Summary
在这里, 我们描述了复制集方法, 一种定量测量C. 线虫寿命/生存和 healthspan 的方法, 以高通量和健壮的方式, 从而允许筛选许多条件而不牺牲数据质量。该协议详细介绍了策略, 并提供了用于分析副本集数据的软件工具。
Abstract
复制集方法是一种以高通量方式定量测量秀丽线虫的寿命或存活的方法, 从而使单个调查人员能够在相同数量的时间内筛查更多的治疗或条件。没有数据质量损失的时间。这种方法需要在大多数实验室中发现的常见的设备与C. 线虫, 因此是简单的采用。该方法的中心是在每个观察点上对一个种群的独立样本进行化验, 而不是随着时间的推移与传统的纵向方法进行抽样。评分需要在多井板块的井中加入液体, 这会刺激C 线虫移动并促进量化 healthspan 的变化。复制集方法的其他主要好处包括减少琼脂表面暴露于空气中的污染物 (例如霉菌或真菌), 对动物的最小处理, 以及对零星错误评分的鲁棒性 (例如, 当动物仍然活着)。为了对副本集样式实验中的数据进行适当的分析和可视化, 还开发了一种自定义软件工具。该软件的当前功能包括绘制副本集和传统 (卡普兰) 实验的生存曲线, 以及副本集的统计分析。这里提供的协议描述了传统的实验方法和副本集方法, 以及对相应数据分析的概述。
Introduction
在了解衰老的遗传基础方面, 最具变革性的技术进步之一是在1线虫中发展基于喂养的 rna 干扰;在实验性地使用 rna 干扰之前, 许多衰老的表型不是遗传的。以喂养为基础的 rna 干扰是通过生产大肠杆菌中的 dsRNA 与内源c. 线虫mRNA: IPTG 诱导双向转录跨插入的任何c. 线虫cDNA 或一部分的在质粒2中打开阅读框架。当C. 线虫饲料在完整的大肠杆菌,由细菌产生的 dsRNA 通过 SID-2 跨膜蛋白3从流明传输到肠道细胞, 然后通过 SID-14分布到其余的动物。在每个细胞内, 外源 dsRNA 由 Dicer 复合体处理成 siRNA, 通过互补基配对与成熟的 mRNA 相互作用, 创建一个新的 siRNA-mRNA 双工。这种双工是由 RISC 复合体和劈裂的, 从而降解内源 mRNA5。因此, 仅仅改变质粒的插入, 你就可以使几乎任何基因在线虫基因组中的功能失效。这一发现导致了几个大的基于喂食的 rna 干扰库的创建--转化的大肠杆菌种群的集合, 可以结合起来以达到约86% 已知的C. 线虫基因的覆盖率6,7。
自从饲养基 rna 干扰的推进, 在C. 线虫的全面屏幕导致发现了900多个基因, 改变生命的灭活时 (由 WormBase 的 rna 干扰-表型协会证明), 我们提到为 gerogenes。大多数 gerogenes 在长寿控制中的作用是在一些精算报告中发现的, 通过喂食为基础的 rna 干扰 (见图 1A和补充文件 1的细节)。在某些情况下, 这些 gerogenes 是根据在单个或几个时间点测量生存能力而确定的, 这不能为使用 rna 干扰治疗的寿命变化提供可量化的衡量标准。在其他情况下, 这些基因已经定量地评估了寿命的变化, 以及其他年龄相关的表型。例如, 我们以前确定了159种基因, 对正常和增加的动物寿命都是必要的, insulin/IGF-1 信号减少, healthspan 的量化变化。其中, 103 基因 inactivations 导致 progeric 表型, 因为损失导致一个或多个过早衰老的迹象8。
虽然有些 gerogenes 与100项或更多的研究相关 (例如 daf-16、daf-2、sir-2.1), 但超过 400 gerogenes 有10或更少的引文 (图 1B和补充文件 2)。因此, 虽然综合饲料基 rna 干扰屏幕发现和马虎的特点数以百计的假定 gerogenes, 如何这些基因在长寿控制中的作用, 这些基因产品之间的遗传关系仍然很差研究。对年龄相关表型的全纵向分析是确定 gerogenes 之间的基因相互作用 (如上位相互作用、asynthetic 相互作用等) 的先决条件。深入了解 gerogenes 之间的遗传相互关系需要一种高通量定量方法, 这也利用了基于喂养的 rna 干扰的优势。
衰老最常见的替代措施是寿命。传统的测量C. 线虫死亡率的方法是在一小部分人口样本中追踪个别动物的死亡情况。随着时间的推移, 动物数量相对较少, 并且周期性地用铂丝或睫毛轻轻地戳, 以运动作为生存能力的指示器 (图 2A)。这种方法得到了广泛的应用, 因为它提供了直接的平均值和最大寿命的测量。然而, 这种传统的方法是耗时和相对较低的吞吐量, 这限制了动物的数量和条件, 可以同时测量的控制方式。最近的一项模拟研究发现, 许多C. 线虫寿命研究并没有对足够数量的动物进行检测, 从而能够可靠地检测出条件9之间的细微变化。此外, 这种传统的方法包括反复处理同一队列动物随着时间的推移, 这反过来可以引入污染, 并可能损害或杀死越来越脆弱, 衰老的动物。
我们开发了一种替代的 "复制集" 方法来测量C. 线虫的寿命。为此, 大量人口的年龄同步, 等基因系动物被划分成少数人口 (或复制品)。生成的副本样本足以覆盖计划实验中的每个时间点。在每个观察时间点, 其中一个副本是为生存, 死亡和被截断的动物的数量得分, 然后动物在复制被丢弃。因此, 在整个人口的预期寿命内, 一系列独立的亚群定期取样 (图 2B)。在使用副本集, 没有重复的刺激动物, 并没有重复暴露在潜在的环境污染。在同一时间点观察到的生存能力完全独立于其他所有观察, 这将最大限度地减少处理和提高吞吐量。这使得我们能够定量8,10的上百个 rna 克隆的寿命变化。
在这里, 我们提出了通过复制集和传统的方法来进行c. 线虫寿命的详细协议, 以评分c. 线虫长寿。我们证明了相似的结果在方法之间得到。我们开发了软件, 以协助对通过任一方法生成的寿命数据进行图形分析, 我们可以根据 GPL V3 许可证免费提供这些信息 (见材料表)。"WormLife" 是在 R11中编写的, 包括图形用户界面 (GUI), 用于绘制数据, 该接口已在 Mac OS 和 Linux 中进行了测试。最后, 我们比较和对比了每种方法的局限性, 并强调在选择方法来测量线虫寿命的定量变化的其他因素。
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Protocol
1. 传统的线虫寿命评分方法
- 试剂的制备
- 通过基于喂养的 rna 识别基因进行灭活。购买已转换的 HT115大肠杆菌2的股票, 其中含有对利益的 rna 克隆。另外, 亚克隆的基因 cDNA 的 multicloning 的 L4440 质粒的网站。
