1: l'avvento di alimentazione basato RNAi piombo a un'epoca della scoperta del gene nella ricerca di invecchiamento, ma la maggior parte gerogenes rimangono poco studiati. (A) gerogenes molti inizialmente sono stati scoperti dagli schermi di genomica funzionale su larga scala. Della gerogenes di c. elegans più di 900 scoperti fino ad oggi, molti sono stati identificati usando RNAi basate su alimentazione, evidenziando il valore di approcci genomici funzionali nel gene scoperto. Il grafico mostra il numero di gerogenes scoperto al manoscritto mediante RNAi, basato sul fenotipo annotazione (Vedi tabella materiali) per ontologia fenotipo termini durata estesa, accorciato durata e durata variante. Per l'elenco completo degli studi che scoperto gerogenes, vedere supplementare File 1 . (B) gerogenes la maggior parte rimangono poco studiati. Al contrario gerogenes a ben studiata come daf-16/FOXO (freccia), che ha più di 800 riferimenti, la maggior parte dei gerogenes hanno meno di 10 riferimenti (generale riferimento-non necessariamente focalizzata sulla durata della vita). Metodi affidabili di alto-rendimento sarà essenziale per derivare più approfondite le inter-relazioni genetiche tra gerogenes. Il grafico si basa sul mapping tra pubblicazioni su PubMed e la gerogenes di c. elegans scoperto dai fenotipi di RNAi. Vedere Supplemental File 2 per l'elenco completo di gerogenes e il numero degli studi associati a ciascuna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Il tradizionale e il metodo di Set di Replica per il Punteggio di durata della vita di c. elegans (A). Il metodo tradizionale per la segnatura elegans del c. Durata della vita. Diverse piccole popolazioni sincronizzati di animali isogeni per condizione sono seguiti nel tempo. La stessa popolazione di animali è seguita durante tutto il corso di studio. La vitalità è valutata dal movimento, che può essere stimolato da prodding delicato. Animali che non riescono a muoversi sono segnati come morto e sono rimosso (aspirazione mostrato) finché non rimangono gli animali non praticabili. (B). The Replica Set metodo per segnare la durata della vita di c. elegans . Una grande popolazione di età-sincronizzato isogeniche animali sono distribuiti attraverso un certo numero di piatti replicati identici. In ogni punto del tempo, una singola replica è segnata: una soluzione tamponata mite (M9) è aggiunto, che stimola la circolazione. Animali che non riescono a muoversi spontaneamente dopo l'allagamenti pozzi sono anche valutati tramite tocchino dello stimolo. La durata di punteggio per l'esperimento viene determinata prima dell'inizio. Ogni animale è segnato solo una volta e longevità per la più grande popolazione è derivata da molte osservazioni indipendenti. (C). The Replica Set approccio è un metodo di alto rendimento per misurare quantitativamente la durata della vita di c. elegans . cloni di RNAi 100 o più indipendenti possono essere monitorati contemporaneamente. HT115 e. coli che esprimono dsRNA per un determinato clone di RNAi è mostrato. Praticamente, ogni 24 campioni dalla piastra a 96 pozzetti sono divisi in una singola piastra a 24 pozzetti. Ogni piastra a 24 pozzetti risultante ha un negativo (ossia vettore vuoto, rosso ben) e controllo positivo (verde ben) distribuite in modo casuale all'interno di una raccolta di RNAi cloni (pozzi di gialli). In genere, il primo pozzetto (A1) in una raccolta contiene un vettore vuoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: l'interfaccia utente grafica (GUI). (A). l'interfaccia di trama principale finestra mostrando la schermata di benvenuto di default. Questo è ciò che viene visualizzato all'apertura del software. Differenze tra piattaforme aspetto dovrebbero essere minime a causa di uso di un piattaforma-indipendente windowing toolkit. (B). Panoramica delle opzioni di menu, per i menu a discesa disponibili dalla finestra trama principale. (C). l'output di esempio trama per entrambi Replica Set stile (a sinistra) e dati (a destra) di stile tradizionale di Kaplan-Meier. I dati visualizzati è stato raccolto in esperimenti indipendenti. Trame