Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Metoden sett replika: En høy gjennomstrømming tilnærming til kvantitativt mål Caenorhabditis elegans levetid

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Summary

Her beskriver vi metoden replika, en tilnærming til kvantitativt mål C. elegans levetid/overlevelse og healthspan på en høy gjennomstrømming og robust måte, slik at screening av mange forhold uten å ofre kvalitet. Denne protokollen detaljer strategien og gir et verktøy for analyse av replikasettet data.

Abstract

Metoden replikasettet er en kvantitativt måle levetid eller overlevelse av Caenorhabditis elegans nematoder på en høy gjennomstrømming måte, slik at en enkelt etterforsker til skjermen mer behandlinger eller forhold over samme mengde tid uten tap av kvalitet. Metoden krever felles utstyr finnes i de fleste laboratorier arbeider med C. elegans og er dermed enkelt å adoptere. Tilnærmingen sentre på assaying uavhengige utvalg fra en populasjon på hvert observasjon poeng, i stedet for et enkelt utvalg over tid som med tradisjonelle langsgående metoder. Scoring innebærer legger væske fordelt av en flere godt plate, som stimulerer C. elegans flytte og forenkler kvantifisere endringer i healthspan. Andre store fordeler av metoden replikasett inkluderer redusert eksponering av agar overflater til luftbåren forurensning (f.eks mold eller sopp), minimal håndtering av dyr og robusthet til sporadiske mis scoring (for eksempel ringer et dyr som døde da det er fortsatt i live). Å riktig analysere og visualisere data fra et replikasett stil eksperiment, utviklet også en tilpasset Programvareverktøyet. Gjeldende funksjoner i programvaren inkluderer plotting av overlevelse kurver for både replikasettet og tradisjonelle (Kaplan-Meier) eksperimenter, som statistisk analyse for replikasettet. Protokollene her beskriver den tradisjonelle tilnærmingen for eksperimentell og metoden replikasett, samt en oversikt over tilsvarende dataanalyse.

Introduction

En av de mest transformerende teknologiske fremskritt mot å forstå genetisk grunnlag av aldring var utviklingen av fôring-baserte RNAi i C. elegans1; før eksperimentell bruk av RNAi var mange fenotyper av aldring ikke genetisk medgjørlig. Fôring-baserte RNAi oppnås gjennom produksjon av dsRNA i E. coli som samsvarer med en endogene C. elegans mRNA: IPTG induserer toveis transkripsjon over en sette av enten C. elegans cDNA eller en del av en Åpne lesing ramme innenfor en plasmider2. Når C. elegans overmodne intakt er E. coli, dsRNA produsert av bakterier transportert fra lumen inn intestinal celler via SID-2 transmembrane protein3, og deretter distribuert gjennom resten av dyret via SID-14. I hver celle eksogene dsRNA behandles av Dicer kompleks i siRNA, som samhandler med en eldre mRNA via utfyllende base sammenkobling å opprette en ny siRNA-mRNA dupleks. Denne dupleks er anerkjent av RISC komplekset og kløyvde, dermed nedverdigende endogene mRNA5. Dermed bare endrer plasmider innsatsen, kan en deaktivere funksjonen av nesten alle genet i C. elegans genomet. Funnet ledet til etableringen av flere store fôring-baserte RNAi biblioteker-samlinger av forvandlet E. coli aksjer som kan kombineres for å oppnå dekning av ca 86% av kjent C. elegans gener6, 7.

Siden fremme av fôring-baserte RNAi, har omfattende skjermer i C. elegans ført til oppdagelsen av mer enn 900 gener som endrer levetid når inaktiv (som dokumentert av RNAi-fenotypen foreninger kuratert i WormBase), som vi kaller til som gerogenes. En rolle for flertallet av gerogenes levetid kontroll ble oppdaget gjennom fôring-baserte RNAi i noen banebrytende rapporter (se figur 1A og supplerende fil 1 for detaljer). I noen tilfeller har disse gerogenes identifisert basert på måling levedyktighet på én eller noen få tidspunkt, som ikke klarer å gi en målbare mål på endring i levetid RNAi behandling. I andre tilfeller har disse genene kvantitativt vurdert for endringer i levetid, samt ekstra alder-assosiert fenotyper. For eksempel identifisert vi tidligere 159 gener som var nødvendig for både vanlig og økt levetid på dyr med redusert insulin/IGF-1 signalering, og kvantifisert endringer i healthspan. Av disse resultere 103 genet inactivations i en progeric fenotype, som tap resulterte i ett eller flere tegn til tidlig aldring8.

Mens noen gerogenes har blitt assosiert med 100 eller flere studier (f.eks daf-16, daf-2, sir-2.1), har over 400 gerogenes 10 eller færre sitater (figur 1Bog supplerende fil 2). Dermed mens omfattende fôring-baserte RNAi skjermer har oppdaget og cursorily preget hundrevis av antatte gerogenes, hvordan disse genene funksjonen levetid kontroll og til genetisk innbyrdes forbindelser mellom produktene genet fortsatt dårlig studerte. Full langsgående analyse for alder-assosiert fenotyper er en forutsetning for å identifisere genetiske interaksjoner mellom gerogenes (f.eks epistatic vekselsvirkningene, asynthetic vekselsvirkningene, etc.). Få dypere innsikt i de genetiske sammenhengen mellom gerogenes krever en høy gjennomstrømming kvantitativ metode, som også benytter fordelene med fôring-baserte RNAi.

Det vanligste surrogat målet aldring er levetid. Den tradisjonelle tilnærmingen for å måle C. elegans dødelighet spor dødsfall av enkelte dyr over tid i en liten populasjon. Et relativt lite antall dyr følges over tid og med jevne mellomrom er forsiktig prodded en platina wire eller øyenvippe, med bevegelse som en indikator av levedyktighet (figur 2A). Denne metoden har vært mye brukt, som det gir enkel, direkte målinger av gjennomsnittlig og maksimal levetid. Men er denne tradisjonelle metoden tidkrevende og relativt lav-gjennomstrømning, som begrenser antall dyr og forhold som samtidig kan måles på en kontrollert måte. En fersk simulering studie fant at mange C. elegans levetid studier ikke analysen nok mange dyrene kunne oppdage små endringer mellom forhold9. Videre innebærer denne tradisjonelle metoden håndtering gjentatte ganger samme kohort av dyr over tid, som i sin tur kan introdusere forurensning, og kan skade eller drepe stadig skjøre, alderen dyr.

Vi har utviklet en alternativ "replikasett" metode for å måle C. elegans levetid. Dette er en stor bestand av alder-synkronisert, isogenic dyr inndelt i en rekke små bestander (eller kopier). Nok kopi prøver genereres for å dekke hvert punkt i planlagte eksperimentet. Hver observasjon tidspunkt, en av replikaene er scoret av levende, døde og sensurert dyr og dyr i at gjenskape er forkastet. Dermed over forventet levetid av befolkningen som helhet, en rekke uavhengige subpopulasjoner er regelmessig samplet (figur 2B). I bruker replikasett er det ingen gjentatte prodding og ingen gjentatt eksponering for potensielle miljøforurensning. Levedyktigheten observert på engangsreferansenummer punkt er helt uavhengig av alle andre observasjon, som minimerer håndtering og øker gjennomstrømningen av minst en størrelsesorden. Dette har tillatt oss å quantitate endringer i levetid for hundrevis av RNAi kloner samtidig8,10.