注: HT115 是一种 RNase III. 型大肠杆菌菌株, IPTG 诱导 T7 聚合酶活性, 用于防止细菌中 dsRNA 的降解。对于不使用基于喂养的 rna 干扰的寿命研究, 可以使用标准 NGM 板上的 HT115 或 OP50大肠杆菌. - 为每个测试条件准备 3–6 (或更多) 6 厘米的 rna 干扰板 (配方的补充文件 3 )。在细菌播种4摄氏度前, 将 rna 干扰盘贮存到几个月。
- 一夜之间生长转化为大肠杆菌(16–20 h, 37 °c 震动孵化器在 180–220 RPM)。
注: HT115大肠杆菌生长在 LB 与氨苄西林 (50 毫克/毫升)。标准 OP50大肠杆菌是不耐药性的, 并在没有氨苄西林的情况下生长。区域性体积取决于板块的 #, 但通常介于8到100毫升的磅之间, 这取决于实验设计。- 在台式离心机中, 用 3000 x g离心法浓缩细菌, 15–20分钟。吸入上清液, 并在 1/第十起始容积 (即10x) 磅与氨苄西林 HT115 (或无氨苄西林标准 OP50) 中重新悬浮颗粒。
- 整除200µL 的浓缩10x 细菌, 每6厘米板。准备3–4复制每个测试条件, 有2个额外的备份板, 用于在发生污染的情况下使用。在准备盘子的时候, 给它们贴上标签, 这样实验者就可以用颜色代码或类似的编码方案来检测试验条件。确保记录了代码。
- 在清洁的环境中, 如层流工作台, 允许打开的盘子干燥, 直到所有液体被吸收或允许盖板在工作台上一夜之间晾干。在干燥时监测板材, 以确保琼脂干燥而不过度干燥。
注意: 过度干燥的板块导致的琼脂开裂, 将导致C. 线虫的洞穴进入琼脂。湿琼脂表面也促进穴居。
- 将干燥的盘子在一个蠕虫盒子里过夜 (高达24小时) 在室温下, 以允许 dsRNA 生产。经过1天的 RT, 储存板在4°c 2 周, 在一个密封的拉链袋 (以防止板材干燥)。使用前, 返回板在拉链袋内的室温, 以防止冷凝从引入空气中的真菌污染物。
- 通过基于喂养的 rna 识别基因进行灭活。购买已转换的 HT115大肠杆菌2的股票, 其中含有对利益的 rna 克隆。另外, 亚克隆的基因 cDNA 的 multicloning 的 L4440 质粒的网站。
- 用次氯酸盐处理C. 线虫的同步
注: 参阅 M9 和次氯酸盐溶液配方的补充文件 3 。- 用 M9 收集妊娠成年动物。使用插入的玻璃吸管移动到 2x 15 毫升管。
- 旋转管为 30 "在2000转每分钟。检查管底部的线虫池。吸入上清液。用 M9 溶液清洗两次, 重复旋转和吸入。
- 在4毫升的 M9 中重新悬浮C 线虫。加入2毫升次氯酸盐溶液。立即旋涡为 ~ 3 分钟, 周期性剧烈晃动。3分钟后, 在解剖显微镜下寻找卵云。漩涡一个额外的 10–20 s, 如果鸡蛋没有被释放后3分钟。
注意: 时间的次氯酸钠治疗是必不可少的。卵子内的妊娠成人是什么生存治疗。在3分钟后, 怀孕的成年人打破开放, 鸡蛋溢出。然而, 如果鸡蛋是在次氯酸盐溶液太长后释放, 他们将死。反之, 如果妊娠成年人不留在次氯酸盐溶液足够长的时间, 没有鸡蛋将被释放。 - 用 M9 溶液快速清洗两次, 如步骤2.1.2。
- 在3毫升 M9 中重新悬浮线虫卵颗粒, 并转移到一个新的15毫升管。允许胚胎在3毫升的 M9 溶液中过夜, 旋转20摄氏度。
- 计算每µL 的 L1 动物 (或胚胎) 的密度, 方法是在6厘米的盘子上滴下10µL L1 溶液 3x, 并计算 L1 动物的数量以计算 L1s/µL 的平均数量。
注意: L1 动物会随着时间的推移而安定下来。因此, L1 解决方案应定期混合。 - 每片种子 50 L1 动物。用橡皮筋将板材和密封件倒置。把盘子放在塑料蠕虫盒子里。密封盒在一个大的拉链袋。移动到20摄氏度孵化器。
- 通过添加 5-氟-2 '-脱氧尿苷 (FUdR) 防止后代生产
- 种植动物直到 L4 阶段在20°c。检查同步动物是否已经发展到 L4 大约40小时后播种 (步骤 2.1.7)。
注:线虫发育时间在不同温度下变化12 , 变异动物的生长速率必须经过实证检验。- 添加160µL 50x FUdR 到每6厘米板与 L4 动物。
注意: 在 L4 阶段添加 FUdR 是非常重要的。为方便起见, 通过将1克 FUdR 分解成10毫升超纯 H2o FUdR 过滤消毒库存 FUdR 与0.2 µm 过滤器和 10 cc 注射器, 使1,000x 库存。整除 ~ 1 毫升的库存进入无菌1.5 毫升管。冷冻并贮存在摄氏-20 摄氏度。
- 添加160µL 50x FUdR 到每6厘米板与 L4 动物。
- 检查板材是否存在雄性线虫.移除所有雄性。
注意: 寿命通常是测量雌雄同体而不是雄性。雌雄同体说, 即使在 FUdR13的存在下, 伴侣的寿命也比未交配动物短。雄性更小, 更薄, 然后雌雄同体, 可以很容易地识别出一个独特的钩尾14。 - 把盒子放回拉链袋里。返回20°c 孵化器。
- 种植动物直到 L4 阶段在20°c。检查同步动物是否已经发展到 L4 大约40小时后播种 (步骤 2.1.7)。
- 评分可行性
- 通过用铂丝或睫毛轻轻地接触头上的动物, 每天都能获得生存能力。得分的动物, 不能移动作为死亡和删除他们从板块 (图 2A)。记录每个观测时间点的每个条件所观察到的死数。
注: 为了降低评分偏差的风险, 实验者必须保持对实验条件的盲目, 同样不能在评分过程中引用以前时间点的结果。 - 检查动物的破裂, 死于其他明显的发展缺陷, 或爬行的一侧的菜: 删除这些动物和记录的数字在每个观察到的时间点, 以考虑在统计分析。此外, 如果发现雄性, 取出它们并记录观察到的数字。
- 每天重复从步骤1.4.1 直到没有动物活着。
注: 如果大肠杆菌的草坪明显减少或真菌开始生长在盘子上, 转移所有剩余的动物到一个新鲜的盘子与适当的 rna 干扰和 FUdR。
- 通过用铂丝或睫毛轻轻地接触头上的动物, 每天都能获得生存能力。得分的动物, 不能移动作为死亡和删除他们从板块 (图 2A)。记录每个观测时间点的每个条件所观察到的死数。
- 数据分析. 制图和统计
- 在支持生存分析的软件中输入或打开记录的观测数据与非参数的卡普兰-梅尔估计15和日志等级测试16 (参见补充文件 3)。一定要包括被截断的动物。不要包括被观察到的雄性, 如果有的话。
注意: 数据格式可能会因软件而异, 但通常的格式是记录在单独一行上观察到的每个单独的动物。动物被观察为死的实验 timepoint 是 "事件" 时间。如果被审查, "事件" 时间是动物被审查的 timepoint。通常有一个字段或复选框来指示被审查的观察。 - 剧情卡普兰-Meier 生存曲线。如果对多个条件进行了测定以提高可读性, 则为单个绘图选择少于六个条件。