esportati non includono etichette pre-stampate dell'asse, per la massima flessibilità nell'aggiunta di tali etichette. Per facilitare ciò, gli assi sono sempre divisi in incrementi del 20% per l'asse y e con incrementi di 5 per l'asse x. In questo esempio, etichette asse e linea (ceppo/trattamento) sono stati aggiunti alle trame salvate, utilizzando un'immagine molto semplice e comune strumento di editing. (D). un esempio di output dalla funzionalità di "TrialView", che consente il confronto visivo tra i risultati di prove indipendenti per i DataSet di stile del Set di repliche. Questo grafico mostra il risultato tra due diverse prove e i relativi risultati aggregati per daf-2 EV(RNAi) (cerchi blu, chiusi), N2 EV (RNAi) (cerchi neri, chiusi) e daf-2 con daf-16 (RNAi) (diamanti rossi, aperto). TrialView permette di verificare rapidamente per problemi di dati specifici della prova che potrebbero influenzare la qualità dell'adattamento del dataset in pool. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: il tradizionale e del Set di repliche metodi producono risultati simili. Durata della vita aumenta la perdita di un componente dell'eterodimero MDL-1(Mad)::MXL-1(Max). In contrasto, perdita di un componente del MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) diminuisce la durata della vita di questa figura è ristampata da riferimento20 con autorizzazione tramite una licenza Creative Commons Attribuzione (CC BY) (Vedi materiali). (A). Kaplan-Meier risultati con il metodo tradizionale. (B). Logit curva utilizzando il metodo del Set di repliche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Il metodo in grado di decifrare interazioni genetiche basate sui cambiamenti nella durata della vita (A) e le alterazioni in healthspan (B) per più di 100 del Set di repliche RNAi cloni contemporaneamente. Questa figura è ristampata da8 con autorizzazione licenza Creative Commons Attribuzione-Non commerciale 4.0 International (CC-BY-NC) (Vedi materiali). Analisi genetica di durata della vita (A) di inattivazioni gene progeric nel contesto di diminuzione insulino-simile segnalazione (ILS) (daf-2, asse x) e in assenza di daf-16/FoxO (asse y), un effettore centrale trascrizionale di ILS21 . Inattivazioni gene con funzioni simili come daf-16 non accorciano ulteriormente durata in assenza di daf-16 (punti neri). Inattivazioni gene con funzioni completamente indipendente da daf-16 accorciano entrambi ambiti di provenienza genetici allo stesso modo (grigio). Inattivazioni gene dove il negativo effetto sulla durata della vita in daf-2 > daf-2; daf-16, suggerisce la funzione in parallelo (bianco). (B) variazioni nei tassi di botte nel corso del tempo possono derivare il healthspan medio per molte perturbazioni genetiche (asse x) durante la valutazione dei cambiamenti nella durata della vita (asse y). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1: flussi di lavoro in WormLife. Illustrazione dei passaggi di alcune visite guidate i flussi di lavoro (a volte chiamati "maghi"). In ciascuno di questi casi, dopo l'ultimo passaggio del flusso di lavoro, lo stato attivo viene restituito alla finestra di trama principale. (A) i dati importare il flusso di lavoro per i DataSet di stile del Set di repliche (B) i dati di importazione del flusso di lavoro per i DataSet tradizionali stile di Kaplan Meier. (C) il flusso di lavoro per l'aggiunta di linee di un complotto per i DataSet di stile del Set di repliche. (D) il flusso di lavoro per aggiungere righe a un complotto per il tradizionale stile di Kaplan Meier DataSet. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare File 1: gli studi che hanno identificato gerogenes. L'avvento dell'alimentazione-basata di RNAi ha condotto a un'epoca della scoperta del gene per i fenotipi che non erano trattabili dalla genetica in avanti, compreso invecchiamento. Studi indipendenti che identificati geni alterati di cui attività durata della vita sono elencati, nell'ordine il numero di gerogenes scoperto. Si noti che lo studio ha identificato il più gerogenes utilizzato il metodo set replica8. La natura di come il gene alterati inattivazioni durata della vita è anche indicato: longevità e progeric geni sono quelli che aumenta o diminuisce la durata della vita quando inattivato, rispettivamente. "Durata variante" si riferisce ai casi in cui direzionalità del cambiamento (cioè aumenta o diminuisce la durata della vita) non è stato specificato o non è stata curata. Dati da WormBase WS262 (gennaio 2018) (Vedi materiali), con l'aggiunta di RNAi-trattamento durata deriva dal riferimento10, che non sono ancora inclusi nella raccolta a cura di fenotipi WormBase RNAi. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare File 2: il numero degli studi associati con ogni gerogene. Gerogenes la maggior parte sono scarsamente studiato. Mentre alcuni geni, come daf-16/FoxO, sono stati oggetto di molta attenzione di ricerca, più di 400 gerogenes hanno meno di 10 pubblicazioni associate. Dati da WormBase WS262 (gennaio 2018), con l'aggiunta di RNAi-trattamento durata risultati da10 che non sono ancora inclusi nella raccolta a cura di fenotipi WormBase RNAi. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare File 3: preparazione dei reagenti comuni per C. elegans esperimenti. (A). ricetta per piastre standard da NGM e RNAi. (B). ricetta per la soluzione tampone e ipoclorito M9. (C). preparazione di LB + piastre Amp/Tet. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare File 4: Replica Set di dati di esempio. Un set di dati di esempio da un esperimento di durata della vita del Set di repliche. Questo set di dati è già formattato per essere adatti all'importazione/analisi. Comprende due prove a condizione (combinazione di ceppo/genotipo e RNAi). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare File 5: dati di esempio longitudinale tradizionale. Un set di dati di esempio da un esperimento di durata longitudinale tradizionale, con diritto-censura, formattati per l'importazione/analisi pronto utilizzando funzionalità trama sopravvivenza di Kaplan-Meier. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Entrambi i metodi tradizionali e replica set richiedono la sincronizzazione degli animali invecchiati in ordine cronologico. Includiamo un metodo che consente di sincronizzare gli animali utilizzando trattamento ipoclorito di gravid adulti, dove solo le uova fecondate con l'adulto gravid sopravvivono al trattamento. Questi embrioni schiudono in sospensione liquida e arrestano inerente allo sviluppo nella prima fase larvale (L1). Dopo la semina L1 animali sul cibo (ad esempio e. coli che esprimono dsRNA ad un gene di interesse), animali riprendere lo sviluppo. La sincronizzazione L1 animali dal trattamento di ipoclorito di gravid adulti ha il vantaggio che gli avanzi non teste di serie L1 animali possono essere congelati e conservati a tempo indeterminato in azoto liquido o in un congelatore a-80 ° C. In questo modo, un campione di ogni ceppo al momento del setup sperimentale sia conservato, creando una risorsa preziosa per gli studi futuri e migliorare la riproducibilità. Tuttavia, mentre il trattamento di ipoclorito di gravid animali adulti è un modo comune per ottenere animali sincronizzati per invecchiamento ricerca22, l'arresto di L1 è una risposta di inedia. Così, alcuni laboratori preferiscono sia per consentire la schiusa si verifica sulle piastre, o di rinunciare del tutto il trattamento di ipoclorito e consentono pochi adulti gravid a deporre le uova per diverse ore (cioè un uovo dei laici). In quest'ultimo caso, i genitori vengono rimossi e la durata della vita di progenie è seguito. Al meglio della nostra conoscenza, nessun evidenti differenze nella durata della vita sono state segnalate tra gli animali che sono stati sincronizzati in M9, nati sulle piastre, o progenie da lay un uovo. Tuttavia, dato che i cambiamenti nella disponibilità di nutrienti sono strettamente legati ai cambiamenti nella durata della vita, c'è la precedenza che specifici ambiti di provenienza genetici potrebbe produrre risultati diversi tra questi approcci di sincronizzazione. Per risolvere questa preoccupazione teorica è necessaria un'analisi più attenta.