Her presenterer vi detaljerte protokoller for å gjennomføre C. elegans levetid via både replikasettet og tradisjonelle metoder for scoring C. elegans levetid. Vi viser at lignende resultater oppnås mellom metodene. Vi har utviklet programvare for å bistå i den grafiske analysen levetid data generert gjennom enten tilnærming, som tilbyr fritt under GPL V3 lisens (se tabell over materialer). "WormLife" er skrevet i R11, og inkluderer et grafisk brukergrensesnitt (GUI) for plotting data som har blitt testet i Mac OS og Linux. Til slutt, vi sammenligne og kontrast begrensningene for hver metode og markere andre hensyn når du velger mellom tilnærminger til å måle kvantitative endringer i C. elegans levetid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tradisjonelle metoden for Scoring C. elegans lang levetid

  1. Forberedelse av reagenser
    1. Identifisere tilblivelse til deaktiveres via fôring-baserte RNAi. Kjøpe transformert aksjer HT115 E. coli2 inneholder RNAi klone av interesse. Eventuelt subclone cDNA av genet av interesse i området multicloning til L4440 plasmider.
      Merk: HT115 er en RNase III-mangelfull E. coli belastning med IPTG-induserbart T7 polymerase aktivitet, som brukes til å hindre nedbrytning av dsRNA i bakterier. For levetid studier som ikke bruker fôring-baserte RNAi, kan HT115 eller OP50 E. coli på standard NGM plater være brukt.
    2. Forberede 3 – 6 (eller flere) 6 cm RNAi plater per testvilkår (ekstra fil 3 for oppskriften). Lagre RNAi plater på 4 ° C før såing med bakterier for opptil flere måneder.
    3. Vokse transformert E. coli natten (16-20 h, 37 ° C risting inkubator på 180-220 RPM).
      Merk: HT115 E. coli er dyrket i LB med ampicillin (50 mg/mL). Standard OP50 E. coli er ikke antibiotika resistente og er dyrket uten ampicillin. Kultur volumet avhenger av antall plater, men er vanligvis mellom 8 og 100 mL LB, avhengig av eksperimentell design.
      1. Konsentrere bakterier med sentrifugering 3000 x g i 15-20 min i en Borstemmaskin sentrifuge. Sug opp nedbryting, og å suspendere pellet på 1/10 starte volum (dvs. 10 x) i LB med ampicillin for HT115 (eller uten ampicillin for standard OP50).
      2. Aliquot 200 µL av konsentrert 10 x bakterier hver 6 cm plate. Forberede 3-4 gjentak per testvilkår, med 2 ekstra backup plater, som skal brukes ved forurensning. Når du forbereder plater, merke dem så eksperimentator scoring analysen er blind eksperimentelle forhold, bruker en fargekode eller lignende koding ordningen. Kontroller at koden er registrert.
      3. Tillate åpent plater tillate dekket plater tørke på benken over natten eller tørke i et rent miljø som laminær strømning benken til all væsken har blitt absorbert. Overvåke plater mens tørking for å sikre at agar tørr uten over tørking.
        Merk: Over tørking platene fører til sprengning av agar som vil forårsake C. elegans å hule agar. Våt agar overflater også fremme Hi.
    4. Lagre tørket plater i en orm boks over natten (opptil 24 h) ved romtemperatur å tillate induksjon av dsRNA produksjon. Etter 1 dag på RT lagre plater på 4 ° C 2 uker i en forseglet glidelås-lås bag (for å hindre plater tørker ut). Før bruk, tilbake platene til romtemperatur i zip-lock posen å hindre kondens fra introdusere luftbåren fungal forurensning.
  2. Synkronisering av C. elegans med hypokloritt behandling
    Merk: Se ekstra fil 3 for M9 og hypokloritt løsning oppskrifter.
    1. Samle gravid voksen dyr med M9. Bruk en plugget glass pipette flytte til 2 x 15 mL rør.
    2. Spinne rør for 30"~ 2000 RPM. Sjekk for en pool av på nematoder nederst på røret. Sug opp nedbryting. Vask to ganger med M9 løsning, gjentatt spinn og aspirasjon.
    3. Nytt avbryte C. elegans 4 mL av M9. Legg 2 mL hypokloritt løsning. Umiddelbart vortex for ~ 3 min, med periodiske kraftig risting. Etter 3 min, se etter en sky av egg under dissecting mikroskop. Vortex en ekstra 10-20 s Hvis eggene ikke frigitt etter 3 minutter.
      Merk: Timing hypokloritt behandling er viktig. Egg i gravid voksne er hva overleve behandling. Etter ~ 3 min gravid voksne bryte åpne og egg søler ut. Men hvis egg i hypokloritt løsning vil for lenge etter de dø. Omvendt, hvis gravid voksne er igjen i hypokloritt løsning lenge nok, ingen egg vil bli utgitt.
    4. Raskt vask med M9 løsning to ganger som i trinn 2.1.2.
    5. Nytt suspendere C. elegans egg pellet i 3 mL M9 og overføre til en ny 15 mL tube. Tillate embryo å klekkes overnatting i 3 mL M9 løsning med rotasjon på 20 ° C.
    6. Beregne tettheten av L1 dyr (eller embryo) per µL ved å slippe 10 µL av L1 løsning 3 x 6 cm plate og antallet L1 dyr til å beregne gjennomsnittlig antall L1s/µL.
      Merk: L1 dyr vil bosette seg over tid. Derfor skal L1 løsninger periodisk blandes.
    7. Frø 50 L1 dyr per plate. Invertere plater og forsegle med en strikk. Plasser plater i en plast ormen. Seal boks i en stor zip-lock bag. Flytte til en 20 ° C inkubator.
  3. Hindre avkom produksjon ved tilsetning av 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Vokse dyr til L4 scenen på 20 ° C. Se om synkronisert dyr har utviklet i L4 ca 40 timer etter seeding (trinn 2.1.7).
      Merk:C. elegans utviklingsmessige vil variere ved forskjellige temperaturer12 og vekst priser mutant dyr som priser ikke har vært preget empirisk må testes.
      1. Legge til 160 µL av 50 x FUdR til hver 6 cm plate med L4 dyr.
        Merk: Det er viktig å legge FUdR på L4 scenen. For bekvemmelighet gjør 1000 x bestander av FUdR ved å løse opp 1 g FUdR i 10 mL ultrapure H2O. Filter-sterilisere stock FUdR med en 0,2 µm filter og en 10 cc syringe. Aliquot ~ 1 mL steril 1,5 mL rør for aksjer. Fryse og lagre på 20 ° C.
    2. Inspisere plater for tilstedeværelsen av mannlige C. elegans. Fjern alle menn.
      Merk: levetid måles vanligvis hermafroditter og ikke menn. Hermafroditter som kompis bor kortere enn unmated dyr, selv i nærvær av FUdR13. Menn er mindre og tynnere deretter hermafroditter, og kan lett identifiseres av en særegen hekta hale14.
    3. Sett boksen tilbake i zip-lock posen. Tilbake til 20 ° C inkubator.
  4. Scoring levedyktighet
    1. Score levedyktighet daglig ved forsiktig berører dyr i hodet med en platina wire eller øyenvippe. Score dyr som ikke klarer å flytte som døde og fjerne dem fra platen (figur 2A). Registrere observert død for hver betingelse for hver observasjon tidspunkt.
      Merk: For å redusere risikoen for scoring bias, eksperimentator må være blind for eksperimentelle forhold og lignende må ikke refererer til resultatene fra tidligere tidspunkt under scoring.
    2. Sensurere dyr som brudd, dø fra andre åpenbare utvikling defekter eller krype opp på siden av parabolen: Fjern disse dyrene og posten nummeret på hver observert tid peker for vurdering i den statistiske analysen. I tillegg, hvis menn er funnet, fjerne dem og registrere observert.
    3. Gjenta fra trinn 1.4.1 daglig til ingen dyr er fortsatt i live.
      Merk: Bør plenen av E. coli avta betydelig eller sopp begynner å vokse på platen, overfører alle gjenværende dyr til en frisk plate med riktig RNAi og FUdR.
  5. Data analyse - plotting og statistikk
    1. Input eller åpne observasjonen data i programvare støtter overlevelse analyse med ikke-parametriske Kaplan-Meier estimator15 og logg-rank test16 (se ekstra filen 3). Husk å inkludere sensurert dyr. Inneholde ikke som ble observert, eventuell.
      Merk: dataformater kan variere mellom programvare, men et felles format er å registrere hvert individuelle dyr observert på en egen linje. Den eksperimentelle timepoint som et dyr var observert som døde er "hendelse" tid. Hvis sensurert, er "hendelsen" tiden timepoint som dyret ble sensurert. Det er vanligvis et felt eller for å angi sensurert observasjoner.
    2. Tegne Kaplan-Meier overlevelse kurver. Velg færre enn seks betingelser for et enkelt gravsted Hvis mange forhold var assayed for å bedre lesbarheten.
      1. Se etter problemer med data som er visuelt tydelig - mangler observasjoner, uventede kontroll resultater, osv. - og adressen disse før statistisk analyse.
    3. Bruk funksjonen Logg-rank test i programvaren utføre parvis statistiske sammenligninger. Kontroller at alle tilgjengelige alternativer for behandling av sensurert resultater er satt riktig høyre-sensurert data.