- 检查是否存在视觉上明显缺失的观测、意外的控制结果等数据问题.-在统计分析之前处理这些问题。
- 使用软件中的日志级测试功能执行配对的统计比较。确保对被审查的结果的任何可用选项都适当地设置为右截尾数据。
- 在支持生存分析的软件中输入或打开记录的观测数据与非参数的卡普兰-梅尔估计15和日志等级测试16 (参见补充文件 3)。一定要包括被截断的动物。不要包括被观察到的雄性, 如果有的话。
2. 用副本集法对线虫长寿进行评分
注意: 虽然传统的方法需要3–6板的每个条件 (见 1.1.2), 副本集方法需要更多的 (请参见下面的步骤 2.2.2)。传统的方法是在整个实验中遵循同一板块的动物 (图 2A)。相比之下, 与副本集动物只得分一次: 许多相同的复制是建立在实验的开始, 以便一个复制在每个时间点 (每次试用) 得分 (图 2B)。
- 库设置。
注: 有关处理 rna 干扰克隆的其他详细信息, 请在这里介绍, 因为复制集协议可以同时得分许多 rna 克隆, 并且一次可缩放到100多个克隆。在96井格式板材中保持甘油类的储存, 将 rna 克隆的集合保留下来。副本集实验使用24井板。每个井是一个不同的测试条件, 这可能对应于一个收集的 rna 克隆, 不同的化学处理, 动物菌株, 等等。- 装配 sublibrary 的布局, 以收集 rna 克隆, 以便满足以下条件:
- 确保在96井集合内, 以及 A1 是一个空的矢量负控制。
- 在每24口井中随机插入额外的空矢量控制。
- 将96井板拆分成24井块, 这样每个24井板都有一个随机插入的负控制 (图 2C)。
- 在每组24井中随机插入一个正控制 (图 2C)。
注意: 正则控制依赖于实验问题。例如, 当查看增加寿命的 rna 克隆的集合时, 通常会包括2 (rna 干扰) 。反之, 当寻找缩短寿命时, 16 (rna 干扰)经常被使用。
- 装配 sublibrary 的布局, 以收集 rna 克隆, 以便满足以下条件:
- 副本集的准备
注意: 所需的复制数等于最小时间点数 (图 2B)。一个人必须知道在实验开始之前测量寿命的时间, 以及评分频率 (例如, 每隔一天得分40天的副本集实验需要准备至少20个副本集, 以便实验开始时的每个条件)。最好是制作5额外的备份集 (请参见下面的2.2.2 和 2.2.2.3)。- 要创建一个新的标记的 rna sublibrary, 接种200µL 磅 + 安培每井在96井格式 (600 µL 板) 使用96针板复制器通过以下步骤:
- 将96针板复制器按顺序浸入50% 漂白剂、超纯 H2O 和乙醇中。保持针脚浸泡至少三十年代的漂白剂和乙醇步骤。 浸泡在乙醇后, 简单地点燃提示。重复。
注: 一定要冲洗掉所有的漂白剂, 不要让针脚暴露在漂白的长时间内, 因为漂白剂会腐蚀不锈钢针脚。 - 小心地从冷冻的96井甘油储存库板上取下胶箔盖, 轻轻而牢固地将灭菌后的印版复制器研磨到仍在冷冻的甘油储存井中。接种200µL 磅 + 安培培养基, 用透气膜封住接种板。允许文化在台式的一夜之间生长。
- 在步骤2.1.1 中对印版复制器进行消毒, 在一夜之间的生长和复制器引脚的浸泡技巧中小心地去除液体培养板上的密封。应用小贴士, 甚至压力, 以一个长方形的 LB 放大器 + 新年琼脂板, 并转移细菌从别针到盘子轻轻地用一个小小的圆形运动, 确保在相邻的斑点之间留有足够的空间。允许菌落在37摄氏度的琼脂盘上一夜之间生长。请参阅补充文件 3 , 以准备 LB + Amp/春节版。
- 使用前, 将琼脂盘存放在4°c 倒置 (盖子侧下), 包裹在石蜡膜中。
注: 储存菌落盖一侧, 将允许冷凝交叉污染的 rna 克隆!大肠杆菌的菌落可以储存在4摄氏度的2–8周, 这取决于特定的 rna 克隆, 因为 rna 克隆保留在诱导 dsRNA 后 IPTG 诱导的时间长短的有效性。对于小集合的 rna 克隆, rna 的效率应该由 qPCR 的经验来确定击倒。
- 将96针板复制器按顺序浸入50% 漂白剂、超纯 H2O 和乙醇中。保持针脚浸泡至少三十年代的漂白剂和乙醇步骤。 浸泡在乙醇后, 简单地点燃提示。重复。
- 计算一次试验所需的最小24井板数: (每个副本集的 # 板) x (预期的 # 时间点)。确保包含一些额外的副本集, 用于处理诸如污染等问题 (图 2B)。
注意: rna 克隆的总数决定了每一个时间点为一组复制副本 (图 2C) 的24井板数。- 准备24井板, 作为步骤 1.1.2 (补充文件 3为食谱)。标签板当准备他们, 所以实验者评分的测试将是盲目的实验条件, 使用颜色代码或类似的编码方案。
- 为每10个副本接种一组1.5 毫升磅 + 安培的区域性 (请参见 2.2.2)。在96井深井板中接种培养基, 使用板块复制器 (如 2.1.3) 和2.1.4 细菌菌落 (图 2C,左)。密封与透气膜, 增长20小时 (37 °c) 与震动。
- 种子120µL 一夜文化每板使用一个6井多通道与可调的尖端间距 (图 2C,右)。干燥板在层流罩中被发现, 直到所有液体被吸收。不要过度干燥。在室温下隔夜储存盘子。
- 要创建一个新的标记的 rna sublibrary, 接种200µL 磅 + 安培每井在96井格式 (600 µL 板) 使用96针板复制器通过以下步骤:
- 用次氯酸盐处理C. 线虫的同步
- 计算实验所需的最小动物数: L1s 所需的最小数量 = (15-20 个动物/井) (24 个井/板) (X 板/副本集) (Y 副本集)。
注意: 复制集方法比传统方法需要更多的动物。一个10厘米厚的板, 充分的妊娠蠕虫可以提供 20,000–50,000 L1 动物的密度, 取决于妊娠成年人。同样, 二十6厘米板产量约 3万 L1 动物。计划准备一个鸡蛋准备, 加倍的最低数量的动物需要。如果准备的人口挨饿, 重新喂养或大块到一个新的板块, 并允许至少三代在食物之前 proceding17,18。一定要冻结剩下的 L1s。 - 遵循步骤 1.2 1.2.6 的传统方法获得同步 L1 动物。种子 15–20 L1 动物进入每个井使用6井可调整的间距吸管和试剂库, 类似于1.2.7。定期混合 L1 解决方案, 防止动物的沉降。
- 计算实验所需的最小动物数: L1s 所需的最小数量 = (15-20 个动物/井) (24 个井/板) (X 板/副本集) (Y 副本集)。
- 添加 5-氟-2 '-脱氧尿苷 (FUdR) 预防后代生产
- 按照步骤1.3.1。 准备无菌 50x FUdR 库存 (见步骤 1.3.1.1)。