Indipendentemente dal metodo utilizzato per sincronizzare la popolazione di partenza, passaggi devono essere prese a impedisce produzione di progenie o per separare la popolazione di partenza sincronizzata da futura progenie. Nel nostro protocollo, descriviamo come utilizzare FUdR per prevenire la produzione di progenie, come separare gli animali non è una valida opzione per la replica del set di metodo. È anche possibile prevenire la produzione di progenie geneticamente attraverso l'uso di un fondo genetico femminizzato (ad es. fer-15(b26);fem-1(hc17), che è un ceppo sterile temperatura-dipendente23). Tuttavia, nessuno è senza difetti: l'utilizzo di ambiti di provenienza genetici possa complicare l'analisi successiva, e in alcuni ambiti di provenienza genetici FUdR possono alterare la longevità24,25,26.

Come alternativa alla prevenzione progenie produzione attraverso chimiche o genetiche significa, animali adulti possono essere spostati periodicamente per piatti freschi di RNAi per isolarli dalla loro progenie. Ciò semplifica le considerazioni di fondo a scapito della velocità effettiva. Periodicamente lo spostamento di animali per cibo fresco ha i vantaggi supplementari di prevenire possibile inedia e rinnovando l'esposizione a dsRNA. Tuttavia, alcune interazioni genetiche che influenzano la durata della vita sono stati scoperti solo quando è stata inibita la produzione di progenie: analisi precoce del pathway TGFβ per un fenotipo di durata della vita ha concluso erroneamente che la segnalazione del TGFβ in diminuzione influenzato C. elegans dauer formazione ma non invecchia27,28. Tuttavia, un follow-up Studio che ha usato FUdR ha rivelato che è diminuito del TGFβ segnalazione aumentata longevità attraverso29di segnalazione dell'insulina. Perché studi precedenti hanno mancato di vedere aumentata durata della vita in animali mutanti TGFβ? TGFβ via mutazioni producono una lieve difetto (egl) la deposizione delle uova ed estendono la longevità riproduttiva, che causa interna schiusa della progenie più tardi nella vita che uccide il padre. È probabile che animali mutanti longevi del TGFβ è apparso ad avere una vita normale a causa del fenotipo di egl ha ucciso gli animali intorno al tempo quando selvaggio-tipo animali normalmente muoiono. Questo potrebbe essere rilevante per altre vie genetiche collegate a DR, come animali morti di fame anche manifestano un fenotipo di egl , forse come un vantaggio di sopravvivenza adattiva alla progenie in condizioni di basso cibo. Questo evidenzia la complessità sottostante in risposte adattative animali subiscono sotto condizioni di stress e la necessità di un'attenta analisi e considerazione durante la progettazione di esperimenti di durata della vita.

Nel progettare e condurre esperimenti di durata della vita di uno dei due metodi è fondamentale per evitare distorsioni. Gli esperimenti devono essere eseguiti in maniera cieca: come campioni precedentemente sono stati segnati in momenti precedenti e l'identità di una condizione di test deve essere sconosciuto allo sperimentatore. Inoltre, è sempre necessario includere controlli positivi e negativi; nel caso il metodo set di replica, questi vengono inseriti in modo casuale in una piastra a 24 pozzetti. E. coli che esprimono un plasmide che non contiene un inserto con la sequenza corrispondente a c. elegans genoma è il controllo di vettore vuoto negativo (cioè "L4440"-Vedi materiali). Controlli positivi dipendono dalla natura specifica di un esperimento. Per esempio, daf-2 codifica per il recettore dell'insulina/IGF-1 c. elegans , e daf-2 inattivazione tramite RNAi alimentazione-basata robustamente aumenta la durata della vita almeno due volte nel selvaggio-tipo animali27. Così daf-2(RNAi) potrebbe essere utilizzato come controllo positivo quando cercando inattivazioni di gene che aumentano la durata della vita. Al contrario, daf-16 codifica la FOXO trascrizione fattore orthologue30. DAF-16 è una componente essenziale di molti paradigmi di longevità e selvaggio-tipo animali (N2) trattati con daf-16(RNAi) sono di breve durati e mostrano segni di progeria31.