2. kopi Set-metode for Scoring C. elegans lang levetid

Merk: mens den tradisjonelle metoden krever 3 – 6 plater per betingelse (se 1.1.2. over), replika metoden krever mange flere (se trinn 2.2.2 nedenfor). Den tradisjonelle metoden følger dyr på samme plate gjennom et eksperiment (figur 2A). I kontrast med replika dyr bare scoret en gang: mange identiske gjentak settes opp i begynnelsen av eksperimentet slik at en replikere er scoret på hvert punkt (per prøve) (figur 2B).

  1. Biblioteket oppsett.
    Merk: Flere detaljer om levering RNAi kloner dekkes her som replikasettet er mottakelig for samtidige scoring av mange RNAi kloner, og kan skaleres til godt over 100 kloner samtidig. Samlinger av RNAi kloner beholdes som glyserol aksjer vedlikeholdes i en 96-brønns format plate. Kopi angi eksperimenter bruker 24-og plater. Hver er også en annen test tilstand, som kan tilsvare en samling av RNAi kloner, ulike kjemiske behandlinger, dyr stammer og så videre.
    1. Montere utformingen av sublibrary samlinger av RNAi kloner, slik at følgende betingelser er oppfylt:
      1. Kontroller at innenfor en 96-brønns samling, godt A1 er en tom vektor negativ kontroll.
      2. Sette inn en ekstra tom vektor kontroll tilfeldig i hver 24 brønner.
      3. Delt 96-brønns platen blokkene 24 brønner, slik at hver 24-vel plate er på en tilfeldig inn negativ kontroll (figur 2C).
      4. Sett inn en positiv kontroll tilfeldig i hver gruppe 24-brønner (figur 2C).
        Merk: Positiv kontrollen er avhengig av eksperimentelle spørsmålet. For eksempel når du ser på en samling av RNAi kloner som øke levetid, er daf-2(RNAi) ofte inkludert. Motsatt, når du ser på kortere levetid, daf-16(RNAi) brukes ofte.
  2. Utarbeidelse av replikasett
    Merk: antall gjentak nødvendig tilsvarer antallet tidspunkt (figur 2B). Man må vite en posteriori hvor lenge å måle levetid før starten av eksperimentet, samt scoring frekvens (f.eks en kopi angi eksperiment kjører 40 dager med hver andre dag scoring krever forbereder minimum 20 replikasett for hver betingelse i begynnelsen av eksperimentet). Det anbefales å ~ 5 ekstra sikkerhetskopisett (se 2.2.2 og 2.2.2.3 nedenfor).
    1. Hvis du vil opprette et friskt preg av RNAi sublibrary, vaksinere 200 µL LB + Amp per brønn i 96-brønnen format (600 µL plater) med en 96-pinners plate replikator ved følgende trinn:
      1. Sterilisere 96 pin plate replikator ved sekvensielt leve pinnene i 50% blekemiddel, ultrapure H2O og etanol. Hold pinnene midt minst 30 s blekemiddel og etanol trinnene.  Etter nedsenking i etanol, flamme tips kort. Gjenta.
        Merk: pass å skylle ut alle blekemiddel, og ikke la pinnene utsatt for å bleke i lengre perioder, som blekemiddel kan korrodere rustfritt stål pinnene.
      2. Fjern forsiktig klebende folie dekselet fra frosne 96-brønns glyserol beholdningsbiblioteket plate og forsiktig men fast slipe tips av sterilisert plate Replikatoren til brønnene av de fortsatt frosset glyserol. Vaksinere 200 µL LB + Amp kulturer og forsegle inokulerte platen med en gjennomtrengelig membran. Tillate kulturer å vokse over natten på Borstemmaskin.
      3. Sterilisere plate Replikatoren som i trinn 2.1.1, nøye fjerne forseglingen fra flytende kultur plate etter overnatting vekst og fordype tips av replikator pinnene. Bruk tipsene med jevnt trykk en rektangulær LB amp + tet agar plate og overføre bakterier fra pinnene til platen forsiktig med en liten sirkulær bevegelse, sikre at tilstrekkelig plass det er igjen mellom tilstøtende flekker. Tillate kolonier å vokse over natten på agar plate på 37 ° C. Se ekstra fil 3 for utarbeidelse av LB + Amp/Tet plater.
      4. Før bruk må lagre agar plate på 4 ° C invertert (lokket side ned), innpakket i parafin film.
        Merk: Lagrer kolonier lokket siden vil tillate kondens kryss-forurense RNAi kloner! Kolonier av E. coli kan lagres i 2-8 uker på 4 ° C, avhengig av bestemt RNAi kloner, som RNAi kloner beholde effekt i inducing dsRNA etter IPTG induksjon for variable lengder tid. For små samlinger av RNAi kloner, bør RNAi effektivitet empirisk bestemmes av RT-qPCR å bekrefte knockdown.
    2. Beregne antallet 24-vel plater nødvendig for en prøveversjon av eksperimentet: (# plater per replikasettet) x (forventet # tidspunkt). Kontroller at noen ekstra replikasett er inkludert for å håndtere spørsmål som forurensning (figur 2B).
      Merk: Antall RNAi kloner bestemmer antall 24-vel plater for å lage ett sett med replikaer for hvert punkt (figur 2C).
      1. Forberede 24-vel plater, som steg 1.1.2 (ekstra fil 3 for oppskriften). Etiketten plater når forberede dem så eksperimentator scoring analysen vil bli blind eksperimentelle forhold, med en fargekode eller lignende koding ordningen.
      2. Vaksinere ett sett med 1,5 mL LB + Amp kulturer for hver 10 replikaer (se 2.2.2). Vaksinere kulturer i 96 godt dyptgående brønn plater med plate replikator (som 2.1.3) og bakteriell koloniene fra 2.1.4 (figur 2C, venstre). Forsegle med pustende membran, vokse 20 h (37 ° C) med skjelvende.
      3. Frø 120 µL av en overnatting kultur til hver plate med en 6-og flerkanals pipette med justerbar tips avstand (figur 2C, høyre). Tørr plater avdekket i laminær strømning hette til all væsken har blitt absorbert. Ikke over tørr. Lagre plater over natten i romtemperatur.
  3. Synkronisering av C. elegans bruke hypokloritt behandling
    1. Beregne antallet dyr nødvendig for eksperimentet: minimum antall L1s nødvendig = (15-20 dyr/vel) (24 brønner/plate) (X plater/replikasettet)(Y replica sets).
      Merk: metoden replikasett krever flere dyr enn den tradisjonelle metoden. En 10 cm plate full av gravid ormer kan gi 20.000-50.000 L1 dyr avhengig av tettheten av gravid voksne. Tilsvarende gi 20 6 cm plater rundt ~ 30.000 L1 dyr. Planlegg å forberede et egg forberedelse som dobler minimum antall dyr nødvendig. Hvis befolkningen i forberedelse har sultet, nytt feed eller blings til en ny plate og at minst tre generasjoner på mat før du går videre17,18. Husk å fryse tilbake leftover L1s.
    2. Følge etter etter skritt 1.2 til 1.2.6 som den tradisjonelle metoden å få synkronisert L1 dyr. Frø 15-20 L1 dyr i hver brønn ved å en 6-og justerbar avstand pipette og reagens reservoaret ligner 1.2.7. Regelmessig bland L1 løsningen forhindre bosetting av dyr.
  4. Forebygging av avkom produksjon ved tilsetning av 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Følg trinn 1.3.1.  Forberede sterilt 50 x FUdR lager (se trinn 1.3.1.1).
    2. Når dyr nå L4, legger til 25 µL av 50 x FUDR i hver brønn på en 24-godt plate ved hjelp av en 6-kanals justerbar avstand pipette.
  5. Score levedyktighet
    1. Fjern ett sett av Repliker plater og flom brønner med M9 solution posten totale dyr per brønn, og trykk deretter forsiktig ikke dyr i hodet med en orm plukke (figur 2B). Dyr sviktende å flytte er scoret som døde. Forkast scoret plater. Registrere levedyktighet daglig.
      Merk: Dyr som brudd, Vis brutto morfologiske feil, ikke kan utvikle eller krøp opp på siden av brønnen er å bli sensurert av ekskludere dem fra både døde og totale verdiene.
      1. Registrere antall dyr som er sensurert i hver brønn på hvert tidspunkt separat fra de andre verdiene.
      2. Ikke scorer brønner som ikke har mat eller er forurenset (f.eks sopp eller Slim); slike brønner anses sensurert. Også sensurere et godt hvis alle dyrene vise morfologiske eller utviklingsmessige defekter. Registrere hendelsen sensur for denne RNAi klone/godt på dette tidspunkt.
      3. Etter scoring en Repliker plate, kaste den. Fortsette scoring en ny gjenskape sett hver dag til alle dyr over alle brønnene er død. For å redusere risikoen for scoring bias, eksperimentator må være blind for eksperimentelle forhold og tilsvarende må ikke referanse resultatene fra tidligere tidspunkt under scoring.
      4. Hvis alle dyr i et godt var døde på et gitt tidspunkt, så etter dagens scoring, undersøke om alle dyr har blitt scoret som døde for to ganger poeng for en gitt godt. I så fall er scoring levedyktighet ikke lenger nødvendig for at godt i gang poeng.
      5. Gjennomføre flere uavhengige eksperiment forsøk. Spore resultatene av påfølgende forsøk separat fra de forrige forsøk, med prøve nummer bemerket.