- 当动物到达 L4 时, 使用6通道可调间距吸管, 在24井板的每一个井中添加25µL 的 50x FUDR。
- 评分可行性
- 删除一组复制板和洪水井与 M9 解决方案, 记录总的动物每井, 然后轻轻地触摸非移动的动物头部与蠕虫采摘 (图 2B)。没有移动的动物被评分为死亡。放弃得分的盘子。每日记录生存能力。
注意: 破裂的动物, 显示总形态学缺陷, 没有开发, 或爬行在井的边将被审查通过排除他们从死亡和总价值。- 记录每一个井中被审查的动物的数量在每个时间点单独地从其他价值。
- 不要在没有食物或被污染的油井中得分 (如真菌或粘液);这些水井被认为是被审查的。同时, 如果所有的动物都显示出形态学或发育缺陷, 那么审查一下。在此时间点记录此 rna 克隆/井的审查事件。
- 在打完复制盘后, 扔掉它。每天继续评分一个新的复制集, 直到所有的动物在所有的水井都死了。为了降低评分偏差的风险, 实验者必须保持对实验条件的盲目, 同样不能在评分过程中引用以前时间点的结果。
- 如果一个井内的所有动物都死在给定的时间点, 那么在那一天的得分之后, 检查是否所有的动物都被连续两个时间点的死亡评分为一个给定的井。如果是这样的话, 那么在随后的时间点, 得分的可行性就不再需要了。
- 进行额外的独立实验试验。与以前的试验中的试验次数分开, 跟踪连续实验的结果。
- 删除一组复制板和洪水井与 M9 解决方案, 记录总的动物每井, 然后轻轻地触摸非移动的动物头部与蠕虫采摘 (图 2B)。没有移动的动物被评分为死亡。放弃得分的盘子。每日记录生存能力。
3. 图形数据
注意: 用副本集方法将曲线拟合应用于近似平均和最大寿命。评估C. 线虫死亡率的参数符合 logit 曲线19。 由于大多数生存工具不支持 logit 曲线拟合, 开发了一个新的程序来绘制 logit 曲线 (对于副本集);卡普兰-Meier 曲线 (为传统方法) 也支持。
- 从软件开始。下载当前版本的发行 zip 文件 (请参阅参考资料部分)。将 zip 文件解压到文件夹。有关其他安装说明, 请参阅解压文件夹中的 "自述文件"。
- 启动绘图界面。在从 zip 文件提取的文件夹中查找 "代码" 目录的位置 (例如, "/使用者/用户名/桌面/WormLife/代码")。
- 在 R 控制台中输入以下命令, 替换刚刚标识的文件夹路径。按 enter 或返回后, 每输入行: 1) setwd ("/用户/客户名/桌面/WormLife/代码"), 2) 源 ("plotGUI"), 3) openMain ()。
- 允许在新窗口中加载接口的时间, 从而显示默认屏幕, 如图 3A所示。让 R 在后台运行。
- 将数据格式化为逗号分隔值 (CSV) 或制表符分隔值 (TSV) 文件。指定列和名称, 取决于分析类型。请参阅补充文件 4 (副本集) 和补充文件 5 (传统/卡普兰-梅尔) 为预先格式化的示例数据。
注: 数据必须以 "长" 格式指定,即每次试用时每一个时间点每一个应变/处理的一行。建议使用 CSV 文件以在平台之间进行最佳兼容性。- 移除与跳过或审查的观察相对应的行。检查是否缺少丢失值或非数值, 因为导入数据时可能会导致错误。
- 对于传统的卡普兰-梅尔风格分析, 不要从独立试验中汇集数据-分别绘制它们。对于副本集分析, 从多个试验中汇集数据, 然后使用 "TrialView" 功能进行调查 (请参见 6.3.3.4)。
- 使用绘图界面
- 使用对话框加载数据文件 ("文件" 菜单下的 "导入")。要打开 ". csv" 文件, 请将下拉列表中的文件类型更改为 ". csv" (默认为 ".txt/. tsv"), 导航到带有数据文件的文件夹。这里的文件是副本集示例数据 (补充文件 4)。
注意: 在数据集已打开时导入文件将替换当前数据集。 - 选择要导入的文件以启动 "导入向导", 通过标识所选文件的列 (图 S1A用于副本集)。如果输入数据对应于一个副本集实验, 请为学习类型选择 "Logit"。
注意: 导入工作流不同于副本集 (图 S1A) 和传统 (卡普兰-Meier) (图 S1B)。 - "绘制数据"。选择 "添加行" 开始绘制数据。(一条线对应一组条件。有一些功能, 以帮助实验, 在许多条件被测试)。
- 情节控制条件-在例子数据 N2 (L4440) 以 (空的媒介) 干扰的情况下是适当的。在 "图形" 菜单下选择 "添加行" 以启动 "添加行向导": 选择要绘制的条件和表示线条的图形参数。
- 要手动为其他条件添加曲线, 请重复3.3.3.1 中的步骤。
- 要更改线条的颜色或绘制符号, 请在 "图形菜单" 下选择 "修改线条"。
- 若要在不清除所有行的情况下删除行, 请在 "图形菜单" 下选择 "删除行"。
- 要清除当前绘图中的所有行, 请在 "图形菜单" 下选择 "清除行"。
- 要覆盖自动选定的最大 x 轴 (时间) 值, 请在 "图形菜单" 下使用 "设置 x 刻度"。
注意: y 轴 (幸存分数) 总是以20% 的增量显示 100% (顶部) 到 0% (底部)。x 轴始终以5为增量显示。在保存绘图图像后, 不绘制坐标轴标签以启用标记的灵活性。
- 要保存当前显示图形的 JPEG 格式图像, 请使用 "文件菜单" 中的 "保存绘图" 选项;仅保存当前绘图。
- 为了在一个实验中为许多不同的条件创建单个地块, 软件允许定义和绘制一个 "系列"。
注意: 在使用大型实验时, 该系列概念的实现提高了效率。- 如果从空白绘图工作区开始, 则添加对应于在系列中所有图块之间保持一致的控制条件的行 (请参见 3.3.3.1)。
- 在 "图形" 菜单中定义 "定义系列" 系列。选择与该系列中第一个显示的线条相对应的条件;只能选择一个。为线条选择图形参数 (线条颜色和绘图符号), 如3.3.3.1。
- 查看不同测试条件的地块。使用在主绘图窗口两侧以及顶部菜单栏中找到的左/右箭头按钮, 在条件之间切换 "系列线" 的显示 (图 3A-C)。
注意: 如果选定的系列线与以前添加的控件/参照行的条件相同, 则新行可能会出现叠加。 - 定义系列以使某些其他函数可用 (保存系列图和 Trialview-请参见 3.3.3.4)。定义系列后, 使用 "文件" 菜单中的 "保存系列图" 选项, 可以为新文件夹中的系列中的每个图形保存单个绘图图像文件。
- Trialview-从副本集实验的独立试验中可视化结果。如果为一个或多个样本组运行多个试验, 则分别从各个试验和汇集的数据中单独绘制数据, 以评估独立试验之间的一致性 (见图 3D)。
- 设置3.3.3.3 中所述的系列。不同的试验将在不同的图像中针对指定的参照/控制样本的各自试验, 对每个 "不同" 样本组进行绘制。