I vantaggi principali dell'approccio tradizionale longitudinale durata della vita sono che esso è molto ben consolidata, e gli esperimenti sono facili da impostare. Relativamente pochi animali sono necessari solo pochi piatti per ogni condizione di test. Così, i ceppi che crescono male o richiedono bilanciatori per propagare possono essere facilmente testati. L'approccio tradizionale è altamente adattabile e può essere utilizzato con qualsiasi uno degli approcci disponibili per gestione produzione di progenie, compreso il trattamento con FUdR, attraversando in una priorità bassa genetica femminizzata o trasferirsi periodicamente animali adulti nuove piastre durante il periodo di deposizione delle uova. Mentre gli animali in movimento notevolmente riduce la velocità effettiva, lavorare con uno sfondo mutante mai è ideale, e anche se FUdR non altera la durata della vita del selvaggio-tipo32,33,34, può influenzare la durata della vita e fenotipi correlati di età in alcuni ambiti di provenienza genetici35,25,26. Si noti che la presenza di maschi, anche con l'uso di FUdR, ridurrà significativamente ermafrodita durata13, quindi un piatto che conteneva i maschi dopo i hermaphrodites raggiunto L4 è inutilizzabile. Allo stesso modo, l'analisi attraverso la stima di Kaplan-Meier e curve associate e il log-rank test, è ben consolidata per i dati di mortalità. Tuttavia, ci sono parecchi svantaggi per l'analisi di durata della vita tradizionale. Ripetuto la movimentazione delle lastre (cioè esponendo le piastre all'aria) facilita l'introduzione di prevenirne la contaminazione fungina. Inoltre, ripetuto frugando può danneggiare o uccidere gli animali, soprattutto come la popolazione avanza in età e diventano fragile. Gli animali più anziani diventano in gran parte paralizzato e invischiato in e. coli, mentre Escherichia coli diventa un agente patogeno opportunistico (colonizzando il lume e imballaggio faringe)36. Molto vecchi animali viventi possono essere identificati solo da sottili movimenti della testa. Così, è facile da classificare un animale vivo decrepito come morto. Infine, l'approccio tradizionale è limitata dalla velocità effettiva.

Il metodo del Set di repliche è elevato throughput e quantitativa. Tuttavia, lo svantaggio di questo metodo è un grande investimento di tempo e risorse nella configurazione iniziale. Un esperimento moderatamente grande per esaminare 100 cloni di RNAi oltre 20 punti di tempo richiede 30.000 animali L1 (dove circa 15 animali sono esaminati al clone di RNAi per punto di tempo), che mentre è facile per la maggior parte dei ceppi, può essere problematico in alcuni casi. Per esempio, senza un ceppi grandi-particella sorter "(selezionatore di vite senza fine del) che devono essere mantenuta con bilanciatori o linee transgeniche che trasportano una matrice extra-cromosomica mal trasmessa non può essere facilmente esaminata da questo metodo. Un altro svantaggio è che deve essere inibito produzione di progenie, che prevede l'uso di FUdR o un background genetico femminilizzata. Infine, bisogna conoscere la lunghezza di tempo che verrà eseguito il test, come si deve preparare un set di repliche per ogni punto di tempo all'inizio dell'esperimento. Tuttavia, i vantaggi di questo metodo sono numerosi. Innanzitutto, segnando la redditività è molto più veloce e si possono facilmente seguire animali sopra 100 condizioni di test contemporaneamente (cioè cloni di RNAi). Poiché un set di repliche è solo un gol poi scartata, non c'è nessuna manipolazione ripetuta delle piastre o frugando degli animali, che riduce al minimo la probabilità di contaminazione fungina ed elimina la mortalità causata dall'occasionale prodding ruvido con un verme pick. Inoltre, l'aggiunta di liquido al pozzo facilita notevolmente segnando. Liberando i vecchi animali dalla piastra e che circonda i batteri assist in permettendo sottili movimenti della testa ad essere più facilmente segnato. Aggiunta di liquido offre anche l'opportunità di misurare il tasso di botte come una misura di fitness (ad es. healthspan8,37).