3. grafdata

Merk: Med replikasettet metoden en Kurvetilpasning brukes omtrentlig av mean og maksimal levetid. Parameterne for å vurdere C. elegans dødelighet passer en logit kurve19.  Som de fleste overlevelse verktøy ikke støtter logit kurve montering, utviklet et nytt program for plotting logit kurver (for replikasettet); Kaplan-Meier kurver (for den tradisjonelle metoden) støttes også.

  1. Komme i gang med programvaren. Dataoverføre det løslate zip arkiv for den nåværende versjonen (se Under materialer). Pakk ut zip-filen til en mappe. Se filen "viktig" inne utdraget brosjyre ytterligere installasjonsinstruksjoner.
  1. Starte inntegningsrekkefølgen grensesnittet. Finn plasseringen til mappen "koden" i mappen pakket ut fra zip-filen (f.eks  "/ Brukere/UserName /Desktop/WormLife/kode").
    1. Skriv inn følgende kommandoer i R konsollen, erstatter mappebanen bare identifisert. Trykk Angi eller returnere etter hver angitt linje: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. La tid for grensesnittet laste inn i et nytt vindu, bringe opp Standardskjermbildet som vist i figur 3A. La R kjøre i bakgrunnen.
  2. Formater som kommaseparerte verdier (CSV) eller tabulatordelt (TSV) filer. Angi kolonner og navn, avhengig av typen analyse. Se ekstra fil 4 (replikasett) og ekstra filen 5 (tradisjonell/Kaplan-Meier) for pre-formatert eksempeldata.
    Merk: Data angis i en "lang" format, dvs én rad per belastning/behandling per punkt per rettssaken. CSV-filer anbefales for best mulig kompatibilitet mellom plattformer.
    1. Fjerne rader tilsvarer observasjoner som ble hoppet over eller sensurert. Sjekk for fravær av manglende eller ikke-numeriske verdier, fordi det kan føre til en feil når dataene importeres.
    2. For tradisjonelle Kaplan-Meier stil analyse, ikke samle data fra uavhengige studier-komplott dem separat. Hvis replikasettet analyse, samle data fra flere studier, og deretter undersøke bruke funksjonen "TrialView" (se 6.3.3.4).
  3. Bruke inntegningsrekkefølgen grensesnittet
    1. Laste inn en datafil ("import" under "Fil"-menyen) ved å bruke dialogboksen. Åpne "CSV" filer, endre filtypen i miste ned til "CSV" (standard er ".txt/.tsv"), gå til mappen i datafilen. Her er filen replikasett eksempeldataene (ekstra fil 4).
      Merk: Importere en fil når dataset er allerede åpen erstatter gjeldende datasettet.
    2. Velg fil som skal importeres for å starte veiviseren for import, som går gjennom identifisere kolonnene i den valgte (Figur S1A for replikasettet). Hvis inndataene tilsvarer et replikasett eksperiment, velge "Logit" studie type.
      Merk: Import arbeidsflyt er forskjellig mellom replikasettet (Figur S1A) og tradisjonelle (Kaplan-Meier) (Figur S1B).
    3. "Plott data". Velg "Legg til linje" å begynne å plotte dataene. (En linje tilsvarer ett sett med betingelser. Finnes det funksjoner med eksperimenter hvor mange forhold ble testet).
      1. Tomt kontroll forhold-i eksempeldataene N2 (WT) med L4440 (tom vektor) RNAi er riktig. Velg "Legg til linje" under "Grafer"-menyen for å starte veiviseren Legg til linjen: Velg betingelsen plot og de grafiske parameterne for å representere linjen.
        1. Legge til en kurve til en annen tilstand manuelt, Gjenta 3.3.3.1
        2. Å endre farge eller tegne inn symbolet for en linje, velger du "Endre linjen" under "grafen menyen".
        3. For å fjerne en linje uten å tømme alle linjene, velger du "Slette linje" under "grafen menyen".
        4. Fjerne alle linjer i gjeldende plottet, velg "Fjern linje" under "grafen menyen".
        5. Hvis du vil overstyre automatisk valgt maksimalt x-aksen (tid) verdi, bruk "Angi X skala" under "grafen menyen".
          Merk: y-aksen (overlevende brøkdel) viser alltid 100% (øverst) til 0% (nederst) i trinn på 20%. X-aksen vises alltid i trinn 5. Akseetiketter tegnes ikke aktivere fleksibilitet i merking når handlingen bilder.
      2. Hvis du vil lagre JPEG-format bilder av vises tomten, bruk alternativet "Lagre tomten" i "fil-menyen"; bare gjeldende tomten lagres.
      3. For å lage personlige plott for mange forskjellige tilstander i et eksperiment, kan programvaren definere og plotte en "serien".
        Merk: Gjennomføringen av serien forbedrer effektiviteten når du arbeider med store eksperimenter.
        1. Hvis starter med et tomt tomt arbeidsområde, Legg linjene tilsvarer kontroll forhold som er å være konsekvent i alle tomter i serien (se 3.3.3.1).
        2. Definere serien med "Definere serien" i menyen i grafer. Velg en tilstand svarer til linjen for å vise først i serien; bare én kan velges. Velg grafiske parametre (linje farge og plot symbol) for linjen som 3.3.3.1.
        3. Gjennom tomter for ulike teste forholdene. Bytte visning av "serien linje" mellom bruke venstre/høyre pil-knappene på sidene i vinduet hovedhandlingen og øverste menylinjen (figur 3A-C).
          Merk: Hvis den merkede serie linjen er den samme tilstanden som en av de tidligere kontrollreferanse linjene, den nye linjen vises overlappet.
        4. Definere serien for å gjøre visse andre funksjoner tilgjengelig (lagre serien tomter og Trialview-se 3.3.3.4 for sistnevnte). Etter definerer en serie, bruker du alternativet «Lagre serien tomter» fra "Fil"-menyen for å lagre personlige tomten bildefilene for hver tomt i serien i en ny mappe.
      4. Trialview-visualisere resultatene fra uavhengige forsøk av et replikasett eksperiment. Hvis flere forsøk ble kjørt for én eller flere av de eksempler, tegn data fra personlige prøvelser og gruppert data fra alle forsøk separat for å vurdere overensstemmelse mellom uavhengige forsøk (se figur 3D).
        1. Definer en serie som beskrevet i 3.3.3.3. Forskjellige forsøkene plottes for hver av de "varierende" eksempel gruppene i et annet bilde over respektive prøvelser for angitte Referansekontrollen prøvene.
        2. For å spare TrialView bilder, gå til "Print TrialViews" i Data-menyen; et JPEG-bilde skal vises for hver tomt i serien.
          Merk: Eksempel resultatene i figur 3D er en sak med to studier.
    4. Median levetid sammendragstabellen for replikasettet data. Visuelt inspisere kurver for å sikre rimelig passer til dataene, og velg "sammendragstabellen" alternativet i Data-menyen for å lagre en tabell med median levetid verdier (tid på 50% overlevelse på logit kurve) for hver prøve.
  4. Statistiske evalueringer av dataene som genereres via metoden replikasett
    1. For statistisk analyse mellom to grupper fra en replika eksperiment, endrer og kjører et R skript, i utgivelsen zip-filen (se "WormLife statistisk analyse mal skript. R").
      Merk: Ferdigheter i R er ikke nødvendig å kjøre skriptet. Ytterligere dokumentasjon er på kommentarer i filen. Skriptet er klar for analyse av eksemplet replikasett data. Brukergenererte data i riktig format kan (se ekstra fil 4) også analyseres.
      1. Åpne filen i R (R GUI eller RStudio).
        Merk: Dette viser skriptet uten å kjøre den.
      2. Endre plasseringen av nødvendige filene tilsvarer hvor på datamaskinen.
        Merk: Disse filbanene må "kvalifisert" (i.e. bør inkludere komplett filplasseringen, inkludert).
        1. Endre banene (fil/mappe steder) for "wlDir" (plassering av katalogen), "dataFile» (replikasett datafilen analysere),"compFile"(spesifikasjon sammenligninger å kjøre, hvis aktuelt) og"outputPath"(der hvor resultatet filer vil bli skrevet til).
      3. Sett kolonnenavn i delen "Angi kolonner i datafilen" Hvis kolonnenavnene i filen analyseres er forskjellig fra eksempelfilen. Angi en kolonne for hver parameter. Hvis en studie har flere stammer, men ingen RNAi (eller annen behandling) omfatter en kolonne i datafilen med tomme oppføringer eller den samme for alle radene (f.eks "no_treatment", osv.).
      4. Sett parameteren "compFile". Hvis parameteren "compFile" er satt til NA, kjøres alle mulige parvis sammenligninger av grupper.
        Merk: En gruppe defineres av kombinasjonen av belastning/anleggspreg og behandling, som er sammensatt og vises som "strain_treatment". For større studier med mange grupper, er en CSV-fil angir sammenligninger tilgjengelig. Se eksempelfilen "comps_rsm_example.csv".
      5. Angi antall gjentakelser for Monte Carlo omsampling ("k.resamp", standard er 1000).
        Merk: P-verdiene 0 kan returneres når for noen gjentakelser utføres; i slike tilfeller er det riktig å rapportere "p < 0.01" (hvis k.resamp = 100), eller "p < 0,001" (hvis k.resamp = 1000), osv.
      6. Kjør skriptet: "kilde"-knappen i RStudio (øverst til høyre i redigeringsvinduet) eller "kildedokumentet" i menyen "Rediger" i R GUI. (Kjøring kan ta litt tid.)
      7. Når indikatoren R "opptatt" ikke lenger vises, åpner du resulterende katalogen-det vil være en tabell med resultatene av hver sammenligning (median overlevelse, p-verdier, % median levetid endring).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I utviklingen av noen nye metodikken er det viktig at den nye metoden viser akseptert resultater fra tidligere tilnærmingsmetoder og oppfyller standarden i et felt. Vi har tidligere vist empirisk at replikasettet og tradisjonelle metoder for assaying C. elegans levetid produserer lignende resultater20. Vill-type C. elegans (N2) opprettholdt på 20 ° C vanligvis bor mellom 20 og 25 dager, som med både tradisjonelle (figur 4A, svart linje) og replikasett tilnærming (figur 4B, svart). Dermed tilnærmet begge metodene rimelig vill-type levetid. Det er også viktig at en ny metode har oppløsningen å tallfeste nøyaktig endringer mellom testforhold og statistiske makt til å oppdage vesentlige endringer. I vår forrige undersøkelse oppdaget vi at Myc familie transkripsjonsfaktorer er determinanter av C. elegans levetid. mml-1 og mxl-2 kode C. elegans homologs av pattedyr Mondo A / karbohydrater svar element bindende protein (ChREBP) og Mlx, henholdsvis. Både C. elegans og pattedyr, disse Myc-familie medlemmer heterodimerize å regulere transkripsjon. Vi fant at tap av mml-1 eller mxl-2 betydelig reduserer normalt levetid, målt ved enten en tradisjonell levetid analysen eller replikasett (figur 4A-B, gul og rødbrun). I motsetning til MML-1::MXL-2 komplekset fant vi at tap av mdl-1 (homologe til pattedyr Mad) eller mxl-1 (Max) betydelig økt C. elegans levetid målt ved enten metodikk (Figur 4 lilla og blått, i begge paneler).