- 要保存 TrialView 图像, 请转到 "数据" 菜单中的 "打印 TrialViews";将为序列中的每个图形输出 JPEG 图像。
注:图 3D中的示例结果为一个有两个试验的案例。
- 情节控制条件-在例子数据 N2 (L4440) 以 (空的媒介) 干扰的情况下是适当的。在 "图形" 菜单下选择 "添加行" 以启动 "添加行向导": 选择要绘制的条件和表示线条的图形参数。
- 副本集数据的中值寿命摘要表。通过目视检查曲线以确保数据的合理匹配, 然后在 "数据" 菜单中选择"汇总表" 选项, 以保存每个样本类型的平均寿命值表 (logit 曲线的50% 生存时间).
- 使用对话框加载数据文件 ("文件" 菜单下的 "导入")。要打开 ". csv" 文件, 请将下拉列表中的文件类型更改为 ". csv" (默认为 ".txt/. tsv"), 导航到带有数据文件的文件夹。这里的文件是副本集示例数据 (补充文件 4)。
- 通过副本集方法生成的数据的统计评估
- 对于两组从副本集实验中进行的统计分析, 请修改并运行在发行 zip 文件中提供的 R 脚本 (请参阅 "WormLife 统计分析模板脚本"。R ")。
注: 运行脚本时不需要精通 R。文件中的注释中还有其他文档。该脚本已准备好对示例副本集数据进行分析。用户生成的数据以适当的格式 (参见补充文件 4) 也可以分析。- 以 r (r GUI 或 RStudio) 打开脚本文件。
注意: 这将显示脚本而不运行它。 - 修改所需文件的位置以匹配计算机上的位置。
注意: 这些文件路径必须是 "完全限定" (即应包括完整的文件位置, 包括文件夹)。- 修改 "wlDir" (目录的位置) 的路径 (文件/文件夹位置)、"数据文件" (要分析的副本集数据文档)、"compFile" (要运行的比较规范 (如果适用) 和 "outputPath" (将写入结果文件的位置到)。
- 如果要分析的文件中的列名与示例文件不同, 请在 "指定数据文件中的列" 部分中设置列名。为每个参数指定一列。如果一项研究有多个菌株, 但没有任何干扰 (或其他处理) 包括数据文件中的列, 其中包含空白条目或所有行的相同 (例如"no_treatment"等)。
- 设置 "compFile" 参数。如果 "compFile" 参数设置为 NA, 则将运行组的所有可能的配对比较。
注意: 组是由应变/基因型和治疗的组合定义的, 它们被串联并显示为 "strain_treatment"。对于具有许多组的更大的研究, 可以提供一个指定比较的 CSV 文件。请参阅示例文件 "comps_rsm_example. csv"。 - 设置蒙特卡罗重新取样的迭代次数 ("resamp", 缺省值为 1000)。
注: 在执行太少迭代时返回5月0日的 P 值;在这种情况下, 报告 "p < 0.01" (如果 resamp = 100), 或 "p < 0.001" (如果 resamp = 1000), 则是适当的. - 运行脚本: RStudio 中的 "源" 按钮 (编辑窗口的右上) 或 R GUI 中 "编辑" 菜单中的 "源文档"。(执行可能需要一段时间。
- 当 R "忙" 指示器不再显示时, 打开输出目录-将有一个表, 每个比较的结果 (中值存活率, p 值,% 中值寿命变化)。
- 以 r (r GUI 或 RStudio) 打开脚本文件。
- 对于两组从副本集实验中进行的统计分析, 请修改并运行在发行 zip 文件中提供的 R 脚本 (请参阅 "WormLife 统计分析模板脚本"。R ")。
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Representative Results
在任何新的方法的发展中, 新方法概括从以前的方法中接受的结果, 并符合领域内的标准势在必行。我们以前的经验表明, 复制集和传统的测定C. 线虫寿命的方法产生类似的结果20。野生型线虫(N2) 维持在20摄氏度通常生活在20和25天之间, 我们观察到的传统 (图 4A, 黑线) 和副本集方法 (图 4B, 黑色)。因此, 这两种方法都合理地近似野生型寿命。同样重要的是, 一个新的方法有决心准确地量化测试条件和统计能力之间的变化, 以检测重大变化。在我们之前的研究中, 我们发现, 转录因子的 c-myc 家族是C. 线虫长寿的决定因素。mml-1和mxl-2编码的同系物哺乳动物蒙多 A/碳水化合物反应元素结合蛋白 (ChREBP) 和 Mlx 分别。在线虫和哺乳动物中, 这些 c-myc 家族成员 heterodimerize 调节转录。我们发现, 无论是mml-1还是mxl-2的丢失都显著降低了正常的寿命, 这是通过传统的寿命分析或复制集 (图 4A-B, 黄色和栗色) 来衡量的。与 MML-1::MXL-2 复杂, 我们发现, mdl-1 (同源的哺乳动物疯狂) 或mxl-1 (最大) 的损失显著增加了 C. 线虫的寿命, 用两种方法来衡量 (图 4紫色和蓝色, 分别在两个面板)。
对传统的寿命测量方法的严重限制是吞吐量。这两种方法都依赖于运动来调用动物是活的还是死的, 这变得越来越难以评估。幼兽在没有刺激的情况下会在盘子里移动, 因此很容易得分。老化的线虫变得越来越久坐, 但将响应一个轻触头由反转运动的板块。然而, 随着动物变老, 向后移动的能力减弱, 变得越来越不协调。最终动物变得瘫痪, 一个表型强烈类似于骨骼肌减少, 当通过传统的方法进行评分时, 只能通过观察动物极端前尖端的细微抽搐来确定。相比之下, 当通过复制集方法得分时, 液体被添加到井中, 这是一种刺激, 它产生了一个可量化为 healthspan8读数的抖动响应。液体中的运动更容易观察到更老的动物: 按年代年龄配对的衰老动物在干板上产生微妙的头部运动, 但在液体中更明显 (虽然缓慢) 身体弯曲。最后, 当评分副本集, 整个井是在视野 (1.1 厘米直径) 和所有动物都在悬浮-允许观察所有动物同时。相比之下, 当通过传统的方法评分6厘米板, 你必须扫描整个板块搜索通过细菌草坪和沿边缘为动物。这些差异的净结果是, 使用副本集方法时的吞吐量至少比传统方法大一级, 这使得可以同时量化超过100的寿命变化。条件在一个实验与一个调查员。例如, 从一个全基因组的基于喂食的 rna 干扰屏幕, 我们以前确定了159基因是必要的增加寿命, 由减少daf-2/胰岛素样信号8。在这一分析中, 我们量化了野生型的寿命变化, 一个长期存在的2 (e1370)突变体, 和短命的 e1370 (2);d af-16 (mgDf47)双突变动物 (图 5A), 这使我们能够破译遗传胰岛素样信号与 100 progeric 基因 inactivations 的关系。此外, 我们评估了这些 progeric 基因 inactivations 如何改变 healthspan (当时称为 "activespan") 通过观察的下降,线虫跨越复制一段时间 (图 5B)。