L'invecchiamento è un fenomeno complesso che coinvolge i meccanismi causali multipli che richiedono l'uso di sistemi biologici approcci per svelare. Questi approcci spesso incorporano modellazione guidata dai dati, utilizzando grandi volumi di dati genomici/Transcrittomica e richiedono metodi complementari di alto-rendimento e robusti per misurare la durata della vita e healthspan. Il metodo di Set di repliche di alto-rendimento permetterà il confronto di molti cloni di RNAi longitudinalmente, riducendo gli effetti batch ed errori tecnici, facilitando così lo sviluppo di modelli dinamici che possono dedurre le interazioni tra le vie causali in maniera quantitativa. Inoltre, integrazione dei diversi approcci di genomica del genoma con il metodo del Set di repliche è fattibile perché una vasta popolazione di animali di età-sincronizzato è suddiviso in un numero di piccole popolazioni.

Altri metodi sono stati sviluppati in precedenza per migliorare il throughput di esperimenti di durata della vita di c. elegans , spesso concentrandosi sull'adattamento del tradizionale approccio longitudinale (cioè seguendo lo stesso insieme di animali nel corso del tempo) a automatizzato osservazione e registrazione utilizzando comuni flatbed scanner38,39, o attrezzature più specializzate come microfluidici piastre40. Gli approcci basati su scanner usano la luce come uno stimolo e confrontare le immagini catturate in sequenza per determinare lo stato di vita/morte basato sul movimento per piastre multiple in una sola volta; mentre tali approcci non richiedono hardware proprietario scientifico, tempo coinvolti nella creazione di flussi di lavoro può essere notevole a seconda la scala desiderata. In alternativa, gli esperimenti di durata della vita in dispositivi microfluidici personalizzati consentono approfondita caratterizzazione fenotipica dei singoli soggetti nel corso del tempo e senza trattamento per evitare la progenie, ma necessitano di fabbricazione delle piastre di microfluidica e acquisizione di microfluidica associato pompe e apparecchiature di imaging. Al contrario, il metodo del Set di repliche, in combinazione con il software dettagliato qui, consente velocità di trasmissione notevolmente migliorato utilizzando gli strumenti che già sono comuni nei laboratori che lavorano con c. elegans.

Il software WormLife migliorerà in futuro per offrire un accesso più facile al confronto statistico e compatibilità con altre piattaforme. La documentazione più aggiornata del software è reperibile alla pagina GitHub, incluse le istruzioni di installazione per le piattaforme su cui il software è stato testato. Si svilupperanno inoltre una versione basata su web per consentire l'accesso conveniente senza la necessità di installare alcun software.

In sintesi, la combinazione del metodo del Set di repliche e il software liberamente disponibile dettagliate qui fornisce una piattaforma potente per migliorare il throughput e la robustezza degli esperimenti di durata della vita e una vasta gamma di analisi di sopravvivenza-based (ad es. sforzo di tolleranza, gli studi di tossicologia, healthspan, ecc.). Soprattutto se combinata con la genomica funzionale, questo approccio sfrutta i numerosi vantaggi del sistema dei metazoi modello c. elegans per decifrare la miriade delle interazioni genetiche che contribuiscono alla progressione dell'invecchiamento.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Finanziamenti per questo lavoro descritto in questo manoscritto è stato fornito da: l'ufficio università di Rochester di The Provost e la scuola di medicina e odontoiatria decanato di tramite il centro di Scienze di salute per l'innovazione computazionale (HSCCI); Ellison Medical Foundation nuovi studiosi in Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) i finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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