En alvorlig begrensning til den tradisjonelle tilnærmingen for å måle levetid er gjennomstrømning. Begge metodene er avhengig av bevegelse å ringe enten et dyr er levende eller døde, som blir stadig vanskeligere å vurdere. Ung dyrene vil gå gjennom en plate i fravær av stimuli, og er dermed enkle å score. Aldring C. elegans blitt stadig stillesittende men vil svare på en lett berøring i hodet av en tilbakeføring bevegelse på en plate. Men som dyrene blir eldre muligheten til å flytte bakover avtar og blir stadig ukoordinerte. Til slutt dyr bli lammet, en fenotypen sterkt ligner sarcopenia, og når scoring via den tradisjonelle metode levedyktigheten kan bare bestemmes ved å observere subtile twitch ekstreme fremre tuppen av dyret. Derimot når scoring levedyktighet via metoden replikasett, lagt væsken til brønnen, som fungerer som en stimulans som genererer en juling svar som kan kvantifiseres som en presentasjon av healthspan8. Bevegelse i væsken er lettere å observere for eldre dyr: kronologisk alder-matchet avfeldig dyr produsere subtile bevegelser av hodet på tørr plater, men en mer markert (riktignok sakte) kroppen bøy i væske. Til slutt, når scoring replikasett, hele brønnen er synsfelt (~1.1 cm i diameter) og alle dyr er i suspensjon slik at observasjon av alle dyr samtidig. I kontrast, når scoring en 6 cm plate via den tradisjonelle metoden, må en skanne gjennom hele plate - søker gjennom bakteriell plenen og langs kantene for dyr. Netto konsekvensen av disse forskjellene er at gjennomstrømningen når du bruker metoden replikasettet er minst en størrelsesorden større enn den tradisjonelle tilnærmingen, som gjør det mulig å kvantifisere samtidig endringer i levetid over mer enn 100 forholdene i ett enkelt eksperiment med en etterforsker. For eksempel fra en genomet-fôring-baserte RNAi widescreen vi tidligere identifisert 159 gener som var nødvendig for økt levetid av redusert daf-2 /insulin-lignende signalering8. I at analyse, vi kvantifisert endringer i levetid i vill-type, en lang levetid daf-2(e1370) mutant og kortvarige daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) dobbel mutant dyr (figur 5A), som tillot oss å dechiffrere den genetiske relasjoner mellom insulin-lignende signalisering og over 100 progeric gene inactivations. Videre vurdert vi hvordan disse progeric gene inactivations endret healthspan (på tiden kalt "activespan") ved å observere nedgangen i C. elegans juling over gjentak over tid (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: bruk av fôring basert RNAi føre til en epoke av gen funnet i aldring forskning, men de fleste gerogenes fortsatt dårlig studerte. (A) mange gerogenes ble først oppdaget fra storskala funksjonelle genomisk skjermene. Av de mer enn 900 C. elegans gerogenes oppdaget hittil, ble mange identifisert med fôring-baserte RNAi, fremheve verdien av funksjonelle genomisk tilnærminger i gen funnet. Diagrammet viser antall gerogenes oppdaget per manuskriptet bruker RNAi, basert på fenotypen merknad (se tabell av materialer) for fenotypen ontologi vilkår utvidet levetid, forkortet levetid og life span variant. Se ekstra fil 1 for den fullstendige listen over studier som oppdaget gerogenes. (B) de fleste gerogenes fortsatt dårlig studert. I kontrast til godt studert gerogenes som daf-16/FOXO (pil), som har mer enn 800 referanser, flertallet av gerogenes har færre enn 10 referanser (generell referanse-ikke nødvendigvis fokusert på levetid). Pålitelig høy gjennomstrømming metoder vil være avgjørende for å få større innsikt i genetisk Inter forholdet mellom gerogenes. Diagrammet er basert på tilordningene mellom publikasjoner i PubMed og C.elegans gerogenes RNAi fenotyper er oppdaget. Se ekstra fil 2 for den fullstendige listen over gerogenes og studier som er tilknyttet hver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Tradisjonelle og kopi Angi metoden for scoring C.elegans levetid (A). Den tradisjonelle metoden for scoring C. elegans levetid. Flere små synkronisert bestander av isogenic dyr per betingelse følges over tid. Samme populasjon av dyr følges gjennom studien. Levedyktighet vurderes av bevegelsen, som kan bli stimulert av mild prodding. Dyrene som ikke klarer å flytte scoret som døde og er fjernet (aspirasjon vises) gjenstår ingen levedyktig dyr. (B). The kopi satt metode for scoring C. elegans levetid. En stor bestand av alder-synkroniserte isogenic dyr fordeles på flere identiske Repliker plater. På hvert punkt, en enkelt gjenskape Scores: en mild bufferløsning (M9) legges, som stimulerer bevegelse. Dyr som ikke klarer å flytte spontant etter flom brønner er også vurdert touch stimulans. Hele scoring for eksperimentet bestemmes før starten. Hvert dyr er scoret bare én gang og levetid for større befolkningen er avledet fra mange uavhengige observasjoner. (C). The replikasett tilnærming er en høy gjennomstrømning metode for å måle kvantitativt C. elegans levetid. 100 eller mer selvstendige RNAi kloner kan spores samtidig. HT115 E. coli uttrykke dsRNA for en gitt RNAi klone vises. Praktisk talt er hver 24 prøver fra 96-brønns platen delt inn i en enkelt 24-vel-plate. Hver resulterende 24-vel plate har en negativ (i.e. tom vektor, rød godt) og positiv kontroll (grønn godt) fordelt tilfeldig i en samling av RNAi kloner (gul wells). Vanligvis inneholder den første brønnen (A1) i en samling som en tom vektor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: det grafiske brukergrensesnittet (GUI). (A). hovedhandlingen vindusgrensesnittet viser standard velkomstskjermen. Dette er hva som vises når du åpner. Forskjeller i utseende mellom plattformer bør være minimal bruk av en plattformuavhengig windowing toolkit. (B). oversikt over menyalternativene for miste-ned menyer tilgjengelig fra vinduet hovedhandlingen. (C). eksempel tomten utgang for begge replikasett stil (venstre) og tradisjonelle Kaplan-Meier stil (høyre) data. Dataene som vises ble samlet inn i uavhengige eksperimenter. Eksporterte tomter inkluderer ikke pre plottet akseetiketter, for maksimal fleksibilitet i å legge slike merkelapper. For å lette dette, er aksene alltid delt inn i intervaller på 20% for y-aksen, og trinn 5 for x-aksen. I dette eksemplet ble aksen og linje etiketter (belastning/behandling) lagt til de lagrede tomtene, med en svært enkel og vanlig bilderedigering verktøyet. (D). et eksempel på utdata fra funksjonen "TrialView", slik at den visuelle sammenligningen av resultatene av uavhengige forsøk for replikasettet stil datasett. Denne handlingen viser resultatet mellom to