图 1: 基于喂食的 rna 干扰的出现导致了衰老研究中基因发现的时代, 然而大多数 gerogenes 仍然缺乏研究.(A)许多 gerogenes 最初是从大规模功能基因组筛中发现的。在迄今发现的900多种线虫gerogenes 中, 许多都是使用基于喂养的 rna 识别技术, 突出了功能基因组方法在基因发现中的价值。该图显示了每篇手稿所发现的 gerogenes 的数量, 其方法是基于表型标注 (见材料表), 用于表型本体术语延长寿命, 缩短寿命和寿命变体。有关发现 gerogenes 的完整研究列表, 请参阅补充文件 1 。(B)大多数 gerogenes 仍然缺乏研究。与研究 gerogenes 类似的daf-16/foxo 蛋白 (箭头) 相比, 它有800多个参考文献, 但大多数 gerogenes 的参考文献少于10个 (一般参考, 不一定侧重于寿命)。可靠的高通量方法对于深入了解 gerogenes 之间的遗传相互关系是至关重要的。该图基于 PubMed 中的出版物与 gerogenes 的 rna 表型中发现的C. 线虫之间的映射。有关 gerogenes 的完整列表和与之相关的研究数量, 请参阅补充文件 2 。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 传统的和副本集方法, 用于评分C. 线虫寿命 (A)。对线虫寿命的传统评分方法。随着时间的推移, 等基因系动物的几个小的同步种群。在整个学习过程中都遵循同样的动物种群。活力是通过运动来评估的, 这可能受到温和的刺激。不能移动的动物被评分为死, 并被删除 (显示的愿望), 直到没有活着的动物留下。(B).用于评分C. 线虫寿命的复制集方法。大量的年龄同步的等基因系动物分布在多个相同的复制板上。在每个时间点, 一个单一的复制被评分: 一个温和的缓冲解决方案 (M9) 增加, 刺激运动。在注水井后不能自发移动的动物也通过触控刺激来评估。实验的评分持续时间是在开始之前确定的。每只动物只得分一次, 更大的人口的长寿来自许多独立观察。(c).复制集方法是一种用于定量测量线虫寿命的高通量方法。可以同时跟踪100个或更多独立的 rna 干扰克隆。HT115大肠杆菌表达 dsRNA 的一个特定的 rna 干扰克隆显示。实际上, 从96井板中抽取的每24个样品都被分成一个24井板。每一个产生的24井板有一个负 (即空矢量, 红色井) 和积极控制 (绿色井) 随机分布在一个收集的 rna 干扰克隆 (黄色水井)。通常, 集合中的第一个井 (A1) 包含一个空向量。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 图形用户界面 (GUI)。(A).显示默认欢迎屏幕的主绘图窗口界面。这是打开软件时显示的内容。由于使用平台无关的窗口化工具包, 平台之间的外观差异应该是最小的。(B).菜单选项概述, 用于从主绘图窗口提供的下拉菜单。(C).复制副本集样式 (左) 和传统卡普兰-Meier 样式 (右) 数据的绘图输出示例。所显示的数据是在独立实验中收集的。导出的地块不包括预先绘制的坐标轴标签, 以便在添加此类标签时具有最大的灵活性。为便于实现此目的, 坐标轴总是被划分为 Y 轴的20% 增量, X 轴的增量为5。在此示例中, 使用非常简单和常见的图像编辑工具, 将坐标轴和线条标签 (应变/处理) 添加到保存的图中。(D).从 "TrialView" 功能输出的一个示例, 允许对副本集样式数据集的独立试验结果进行可视比较。这个情节显示了两个不同的试验结果和相应的汇集结果为daf-2 EV (rna) (蓝色, 闭合的圈子), N2 EV (rna) (黑, 闭合的圈子) 和daf-2与daf-16 (rna 干扰) (红色, 开放金刚石)。TrialView 允许快速检查可能影响池数据集匹配质量的特定于试验的数据问题。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 传统和副本集方法产生相似的结果.1 (Mad) 的任一组分的损失:: MXL-1 (最大) heterodimer 增加寿命。相比之下, MML-1 (蒙多/ChREBP) 的任一组成部分的损失:: MXL-2 (Mlx) 降低寿命这一数字是从参考20重印, 通过一个创造性的共同性归属 (CC) 许可证 (见材料)。(A).卡普兰-梅尔结果与传统方法。(B). Logit 曲线适合使用副本集方法。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5:复制集方法可以根据寿命 (A) 的变化和 healthspan (B) 中100个 rna 克隆同时进行的改变来破译遗传相互作用。这个数字被重印从8在创作共同性归因于的允许之下-非商业4.0 国际执照 (由 NC) (参见材料)。(a) progeric 基因 inactivations 的遗传寿命分析在胰岛素样信号 (ILS) 减少 (daf-2, x 轴) 和缺乏daf-16/foxo 蛋白 (Y 轴) 的情况下, ILS 21 的中枢转录效应器.基因 inactivations 具有类似的功能, daf-16在没有daf-16 (黑点) 的情况下不会进一步缩短寿命。基因 inactivations 与功能完全地独立从daf-16缩短两个基因背景相似地 (灰色)。基因 inactivations 在daf-2 > daf-2;daf-16 中对生命周期产生负面影响,提示平行 (白色) 功能。(B)随着时间推移, 颠簸率的变化可以得出许多遗传扰动 (x 轴) 的平均 healthspan, 同时评估寿命的变化 (y 轴)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 S1: WormLife 中的工作流.一些引导工作流 (有时称为 "向导") 步骤的说明。在这些情况下, 在工作流的最后一步之后, 焦点将返回到主绘图窗口。(A)复制副本集样式集的数据导入工作流(B)传统的卡普兰 Meier 样式数据集的数据传输工作流。(C)将行添加到副本集样式数据集的绘图中的工作流。(D)为传统的卡普兰 Meier 样式数据集添加线条到绘图区的工作流。请单击此处下载此文件.
补充文件 1: 已确定 gerogenes 的研究.基于喂食的 rna 干扰的出现导致了一个基因发现的时代, 它不是由前遗传学 (包括衰老) 驯服的。按发现的 gerogenes 数量顺序列出的是独立的研究, 它确定了其活动改变了寿命的基因。请注意, 识别最 gerogenes 的研究使用了复制集方法8。基因 inactivations 改变寿命的性质也表明: 长寿和 progeric 基因是那些增加或降低生命周期时, 分别。"寿命变体" 指的是没有指定或未被策划的变化方向性 (即增加或减少寿命) 的情况。来自 WormBase WS262 (2018年1月) 的数据 (见材料), 加上参考文献10的 rna 处理寿命结果, 这还未包括在精心策划的 WormBase rna 表型的收集中。请单击此处下载此文件.
补充文件 2: 与每个 gerogene 相关的研究的数量.大多数 gerogenes 研究得不好。虽然一些基因, 如daf-16/foxo 蛋白, 一直是研究关注的主题, 超过 400 gerogenes 有少于10相关的出版物。数据从 WormBase WS262 (2018年1月), 加上干扰治疗寿命的结果从10 , 其中尚未包括在精心策划的收集 WormBase rna 干扰表型。请单击此处下载此文件.
补充文件 3: 制备常用试剂C. 线虫实验。(A)标准 NGM 和 rna 干扰板的配方。(B) M9 缓冲液和次氯酸盐溶液的配方。(C)制备 LB/春节版。请单击此处下载此文件.
补充文件 4: 副本集示例数据.副本集寿命试验中的一个示例数据集。此数据集已格式化为适合导入/分析。包括每一个条件的两个试验 (应变/基因型和 rna 干扰的组合)。请单击此处下载此文件.
补充文件 5: 传统的纵向示例数据.一个例子数据集从传统的纵向寿命实验, 与右审查, 格式化的准备进口/分析使用卡普兰-梅尔生存情节功能。请单击此处下载此文件.
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Discussion
传统和副本集方法都需要对年代衰老动物进行同步处理。我们包括一种方法, 使动物使用次氯酸钠治疗妊娠成人, 只有受精卵与妊娠成人生存治疗。这些胚胎孵化在液体悬浮和发育停止在第一幼虫阶段 (L1)。在将 L1 动物播种到食物上后 (如大肠杆菌表达 dsRNA 的基因), 动物恢复发育。用次氯酸盐治疗妊娠 L1 动物, 可以使残留的非种子选手 L1 动物在液氮或-80 摄氏度冷藏库中无限期地冷冻储存。这样, 在实验设置时, 每个应变的样本都被保留下来, 为将来的研究和提高重现性创造了宝贵的资源。然而, 虽然次氯酸钠治疗妊娠成年动物是一种常见的方式获得同步动物的衰老研究22, L1 逮捕是一个饥饿的反应。因此, 一些实验室倾向于允许孵化发生在盘子上, 或完全放弃次氯酸盐治疗, 并允许一些怀孕的成年人产卵几个小时 (即鸡蛋躺)。在后一种情况下, 父母被删除, 后代的寿命被遵循。据我们所知, 在 M9 的动物, 在盘子上孵化, 或从卵产卵的后代之间, 没有明显的寿命差异。然而, 鉴于营养可用性的变化与寿命的变化密切相关, 在这些同步方法之间, 特定的遗传背景可能产生不同的结果。为了解决这一理论问题, 需要进行更细致的分析。
无论用于同步起始种群的方法是什么, 都必须采取步骤以防止后代生产或将同步开始的人口与未来后代分离。在我们的协议中, 我们概述了如何使用 FUdR 来防止后代的产生, 因为分离动物不是复制集方法的可行选择。还可以通过使用女性化的遗传背景 (例如 15 (b26) 来防止后代生产, 而有限元-1 (hc17),这是一个温度依赖性的无菌菌株23)。然而, 两者都没有缺点: 遗传背景的使用会使随后的分析复杂化, 在某些遗传背景下 FUdR 可以改变长寿24,25,26。
作为防止后代通过化学或遗传手段生产的替代品, 成年动物可以周期性地移到新鲜的 rna 板上, 使其与后代隔绝。这就以牺牲吞吐量为代价简化了背景考虑。定期将动物迁移到新鲜食物有防止可能的饥饿和更新接触 dsRNA 的额外好处。然而, 一些影响寿命的基因相互作用只有在后代生产受到抑制时才发现: 生命表型的 TGFβ通路的早期分析错误地断定, TGFβ信号的减少影响了线虫dauer 形成但不老化27,28。然而, 使用 FUdR 的后续研究显示, TGFβ信号的减少, 通过胰岛素信号29增加了长寿。为什么早期的研究不能看到 TGFβ变种动物的寿命增加？TGFβ路径突变产生轻微的产卵缺陷 (egl) 和延长繁殖寿命, 这导致后代的内部孵化后, 生命中杀死的父母。很可能长寿的 TGFβ变种动物似乎有正常的寿命, 因为egl表型杀死动物的时候, 野生型动物通常死亡。这可能与其他与 DR 相关的基因通路有关, 因为饥饿的野生型动物也表现出一种egl表型, 也许是在低食物条件下后代的适应性生存优势。这突出了动物在压力条件下的适应性反应的基本复杂性, 以及在设计寿命试验时需要仔细分析和考虑的问题。
在设计和进行寿命试验的任何一种方法, 这是至关重要的, 以避免偏差。实验必须以双盲的方式进行: 以前的时间点上的样本是如何得分的, 测试条件的身份必须是实验者所不知道的。此外, 始终必须包括正反两方面的控制;在复制集方法的情况下, 这些被随机地插入到一个24井板中。大肠杆菌表达的质粒不含有与C. 线虫基因组对应的序列的插入物, 是空矢量负控制 (即"L4440"-见材料)。积极的控制取决于实验的具体性质。例如, daf-2编码的C. 线虫insulin/IGF-1 受体, 和daf-2失活通过喂养基的干扰有力地增加寿命至少两倍的野生型动物27。因此, 2 (rna 干扰)可能作为一个积极的控制, 当寻找基因 inactivations, 增加寿命。反之, daf-16编码 foxo 蛋白转录因子 orthologue30。DAF-16 是许多长寿范式的重要组成部分, 野生型动物 (N2) 处理的16 (rna)是短命的和显示的迹象, 早衰31。
传统的纵向寿命方法的主要优点是它建立得很好, 实验容易建立。在每个试验条件下只需要几个盘子就能得到相对较少的动物。因此, 生长不良或需要平衡器传播的菌株可以很容易地被测试。传统的方法具有很强的适应性, 可用于处理后代生产的任何一种现有方法, 包括 FUdR 治疗、杂交成女性化的遗传背景, 或定期将成年动物移到新板块在产卵期间。虽然移动的动物大大降低了吞吐量, 但使用突变体的背景从来都不是理想的, 虽然 FUdR 不改变野生型寿命32,33,34, 它可以影响寿命和年龄相关的表单在一些遗传背景35,25,26。注意, 雄性的存在, 即使使用 FUdR, 也会显著缩短13的雌雄同体寿命, 因此在雌雄同体到达 L4 后, 含有雄性的盘子是不可用的。同样, 通过卡普兰-梅尔估计和相关曲线的分析, 以及对数秩测试, 对死亡率数据也有很好的确定。然而, 传统的寿命分析存在着一些弊端。反复处理板材 (即将盘子暴露在空气中) 有助于引入空气中的真菌污染。此外, 反复戳可以伤害或杀死动物, 特别是随着人口的老龄化和变得脆弱。年长的动物基本上瘫痪并陷入大肠杆菌,而大肠杆菌则成为一种机会主义病原体 (殖民腔和包装咽)36。非常古老的活体动物只能通过微妙的头部运动来识别。因此, 将一只衰老的活动物归类为死亡是很容易的。最后, 传统的方法受到吞吐量的限制。
副本集方法具有较高的吞吐量和定量。但是, 这种方法的缺点是在初始设置中投入大量的时间和资源。一个适度大的实验, 以检查100个 rna 变异克隆超过20个时间点需要 3万 L1 动物 (其中大约15个动物每次 rna 干扰克隆检查), 虽然容易对多数菌株, 在某些情况下可能是疑难的。例如, 如果没有一个大粒子分类器 ("蠕虫分拣") 菌株, 必须保持与平衡器或转基因线携带一个不良的外染色体阵列不能很容易地检查此方法。第二个缺点是必须抑制后代的生产, 这需要使用 FUdR 或女性化的遗传背景。最后, 你必须知道化验将运行的时间长短, 因为你必须准备一个副本集为每个时间点在实验开始。然而, 这种方法的优点很多。最重要的是, 得分的可行性要快得多, 你可以很容易地跟踪动物100多个测试条件同时 (即rna 克隆)。由于复制品集只被打一次然后丢弃, 没有重复处理的板块或戳动物, 这将减少真菌污染的可能性, 并消除由偶尔粗暴刺激的蠕虫采摘造成的死亡率。此外, 液体在井中的加入大大促进了评分。从盘子和周围的细菌中释放老动物有助于使细微的头部运动更容易得分。添加液体也提供了一个机会, 以测量颠簸率作为衡量的健身 (如healthspan8,37)。
衰老是一个复杂的现象, 涉及多种因果机制, 需要使用系统的生物方法来解开。这些方法通常结合数据驱动的建模, 使用大量的基因组/transcriptomic 数据, 并需要互补的健壮和高通量的方法来测量寿命和 healthspan。高通量复制集方法可以纵向比较许多 rna 干扰克隆, 同时尽量减少批处理效果和技术误差, 从而促进动态模型的开发, 从而可以推断因果通路之间的相互作用。定量的方式。此外, 由于大量年龄同步的动物被划分成少数群体, 因此, 将几个全基因组学方法与复制集方法结合起来是可行的。
以前已经开发了其他方法来提高C. 线虫寿命试验的吞吐量, 通常侧重于适应传统的纵向方法 (即跟随同一组动物随着时间的推移), 以自动化观察和记录使用普通平板扫描仪38,39, 或更专业的设备, 如微流控板40。基于扫描仪的方法使用光作为刺激, 并比较按顺序捕获的图像, 以确定活/死的状态, 基于移动多个板块的一次;虽然这种方法不需要专有的科学硬件, 但根据所需的规模, 设置工作流所涉及的时间可能很大。另外, 自定义微流控装置的寿命试验允许在一段时间内对单个动物进行深入的表型表征, 而无需治疗以防止后代, 但需要制作微流控板和获取相关的微流控泵和成像设备。与此相反, 复制集方法与此处详细介绍的软件相结合, 可以极大地提高吞吐量, 使用在与C. 线虫一起工作的实验室中已经常见的工具。
WormLife 软件将在将来得到改进, 以便更方便地访问统计比较, 并与其他平台兼容。该软件的最新文档可以在 GitHub 页面找到, 包括测试软件的平台的安装说明。还将开发一个基于 web 的版本, 以便在不需要安装任何软件的情况下方便地访问。
总之, 复制集方法和可用的免费软件的组合提供了一个强大的平台, 用于提高寿命实验的吞吐量和健壮性, 以及广泛的基于生存的测试 (例如,应激耐受、毒理学研究、healthspan等)。特别是当与功能基因组学结合时, 这种方法利用了后生模型系统C. 线虫的许多好处来破译无数的基因相互作用, 从而促进衰老的进程.
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
本手稿所描述的这项工作的经费由下列机构提供: 教务长大学院长办公室和医学院和牙科院长办公室, 通过卫生科学中心进行计算创新 (HSCCI);埃里森医学基金会新学者老龄化研究 (AG-NS-0681-10) 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
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