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Genetics

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819

Summary

Hier beschreiben wir die Replikatgruppe Methode, Vorgehensweise quantitativ Messen C. Elegans Lebensdauer/überleben und Healthspan in hohem Durchsatz und robuste Art und Weise, so dass Screening von vielen Bedingungen ohne Einbußen bei der Qualität der Daten. Dieses Protokoll beschreibt die Strategie und bietet ein Software-Tool für die Analyse der Replikatgruppe Daten.

Abstract

Die Replikatgruppe Methode ist ein Ansatz zur Messung quantitativ Lebensdauer oder das Überleben von Nematoden Caenorhabditis Elegans in einer Hochdurchsatz-Weise, so dass eine einzelne Forscher mehr Behandlungen oder Bedingungen über die gleiche Menge an den Bildschirm jederzeit ohne Verlust der Qualität der Daten. Die Methode erfordert eine gemeinsame Ausstattung in den meisten Labors arbeiten mit C. Elegans gefunden und ist somit einfach zu verabschieden. Der Ansatz konzentriert sich auf unabhängige Stichproben einer Grundgesamtheit an jedem Aussichtspunkt, anstatt eine einzelne Probe im Laufe der Zeit als mit herkömmlichen longitudinalen Methoden prüfen. Ritzen mit sich bringt, die Zugabe von Flüssigkeit in die Vertiefungen von Multi-well-Platte, die stimuliert C. Elegans zu bewegen und Quantifizierung Änderungen in Healthspan erleichtert. Andere wichtige Vorteile der Replica Set-Methode enthalten reduzierte Exposition von agarflächen in der Luft Schadstoffe (z.B. Schimmel oder Pilz), minimale Umgang mit Tieren und Robustheit auf sporadische MIS scoring (z. B. ein Tier als Tote gefordert, wenn es noch (lebendig). Um angemessen analysieren und Visualisieren von Daten aus einer Replikatgruppe Stil-Experiment, wurde auch eine benutzerdefinierte Software-Tool entwickelt. Aktuelle Funktionen der Software gehören Plotten von Survival-Kurven für sowohl Replikatsatz und traditionellen (Kaplan-Meier) Experimente, sowie statistische Analysen für Replikatsatz. Die Protokolle, die hier zur Verfügung gestellten beschreiben die traditionelle experimentellen Ansatz und Replica Set-Methode sowie einen Überblick über die entsprechenden Daten-Analyse.

Introduction

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Die transformative technologischen Fortschritt in Richtung zum Verständnis der genetischen Grundlagen des Alterns gehörte die Entwicklung der Fütterung-basierte RNAi in C. Elegans1; vor den experimentellen Einsatz von RNAi waren viele Phänotypen des Alterns nicht genetisch steuerbar. Fütterung-basierte RNAi wird erreicht durch die Produktion von DsRNA in E. Coli , das entspricht einer endogenen C. Elegans mRNA: IPTG induziert bidirektionale Übertragung über einen Einsatz entweder C. Elegans cDNA oder eine Portion ein Öffnen Sie Leserahmen in ein Plasmid-2. Bei C. Elegans intakt nach einziehen E. Coli DsRNA produziert durch Bakterien aus dem Lumen in Darmzellen über die SID-2 transmembranen Protein3transportiert und dann durch den Rest des Tieres über SID-14verteilt. In jeder Zelle exogene DsRNA verarbeitet durch komplexe Dicer SiRNA, die interagieren mit einem Reife mRNA über komplementäre Basenpaarung zum Erstellen eines neuen SiRNA-mRNA Duplex. Diese Maisonette ist anerkannt von der RISC-komplex und gespalten, so erniedrigend die endogenen mRNA-5. So ändern Sie lediglich das Plasmid einfügen, kann man die Funktion der fast jedes Gen in das Genom von C. Elegans inaktivieren. Diese Entdeckung führte zu die Kreation von mehreren großen Fütterung-basierte RNAi Bibliotheken-Sammlungen von E. Coli Aktien umgewandelt, die kombiniert werden können, um die Reichweite von ca. 86 % erzielen bekannt C. Elegans Gene6, 7.

Seit der Weiterentwicklung der Fütterung-basierte RNAi führten umfassende Bildschirme in C. Elegans zur Entdeckung von mehr als 900 Gene, die Lebensdauer bei inaktiviert (ausweislich der RNAi-Phänotyp Verbände kuratiert in WormBase), zu ändern, die wir beziehen um als Gerogenes. Eine Rolle für die Mehrheit der Gerogenes Langlebigkeit Kontrolle durch Fütterung-basierte RNAi in wenigen bahnbrechenden Berichten entdeckt wurde (siehe Abbildung 1A und ergänzende Datei 1 für Details). In einigen Fällen wurden diese Gerogenes festgestellt, basierend auf der Messung der Rentabilität auf ein einzelnes oder wenige Zeitpunkte, die nicht quantifizierbaren Maß für die Veränderung der Lebensdauer RNAi-Behandlung zur Verfügung zu stellen. In anderen Fällen wurden diese Gene für Veränderungen der Lebensdauer sowie zusätzliche altersassoziierter Phänotypen quantitativ bewertet. Beispielsweise haben wir bisher 159 Gene, die für normale und erhöhte Lebensdauer von Tieren mit verringerten Insulin/IGF-1 Signalisierung waren notwendig, und Änderungen in Healthspan quantifiziert. Von diesen führen 103 gen inaktivierungen progeric Phänotyp, wie ein oder mehrere Zeichen der vorzeitigen Alterung8Verlust führte.

Während einige Gerogenes mit 100 oder mehr Studien (z. B. Daf-16, Daf-2, Sir-2.1) in Verbindung gebracht haben, haben mehr als 400 Gerogenes höchstens 10 Zitate (Abbildung 1 bund ergänzende Datei 2). So umfassende Fütterung-basierte RNAi-Bildschirme haben entdeckt und kursorisch gekennzeichnet Hunderte von vermeintlichen Gerogenes, bleiben wie diese Gene funktionieren auf Langlebigkeit Kontrolle, und die genetischen Zusammenhänge zwischen diesen Genprodukte schlecht studierte. Volle Längsschnittanalyse für altersassoziierter Phänotypen ist eine Voraussetzung für genetische Interaktionen zwischen Gerogenes (z.B. epistatic Interaktionen, Asynthetic Interaktionen, etc.) zu identifizieren. Tiefer Einblick in die genetischen Zusammenhänge zwischen Gerogenes, erfordert eine Hochdurchsatz-quantitative Methode, die auch die Vorteile der Fütterung-basierte RNAi nutzt.

Die häufigsten Surrogat-Maßnahme des Alterns ist Lebensdauer. Der traditionelle Ansatz zur Messung von C. Elegans Sterblichkeit verfolgt den Tod einzelner Tiere im Laufe der Zeit innerhalb einer kleinen Stichprobe. Eine relativ kleine Anzahl von Tieren werden im Laufe der Zeit verfolgt und in regelmäßigen Abständen sind sanft stieß mit einem Platindraht oder Wimpern mit Bewegung als Indikator der Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Diese Methode ist weit verbreitet, da es einfache, direkte Messungen die durchschnittliche und die maximale Lebensdauer bietet. Diese traditionelle Methode ist jedoch zeitaufwendig und relativ niedrigen Durchsatz, die begrenzt die Anzahl der Tiere und Bedingungen, die gleichzeitig in einer kontrollierten Weise gemessen werden können. Eine kürzlich durchgeführte Simulationsstudie festgestellt, dass viele C. Elegans Lebensdauer Studien keine genügend große Zahl von Tieren Assay, kleine Änderungen zwischen Bedingungen9zuverlässig erkennen zu können. Darüber hinaus beinhaltet diese traditionelle Methode Umgang mit immer wieder die gleichen Kohorte von Tieren im Laufe der Zeit, die wiederum kann einzuführen, Kontamination, und kann beschädigen oder zunehmend gefährdet, im Alter von Tieren zu töten.

Wir haben eine alternative "Replica Set" Methode zur Messung von C. Elegans Lebensdauer entwickelt. Zu diesem Zweck eine große Population von Alter synchronisiert, isogenen Tiere gliedern sich in eine Reihe von kleinen Populationen (oder Nachbauten). Genügend Replik Proben werden generiert, um jeden Zeitpunkt in das geplante Experiment zu decken. Jedem Zeitpunkt Beobachtung eines der Replikate ist für die Anzahl der lebenden Toten erzielte und zensierte Tiere, dann Tiere innerhalb dieser replizieren werden verworfen. So über die erwartete Lebensdauer der Bevölkerung als Ganzes, eine Reihe von unabhängigen Subpopulationen sind in regelmäßigen Abständen abgetastet (Abb. 2 b). Bei der Verwendung von Replikatsätzen gibt es kein wiederholtes drängen von Tieren und keine wiederholte Exposition gegenüber potentiellen Kontamination der Umwelt. Die Lebensfähigkeit beobachtet an der einmaligen Stelle ist völlig unabhängig von jeder anderen Beobachtung, das minimiert die Handhabung und erhöht den Durchsatz von mindestens eine Größenordnung. Dies hat uns erlaubt, Änderungen in Lebensdauer quantitate für Hunderte von RNAi gleichzeitig8,10 Klone.

Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Durchführung von C. Elegans Lebensdauer über die Replikatgruppe und traditionelle Methoden zur Bewertung von C. Elegans Langlebigkeit. Wir zeigen, dass ähnliche Ergebnisse, zwischen den Methoden erzielt werden. Wir haben entwickelten Software, bei der die grafische Auswertung der Daten, Lebensdauer durch beide Ansätze, die wir frei unter einer GPL V3 Lizenz (siehe Tabelle der Materialien) zur Verfügung. "WormLife" ist in R11geschrieben und enthält eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) für das Plotten von Daten, die in Mac OS und Linux getestet wurde. Zu guter Letzt wir vergleichen und kontrastieren die Grenzen der einzelnen Methoden und andere Überlegungen bei der Wahl zwischen Ansätze zur Messung der quantitativen Veränderungen in C. Elegans Lebensdauer zu markieren.

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Protocol

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1. traditionelle Methode für Scoring C. Elegans Langlebigkeit

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Identifizieren Sie Gene über Fütterung-basierte RNAi inaktiviert werden. Kaufen Sie transformierten Bestände an HT115 E. Coli2 mit der RNAi-Klon von Interesse. Alternativ subclone die cDNA des Gens von Interesse in die Multicloning Site des Plasmids L4440.
      Hinweis: HT115 ist eine RNase III-defizienten E. Coli -Stamm mit IPTG-induzierbaren T7-Polymerase-Aktivität, die verwendet wird, um Abbau der DsRNA innerhalb der Bakterien zu verhindern. Für Lebensdauer Studien, die nicht füttern-basierte RNAi verwenden, kann entweder HT115 OP50 E. Coli auf NGM standardteller oder gebrauchte.
    2. Bereiten Sie 3 – 6 (oder mehr) 6 cm RNAi Platten pro Testbedingung (ergänzende Datei 3 für Rezept). RNAi-Platten bei 4 ° C vor der Aussaat mit Bakterien für bis zu mehreren Monaten zu speichern.
    3. Wachsen Sie transformierten E. Coli über Nacht (16-20 h, 37 ° C Inkubator bei 180 bis 220 u/min schütteln).
      Hinweis: HT115 E. Coli wächst in LB mit Ampicillin (50 mg/mL). Standard OP50 E. Coli ist nicht Antibiotika-resistente und wird ohne Ampicillin gewachsen. Kulturvolumen richtet sich nach der Anzahl der Platten, aber ist in der Regel zwischen 8 und 100 mL LB, abhängig von den experimentellen Design.
      1. Konzentrieren Sie Bakterien durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 15-20 min in einer Zentrifuge Benchtop. Aspirieren überstand und wieder auszusetzen das Pellet 1/10. ab Volumen (z.B. 10 X) in LB mit Ampicillin für HT115 (oder ohne Ampicillin für standard OP50).
      2. Aliquoten 200 µL konzentriert 10 X Bakterien auf jede 6 cm Platte. Bereiten Sie 3 bis 4 Wiederholungen pro Test Zustand, mit 2 zusätzlichen backup Platten, im Falle einer Kontamination verwendet werden. Wenn Sie Platten vorbereiten, beschriften sie, so dass der Experimentator erzielte des Tests mit einem Farbcode oder ähnliche Codierschema blind für die experimentellen Bedingungen ist. Stellen Sie sicher, dass der Code aufgenommen wird.
      3. Lassen Sie offene Platten Trocknen in einer sauberen Umgebung wie z. B. einer Laminar-Flow Bank, bis alle Flüssigkeit aufgesogen worden ist oder überdachte Platten auf der Bank über Nacht trocknen. Monitor-Platten während des Trocknens um sicherzustellen, dass der Agar ohne übermäßige Trocknung trocken ist.
        Hinweis: Über Trocknung der Platten führt zu einer Rissbildung des Nährbodens, der C. Elegans , bohren sich in den Agar veranlaßt. Nass die agaroberflächen auch Graben zu fördern.
    4. Speichern Sie getrockneten Platten innerhalb einer Wurmkiste über Nacht (bis zu 24 Stunden) bei Raumtemperatur zur Induktion von DsRNA Produktion zu ermöglichen. Nach 1 Tag bei RT speichern Sie Platten bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen in einem versiegelten Zip-Lock Beutel (um Platten zu verhindern Austrocknung). Vor dem Gebrauch zurück Platten auf Raumtemperatur in dem Zip-Lock Beutel um Kondensation von der Einführung in der Luft Pilz Verunreinigungen zu verhindern.
  2. Synchronisation von C. Elegans mit Hypochlorit-Behandlung
    Hinweis: Weitere ergänzende Datei 3 M9 und Hypochlorit-Lösung-Rezepte.
    1. Trächtigen Erwachsene Tiere mit M9 zu sammeln. Verwenden Sie einen verstopften Glaspipette Übersiedlung nach 2 x 15 mL-Tuben.
    2. Drehen Sie Rohre für 30"~ 2.000 u/min. Suchen Sie einen Pool von Nematoden an der Unterseite des Rohres. Den überstand abgesaugt. Waschen Sie zwei Mal mit M9 Lösung, Spin und Aspiration zu wiederholen.
    3. Wieder aussetzen Sie C. Elegans in 4 mL M9. 2 mL Hypochlorit-Lösung zugeben. Sofort Vortexen ~ 3 min, mit regelmäßigen kräftig schütteln. Suchen Sie nach 3 min eine Wolke aus Eier unter dem sezierenden Mikroskop. Vortex zusätzlich 10 – 20 s, wenn Eier nicht nach 3 min freigegeben worden sind.
      Anmerkung: Timing der Hypochlorit-Behandlung ist wichtig. Eier in die trächtigen Erwachsenen sind was Behandlung überleben. Nach ca. 3 min die trächtigen Erwachsenen aufbrechen und die Eier austreten. Jedoch wenn Eier in Hypochlorit-Lösung sind sterben zu lange nach Veröffentlichung sie. Umgekehrt, wenn trächtigen Erwachsene nicht Hypochlorit-Lösung lange genug bleiben, keine Eier freigegeben werden.
    4. Waschen Sie schnell mit M9 Lösung zweimal wie in Schritt 2.1.2.
    5. Wieder aussetzen Sie C. Elegans Ei Pellet in 3 mL M9 und Übertragung auf eine neue 15 mL Tube. Embryonen über Nacht in 3 mL der Lösung der M9 mit Rotation bei 20 ° c schlüpfen zu ermöglichen
    6. Berechnen Sie die Dichte der L1 Tiere (oder Embryonen) pro Mikroliter durch Fallenlassen 10 µL L1 Lösung 3 X 6 cm Platte und Count die Anzahl der L1-Tiere, die durchschnittliche Anzahl der L1s/µL zu berechnen.
      Hinweis: L1 Tiere werden im Laufe der Zeit Regeln. Daher sollte in regelmäßigen Abständen L1 Lösungen gemischt werden.
    7. Samen 50 L1 Tiere pro Platte. Platten zu invertieren und Dichtung mit einem Gummiband. Platzieren Sie Platten in einem Kunststoff Wurmkiste. Verschließen Sie Feld in einem großen Zip-Lock Beutel. Bewegen Sie in einem Inkubator 20 ° C.
  3. Vermeidung von Nachkommen-Produktion durch die Zugabe von 5-Fluoro-2'-Deoxyuridine (FUdR)
    1. Wachsen Sie die Tiere erst L4-Stadium bei 20 ° C. Überprüfen Sie, ob synchronisiert Tiere entwickelt, um einen L4 ca. 40 h nach der Aussaat (Schritt 2.1.7).
      Hinweis:C. Elegans Entwicklungszeit wird bei verschiedenen Temperaturen unterschiedlich12 und Wachstumsraten von mutierten Tieren für die Preise nicht charakterisiert wurden empirisch geprüft werden müssen.
      1. Fügen Sie 160 µL 50 X FUdR auf jede 6 cm Platte mit L4 Tiere.
        Hinweis: Es ist entscheidend für FUdR in der L4-Stadium hinzufügen. Der Einfachheit halber stellen Sie 1.000 X Bestände von FUdR durch Auflösen von 1 g in 10 mL FUdR ultrapure H2O. Filter sterilisieren Lager FUdR mit einem 0,2 µm-Filter und 10 cc Spritze. Aliquoten ~ 1 mL Lager in sterilen 1,5 mL Röhrchen. Einfrieren und Lagerung bei-20 ° C.
    2. Platten für die Anwesenheit des Mannes zu inspizieren C. Elegans. Entfernen Sie alle Männer.
      Hinweis: Lebensdauer bemisst sich in der Regel für Hermaphroditen und nicht Männer. Hermaphroditen, die Paaren Leben kürzer als EWK Tiere, auch in Gegenwart von FUdR13. Männchen sind kleiner und dünner als Hermaphroditen und können leicht durch eine unverwechselbare hakenförmige Rute14identifiziert werden.
    3. Box in den Zip-Lock Beutel zurücklegen. Zurück zu 20 ° C Inkubator.
  4. Scoring Lebensfähigkeit
    1. Ergebnis Lebensfähigkeit täglich durch das Tier auf dem Kopf mit einem Platindraht oder Wimpern sanft zu berühren. Punkten Sie Tiere, die nicht als tot zu verschieben und entfernen sie aus der Platte (Abbildung 2A). Notieren Sie die Anzahl beobachtet tot für jede Bedingung für jeden Zeitpunkt der Beobachtung.
      Hinweis: Um das Risiko von scoring Voreingenommenheit der Experimentator blind für experimentellen Bedingungen bleiben muss und ebenso darf nicht verweisen die Ergebnisse aus früheren Zeitpunkten während scoring.
    2. Zensor-Tiere, die Ruptur, sterben an andere offensichtliche Entwicklung Mängel oder Crawl oben auf der Seite der Schale: Entfernen Sie diese Tiere und Datensatz die Anzahl jeweils Zeit festgestellt für die Prüfung in der statistischen Analyse Punkt. Zusätzlich wenn Männer gefunden werden, entfernen sie und notieren Sie die Anzahl beobachtet.
    3. Wiederholen Sie ab Schritt 1.4.1 täglich, bis keine Tiere am Leben bleiben.
      Hinweis: Sollte der Rasen von E. Coli deutlich vermindern oder Pilz beginnt zu wachsen auf der Platte, alle verbleibenden Tiere auf eine frische Platte mit den entsprechenden RNAi und FUdR übertragen.
  5. Daten-Analyse - Plotten und Statistiken
    1. Eingabe oder offene aufgezeichnete Beobachtungsdaten in Software unterstützt Überlebensanalyse mit dem nicht-parametrische Kaplan-Meier Abschätzer15 und Log-Rank test16 (siehe ergänzende Datei 3). Achten Sie darauf, zensierte Tiere umfassen. Enthalten Sie Männer, die beobachtet wurden, nicht, falls vorhanden.
      Hinweis: Datenformate variieren zwischen Software, aber ein gemeinsames Format ist es, jedes einzelne Tier beobachtet in einer separaten Zeile zu erfassen. Die experimentelle Timepoint, an dem ein Tier beobachtet wurde, wie die "Veranstaltung" Zeit tot ist. Wenn zensiert, ist die "Veranstaltung" Zeit der Timepoint, an dem das Tier zensiert wurde. Normalerweise gibt es ein Feld oder eine Checkbox zu zensierten Beobachtungen weisen darauf hin.
    2. Plotten Sie Kaplan-Meier-Survival-Kurven. Wählen Sie weniger als sechs Bedingungen für eine einzelne Handlung, wenn viele Bedingungen untersucht wurden, um die Lesbarkeit zu verbessern.
      1. Überprüfen Sie, ob Daten Fragen, die visuell deutlich - fehlende Beobachtungen, unerwartete Ergebnisse, etc. sind — und diese vor der statistischen Analyse.
    3. Verwenden Sie die Log-Rank-Test-Funktion in Ihrer Software paarweise auszuführenden statistische Vergleiche. Stellen Sie sicher, dass alle verfügbaren Optionen für die Behandlung von zensierte Ergebnisse für Recht zensierten Daten entsprechend festgelegt sind.

(2) Replica Set-Methode für Scoring C. Elegans Langlebigkeit

Hinweis: während die traditionelle Methode 3 – 6 Platten pro Zustand erfordert (siehe 1.1.2. oben), Replica Set-Methode erfordert viele mehr (siehe Punkt 2.2.2 unten). Die traditionelle Methode folgt Tiere auf der gleichen Platte während eines Experiments (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu mit Replikatsatz Tiere sind zählte nur einmal: viele identische Wiederholungen sind zu Beginn des Experiments so einrichten, dass eine Wiederholung zu jedem Zeitpunkt (pro-Testversion) erzielt wird (Abb. 2 b).

  1. Bibliothek-Setup.
    Hinweis: Zusätzliche Details auf Übergabe RNAi-Klone wird hier, wie das Replica-Set-Protokoll offen ist für die gleichzeitige Bewertung der vielen RNAi Klone behandelt und kann auf weit über 100 Klone gleichzeitig skaliert werden. Sammlungen von RNAi Klone sind als Glycerin Vorräte gehalten in einer 96-Well-Format-Platte erhalten. Replica Set Experimente verwenden 24-Well Platten. Jeder ist auch eine unterschiedliche Testbedingung, die eine Sammlung von RNAi-Klone, verschiedene chemische Behandlungen, tierische Stämme und So weiter entsprechen kann.
    1. Montieren Sie das Layout der Zweigstelle für Sammlungen von RNAi-Klone, so dass die folgenden Bedingungen erfüllt sind:
      1. Sicherstellen Sie, dass innerhalb einer 96-Well-Sammlung auch A1 ein leerer Vektor Negativkontrolle.
      2. Fügen Sie eine zusätzliche leere Vektor-Kontrolle nach dem Zufallsprinzip innerhalb jedes 24 Vertiefungen.
      3. 96-Well-Platte in Blöcke von 24 Wells, aufgeteilt, so dass jede 24-Well-Platte an einer Negativkontrolle (Abbildung 2) nach dem Zufallsprinzip eingefügt hat.
      4. Legen Sie eine Positivkontrolle nach dem Zufallsprinzip innerhalb jeder Gruppe von 24-Brunnen (Abbildung 2).
        Hinweis: Die Positivkontrolle ist die experimentelle Frage abhängig. Zum Beispiel beim Blick auf eine Sammlung von RNAi-, Erhöhung der Lebensdauer Klone, ist daf-2(RNAi) häufig enthalten. Umgekehrt wird bei der Betrachtung verkürzte Lebensdauer daf-16(RNAi) häufig verwendet.
  2. Vorbereitung der Replikatsätze
    Hinweis: die Anzahl der Wiederholungen notwendig ist die minimale Anzahl von Zeitpunkten (Abb. 2 b) gleich. Man muss wissen, a Posteriori wie lange Lebensdauer vor Beginn des Experiments sowie scoring-Frequenz (z.B. eine Replikat Set Experiment läuft 40 Tage mit jedem anderen Tag erzielte erfordert ein Minimum von 20 Replikatsätze für Vorbereitung zu messen jede Bedingung zu Beginn des Experiments). Es ist ratsam, ~ 5 zusätzliche Backup-Sätze (siehe 2.2.2 und 2.2.2.3 unten).
    1. Erstellen Sie einen frischen Stempel der RNAi-Zweigstelle, impfen Sie 200 µL LB + Amp pro Bohrloch in einem 96-Well-Format (600 µL Platten) mit einem 96-Stift Platte Replikator mit den folgenden Schritten:
      1. Sterilisieren Sie 96 Pin Platte Replikator durch nacheinander Eintauchen die Pins in 50 % Bleichmittel, hochreine H2O und Ethanol. Halten Sie die Pins mitten für mindestens 30 s für die Bleichmittel und Ethanol Schritte.  Nach dem Eintauchen in Ethanol Flamme kurz die Tipps. Den Vorgang wiederholen.
        Hinweis: achten Sie darauf, alle Bleichmittel abspülen, und lassen Sie sich nicht die Pins ausgesetzt um über einen längeren Zeitraum zu bleichen als Bleichmittel die Stifte aus rostfreiem Stahl korrodieren kann.
      2. Entfernen Sie vorsichtig die Klebefolie Abdeckung von gefrorenen 96-Well-Glycerin Materialbibliothek Platte und sanft aber mahlen Sie fest Tipps von sterilisierten Platte Replikator in die Vertiefungen der Bestände noch gefrorenen Glycerin. 200 µL LB + Amp Kulturen zu impfen und die beimpften Dichtplatte mit einer durchlässigen Membran. Lassen Sie Kulturen über Nacht auf die Benchtop wachsen.
      3. Sterilisieren des Platte-Replikators wie in Schritt 2.1.1, sorgfältig entfernen Sie die Dichtung aus der Flüssigkultur Platte nach Übernachtung Wachstum und Tipps der Replikator Pins eintauchen. Gelten Sie die Tipps mit gleichmäßigem Druck für einen rechteckigen LB-Amp + Tet nährbodenplatte und Transfer Bakterien von den Stiften auf die Platte vorsichtig mit kleinen kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass ausreichend Platz zwischen benachbarten Spots übrig bleibt. Lassen Sie Kolonien auf Agarplatte bei 37 ° c über Nacht wachsen Vorbereitung der LB + Amp/Tet zusätzliche Datei 3 weitere Platten.
      4. Vor dem Gebrauch speichern Sie nährbodenplatte bei 4 ° C invertiert (Deckel nach unten), in Paraffin Film verpackt.
        Hinweis: Speichern von Kolonien Deckel Seite oben wird Kondenswasser Kreuz-RNAi Klone verunreinigen kann! Kolonien von E. Coli sind für 2 – 8 Wochen bei 4 ° C, abhängig von bestimmten RNAi-Klone, speicherbar, RNAi Klone Wirksamkeit bei der Induktion von DsRNA nach IPTG Induktion für Variable Zeiträume beibehalten. Für kleine Sammlungen von RNAi-Klone sollten RNAi Effizienz empirisch RT-qPCR bestimmt Niederschlag zu bestätigen.
    2. Berechnen Sie die minimale Anzahl von 24-Well-Platten für eine Studie des Experiments notwendig: (# Platten pro Replikatgruppe) x (erwartete # Zeitpunkte). Stellen Sie sicher, dass ein paar zusätzliche Replikatsätze enthalten für den Umgang mit Themen wie Verunreinigung (Abbildung 2 b) sind.
      Hinweis: Die Gesamtzahl der RNAi-Klone bestimmen die Anzahl der 24-Well-Platten zu einem Satz von Repliken für jeden Zeitpunkt (Abbildung 2).
      1. Bereiten Sie 24-Well-Platten vor, wie 1.1.2 (ergänzende Datei 3 für Rezept) Schritt. Label-Platten, wenn sie so vor der Experimentator erzielte der Assay werden blind für die experimentellen Bedingungen, mit einem Farbcode oder ähnliche Codierschema sein.
      2. Eine Reihe von 1,5 mL LB + Amp Kulturen für alle 10 Replikate (siehe 2.2.2) zu impfen. Kulturen in 96 auch Deep-Well-Platten mit der Platte Replikator (wie in 2.1.3) und bakterielle Kolonien von 2.1.4 (Abbildung 2, Links) zu impfen. Mit atmungsaktive Membrane zu versiegeln Sie, wachsen Sie 20 h (37 ° C) mit zittern.
      3. Samen Sie 120 µL einer Übernacht-Kultur auf jede Platte mit einer 6-Well Mehrkanal-Pipette mit verstellbarer Spitze Abstände (Abbildung 2, rechts). Trocknen Sie die Platten in einem Laminar-Flow-Abzug aufgedeckt, bis alle Flüssigkeit aufgesogen hat. Trocknen Sie nicht übermäßig. Lagern Sie Platten über Nacht bei Raumtemperatur.
  3. Synchronisation von C. Elegans mit Hypochlorit-Behandlung
    1. Berechnung der Mindestzahl von Tieren, die für das Experiment benötigt: minimale # L1s benötigt = (15-20 Tiere/Brunnen) (24 Brunnen/Platte) (X Platten/Replikatgruppe)(Y replica sets).
      Hinweis: Replica Set-Methode erfordert mehr Tiere als die traditionelle Methode. Ein 10 cm Teller voller trächtigen Würmer kann 20.000 – 50.000 L1 Tiere abhängig von der Dichte der trächtigen Erwachsenen liefern. In ähnlicher Weise ergeben 20 6 cm Platten um ~ 30.000 L1 Tiere. Planen Sie eine Ei-Vorbereitung vorzubereiten, die die minimale Anzahl von Tieren Bedarf verdoppelt. Wenn die Bevölkerung in Vorbereitung gehungert hat, wieder zu füttern oder Brocken auf eine neue Platte und lassen mindestens drei Generationen auf Lebensmittel vor Routinemaßnahmen17,18. Achten Sie darauf, wieder übrig gebliebenen L1s einfrieren.
    2. Führen Sie die Schritte 1,2 bis 1.2.6 wie bei der traditionellen Methode zu synchronisiert L1 Tiere. Samen Sie 15 – 20 L1 Tiere in jeder gut mit 6-gut einstellbare Abstände Pipette und Reagenz Reservoir, ähnlich wie 1.2.7. In regelmäßigen Abständen mischen Sie L1 Lösung absetzen der Tiere zu verhindern.
  4. Verhinderung der Produktion von Nachkommen durch die Zugabe von 5-Fluoro-2'-Deoxyuridine (FUdR)
    1. Folgen Sie Schritt 1.3.1.  Bereiten Sie steril 50 x FUdR Lager (siehe Schritt 1.3.1.1).
    2. Wenn Tiere erreichen L4, hinzufügen 25 µL 50 X FUDR in jede Vertiefung von einer 24-Well Platte mit einer 6-Kanal-Pipette einstellbare Abstände.
  5. Partitur-Rentabilität
    1. Entfernen Sie einen Satz von replizieren Platten und Flut Brunnen mit der M9-Lösung Rekord insgesamt Tiere pro Bohrloch, und berühren Sie dann sanft ruhenden Tiere auf den Kopf mit einem Wurm-Pick (Abb. 2 b). Tiere nicht zu bewegen, werden als tot gewertet. Entsorgen Sie erzielte Platten. Rekord Lebensfähigkeit täglich.
      Hinweis: Tiere, Bruch, zeigen grob morphologischen Mängeln, versäumt, zu entwickeln oder auf der Seite des Brunnens kroch, sind zensiert werden, indem Sie von den Toten und insgesamt Werte ausschließen.
      1. Notieren Sie die Anzahl der Tiere, die innerhalb jedes gut zu jedem Zeitpunkt separat von den anderen Werten zensiert werden.
      2. Nicht Punkten, Brunnen, die haben keine Nahrung oder kontaminiert sind (z.B. Pilze oder Schleim); solche Brunnen gelten als zensiert. Auch eine gut zu zensieren, wenn alle Tiere morphologische oder Entwicklungsstörungen Mängel anzuzeigen. Die Zensur Veranstaltung für diese RNAi Klon/gut zu diesem Zeitpunkt aufzeichnen.
      3. Nach seinem Tor eine Replicate Platte, verwerfen. Weiterhin erzielte eine neue Replikation setzen jeden Tag, bis alle Tiere in alle Wells tot sind. Um das Risiko von scoring Voreingenommenheit der Experimentator blind für experimentellen Bedingungen bleiben muss und ebenso darf nicht verweisen die Ergebnisse aus früheren Zeitpunkten während scoring.
      4. Wenn alle Tiere in einen Brunnen waren tot zu einem bestimmten Zeitpunkt, dann nach diesem Tag scoring, prüfen, ob alle Tiere als tot für zwei aufeinander folgenden Zeitpunkten für erzielt eine gegebene gut. Wenn ja, ist die erzielte Lebensfähigkeit für, dass auch in späteren Zeitpunkten nicht mehr benötigt.
      5. Durchführen Sie weitere unabhängige Experiment Studien. Verfolgen Sie die Ergebnisse von aufeinanderfolgenden Prüfungen getrennt von denen in früheren Studien mit der Prüfungsnummer zur Kenntnis genommen.

3. grafische Darstellung von Daten

Hinweis: Mit der Replikatgruppe ist eine Kurve passen Verfahren ungefähren Mittelwert und maximale Lebensdauer. Die Parameter zur Beurteilung von C. Elegans Sterblichkeit passen ein Logit-Kurve-19.  Da die meisten überleben Tools Logit Kurvenanpassung nicht unterstützen, wurde ein neues Programm entwickelt, für das Plotten Logit-Kurven (für Replikatsatz); Kaplan-Meier-Kurven (für die traditionelle Methode) werden ebenfalls unterstützt.

  1. Erste Schritte mit der Software. Download der Version Zip-Datei für die aktuelle Version (siehe Abschnitt Materials). Extrahieren Sie die Zip-Datei in einen Ordner. Siehe "Readme" Datei in den entpackten Ordner für zusätzliche Installationsanweisungen.
  1. Starten Sie das Plotten Interface. Suchen Sie den Speicherort des Verzeichnisses "Code" in den Ordner aus der Zip-Datei extrahiert (z.B.  "/ Benutzer/Benutzername /Desktop/WormLife/Code").
    1. Geben Sie die folgenden Befehle in der R-Konsole als Ersatz für den Ordnerpfad nur identifiziert. Drücken Sie eingeben oder zurückkehren, nachdem jede Zeile eingegeben: (1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), (2) source("plotGUI.R"), (3) openMain().
    2. Planen Sie Zeit für die Schnittstelle in einem neuen Fenster geladen Erziehung der Standard-Bildschirm wie in Abbildung 3Agezeigt. R, die im Hintergrund laufen zu lassen.
  2. Datenformat als durch Kommas getrennten Wert (CSV) oder tabulatorgetrennte Wert (TSV) Dateien. Geben Sie Spalten und Namen, abhängig von der Art der Analyse. Vorformatierte Beispieldaten finden Sie unter zusätzliche Datei-4 (Replikat festgelegt) und ergänzende Datei 5 (traditionelle/Kaplan-Meier).
    Hinweis: Daten müssen angegeben werden, in einem "langen" Format, d. h. eine Zeile pro Sorte/Behandlung pro Zeitpunkt pro Versuch. CSV-Dateien werden für optimale Kompatibilität zwischen verschiedenen Plattformen empfohlen.
    1. Entfernen Sie Zeilen entsprechend der Beobachtungen, die übersprungen oder zensiert wurden. Überprüfen Sie das Fehlen von fehlenden oder nicht-numerische Werte, da es zu einem Fehler führen kann, wenn die Daten importiert werden.
    2. Für traditionelle Kaplan-Meier Analyse, nicht Daten aus unabhängigen Studien-Plot bündeln sie separat. Für die Replikatgruppe Analyse bündeln Daten aus mehreren Studien, und untersuchen Sie mithilfe der Funktion "TrialView" (siehe 6.3.3.4).
  3. Mit Hilfe der Plotten Schnittstelle
    1. Laden Sie eine Datendatei ("Importieren" im Menü "Datei") im Dialogfeld. Um ".csv" Dateien öffnen, ändern Sie den Dateityp in der Dropdownliste ".csv" (der Standardwert ist ".txt/.tsv"), navigieren Sie zu dem Ordner mit der Datendatei. Hier ist die Datei die Replikatgruppe Beispieldaten (zusätzliche Datei-4).
      Hinweis: Eine Datei zu importieren, wenn ein Dataset bereits geöffnet ist wird der aktuelle Datensatz ersetzt.
    2. Wählen Sie eine Datei importieren, um den Import-Assistenten starten Sie die Spaziergänge durch die Spalten der ausgewählten Datei (Abbildung S1A für Replikatsatz) zu identifizieren. Wenn die eingegebenen Daten eine Replikatgruppe Experiment entspricht, wählen Sie "Logit" für Studientyp.
      Hinweis: Der Import-Workflow unterscheidet zwischen Replikatsatz (Abbildung S1A) und traditionellen (Kaplan-Meier) (Abbildung S1B).
    3. "Plot-Daten". Wählen Sie "Add Line" beginnen Daten Plotten. (Eine Zeile entspricht einer bestimmten Bedingung. Es gibt Funktionen, die mit Experimenten zu helfen wo viele Bedingungen getestet wurden).
      1. Plotten der Kontrolle Bedingungen-bei den Beispieldaten N2 (WT) mit L4440 (leerer Vektor) RNAi eignen. Wählen Sie "Zeile hinzufügen" im Menü "Diagramme" auf den Linien Hinzufügen-Assistenten zu starten: Wählen Sie die Bedingung, die Handlung und die graphische Parameter für die Darstellung der Linie.
        1. Um eine Kurve für eine andere Erkrankung manuell hinzuzufügen, wiederholen Sie die Schritte im 3.3.3.1
        2. Ändern Farbe oder Symbol für eine Linie zeichnen, wählen Sie "Modify Line" im Menü"Diagramm".
        3. Um eine Zeile zu entfernen ohne alle Zeilen zu löschen, wählen Sie "Zeile löschen" im Menü"Diagramm".
        4. Um alle Zeilen in der aktuellen Handlung zu löschen, wählen Sie "Zeile löschen" im Menü"Diagramm".
        5. Um die automatisch gewählte maximale x-Achse (Zeit) Wert zu überschreiben, verwenden Sie "Set X Scale" im Menü"Diagramm".
          Hinweis: der y-Achse (Überlebende Bruch) zeigt immer 100 % (oben) auf 0 % (unten) in Schritten von 20 %. Die x-Achse wird immer in Schritten von 5 angezeigt. Achsenbeschriftungen werden nicht geplottet, Flexibilität bei der Kennzeichnung nach dem Plot Bilder speichern aktivieren.
      2. Um JPEG-Format Bilder des aktuell angezeigten Plots zu speichern, verwenden Sie die "Speichern-Plot" Option im Dateimenü""; nur der aktuelle Plot wird gespeichert.
      3. Für die Erstellung von einzelner Parzellen für viele unterschiedliche Bedingungen in einem Experiment, ermöglicht die Software definieren und Plotten "Serie".
        Hinweis: Die Umsetzung des Konzeptes Serie verbessert die Effizienz bei der Arbeit mit großen Experimente.
        1. Wenn mit einem leeren Grundstück Arbeitsbereich beginnen, fügen Sie Zeilen Kontrolle entsprechen, die konsequent über alle Grundstücke in der Serie sein (siehe 3.3.3.1).
        2. Definieren Sie die Serie mit "Definieren Series" im Menü "Diagramme". Wählen Sie eine Bedingung entspricht der Linie zunächst in der Serie angezeigt; nur eine kann ausgewählt werden. Wählen Sie grafische Parameter (Line Farbe und Plot-Symbol) für die Linie, wie 3.3.3.1.
        3. Überprüfen Sie die Grundstücke für die verschiedenen Testbedingungen. Schalten Sie die Anzeige der "Serie" zwischen Bedingungen mit den Links/rechts Pfeiltasten auf den Seiten des Fensters Haupthandlung sowie in der oberen Menüleiste (Abbildung 3A-C) gefunden.
          Hinweis: Wenn der ausgewählten Serie die gleichen Bedingung als eines der zuvor hinzugefügten Kontrolle/Referenzlinien ist, kann die neue Linie überlagert angezeigt.
        4. Definieren Sie die Serie, um bestimmte andere Funktionen zur Verfügung (speichern Serie Grundstücke und Trialview-siehe 3.3.3.4 für Letzteres) zu machen. Nach der Definition einer Reihe, die Option "Speichern Serie Plots" aus dem Menü "Datei" zu einzelnen Plot-Image-Dateien für jeden Plot in der Serie in einem neuen Ordner speichern.
      4. Trialview — visualisieren Ergebnisse unabhängiger Studien einer Replikatgruppe Experiment. Wenn mehrere Prüfungen für eine oder mehrere der Probe Gruppen ausgeführt wurden, zeichnen Sie die Daten aus den einzelnen Studien und die gepoolten Daten aus allen Studien getrennt, die Konsistenz zwischen unabhängigen Studien (siehe Abbildung 3D) zu bewerten.
        1. Richten Sie eine Reihe wie in 3.3.3.3 beschrieben. Die verschiedenen Studien werden für jede "unterschiedliche" Probe-Gruppen in ein anderes Bild über die jeweiligen Prüfungen für den angegebenen Verweis/Kontrollproben geplottet werden.
        2. Um die TrialView Bilder zu speichern, gehen Sie zu "Print TrialViews" im Menü "Daten"; eine JPEG-Bild wird für jeden Plot in der Serie ausgegeben.
          Hinweis: Die Beispielergebnisse in Abbildung 3D ist für einen Fall mit zwei Studien.
    4. Mittlere Lebensdauer zusammenfassende Tabelle für Replikatsatz Daten. Visuell inspizieren Kurven zum vernünftigen Sitz der Daten zu gewährleisten, und wählen Sie dann " "Übersichtstabelle "Option im Menü" Daten "zum Speichern einer Tabelle mittlere Lebensdauer Werte (Zeit bei 50 % Überleben auf Logit-Kurve) für jede Probe.
  4. Statistische Auswertung der Daten über die Replikatgruppe Methode generiert
    1. Für die statistische Analyse zwischen zwei Gruppen von einer Replikatgruppe Experiment, zu ändern, und führen Sie eine R-Skript in der Release-Zip-Datei zur Verfügung gestellt (siehe "WormLife statistische Analyse Vorlage Skript. "R").
      Hinweis: Kenntnisse in R ist nicht erforderlich, um das Skript auszuführen. Zusätzliche Dokumentation ist in den Kommentaren in der Datei. Das Skript ist für die Analyse des Beispiels Replikatsatz Daten bereit. User generated Daten im geeigneten Format können (siehe ergänzende Datei 4) auch analysiert werden.
      1. Öffnen Sie die Skriptdatei in R (R-GUI oder RStudio).
        Hinweis: Dies wird das Skript anzuzeigen, ohne es auszuführen.
      2. Ändern Sie die Speicherorte der erforderlichen Dateien an den Speicherort auf Ihrem Computer übereinstimmen.
        Hinweis: Diese Dateipfade "voll qualifiziert" sein müssen (d.h. sollte den komplette Dateispeicherort, einschließlich der Ordner enthalten).
        1. Ändern Sie die Pfade (Datei/Ordner Standorte) für "WlDir" (Speicherort des Verzeichnisses), "DataFile" (die Replikatgruppe Datendatei zu analysieren), "CompFile" (Spezifikation Vergleiche zu laufen, falls zutreffend) und "OutputPath" (Standort wo Ergebnisdateien geschrieben werden zu).
      3. Legen Sie die Spaltennamen im Abschnitt "Geben Sie Spalten in der Datendatei", wenn Spaltennamen in der zu analysierenden Datei aus der Beispieldatei unterscheiden. Eine Spalte für jeden Parameter angeben. Wenn eine Studie mehrere Stämme hat, aber keine RNAi (oder einer anderen Behandlung) eine Spalte in der Datendatei mit leere Einträge oder das gleiche für alle Zeilen (z. B. "No_treatment", etc. enthalten).
      4. Legen Sie den Parameter "CompFile". Wenn der Parameter "CompFile" auf NA festgelegt ist, werden alle möglichen paarweise Vergleiche von Gruppen ausgeführt werden.
        Hinweis: Eine Gruppe zeichnet sich durch die Kombination von Belastung/Genotyp und Behandlung, die aneinandergereiht sind und als "Strain_treatment" angezeigt. Für größere Studien mit vielen Gruppen kann eine CSV-Datei angeben Vergleiche bereitgestellt werden. Die Beispieldatei "comps_rsm_example.csv" zu sehen.
      5. Legen Sie die Anzahl der Iterationen für Monte-Carlo resampling ("k.resamp", der Standardwert ist 1.000).
        Hinweis: P-Werte von 0 können zurückgegeben werden, wenn zu wenige Iterationen durchgeführt werden; in solchen Fällen ist es angebracht, Bericht "p < 0,01" (wenn k.resamp = 100), oder "p < 0,001" (wenn k.resamp = 1.000), etc.
      6. Führen Sie das Skript: Taste "Source" in RStudio (oben rechts im Fenster bearbeiten) oder "Quelldokument" im Menü "Bearbeiten" in der R-GUI. (Ausführung kann einige Zeit dauern.)
      7. Wenn die R "Statusanzeige" nicht mehr angezeigt wird, öffnen Sie die Ausgabe-Verzeichnis-dort wird eine Tabelle mit Ergebnissen von jedem Vergleich (mediane Überlebenszeit, p-Werte, mittlere Lebensdauer Veränderung in %).

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Representative Results

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Bei der Entwicklung einer neuen Methodik ist es unerlässlich, dass die neue Methode akzeptierte Ergebnisse von früheren Ansätzen rekapituliert und dem Standard innerhalb eines Feldes entspricht. Wir haben bisher empirisch gezeigt, dass die Replikatgruppe und traditionelle Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Lebensdauer ähnliche Ergebnisse20 produzieren. Wildtyp C. Elegans (N2) in der Regel bei 20 ° C gepflegt Leben zwischen 20 und 25 Tage, die wir mit dem traditionellen (Abbildung 4A, schwarze Linie) und die Replikatgruppe Ansatz (Abbildung 4 b, schwarz) beobachtet. Beide Methoden ungefähr so einigermaßen Wildtyp Lebensdauer. Es ist auch wichtig, dass eine neue Methode der Auflösung genau quantifizieren wechselt zwischen Testbedingungen und die statistische Aussagekraft, Veränderungen zu erkennen. In unserem vorangegangenen Studie entdeckten wir, dass die Myc-Familie von Transkriptionsfaktoren Determinanten von C. Elegans Langlebigkeit sind. MML-1 und Mxl-2 kodieren das C. Elegans Homologe von Säugetieren Mondo A / Kohlenhydrat-Response-Element bindende Protein (ChREBP) und Mlx, beziehungsweise. In C. Elegans und Säugetiere, diese Myc-Familie Mitglieder Heterodimerize, Transkription regulieren. Wir fanden, dass Verlust der Mml-1 oder Mxl-2 normale Lebensdauer gemessen, indem entweder eine traditionelle Lebensdauer-Assay oder Replikatsatz (Abbildung 4A-B, gelb und braun) deutlich verringert. Im Gegensatz zu der MML-1::MXL-2-Komplex fanden wir, dass Verlust der Mdl-1 (Homolog zu Säugetieren Mad) oder Mxl-1 (Max) C. Elegans Lebensdauer gemessen entweder Methodik (Abbildung 4 deutlich erhöht lila und blau, jeweils in beide Platten).

Eine ernsthafte Einschränkung der traditionelle Ansatz zur Messung der Langlebigkeit ist Durchsatz. Beide Methoden beruhen auf Bewegung zu nennen, ob ein Tier noch lebt oder tot, die schwieriger zu beurteilen wird. Junge Tiere bewegt sich in einem Teller in der Abwesenheit von Reizen und sind somit leicht zu erzielen. C. Elegans werden zunehmend alternden sitzende aber eine leichte Berührung mit dem Kopf durch eine Umkehr-Bewegung auf einem Teller beantworten. Jedoch wenn Tiere älter werden die Fähigkeit, rückwärts bewegen vermindert und wird zunehmend unkoordiniert. Letztlich Tiere gelähmt, einen Phänotyp ähnelt stark Sarkopenie und wenn über die traditionelle Methode Lebensfähigkeit scoring können nur durch die Beobachtung der subtilen zucken an der äußersten vorderen Spitze des Tieres ermittelt werden. Im Gegensatz dazu ist wenn Lebensfähigkeit über die Replikatgruppe Methode erzielte, die Flüssigkeit zum Brunnen, hinzugefügt fungiert als Anreiz, die eine Tracht Prügel Antwort generiert, die als ein Auslesen der Healthspan8quantifiziert werden können. Bewegung in der Flüssigkeit ist einfacher, für noch ältere Tiere beobachten: chronologisch Alter abgestimmt altersschwache Tiere erzeugen subtile Kopfbewegungen auf Trockenplatten aber stärker ausgeprägt (wenn auch langsam) Körper Kurve in Flüssigkeit. Zu guter Letzt Replikatsatz scoring, die ganze gut in das Sichtfeld (~1.1 cm im Durchmesser) wird und alle Tiere sind in Aussetzung - so dass Beobachtung aller Tiere gleichzeitig. Im Gegensatz dazu bei eine 6 cm Platte über die traditionelle Methode erzielte, muss man Scannen über den gesamten Teller - Suche durch den bakteriellen Rasen und an den Rändern für Tiere. Net Folge dieser Unterschiede ist, dass der Durchsatz bei Verwendung der Replikatgruppe Methode mindestens eine Größenordnung größer als der traditionelle Ansatz, der es ermöglicht, gleichzeitig Änderungen in Lebensdauer über mehr als 100 quantifizieren Bedingungen in einem einzigen Experiment mit einem Prüfer. Zum Beispiel sank von einer Genom-Fütterung-basierte RNAi Breitbild zuvor wir 159 Gene, die für die erhöhte Lebensdauer identifizierten durch übertragenen notwendig waren Daf-2 /Insulin-ähnliche8-Signalisierung. In diesem Analyse, wir die Veränderungen der Lebensdauer in Wildtyp, eine langlebige daf-2(e1370) Mutante und kurzlebigen daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) doppelte mutierten Tieren (Abb. 5A) quantifizieren, die uns erlaubt, den genetischen entschlüsseln Beziehungen zwischen Insulin-ähnliche Signal- und über 100 progeric gen inaktivierungen. Darüber hinaus untersuchten wir wie diese progeric gen inaktivierungen verändert Healthspan (damals "Activespan" genannt) durch die Beobachtung des Rückgangs in C. Elegans Prügel über Wiederholungen im Laufe der Zeit (Abbildung 5 b).

Figure 1
Abbildung 1: das Aufkommen der Fütterung basierend RNAi führen zu einer Ära der Gen-Entdeckung in der Alternsforschung, doch die meisten Gerogenes bleiben schlecht untersucht. (A) viele Gerogenes wurden ursprünglich aus groß angelegte funktionelle Genomik Bildschirme entdeckt. Von den mehr als 900 C. Elegans Gerogenes bisher entdeckten waren viele mit Fütterung-basierte RNAi, Hervorhebung des Wertes der funktionalen genomischer Ansätze in Gen Entdeckung identifiziert. Das Diagramm zeigt die Anzahl der Gerogenes pro Manuskript mit RNAi entdeckt, basierend auf Phänotyp Annotation (siehe Tabelle der Materialien) für Phänotyp Ontologie längere Lebensdauer Bedingungen verkürzt Lebensdauer und Lebensdauer Variante. Siehe zusätzliche Datei 1 für die vollständige Liste der Studien, die Gerogenes entdeckt. (B) die meisten Gerogenes bleiben schlecht untersucht. Im Gegensatz zu gut untersuchte Gerogenes wie Daf-16/FOXO (Pfeil), verfügt über mehr als 800 Referenzen, die meisten Gerogenes haben weniger als 10 Referenzen (Allgemeine Referenz-nicht unbedingt konzentrierte sich auf Lebensdauer). Zuverlässige Hochdurchsatz-Methoden werden wesentlich tieferen Einblick in die genetischen Zusammenhänge zwischen Gerogenes abgeleitet sein. Die Grafik basiert auf Zuordnungen zwischen Publikationen in PubMed und entdeckt von RNAi Phänotypen C.elegans -Gerogenes. Siehe zusätzliche Datei 2 für die vollständige Liste der Gerogenes und die Anzahl der Studien mit jedem verbunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Die traditionelle und Replica Set-Methode für das scoring C.elegans Lebensdauer (A). Die traditionelle Methode zur Bewertung von C. Elegans Lebensdauer. Mehrere kleine synchronisierte Populationen isogenen Tiere pro Zustand sind im Laufe der Zeit folgten. Der gleichen Population von Tieren ist im Laufe der Studie gefolgt. Lebensfähigkeit bemisst sich durch Bewegung, die durch sanften Druck stimuliert werden kann. Tiere, die nicht verschoben werden als tote gezählt und sind entfernt (Aspiration gezeigt) bis keine lebensfähige Tiere bleiben. (B). die Replica Set-Methode zur Bewertung von C. Elegans Lebensdauer. Eine große Population von Alter synchronisiert isogenen Tiere sind auf eine Anzahl von identischen replizieren Platten verteilt. Zu jedem Zeitpunkt eine einzelne Replikation erzielte: ein leichtes gepuffertes Lösung (M9) wird hinzugefügt, die Bewegung stimuliert. Tiere, die nicht spontan bewegen, nachdem Überschwemmungen Brunnen auch über bewertet werden berühren Reiz. Die scoring Dauer für das Experiment wird vor dem Start bestimmt. Jedes Tier wird nur einmal gewertet und Langlebigkeit für die größere Bevölkerung viele unabhängige Beobachtungen abgeleitet ist. (C). die Replikatgruppe Ansatz ist ein hoher Durchsatz-Methode zur Messung quantitativ C. Elegans Lebensdauer. 100 oder mehr unabhängige RNAi-Klone können gleichzeitig verfolgt werden. HT115 E. Coli mit dem Ausdruck DsRNA für einen gegebenen RNAi-Klon wird angezeigt. Praktisch, gliedern sich alle 24 Proben aus der 96-Well-Platte in einer einzigen 24-Well-Platte. Jede daraus resultierende 24-Well-Platte hat einen negativen (z. B. leerer Vektor, rot gut) und Positivkontrolle (grün gut) zufällig verteilt innerhalb einer Auflistung der RNAi-Klone (gelbe Brunnen). Die erste Bohrung (A1) in eine Sammlung enthält in der Regel einen leeren Vektor. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: die grafische Benutzeroberfläche (GUI). (A). die Haupthandlung Fensterschnittstelle zeigt die Standard-Willkommen-Bildschirm. Dies ist, was beim Öffnen der Software angezeigt wird. Unterschiede im Aussehen zwischen den Plattformen sollte durch Verwendung eines plattformunabhängigen Windowing-Toolkits minimal sein. (B). Überblick über Menü-Optionen für die Drop-Down-Menüs aus dem Fenster der Haupthandlung. (C). Beispiel Plotausgabe für beide Replikatsatz Stil (links) und traditionellen Kaplan-Meier-Stil (rechts) Daten. Die angezeigten Daten wurde in unabhängigen Experimenten gesammelt. Exportierte Grundstücke enthalten keine vor-gezeichneten Achsenbeschriftungen, für maximale Flexibilität in solche Etiketten hinzufügen. Um dies zu erleichtern, sind die Achsen immer in Schritten von 20 % für die Y-Achse und Schritten von 5 für die X-Achse unterteilt. In diesem Beispiel wurden die gespeicherten Grundstücke, eine sehr einfache und gemeinsame Bildbearbeitungs-Tool mit Achse und Linie Etiketten (Belastung/Behandlung) hinzugefügt. (D). ein Beispiel der Ausgabe von der "TrialView"-Funktionalität, so dass für den visuellen Vergleich zwischen den Ergebnissen von unabhängigen Studien für die Replikatgruppe Stil Datasets. Dieses Diagramm zeigt das Ergebnis zwischen zwei verschiedenen Studien und die entsprechenden gepoolten Ergebnisse für Daf-2 EV(RNAi) (blau, geschlossene Kreise), N2 EV (RNAi) (schwarz, geschlossene Kreise) und Daf-2 mit Daf-16 (RNAi) (rote, offene Diamanten). TrialView ermöglicht schnelle Überprüfung für Prozess-spezifische Daten Fragen, die die Qualität der Passung der gepoolten Dataset auswirken könnten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: die traditionelle und Replikatsatz Methoden produzieren ähnliche Ergebnisse. Verlust von entweder Bestandteil der MDL-1(Mad)::MXL-1(Max)-Heterodimer erhöht Lebensdauer. Im Gegensatz dazu, Verlust der beiden Komponenten des MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) sinkt die Lebensdauer dieser Figur von Referenz20 mit Erlaubnis über eine Creative Commons Namensnennung (CC-BY) Lizenz (siehe Material abgedruckt ist). (A). Kaplan-Meier führt mit der traditionellen Methode. (B). Logit Kurvenanpassung Replica Set-Methode verwenden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Die Replikatgruppe Methode genetische Interaktionen basierend auf Veränderungen in der Lebensdauer (A) und Veränderungen in Healthspan (B) für über 100 entziffern kann, klont RNAi gleichzeitig. Diese Zahl ist aus8 mit Erlaubnis unter der Creative Commons Namensnennung-nicht-kommerzielle 4.0 internationale Lizenz (CC-durch-NC) (siehe Material) abgedruckt. (A) genetische Lebensdauer Analyse der progeric gen inaktivierungen im Zusammenhang mit der verminderten Insulin-ähnlichen Signalisierung (ILS) (Daf-2, x-Achse) und in der Abwesenheit von Daf-16/FoxO (Y-Achse), eine zentrale transkriptionelle Effektor des ILS21 . Gen inaktivierungen mit ähnlichen Funktionen als Daf-16 verkürzen Lebensdauer in der Abwesenheit von Daf-16 (schwarze Punkte) nicht weiter. Gen inaktivierungen mit Funktionen, die völlig unabhängig von Daf-16 verkürzen sowohl genetische Hintergründe ebenso (grau). Gen inaktivierungen wo die negativen Auswirkung auf die Lebensdauer in Daf-2 > Daf-2; Daf-16, schlägt Funktion parallel (weiß). (B) die Prügel Steuersatzänderungen im Laufe der Zeit können die durchschnittliche Healthspan für viele genetische Störungen (x-Achse) bei der Begutachtung von Änderungen in Lebensdauer (y-Achse) ableiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung S1: Workflows in WormLife. Abbildung der Schritte von einigen geführte Workflows (manchmal benannt "Assistenten"). In jedem dieser Fälle nach dem letzten Schritt im Workflow ist der Fokus zurück zum Fenster Haupthandlung zurück. (A) die Daten importieren Workflow für Replikatsatz Stil Datasets (B) die Daten Workflow für traditionelle Kaplan-Meier-Stil-Datensätze importieren. (C) den Workflow für das Hinzufügen von Zeilen zu einem Grundstück für Replikatsatz Stil Datasets. (D) den Workflow für das Hinzufügen von Zeilen zu einem Grundstück für traditionelle Kaplan-Meier-Stil-Datasets. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 1: Studien, die Gerogenes identifiziert haben. Das Aufkommen der Fütterung-basierte RNAi führte zu einer Ära der Gen-Entdeckung für Phänotypen, die nicht behandelbar waren durch vorwärts Genetik, einschließlich Alterung. Aufgeführt, sind in der Reihenfolge der Zahl der Gerogenes entdeckt, unabhängige Studien, die Gene identifiziert, deren Tätigkeit Lebensdauer verändert. Beachten Sie, dass die Studie, die am meisten Gerogenes identifiziert die Replicate Set-Methode8genutzt. Die Natur der wie gen inaktivierungen verändert Lebensdauer auch angegeben wurde: Langlebigkeit und progeric Gene sind diejenigen, die erhöht oder verringert die Lebensdauer bzw. inaktiviert. "Lebensdauer-Variante" bezieht sich auf Fälle wo Direktionalität ändern (d. h. erhöhte oder verringerte Lebensdauer) wurde nicht angegeben oder nicht kuratiert wurde. Daten aus WormBase WS262 (Januar 2018) (siehe Material), mit dem Zusatz von RNAi-Behandlung Lebensdauer ergibt sich aus Referenz10, die noch nicht in die kuratierte Sammlung von WormBase RNAi Phänotypen enthalten sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 2: die Anzahl der Studien verbunden mit jeder Gerogene. Die meisten Gerogenes sind schlecht untersucht. Während einige Gene, wie Daf-16/FoxO, das Thema der Forschung Aufmerksamkeit gewesen, haben mehr als 400 Gerogenes weniger als 10 zugehörigen Publikationen. Daten aus WormBase WS262 (Januar 2018), mit dem Zusatz von RNAi-Behandlung Lebensdauer ergibt sich aus10 , die noch nicht in die kuratierte Sammlung von WormBase RNAi Phänotypen enthalten sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 3: Vorbereitung der gemeinsamen Reagenzien für C. Elegans experimentiert. (A). Rezept für NGM und RNAi standardteller. (B). -Rezept für M9-Puffer und Hypochlorit-Lösung. (C). Vorbereitung der LB + Amp/Tet Teller. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 4: Beispieldaten Replikatsatz. Ein Beispiel-Dataset aus einer Replikatgruppe Lebensdauer Experiment. Dieser Datensatz wird bereits formatiert, dass für Import/Analyse geeignet. Beinhaltet zwei Versuche pro Zustand (Kombination von Belastung/Genotyp und RNAi). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 5: traditionelle längs Beispieldaten. Ein Beispiel-Dataset aus einer traditionellen längs-Lebensdauer-Experiment, mit rechts-Zensur, formatiert für bereit Import/Analyse mit Kaplan-Meier-überleben-Plot-Funktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

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Die traditionelle und Replica setzen-Methoden erfordern die Synchronisation von chronologisch im Alter von Tieren. Wir sind eine Methode, die Tiere mit Hypochlorit Behandlung von trächtigen Erwachsene, wo nur die befruchteten Eier mit der trächtigen Erwachsene Behandlung überleben synchronisiert. Diese Embryonen schlüpfen in flüssige Suspension und Entwicklungsgeschichtlich im ersten Larvenstadium (L1) verhaften. Nach der Aussaat L1 Tiere auf Nahrung (z.B. E. Coli mit dem Ausdruck ihrer DsRNA zu einem gen des Interesses), wieder Tiere Entwicklung aufzunehmen. Synchronisieren von L1 Tiere von Hypochlorit-Behandlung von trächtigen Erwachsene hat den Vorteil, dass die übrig gebliebenen ungesetzte L1 Tiere eingefroren und in flüssigem Stickstoff oder einem-80 ° C Gefrierschrank auf unbestimmte Zeit gespeichert werden können. Auf diese Weise wird eine Probe von jedem Stamm zum Zeitpunkt des experimentellen Aufbaus beibehalten, erstellen eine wertvolle Ressource für zukünftige Studien und Verbesserung der Reproduzierbarkeit. Jedoch während Hypochlorit Behandlung trächtigen adulter Tiere eine gängige Methode zum synchronisierten Tiere altern Forschung22zu erhalten ist, ist die L1 Verhaftung eine Hungersnot Antwort. So bevorzugen manche Labors entweder um Schlupf auf Platten, auftreten oder zu Hypochlorit Behandlung ganz zu verzichten und lassen ein paar trächtigen Erwachsene zur Eiablage (d. h. ein Ei legen) für mehrere Stunden zu ermöglichen. Im letzteren Fall Eltern werden entfernt und die Lebensdauer der Nachkommen gefolgt. Nach bestem Wissen und gewissen wurden keine offensichtlichen Unterschiede in der Lebenserwartung zwischen den Tieren gemeldet, die in M9, auf Platten oder Nachkommen aus einem Ei-Lay geschlüpft synchronisiert wurden. Angesichts der Tatsache, dass Veränderungen der nährstoffverfügbarkeit eng mit Veränderungen der Lebensdauer verbunden sind, ist jedoch Vorrang vor, dass bestimmte genetische Hintergründe unterschiedliche Ergebnisse zwischen diesen Ansätzen Synchronisation produzieren könnte. Eine sorgfältigere Analyse ist erforderlich, um diese theoretische Anliegen zu lösen.

Unabhängig von der Methode verwendet, um den Start Bevölkerung zu synchronisieren müssen Schritte unternommen werden, um entweder Nachkommen Produktion zu verhindern oder die synchronisierte Start Bevölkerung von zukünftigen Nachkommen zu trennen. In unserem Protokoll beschreiben wir wie mithilfe von FUdR um Nachkommen Produktion zu verhindern als Trennung der Tiere ist kein gangbarer Weg für den Replikatsatz Methode. Es ist auch möglich, zu verhindern, dass Nachkommen Produktion genetisch durch den Einsatz von Feminisierten genetischen Hintergrund (z. B. fer-15(b26);fem-1(hc17), die eine temperaturabhängige sterile Sorte23). Jedoch ist weder ohne Mängel: die Nutzung der genetischen Hintergründe kann nachfolgende Analyse erschweren und in einige genetische Hintergründe FUdR Langlebigkeit24,25,26verändern kann.

Als Alternative zur Nachkommenschaft zu verhindern Produktionsmittel durch chemische oder genetische, ausgewachsene Tiere in regelmäßigen Abständen frische RNAi Platten verschoben werden können, um sie von ihren Nachkommen zu isolieren. Dies vereinfacht die Hintergrund Überlegungen auf Kosten der Durchsatz. In regelmäßigen Abständen bewegenden Tieren für frische Lebensmittel hat die zusätzlichen Vorteile möglich verhungern zu verhindern und Exposition gegenüber DsRNA zu erneuern. Jedoch einige genetische Interaktionen, die die Lebensdauer beeinflussen wurden erst entdeckt, wenn Nachkommen Produktion gehemmt wurde: frühe Analyse des TGFβ-Signalwegs für eine Lebensdauer-Phänotyp fälschlicherweise dem Schluss, dass verminderte TGFβ Signalisierung C. Elegans beeinflusst Dauer Bildung aber nicht Altern27,28. Jedoch zeigte eine Follow-up-Studie, die FUdR verwendet, die Signalisierung erhöhte Langlebigkeit durch Insulin Signalisierung29TGFβ verringert. Warum hat frühere Studien nicht erhöhte Lebensdauer von TGFβ mutierte Tiere sehen? TGFβ Weg Mutationen produzieren einen leichten defekt (Egl) zur Eiablage und reproduktive Langlebigkeit, wodurch interne Schraffur Nachkommen später im Leben, die das übergeordnete Element tötet zu verlängern. Es ist wahrscheinlich, dass die langlebigen TGFβ mutierte Tiere erschienen haben eine normale Lebensdauer wegen der Egl Phänotyp der Tiere um die Zeit getötet als Wildtyp Tiere normalerweise sterben. Dies möglicherweise relevant zu anderen genetischen Wege verbunden, DR, wie ausgehungert Wildtyp Tiere auch eine Egl Phänotyp, vielleicht als eine adaptive Überlebensvorteil an Nachkommen unter den Bedingungen der niedrigen Essen manifestieren. Dies zeigt die zugrunde liegende Komplexität in adaptive Reaktionen, die Tiere unter Stressbedingungen und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Analyse und Prüfung zu unterziehen, wenn Lebensdauer Experimente zu entwerfen.

In Konzeption und Durchführung von Experimenten Lebensdauer von beiden Methoden ist es wichtig, die Verzerrungen zu vermeiden. Experimente müssen in einer Doppelblind-Art und Weise durchgeführt werden: wie Proben wurden bereits zu früheren Zeitpunkten erzielte und die Identität einer Testbedingung muss der Experimentator unbekannt sein. Darüber hinaus ist es immer notwendig, positive und negative Kontrollen umfassen; im Falle der Replikat-Set-Methode werden diese nach dem Zufallsprinzip in einer 24-Well-Platte eingefügt. E. Coli mit dem Ausdruck ein Plasmid, das keine Beilage mit der Sequenz enthält ist entsprechend der C. Elegans Genom leerer Vektor Negativkontrolle (d. h. "L4440"-siehe Materialien). Positivkontrollen sind abhängig von den Besonderheiten eines Experiments. Zum Beispiel Daf-2 kodiert C. Elegans Insulin/IGF-1 Rezeptor, und Daf-2 Inaktivierung über Fütterung-basierte RNAi kräftig erhöht Lebensdauer mindestens zweifach in Wildtyp Tiere-27. So könnte daf-2(RNAi) als Positivkontrolle dienen, bei der Suche nach gen inaktivierungen, die Lebensdauer zu erhöhen. Umgekehrt, Daf-16 codiert FOXO Transkription Faktor orthologs30. DAF-16 ist ein wesentlicher Bestandteil von vielen Langlebigkeit Paradigmen und Wildtyp Tiere (N2) mit daf-16(RNAi) behandelt sind kurzlebig und Anzeichen von Progerie31.

Die Hauptvorteile des traditionellen längs-Lebensdauer Ansatzes liegen, es ist sehr gut etabliert, und Experimente sind einfach einzurichten. Relativ wenige Tiere sind nur ein paar Platten für jede Bedingung erforderlich. Stämme, die schlecht wachsen oder benötigen Balancer zu propagieren können somit leicht getestet werden. Der traditionelle Ansatz ist sehr anpassungsfähig und kann mit einem der verfügbaren Ansätze für Umgang mit Nachkommen-Produktion, einschließlich der Behandlung mit FUdR, Kreuzung in einer Feminisierten genetischen Hintergrund oder in regelmäßigen Abständen verschieben Erwachsene Tiere zu neuen Platten verwendet werden während der Eiablage Zeit. Während Durchsatz bewegenden Tieren erheblich reduziert werden, arbeiten mit einem mutierten Hintergrund ist nie ideal, und obwohl FUdR Wildtyp Lebensdauer32,33,34nicht ändert, kann es Einfluss auf Lebensdauer und Alter verbundene Phänotypen einige genetische Hintergründe35,25,26. Beachten Sie, dass die Anwesenheit von Männern, auch mit dem Einsatz von FUdR, verkürzt erheblich Zwitter Lebensdauer13, also eine Platte, die Männchen enthalten, nachdem die Hermaphroditen L4 erreicht ist unbrauchbar. Ebenso ist Analyse durch die Kaplan-Meier Abschätzer und damit verbundenen Kurven und die Log-Rank-Test für Mortalitätsdaten etabliert. Es gibt jedoch einige Nachteile der traditionellen Lebensdauer Analyse. Wiederholte Handhabung der Platten (d.h. die Platten an der Luft aussetzen) erleichtert die Einführung von airborne Pilzbefall. Darüber hinaus wiederholt stossen kann beschädigen oder töten Tiere, vor allem wie die Bevölkerung in Alter Fortschritte und brüchig. Ältere Tiere werden weitgehend gelähmt und stecken in E. Coli, während E. Coli eine opportunistische Erreger (das Lumen zu besiedeln und Verpackung des Rachens)36 wird. Sehr alte lebende Tiere können nur durch subtile Kopfbewegungen identifiziert werden. So ist es leicht zu ein altersschwaches lebenden Tier als tot zu klassifizieren. Zu guter Letzt ist der traditionelle Ansatz durch Durchsatz begrenzt.

Die Replikatgruppe Methode ist hoher Durchsatz und quantitative. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch eine größere Investition an Zeit und Ressourcen bei der ersten Einrichtung. Ein mäßig großen Experiment untersuchen 100 RNAi-Klone, die mehr als 20 Mal Punkte erfordert 30.000 L1 Tiere (wo ca. 15 Tiere pro RNAi Klon pro Zeitpunkt geprüft werden), was zwar einfach für die meisten Sorten, in einigen Fällen problematisch sein kann. Ohne ein großer Partikel Sorter ("Wurm-Sorter") Stämme, die mit Balancer oder transgenen Linien tragen einzuhalten sind, kann ein schlecht übertragenen extra chromosomalen Array beispielsweise leicht von dieser Methode untersucht werden. Ein zweiter Nachteil ist, dass Nachkommen Produktion gehemmt werden muss, erfordert die Verwendung von FUdR oder einer Feminisierten genetischen Hintergrund. Schließlich muss man die Länge der Zeit, die der Test läuft, wissen, wie man eine Replikatgruppe für jeden Zeitpunkt zu Beginn des Experiments vorbereiten muss. Die Vorteile dieser Methode sind jedoch zahlreich. Vor allem scoring Lebensfähigkeit ist viel schneller und kann man leicht Tiere über 100 Testbedingungen folgen gleichzeitig (d.h. RNAi-Klone). Da eine Replikatgruppe ist nur einmal erzielte dann verworfen, es gibt keine wiederholte Behandlung der Platten oder wählen Sie stossen von Tieren, die minimiert der Wahrscheinlichkeit von Pilzbefall und eliminiert Sterblichkeit durch die gelegentliche rau drängen mit einem Wurm verursacht. Darüber hinaus erleichtert die Zugabe von Flüssigkeit zu dem Brunnen erzielte. Alte Tiere von der Platte zu befreien und den umliegenden Bakterien hilft bei ermöglicht subtile Kopfbewegungen leichter erzielt werden. Zugabe von Flüssigkeit bietet auch die Möglichkeit, Prügel als ein gewisses Maß an Fitness (z.B. Healthspan8,37) messen.

Altern ist ein komplexes Phänomen mit mehreren kausalen Mechanismen erfordern Systeme biologische Ansätze zu entwirren. Diese Ansätze oft datengetriebene Modellierung, mit großen Datenmengen genomische/transkriptomischen, zu integrieren und erfordern ergänzende robuste und Hochdurchsatz-Methoden, Lebensdauer und Healthspan zu messen. Hochdurchsatz-Replica Set-Methode ermöglicht Vergleich der vielen RNAi-Klone längs, bei gleichzeitiger Minimierung der Batch-Effekte und technischen Fehlern, und erleichtert so die Entwicklung von dynamischen Modellen, die die Wechselwirkungen zwischen kausale Pfade im ableiten kann eine quantitative Art und Weise. Darüber hinaus ist mehrere genomweite Genomics Ansätze mit der Replikatgruppe Methode möglich, da eine große Population von Alter synchronisiert Tiere sich in eine Reihe kleiner Populationen gliedert.

Andere Methoden wurden bisher entwickelt, um den Durchsatz von C. Elegans Lebensdauer Experimente, wobei Sie sich über die Anpassung des traditionellen längs-Ansatzes verbessern (d. h. nach den gleichen Satz von Tieren im Laufe der Zeit) zu automatisierten Beobachtung und Aufzeichnung mit gemeinsamen Flachbett-Scanner38,39oder mehr Spezialgeräte wie z.B. mikrofluidischen Platten40. Die Scanner-basierte Ansätze nutzen Licht als Anregung und vergleichen Sie nacheinander aufgenommenen Bilder um basierend auf Bewegung für mehrere Platten auf einmal lebendig/tot-Status zu bestimmen; solche Ansätze erfordern keine proprietären wissenschaftliche Hardware, kann Zeitaufwand bei der Einrichtung von Workflows erheblich je nach der gewünschten Maßstab sein. Alternativ können Lebensdauer Experimente in benutzerdefinierten mikrofluidischen Geräten für eingehende phänotypischen Charakterisierung der einzelnen Tiere im Laufe der Zeit und ohne Behandlung zu verhindern nachkommen, aber erfordern Herstellung der mikrofluidischen Platten und Erwerb der damit verbundenen mikrofluidischen Pumpen und bildgebende Geräte. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Replikatgruppe Methode in Kombination mit der Software, die hier stark verbesserten Durchsatz mit Werkzeugen, die in Laboratorien mit C. Elegansarbeiten bereits üblich sind.

Die WormLife-Software wird in Zukunft verbessert werden, um leichteren Zugang zu den statistischen Vergleich und Kompatibilität mit zusätzlichen Plattformen bieten. Die aktuellste Dokumentation der Software finden Sie bei GitHub Seite, einschließlich Installationsanweisungen für Plattformen, auf denen die Software getestet wurde. Eine Web-basierte Version wird auch entwickelt, um bequemen Zugang ohne die Notwendigkeit, keine Software installieren können.

Zusammenfassend lässt sich sagen bietet die Kombination von Replica Set-Methode und die frei verfügbare Software, die hier eine leistungsfähige Plattform zur Verbesserung der Durchsatz und die Robustheit der Lebensdauer Experimente und ein breites Spektrum von überleben basierende Assays (z.B. Stress, Toleranz, toxikologischen Untersuchungen, Healthspan usw.). Besonders in Kombination mit funktioneller Genomik nutzt dieser Ansatz die vielen Vorteile der Metazoen Modellsystem C. Elegans für die Entschlüsselung der unzähligen genetische Interaktionen, die dazu, das Fortschreiten beitragen des Alterns.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Finanzierung dieser Arbeit beschrieben in diesem Manuskript von zur Verfügung gestellt wurde: die University of Rochester-Büro der Propst und der School of Medicine und Dentistry Dekanat über die Health Sciences Center für Computational Innovation (HSCCI); die Ellison Medical Foundation neue Wissenschaftler in alternden Fellowship (AG-NS-0681-10) hatte die Geldgeber keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen <em>Caenorhabditis Elegans</em> Lebensdauer
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Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

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