ulike forsøk og tilsvarende grupperte resultater for daf-2 EV(RNAi) (blå, lukket sirkler), N2 EV (RNAi) (svart, lukket sirkler) og daf-2 med daf-16 (RNAi) (rød, åpne diamanter). TrialView gir raskt sjekke prøveversjon-spesifikke data problemer som kan påvirke kvaliteten på passformen til den grupperte datasettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: den tradisjonelle og replikasett produserer lignende resultater. Tap av enten del av MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) heterodimer øker levetiden. I kontrast, tap av enten del av MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) reduserer levetiden dette tallet er gjengitt fra referanse20 med tilgang via en Creative Commons Attribution (kopi av) lisens (se materialer). (A). Kaplan-Meier resultater med den tradisjonelle metoden. (B). Logit kurve med metoden replikasett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Replikasettet metoden kan dechiffrere genetisk interaksjoner basert på endringer i levetid (A) og endringer i healthspan (B) for over 100 RNAi kloner samtidig. Dette tallet er gjengitt fra8 med tillatelse under Creative Commons Attribution-ikke-kommersielle 4.0 International lisens (CC-BY-NC) (se materialer). (A) genetisk levetid analyse av progeric genet inactivations i forbindelse med redusert insulin-lignende signalering (ILS) (daf-2, x-aksen) og i fravær av daf-16/FoxO (y-aksen), en sentral transcriptional effektor av ILS21 . Genet inactivations med lignende funksjoner som daf-16 forkorte ikke ytterligere levetiden i fravær av daf-16 (svarte prikker). Genet inactivations funksjoner helt uavhengig daf-16 forkorte både genetisk bakgrunn tilsvarende (grå). Genet inactivations hvor negativt effekten på levetid i daf-2 > daf-2, daf-16, foreslår funksjonen parallelt (hvit). (B) endringer i juling priser over tid kan avlede den gjennomsnittlige healthspan for mange genetiske forstyrrelser (x-aksen) samtidig vurdere endringer i levetid (y-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Finne S1: arbeidsflyter i WormLife. Illustrasjon av trinnene av noen guidet arbeidsflyter (noen ganger kalt "veivisere"). I hvert av disse tilfellene, etter det siste trinnet i arbeidsflyten, returneres fokus tilbake til vinduet hovedhandlingen. (A) data import arbeidsflyt for replikasettet stil datasett (B) data import arbeidsflyt for tradisjonelle Kaplan Meier stil datasett. (C) arbeidsflyten for å legge til linjer i et plott for replikasettet stil datasett. (D) arbeidsflyten for å legge til linjer i et plott for tradisjonelle Kaplan Meier stil datasett. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra fil 1: studier som har identifisert gerogenes. Ankomsten av fôring-baserte RNAi førte til en tid av gen funnet for fenotyper som ikke var tett arvelighetsforskning fremover, inkludert aldring. Listet, er i antall gerogenes oppdaget, uavhengige studier som identifiserte gener der aktiviteten endret levetid. Merk at studien identifisert de gerogenes utnyttet Repliker set-metode8. Natur hvor genet inactivations endret levetid er også indikert: lang levetid og progeric gener er de som økt eller redusert levetid når inaktiv, henholdsvis. "Levetid variant" refererer til tilfeller der retningen for endring (dvs. økt eller redusert levetid) er ikke angitt eller har ikke vært kuratert. Data fra WormBase WS262 (januar 2018) (se materiale), med tillegg av RNAi behandling levetid resultater fra referanse10, som ennå ikke er inkludert i samlingen kuratert WormBase RNAi fenotyper. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra fil 2: antall studier knyttet til hver gerogene. De fleste gerogenes er dårlig studerte. Mens noen gener, som daf-16/FoxO, har vært gjenstand for mye forskning oppmerksomhet, har mer enn 400 gerogenes færre enn 10 tilknyttede publikasjoner. Data fra WormBase WS262 (januar 2018), med tillegg av RNAi behandling levetid resultater fra10 som ennå ikke er inkludert i samlingen kuratert WormBase RNAi fenotyper. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra fil 3: utarbeidelse av felles reagensene C. elegans eksperimenter. (A). oppskrift på standard NGM og RNAi plater. (B). oppskrift for M9 buffer og hypokloritt løsning. (C). forberedelse av LB + Amp/Tet plater. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra fil 4: replikasett eksempeldataene. Et eksempel datasett fra et replikasett levetid eksperiment. Dataset allerede er formatert for å være egnet for import/analyse. Inkluderer to studier per betingelse (kombinasjon av belastning/anleggspreg og RNAi). Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra fil 5: tradisjonell langsgående eksempeldataene. Et eksempel datasett fra en tradisjonell langsgående levetid eksperiment, med høyre-sensur, formatert for klar import/analyse bruker Kaplan-Meier overlevelse tomten funksjonalitet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Både tradisjonelle og kopi angi metodene krever synkronisering av kronologisk alderen dyr. Vi inkluderer en metode som synkroniserer dyr med hypokloritt behandling av gravid voksne, hvor bare befruktede egg med gravid voksen overleve behandling. Disse Foster klekkes i flytende suspensjon og developmentally arrestere på første larvestadiet (L1). Etter seeding L1 dyr til mat (f.eks E. coli uttrykke dsRNA til en genet av interesse), gjenoppta dyr utvikling. Synkronisere L1 dyr av hypokloritt behandling av gravid voksne har fordelen at leftover unseeded L1 dyrene kan være frosset og lagret på ubestemt tid i flytende nitrogen eller-80 ° C fryser. Et utvalg av hver stamme ved eksperimentelle oppsettet beholdes på denne måten skaper en verdifull ressurs for fremtidige studier og forbedre reproduserbarhet. Men mens hypokloritt behandling av gravid voksen dyr er en vanlig måte å få synkronisert dyr for aldring forskning22, er L1 arrestasjonen sult svar. Dermed foretrekker noen laboratorier enten å tillate klekking på plater, eller å avkall hypokloritt behandling helt og tillate noen gravid voksne å legge egg i flere timer (dvs. et egg lå). I sistnevnte tilfelle, foreldre fjernes og avkom levetiden etterfølges. Til best av vår kunnskap, er ingen åpenbare forskjeller i levetid rapportert mellom dyr som ble synkronisert i M9, klekket ut på plater eller avkom fra et egg lå. Men gitt at endringer i nærings tilgjengelighet er nært knyttet til endringer i levetid, er det prioritet at bestemte genetisk bakgrunner kan produsere ulike resultater mellom disse synkronisering tilnærminger. En mer forsiktig analyse må løse dette teoretisk bekymring.

Uansett hvilken metode som brukes til å synkronisere befolkningen Start, må skritt tas å enten hindre avkom produksjon eller skille synkronisert Start befolkningen fra fremtidige avkom. I vår protokollen, vi skissere bruke FUdR til å hindre avkom produksjon, som skiller dyr er ikke et levedyktig alternativ for replikasettet metoden. Det er også mulig å forhindre avkom produksjon genetisk ved hjelp av en feminized genetisk bakgrunn (f.eks fer-15(b26);fem-1(hc17), som er en temperaturen-avhengige sterilt belastning23). Men ingen er uten mangler: bruk av genetisk bakgrunn kan komplisere påfølgende analyse, og i noen genetiske bakgrunner FUdR kan endre levetid24,25,26.

Som et alternativ til å forebygge avkom betyr produksjon gjennom kjemiske eller genetisk, voksen dyr kan flyttes med jevne mellomrom til frisk RNAi plater å isolere dem fra deres avkom. Dette forenkler bakgrunn hensyn på bekostning av gjennomstrømning. Jevnlig flytte dyr til fersk mat har flere fordeler av forhindrer mulig sult og fornye eksponering for dsRNA. Men noen genetiske interaksjoner som påvirker levetid ble bare oppdaget når avkom produksjon var hemmet: tidlig analyse av TGFβ veien for en levetid fenotypen feilaktig konkludert med at redusert TGFβ signalering påvirket C. elegans dauer formasjon men ikke aldring27,28. Imidlertid avslørte en oppfølging studie som brukes FUdR som redusert TGFβ signalering økt levetid gjennom insulin signalering29. Hvorfor tidligere studier klarer å se økt levetid i TGFβ mutant dyr? TGFβ veien mutasjoner produsere en liten egglegging defekt (egl) og utvide reproduktive levetid, som forårsaker interne klekking Progeny senere i livet som dreper foreldrene. Det er sannsynlig at varige TGFβ mutanter syntes å ha et normalt levetid på grunn av egl fenotypen drept dyrene rundt når vill-type dyr normalt dø. Dette kan være relevant for andre genetisk trasé knyttet til DR, som starved vill-type dyr også manifestere en egl fenotype, kanskje som en adaptiv overlevelse fordel å avkom under forhold med lite mat. Dette understreker underliggende kompleksiteten i adaptive svar dyr gjennomgå under stress forhold, og behovet for forsiktig analyse og vurdering når du utformer levetid eksperimenter.

I å utforme og gjennomføre levetid eksperimenter av disse metodene er det avgjørende å unngå bias. Eksperimenter må utføres på en dobbel-blind måte: hvordan prøver ble tidligere scoret på tidligere tidspunkt og identiteten til en testvilkår må være ukjent for eksperimentator. Videre er det alltid nødvendig å inkludere både positive og negative kontroller; ved metoden kopi sett er disse tilfeldig inn i en 24-vel plate. E. coli uttrykke en plasmider som ikke inneholder insert med sekvensen er tilsvarer C. elegans genom tom vektor negative kontrollen (dvs "L4440"-se materialer). Positiv kontroller er avhengige av spesifikke natur et eksperiment. For eksempel, daf-2 koder C. elegans insulin/IGF-1 reseptoren og daf-2 inaktivering via fôring-baserte RNAi øker robust levetiden minst to ganger i vill-type dyr27. Dermed kan daf-2(RNAi) tjene som en positiv kontroll når du ser på gene inactivations som øker levetiden. Omvendt, daf-16 koder FOXO transkripsjon faktor orthologue30. DAF-16 er en viktig del av mange levetid paradigmer og vill-type dyr (N2) behandles med daf-16(RNAi) er korte bodde og viser tegn til progeria31.

Den primære fordeler av tradisjonelle langsgående levetid tilnærming er at det er godt etablert, og eksperimenter er lett å konfigurere. Relativt få dyr er nødvendig på kun plater for hver testvilkår. Dermed kan stammer som vokser dårlig eller kreve balancers overføres lett testes. Den tradisjonelle tilnærmingen er meget tilpasningsdyktig og kan brukes med noen av de tilgjengelige tilnærmingene til håndtering avkom produksjon, inkludert behandling med FUdR, krysset inn feminized genetisk bakgrunn eller jevnlig flytte voksen dyr til nye plater i egg-legging perioden. Mens flytte dyr sterkt reduserer gjennomstrømning, arbeider med en mutant bakgrunn er aldri ideelt, og selv om FUdR ikke endrer vill-type levetid32,33,34, kan det påvirke levetiden og alder relaterte fenotyper i noen genetiske bakgrunner35,25,26. Merk at tilstedeværelsen av menn, selv med bruk av FUdR, vil betydelig redusere Hermafroditt levetid13, dermed en plate som inneholdt menn etter hermafroditter nådd L4 er ubrukelig. Likeledes er analyse gjennom Kaplan-Meier estimator og tilknyttede kurver og logg-rank test, godt etablert for dødelighet. Det er imidlertid flere ulemper til tradisjonelle levetid analyse. Gjentatt håndtering av plater (i.e. utsette platene til luft) forenkler innføring av luftbårne fungal smitte. I tillegg gjentas poking kan skade eller drepe dyr, spesielt som befolkningen avanserer inne alderen og bli skjør. Eldre dyr bli stort sett lammet og fast i E. coli, mens E. coli blir en opportunistisk patogen (kolonisering av lumen og pakking pharynx)36. Svært gamle levende dyr kan bare bli identifisert av subtile bevegelser av hodet. Dermed er det lett å klassifisere avfeldig levende dyr som døde. Til slutt, den tradisjonelle tilnærmingen er begrenset av gjennomstrømning.

Metoden replikasettet er høy gjennomstrømning og kvantitativ. Ulempen med denne metoden er imidlertid en større investering av tid og ressurser i den installering. En middels stort eksperiment for å undersøke 100 RNAi kloner over 20 tidspunkt krever 30.000 L1 dyr (hvor omtrent 15 dyr er undersøkt per RNAi klone per punkt), som mens lett for de fleste stammer, kan være problematisk i noen tilfeller. For eksempel uten en stor-partikkel sorter ("ormen sorter") stammer som må være med balancers eller transgene linjer med undersøkes en dårlig overført ekstra chromosomal matrise ikke lett av denne metoden. En andre ulempen er at avkom produksjon må bli hemmet, som krever bruk av FUdR eller feminized genetisk bakgrunn. Til slutt, en må vite hvor lenge analysen kjøres, som man må forberede et replikasett for hvert punkt i begynnelsen av eksperimentet. Fordelene med denne metoden er imidlertid mange. Fremst scoring levedyktighet er mye raskere og en enkelt kan følge dyr over 100 testforhold samtidig (dvs. RNAi kloner). Siden et replikasett er bare scoret en gang deretter forkastet, det er ingen gjentatte håndtering av plater eller poking av dyr, som reduserer sannsynligheten for fungal smitte og eliminerer dødelighet som skyldes den sporadiske grov prodding med en orm plukke. Videre forenkler tillegg av væske brønnen sterkt scoring. Frigjøre gamle dyr fra platen og rundt bakterier bistår i å la små bevegelser av hodet å bli lettere scoret. Tillegg av væske gir også muligheten til å måle juling priser som et mål på fitness (f.eks healthspan8,37).

Aldring er et sammensatt fenomen som involverer flere kausale mekanismene som krever bruk av systemer biologiske metoder å rakne. Disse tilnærmingene ofte innlemme datadrevne modellering, med store datamengder genomisk/transcriptomic, og krever komplementære robust og høy gjennomstrømming metoder å måle levetid og healthspan. Metoden for høy gjennomstrømming replikasett vil tillate sammenligning av mange RNAi kloner langs, samtidig som satsvise effekter og tekniske feil, dermed tilrettelegge for utvikling av dynamiske modeller som kan antyde samspillet mellom kausale stier i en kvantitativ måte. I tillegg er integrering av flere genomet hele genomics tilnærminger med metoden replikasettet mulig fordi en stor bestand av alder-synkroniserte dyr er delt inn i flere små bestander.

Andre metoder er tidligere utviklet for å forbedre gjennomstrømningen C. elegans levetid eksperimenter, ofte fokuserer på å tilpasse den tradisjonelle langsgående tilnærmingen (dvs. etter samme sett med dyr over tid) til automatisk observasjon og innspilling med vanlige flatbed scannere38,39, eller mer spesialisert utstyr som microfluidic plater40. De skanner tilnærmingene bruker lys som en stimulans og sammenligne sekvensielt bildene for å finne levende/dead status basert på bevegelsen for flere plater samtidig; Mens disse ikke krever proprietære vitenskapelige maskinvare, kan det hende at tiden involvert i å sette opp arbeidsflytene betydelig avhengig av ønsket skala. Alternativt tillate levetid eksperimenter i egendefinerte microfluidic-enheter inngående fenotypiske karakteristikk av enkelt dyr over tid og uten behandling å forhindre avkom, men nødvendiggjøre fabrikasjon av microfluidic platene og oppkjøp tilknyttede microfluidic pumper og bildebehandlingsutstyr. Derimot kan metoden replika i kombinasjon med programvaren beskrevet her, sterkt forbedret ytelse ved hjelp av verktøy som allerede er felles i laboratorier arbeider med C. elegans.

WormLife programvaren vil bli bedre i fremtiden for å tilby enklere tilgang til statistisk sammenligning og kompatibilitet med flere plattformer. Nyeste dokumentasjonen for programmet finner du på GitHub side, inkludert installasjonsinstruksjoner for plattformer som programvaren har blitt testet. En web-basert versjon vil også bli utviklet for å aktivere enkel tilgang uten å måtte installere programvare.

I sammendraget gir kombinasjonen av metoden replikasettet og fritt tilgjengelig programvare finnesher en kraftig plattform for bedre gjennomstrømming og robusthet levetid eksperimenter og et bredt spekter av overlevelse-baserte analyser (f.eks stress toleranse, toksikologi studier, healthspan, etc.). Spesielt når kombinert med funksjonell genomforskning, gjør denne tilnærmingen de mange fordelene av metazoan modellen C. elegans for å tyde mylderet av genetisk interaksjoner som bidrar til utviklingen av aldring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Midler til dette arbeidet som beskrevet i dette manuskriptet ble levert av: Universitetet i Rochester Office of The Provost og School of Medicine og Dentistry Dekanus kontor via Health Sciences Center for beregningsorientert innovasjon (HSCCI); Ellison medisinsk Foundation nye forskere i aldring fellesskap (AG-NS-0681-10) vil Oppdragsgivers ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).

Tags

Genetikk problemet 136 aldring levetid overlevelse analyse C. elegans høy gjennomstrømming statistisk analyse av kvantitative fenotyper programvare
Metoden sett replika: En høy gjennomstrømming tilnærming til kvantitativt mål <em>Caenorhabditis elegans</em> levetid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornwell, A. B., Llop, J. R.,… More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter