Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819

Summary

כאן נתאר שיטת עותקים משוכפלים, גישה באופן כמותי מודדים C. elegans תוחלת החיים/הישרדות, healthspan באופן תפוקה גבוהה וחזק, ובכך לאפשר הקרנה של מצבים רבים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. פרוטוקול זה מפרט את האסטרטגיה, ומספק כלי תוכנה לניתוח של נתונים המשוכפלים.

Abstract

השיטה העותקים המשוכפלים היא גישה למדוד באופן כמותי תוחלת החיים או ההישרדות של נמטודות Caenorhabditis elegans באופן תפוקה גבוהה, ובכך מאפשר חוקר יחיד למסך טיפולים או תנאים נוספים על אותה כמות של זמן ללא אובדן של איכות הנתונים. השיטה דורשת ציוד נפוץ נמצאו רוב מעבדות עובד עם C. elegans , והוא לכן פשוט לאמץ. הגישה מתמקדת assaying דגימות עצמאית של אוכלוסיה בכל נקודה תצפית, ולא דוגמה אחת לאורך זמן כמו עם שיטות מסורתיות האורך. אשר הניקוד כרוך הוספת נוזל הבארות של צלחת רב טוב, מעורר C. elegans לעבור ומקל לכימות לשינויים healthspan. היתרונות העיקריים האחרים של השיטה העותקים המשוכפלים כוללים חשיפה מופחתת של אגר משטחים כדי מזהמים הנישאים באוויר (למשל עובש או פטריות), מינימלי טיפול בעלי חיים, ועמידות סדיר בזיהוי שגיאות ניקוד (כגון קוראים חיה למתה זה עדיין בחיים). כדי כראוי לנתח והמחש את הנתונים מתוך ניסוי סגנון עותקים משוכפלים, פותחה גם כלי תוכנה מותאמת אישית. ליכולות הנוכחיות של התוכנה כוללים התוויית של עקומות הישרדות הן עותקים משוכפלים ואת הניסויים (קפלן-מאייר) המסורתי, כמו גם ניתוח סטטיסטי עבור עותקים משוכפלים. הפרוטוקולים שסופק כאן לתאר ניסיוני הגישה המסורתית בשיטת עותקים משוכפלים, כמו גם סקירה של ניתוח הנתונים המתאימים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אחד הפיתוחים הטכנולוגיים טרנספורמטיבי ביותר להבנת בסיס גנטי של הזדקנות היה הפיתוח של האכלה מבוססי RNAi ב- C. elegans1; לפני שימוש ניסיוני RNAi, פנוטיפים רבים של הזדקנות לא היו גנטית צייתן. RNAi האכלה מבוססי מושגת דרך יצירת dsRNA בתוך החיידק המתאים אנדוגני C. elegans mRNA: IPTG גורם שעתוק דו-כיווני מעבר מוסף של cDNA C. elegans או או חלק מסגרת קריאה פתוחה בתוך פלסמיד2. כאשר C. elegans להאכיל על ללא פגע dsRNA e. coli, מיוצר על ידי חיידקים מועבר מן לומן לתאי המעי באמצעות חלבון טראנסממברנלי סיד-23, הופצו בין שאר החיות באמצעות סיד-14. בתוך כל תא, dsRNA אקסוגני יעובד על-ידי לטעמים מורכבים לתוך siRNA, אשר אינטראקציה עם mRNA בוגר דרך זיווג הבסיס משלימים ליצירת חדש דופלקס siRNA-mRNA. דופלקס זה מזוהה על-ידי המתחם RISC, ביקע, ובכך משפילים את ה-mRNA אנדוגני5. לפיכך, על ידי, רק לשנות את תותב פלסמיד אחד יכול להשבית את הפונקציה של כמעט כל הגנים בתוך הגנום C. elegans . תגלית זו הובילה ליצירת מספר גדול RNAi האכלה מבוסס ספריות-אוספים של טרנספורמציה מניות e. coli שניתן לשלב כדי להשיג כיסוי של-86% ידוע C. elegans גנים6, 7.

מאז לקידום האכלה מבוססי RNAi, מסכי מקיף C . elegans הובילו גילוי גנים למעלה מ-900 לשנות תוחלת כאשר לא פעיל (כפי שמעידים השיוכים RNAi-פנוטיפ מספר פעמים ב- WormBase), שאותם אנו מכנים כדי כמו gerogenes. תפקיד עבור הרוב המכריע של gerogenes בשליטה אריכות ימים התגלה באמצעות האכלה מבוססי RNAi בדוחות הזרע ספורות (ראה איור 1A ו- 1 קובץ משלים לפרטים). במקרים מסוימים, gerogenes אלה זוהו מבוסס על מדידת הכדאיות בודד או מספר נקודות זמן, נכשל לספק מידה הניתנת לכימות של שינוי תוחלת חיים עם טיפול RNAi. במקרים אחרים, הגנים האלה היה להעריך באופן כמותי לקראת שינויים תוחלת חיים, וכן פנוטיפים נוספים הקשורים לגיל. למשל, בעבר זוהו גנים 159 היו נחוצים עבור תוחלת החיים הרגילה והן מוגברת של חיות עם איתות אינסולין/IGF-1 ירידה ולאחר לכמת את השינויים ב- healthspan. אלה, 103 ג'ין inactivations לגרום הפנוטיפ progeric, כמו אובדן, גרמו סימני הזדקנות מוקדמת8אחד או יותר.

בעוד כמה gerogenes קושרו עם 100 או יותר מחקרים (למשל הדף היומי-16, הדף היומי-2, אדוני-2.1), gerogenes מעל 400 יש אזכורים 10 או פחות (איור 1B, ו -2 קובץ משלים). לכן, בעוד מסכי RNAi האכלה מבוססי מקיף גילה ואתה cursorily מאופיין מאות בשם gerogenes, איך פונקציה גנים בשליטה אריכות ימים, את קשרי הגומלין גנטי בין מוצרים אלה ג'ין נותרו לקוי למד. ניתוח מלא האורך של גיל-הקשורים פנוטיפים הוא תנאי הכרחי לזיהוי גנטי האינטראקציות בין gerogenes (למשל epistatic אינטראקציות, asynthetic אינטראקציות, וכו '.). צובר בתובנה עמוקה יותר יחסי הגומלין גנטי בין gerogenes דורש שיטה כמותית תפוקה גבוהה, אשר גם ממנף את היתרונות של האכלה מבוססי RNAi.

המדד הנפוץ ביותר הפונדקאית ההזדקנות היא תוחלת החיים. הגישה המסורתית למדידת C. elegans התמותה עוקב אחר מותם של חיות בודדות לאורך זמן בתוך מדגם אוכלוסיה קטנה. מספר קטן יחסית של בעלי חיים עוקבים לאורך זמן ו מעת לעת הינם בעדינות דחק עם חוט פלטינה או עפעף, עם תנועת כמחוון הכדאיות (איור 2 א). שיטה זו כבר בשימוש נרחב, כפי שהיא מספקת מדידות פשוטה, ישירה של הממוצע ואת תוחלת החיים המירבי. שיטה מסורתית זו זאת, זמן רב, יחסית תפוקה נמוכה, אשר מגביל את מספר בעלי החיים ואת התנאים שבהם ניתן למדוד בו זמנית בצורה מבוקרת. מחקר הדמיה שנערך לאחרונה מצא כי מחקרים רבים של תוחלת החיים המוטנטיות לא assay מספר מספיק גדול של בעלי חיים כדי להיות מסוגלים לזהות שינויים קטנים בין התנאים9בצורה אמינה. יתר על כן, שיטה מסורתית זו כרוכה שוב ושוב טיפול באותה קבוצה של בעלי חיים לאורך זמן, אשר בתורו יכול להציג זיהום, ואני יכול לפגוע או להרוג בעלי חיים שברירית יותר ויותר, בגילאי.

פיתחנו מתודולוגיה אלטרנטיבית "העותקים המשוכפלים" למדידת אורך C. elegans . לשם כך, אוכלוסיה גדולה של בעלי חיים גיל-מסונכרנות, isogenic מחולקים מספר אוכלוסיות קטנות (או העתקים). מספיק דוגמאות משוכפל נוצרים כדי לכסות את נקודת זמן הניסוי המתוכנן. בכל נקודה בזמן התבוננות, באחד העותקים המשוכפלים הוא הבקיע עבור מספר חי, מת, החיות מצונזרים, אז חיות בתוך זה שכפול יימחקו. לכן, מעל תוחלת החיים הצפויה של האוכלוסייה בכללותה, סדרה של subpopulations עצמאית הן מעת לעת לטעום (איור 2B). באמצעות המשוכפלים יש לא לדרבן חוזרות ונשנות של בעלי חיים, אין חשיפה חוזרת ונשנית פוטנציאל זיהום סביבתי. הכדאיות שנצפה בנקודה חד פעמי הוא עצמאי לחלוטין כל התבוננות אחרים, אשר מצמצם את הטיפול, מגדיל את התפוקה על-ידי לפחות בסדר גודל. זו אפשרה לנו quantitate לשינויים תוחלת החיים עבור מאות RNAi שיבוטים בו זמנית8,10.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורט עבור ניצוח C. elegans תוחלת החיים באמצעות עותקים משוכפלים והן שיטות מסורתיות עבור ניקוד C. elegans אריכות ימים. נדגים כי תוצאות דומות מתקבלים בין השיטות. יש לנו התוכנות שפותחו כדי לסייע בניתוח הגרפי של תוחלת החיים נתונים שנוצרו באמצעות גם גישה, אשר אנו מספקים באופן חופשי תחת רישיון GPL V3 (ראו טבלה של חומרים). "WormLife" נכתב ב- R11, כולל ממשק משתמש גרפי (GUI) עבור התוויית נתונים, אשר נבדקו ב- Mac OS ו- Linux. לבסוף, אנחנו להשוות ניגודיות המגבלות של כל שיטה, לסמן שיקולים נוספים בבחירת בין גישות למדידת שינויים כמותיים ב- C. elegans תוחלת החיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. השיטה המסורתית רישום נקודות C. elegans לאריכות ימים

  1. הכנה של ריאגנטים
    1. לזהות גנים כדי ניתן להשבית באמצעות האכלה מבוססי RNAi. רכישת מניות טרנספורמציה של HT115 e. coli2 המכיל RNAi שיבוט של ריבית. לחלופין, subclone את cDNA של הגן עניין לתוך האתר multicloning של פלסמיד L4440.
      הערה: HT115 הוא זן III לקויה RNase e. coli עם T7 IPTG-inducible פולימראז פעילות, אשר משמש כדי למנוע השפלה של dsRNA בתוך החיידק. ללימודים תוחלת החיים שאינם משתמשים מבוססי האכלה RNAi, או HT115 או OP50 e. coli על צלחות NGM רגיל יכול להיות בשימוש.
    2. להכין 3 – 6 (או יותר) 6 ס מ RNAi צלחות לכל תנאי המבחן (3 קובץ משלים למתכון). חנות צלחות RNAi ב 4 ° C לפני זריעה עם חיידקים עבור אפילו מספר חודשים.
    3. לגדול טרנספורמציה e. coli בן לילה (ח 16 – 20, 37 ° C רועד חממה-180-220 סל"ד).
      הערה: HT115 e. coli הוא גדל ליברות עם אמפיצילין (50 מ"ג/מ"ל). OP50 סטנדרט e. coli לא עמידים בפני אנטיביוטיקה, הוא גדל ללא אמפיצילין. תרבות נפח תלוי הסימן # של צלחות, אבל הוא בדרך כלל בין 8 ו- 100 מ ל LB, בהתאם לעיצוב הניסיונית.
      1. רכז חיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 15-20 דקות ומפרידה benchtop. וארוקן את תגובת שיקוע, וכן מחדש להשעות את צניפה-1/10th החל נפח (כלומר 10 x) ב ליברות עם אמפיצילין HT115 (או ללא אמפיצילין בשביל OP50 רגיל).
      2. Aliquot µL 200 של מרוכזת x 10, לחיידקים כל צלחת 6 ס מ. להכין 3-4 משכפל לכל תנאי המבחן, עם שתי צלחות גיבוי נוסף, כדי לשמש במקרה של זיהום. בעת הכנת לוחות, תווית אותם אז הנסיין הבקיע וזמינותו היא עיוורת לתנאי הניסוי, באמצעות קוד הצבע או ערכת קידוד דומה. ודא כי הקוד מתועד.
      3. לאפשר צלחות פתוח יבש בסביבה נקייה כמו ספסל זרימה שכבתית עד כל הנוזל נספג או לאפשר מכוסה לוחות להתייבש על הספסל במשך הלילה. לפקח על צלחות בזמן הייבוש כדי להבטיח אגר יבש ללא ייבוש יתר על המידה.
        הערה: ייבוש יתר על המידה את הצלחות מוביל פיצוח של אגר שיגרמו C. elegans להתחפר אגר. רטוב שמשטחים אגר גם לקדם ומחילות.
    4. חנות צלחות מיובשים בתוך תיבת תולעת בין לילה (עד 24 שעות) בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר אינדוקציה של dsRNA הייצור. לאחר יום 1-RT, חנות צלחות ב 4 ° C עד 2 שבועות בשקית אטומה נעל-zip (כדי למנוע צלחות מתייבשת). לפני השימוש, להחזיר את הצלחות לטמפרטורת החדר בתוך השקית zip-lock כדי למנוע עיבוי של החדרת מזהמים הנישאים באוויר פטרייתי.
  2. סינכרון של C. elegans בטיפול תת-כלורי
    הערה: ראה 3 קובץ משלים M9 ומתכונים פתרון תת-כלורי.
    1. איסוף gravid למבוגרים בעלי M9. השתמש פיפטה מזכוכית פקוק כדי להעביר צינורות 2 x 15 מ"ל.
    2. ספין צינורות עבור 30"-~ 2,000 סל ד. בדוק אם יש בריכה של נמטודות בתחתית הצינורית. וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף פעמיים עם פתרון M9, חוזרים ספין ושאיפה.
    3. מחדש להשעות C. elegans ב 4 מיליליטר M9. להוסיף 2 מ"ל של פתרון תת-כלורי. מיד מערבולת ~ 3 דקות, עם טלטול נמרץ תקופתיים. לאחר 3 דקות, חפשו ענן של ביצים תחת מיקרוסקופ ויבתר. מערבולת 10 – 20 נוספים s אם ביצים לא פורסמו לאחר 3 דקות.
      הערה: תזמון הטיפול תת-כלורי חיוני. בתוך המבוגרים gravid הביצים לשרוד מה הטיפול. לאחר ~ 3 דקות המבוגרים gravid נפתח, הביצים להישפך החוצה. עם זאת, אם הביצים בפתרון תת-כלורי זמן רב מדי לאחר שחרור הם ימותו. לעומת זאת, מבוגרים gravid נותרו לא בפתרון תת-כלורי, מספיק זמן, בלי ביצים ישוחרר.
    4. מהר לשטוף עם פתרון M9 פעמיים כמו שלב 2.1.2.
    5. מחדש להשעות C. elegans צניפה ביצה 3 מ"ל M9, העברת צינור 15 מ"ל. לאפשר עוברי לבקוע ללון ב- 3 מ"ל של פתרון M9 עם סיבוב ב 20 º C.
    6. חישוב הצפיפות של חיות L1 (או עוברי) לכל µL על ידי הטלת 10 µL של L1 פתרון 3 x ב- 6 ס מ צלחת עם ספירת מספר L1 החיות כדי לחשב את המספר הממוצע של L1s/µL.
      הערה: L1 חיות יסדר לאורך זמן. לכן, פתרונות L1 צריך להיות מעת לעת מעורב.
    7. בעלי חיים לכל צלחת זרע 50 L1. היפוך צלחות, חותם עם גומייה. מניחים צלחות בתוך קופסת פלסטיק תולעת. חותם או באריזה בשקית גדולה zip-lock. העבר חממה 20 ° C.
  3. מניעת ייצור רומא על ידי התוספת של 5-פטור-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. לגדל בעלי חיים עד שלב L4-20 º C. לבדוק ולראות האם מסונכרן חיות פיתחו כדי L4 כ 40 שעות לאחר זריעה (שלב 2.1.7).
      הערה: זמן התפתחותיתC. elegans ישתנו בטמפרטורות שונות12 שיעורי צמיחה של חיות אשר המחירים לא היו שאפיינו חייב להיבדק מדעית.
      1. להוסיף µL 160 של 50 x FUdR כל צלחת 6 ס מ עם חיות L4.
        הערה: חיוני כדי להוסיף FUdR בשלב L4. לנוחיותכם, להפוך 1,000 מניות x של FUdR על ידי המסת 1 g FUdR לתוך 10 מ ל הנדסה גנטית מניות2לחטא או מסנן H FUdR עם מסנן 0.2 µm ומזרק cc 10. Aliquot ~ 1 מ של מניות לתוך צינורות סטרילי mL 1.5. הקפאת ולאחסן ב-20 ° C.
    2. לבדוק הצלחות לנוכחות של זכר C. elegans. הסר את כל הזכרים.
      הערה: תוחלת החיים נמדד בדרך כלל אנדרוגינוסים, לא זכרים. אנדרוגינוסים זה חבר חיים קצר יותר unmated בעלי-חיים, אפילו בנוכחות FUdR13. הזכרים קטנים יותר, רזה ואז אנדרוגינוסים, ניתן לזהות בקלות על ידי הזנב מכור ייחודי14.
    3. לשים תיבת בחזרה לתוך השקית zip-lock. חזור אל חממה 20 ° C.
  4. הכדאיות הבקיע
    1. ציון הכדאיות מדי יום על ידי לגעת בעדינות את החיה על הראש עם פלטינה חוטים או עפעף. ציון חיות להיכשל כדי לזוז כמו המלח להסיר אותם מן הלוח (איור 2 א). שיא מספר שנצפו מת כל תנאי על כל נקודת זמן של התבוננות.
      הערה: כדי להפחית את הסיכון של מניה הטיה, הנסיין חייבים להישאר עיוור תנאים ניסיוני וההתייחסות באופן דומה בטח לא את התוצאות מנקודות בפעם הקודמת במהלך ניקוד.
    2. חיות צנזור להיקרע, למות אחרים פיתוח ברור פגמים או סריקה למעלה לצד המנה: הסר אלה חיות ולהקליט המספר בכל נצפתה זמן הצבע עבור שיקול ניתוח סטטיסטי. בנוסף, אם נמצאו זכרים, להסיר אותם ולהקליט את המספר שנצפו.
    3. חזור מ שלב 1.4.1 מדי יום עד חיות לא להישאר בחיים.
      הערה: כדאי הדשא של e. coli להפחית באופן משמעותי או פטריה מתחיל לגדול על הצלחת, להעביר את כל בעלי החיים הנותרים צלחת טריים עם RNAi המתאים ואת FUdR.
  5. ניתוח - התוויית נתונים וסטטיסטיקות
    1. קלט או תצפית פתוחה מוקלטות נתונים תוכנה התומכת ניתוח הישרדות עם קפלן-מאייר ללא פרמטרי משערך15 ואת יומן-דרגה מבחן16 (ראה קובץ משלים 3). הקפד לכלול חיות מצונזרים. אל תכלול זכרים נצפו, אם בכלל.
      הערה: תבניות נתונים עשויים להשתנות בין תוכנה, אבל יש עיצוב משותף הוא להקליט כל בעל חיים בודדים נצפו בשורה נפרדת. ניסיוני timepoint שבו נצפתה חיה למתה זה הזמן "אירוע". אם צונזרו, הזמן "אירוע" הוא timepoint שבו החיה הייתה צנזורה. יש בדרך כלל שדה או תיבת הסימון כדי לציין תצפיות מצונזרים.
    2. מגרש קפלן-מאייר הישרדות עקומות. בחר תנאי פחות משישה חלקה אחת אם תנאים רבים היו לבדיקה כדי לשפר את קריאותם.
      1. בדוק בעיות נתונים באופן חזותי לעין - תצפיות חסרים, תוצאות הבקרה לא צפוי, וכו ' — וכתובת אלה לפני ניתוח סטטיסטי.
    3. השתמש בפונקציה יומן-דרגה הבדיקה בתוכנה שלך לביצוע של pairwise השוואות סטטיסטי. ודא כל האפשרויות הזמינות עבור טיפול של תוצאות מצונזרים הם בהתאם לנתוני צנזורה מימין.

2. העתק קבע שיטת רישום נקודות C. elegans לאריכות ימים

הערה: בעוד השיטה המסורתית דורשת 3 – 6 צלחות לכל תנאי (ראה 1.1.2. לעיל), השיטה העותקים המשוכפלים דורש הרבה יותר (ראה שלב 2.2.2 להלן). השיטה המסורתית בעקבות בעלי חיים באותה צלחת במהלך ניסוי (איור 2 א). לעומת זאת, עם עותקים משוכפלים בעלי חיים הם רק הבקיע פעם: משכפל זהים רבים מוגדרים בתחילת הניסוי כך שכפול אחד הוא הבקיע בכל נקודה בזמן (לפי משפט) (איור 2B).

  1. ספריית ההתקנה.
    הערה: פירוט נוסף על מסירת RNAi שיבוטים מכוסה כאן, כמו קבוצת העותקים המשוכפלים פרוטוקול הוא נוטה מניה בו זמנית של שיבוטים רבים RNAi, וניתן לשנותם שיבוטים מעל 100 בכל פעם. אוספים של שיבוטים RNAi נשמרים מניות גליצרול בהשתתפות צלחת 96-ובכן בתבנית. ניסויים קבע משוכפל להשתמש. ובכן 24 צלחות. כל טוב הוא תנאי בדיקה שונים, אשר עשויים להתאים לאוסף של שיבוטים RNAi, טיפולים כימיים שונים, זנים בעלי חיים וכן הלאה.
    1. להרכיב את הפריסה של sublibrary עבור אוספים של שיבוטים RNAi, כך ימולאו התנאים הבאים:
      1. ודא בתוך אוסף 96-ובכן, ובכן A1 פקד שלילי וקטור ריק.
      2. הוספת פקד וקטור ריקים נוספים באופן אקראי בתוך כל בארות 24 שעות ביממה.
      3. פצל את הצלחת 96-ובכן בלוקים של וולס 24 שעות ביממה, כך כל צלחת 24-ובכן אחד באופן אקראי הוסיף שליטה שלילי (איור 2C).
      4. הוספת פקד חיובית באופן אקראי בתוך כל קבוצה של 24-ולס (איור 2C).
        הערה: הפקד חיובית היא תלויה השאלה ניסיוני. לדוגמה, כאשר מסתכלים על אוסף של RNAi שיבוטים את תוחלת החיים של עלייה, daf-2(RNAi) נכלל לעתים קרובות. לעומת זאת, כאשר מסתכלים על קיצור תוחלת החיים, daf-16(RNAi) משמש לעתים קרובות.
  2. הכנת ערכות של עותק משוכפל
    הערה: המספר של משכפל הצורך שווה למספר המינימלי של נקודות זמן (איור 2B). צריך לדעת posteriori כמה זמן כדי למדוד את תוחלת החיים לפני תחילת הניסוי, כמו גם ניקוד תדר (למשל ניסוי קבע משוכפל רץ 40 ימים עם כל שאר היום הניקוד מחייבת הכנת מינימום של עותק משוכפל 20 ערכות כל תנאי בתחילת הניסוי.) רצוי להכין ~ 5 גיבוי נוסף קובע (ראה 2.2.2 ו 2.2.2.3 להלן).
    1. כדי ליצור חותמת טריים sublibrary RNAi, לחסן µL 200 ק ג + מגבר לכל טוב בתבנית 96-ובכן (600 צלחות µL) באמצעות משכפל 96 פינים צלחת לפי השלבים הבאים:
      1. לחטא 96 pin צלחת משכפל במועט ברצף הפינים 50% מלבין, הנדסה גנטית H2O ואתנול. לשמור את הפין שקוע במשך לפחות 30 s עבור הצעדים אקונומיקה ואתנול.  לאחר טבילה אתנול, להבה בקצרה את הטיפים. חזור.
        הערה: יש להקפיד לשטוף כל אקונומיקה, אל תשאירו את הסיכות נחשפים אקונומיקה לתקופות ממושכות, כמו אקונומיקה יכול לאכל פינים מפלדת.
      2. הסר בזהירות את נייר דבק הכיסוי של גליצרול 96-ובכן קפואים מלאי ספריה צלחת ובעדינות אבל בתקיפות לטחון טיפים של המשכפלים צלחת סטיריליים לתוך הבארות של המניות עדיין קפוא גליצרול. לחסן µL ליברות 200 + מגבר תרבויות, לאטום את הצלחת חוסנו עם קרום חדיר. לאפשר תרבויות לצמיחה בן לילה benchtop.
      3. לחטא את המשכפל את הצלחת כמו שלב 2.1.1, בזהירות להסיר את החותם הצלחת תרבית נוזלית לאחר צמיחה לילה, לטבול טיפים הפינים של המשכפלים. להחיל את הטיפים עם גם הלחץ של המגבר LB מלבני + צלחת אגר ט ולאחר העברת חיידקים מן הפינים לצלחת בעדינות עם תנועה מעגלית קטן, הקפדה על מרחב מספיק שהוא שמאל בין כתמים סמוכים. לאפשר מושבות לגדל בן לילה על הצלחת אגר ב 37 º C. ראה 3 קובץ משלים עבור הכנת LB + מגבר/ט צלחות.
      4. לפני השימוש, לאחסן צלחת אגר ב 4 ° C הפוכה (צד המכסה למטה), עטוף בסרט פרפין.
        הערה: וניתן לאחסן מושבות מכסה צד יאפשר עיבוי קרוס-לזהם RNAi שיבוטים! מושבות של e. coli ניתן לאחסן במשך 2-8 שבועות 4 ° C, בהתאם שיבוטים RNAi מסוים, כמו שיבוטים RNAi לשמור על יעילות וגורם dsRNA לאחר אינדוקציה IPTG לפרקי זמן משתנים. עבור אוספים קטנים של שיבוטים RNAi, RNAi יעילות מדעית ייקבע מאת RT-qPCR כדי לאשר נוקאאוט.
    2. לחשב את המספר המינימלי של 24-ובכן לוחות הדרושים למשפט אחד של הניסוי: (# צלחות לכל העותקים המשוכפלים) x (נקודות זמן צפויים #). ודא כי כמה ערכות נוספות של עותק משוכפל כלולים עבור טיפול בסוגיות כגון זיהום (איור 2B).
      הערה: המספר הכולל של שיבוטים RNAi לקבוע את מספר 24-ובכן הלוחות כדי להרכיב סט אחד העותקים המשוכפלים עבור כל נקודת זמן (איור 2C).
      1. הכנת לוחות 24-ובכן, כמו צעד 1.1.2 (3 קובץ משלים למתכון). תווית צלחות בעת הכנת אותם כך הנסיין הבקיע וזמינותו יהיה עיוור לתנאי הניסוי, באמצעות קוד הצבע או ערכת קידוד דומה.
      2. לחסן ערכה אחת של mL 1.5 ק ג + מגבר תרבויות עבור כל העותקים המשוכפלים 10 (ראה 2.2.2). לחסן תרבויות 96 צלחות באר היטב באמצעות צלחת משכפל (כמו 2.1.3) מושבות חיידקים מן 2.1.4 (איור 2C, משמאל). חותם עם ממברנה לנשימה, לגדול 20 h (37 מעלות צלזיוס) ברעידות.
      3. זרע µL 120 של תרבות לילה כל צלחת באמצעות פיפטה רב-ערוצי 6-ובכן עם טיפ מתכווננת מרווח (איור 2C, נכון). יבש צלחות שנחשפה ב תא למינארי עד כל הנוזל נספג. לא מתייבשים יתר על המידה. חנות צלחות ללילה בטמפרטורת החדר.
  3. סינכרון של C. elegans באמצעות טיפול תת-כלורי
    1. לחשב את המספר המינימלי של בעלי חיים לצורך הניסוי: # מינימום של L1s צריכה = (15-20 בעלי חיים/טוב) (בארות 24/צלחת) (X צלחות/משוכפלים)(Y replica sets).
      הערה: השיטה העותקים המשוכפלים דורש חיות יותר מאשר השיטה המסורתית. לוח 10 ס מ אחד מלא תולעים gravid יכול לספק 20,000 – 50,000 חיות L1 בהתאם הצפיפות של מבוגרים gravid. באופן דומה, עשרים ס מ 6 צלחות תשואות בסביבת חיות L1 ~ 30,000. מתכננים להכין של הכנת ביצה זה מכפיל את המספר המינימלי של חיות הדרושים. אם האוכלוסייה בהכנה יש רעב, מחדש להאכיל או צ'אנק על צלחת חדשה ולא לאפשר לפחות שלושה דורות על מזון לפני17,proceding18. הקפד להקפיא L1s שאריות בחזרה.
    2. השלבים הבאים 1.2 כדי 1.2.6 כמו בשיטה מסורתית כדי להשיג סנכרון L1 חיות. זרע 15 – 20 L1 חיות לתוך כל טוב באמצעות 6-ובכן מתכווננת ריווח פיפטה, ריאגנט מאגר, הדומה 1.2.7. מדי פעם מערבבים L1 פתרון למנוע שיקוע של בעלי חיים.
  4. מניעה של רומא הייצור על ידי התוספת של 5-פטור-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. בצע את שלב 1.3.1.  להכין סטרילי 50 x FUdR מניות (ראה שלב 1.3.1.1).
    2. כאשר חיות יד L4, מוסיף 25 µL של 50 x FUDR אל כל טוב של 24-באר צלחת באמצעות פיפטה מתכווננת ריווח של ערוץ 6.
  5. הציון הכדאיות
    1. להסיר סט צלחות שכפל אחד ולא להציף וולס עם הפתרון M9, הרשומה הכולל בעלי חיים לכל טוב, ולאחר מכן גע בעדינות-המעבר חיות על הראש עם מעדר תולעת (איור 2B). חיות נכשל לעבור הם הבקיע למתה. ביטול הבקיע צלחות. הרשומה הכדאיות מדי יום.
      הערה: קרע, הצג פגמים מורפולוגיים ברוטו, ואיתנה, או זחלו בצד הבאר בעלי החיים כדי להיות צנזורה להוציא אותם מן שני הערכים מת ו הכולל.
      1. רשום את המספר של חיות כי הם צנזורה בתוך כל טוב בכל נקודה בזמן בנפרד מן הערכים האחרים.
      2. לא ציון בארות אשר אין מזון או מזוהמים (למשל פטריה או רפש); וולס כאלה נחשבים צנזורה. כמו כן, לצנזר גם אם כל החיות מציג פגמים מורפולוגיים או התפתחותית. שיא האירוע הצנזורה הזאת RNAi שיבוט/טוב בשלב זה הזמן.
      3. אחרי הניקוד צלחת שכפל, למחוק אותו. המשך הניקוד שכפול החדש להגדיר כל יום עד כל החיות על פני כל בארות ימותו. כדי להפחית את הסיכון של מניה הטיה, הנסיין חייבים להישאר עיוור לתנאי הניסוי, באופן דומה כנראה אינו מפנה את התוצאות מנקודות בפעם הקודמת במהלך ניקוד.
      4. אם כל בעלי החיים בתוך באר היו מתים בנקודת זמן נתונה, אז לאחר יום זה הניקוד, לבחון אם כל בעלי החיים יש כבר הבקיע למתה עבור שתי נקודות זמן רצופים נתון טוב. אם כך, הבקיע הכדאיות אינה נחוצה עוד על כך טוב בנקודות זמן עוקבות.
      5. לערוך ניסויים נוספים ניסוי עצמאית. לאתר את התוצאות של ניסויים רצופים בנפרד מאלה בניסויים הקודמים, עם המספר המשפט ציין.

3. נתוני תרשים

הערה: עם קבוצת העותקים המשוכפלים השיטה העקומה מתאימה מוחלת על משוער את אומר ואת תוחלת החיים המירבי. הפרמטרים להערכת C. elegans התמותה להתאים עקומה logit19.  כמו למרבית כלי הישרדות אינם תומכים עקומה logit, פותחה תוכנית חדשה להתוויה logit עקומות (עבור עותקים משוכפלים); קפלן-מאייר עקומות (עבור השיטה המסורתית) נתמכים גם.

  1. להתחיל לעבוד עם התוכנה. הורד את קובץ ה-zip שחרור עבור הגירסה הנוכחית (ראה סעיף חומרים). לחלץ את קובץ ה-zip לתיקייה. עיין בקובץ "readme" בתיקיית המחולץ לקבלת הוראות התקנה נוספים.
  1. הפעל את ממשק ההתוויה. למצוא את המיקום של ספריית "קוד" בתיקיה מופק קובץ ה-zip (למשל  "/ משתמשים/שם משתמש /Desktop/WormLife/קוד").
    1. הזן את הפקודות הבאות במסוף R, מחליף נתיב התיקיה כרגע זיהו. הקש enter או להחזיר לאחר הזנת כל קו: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), openMain() 3).
    2. מאפשרים זמן הממשק לטעון בחלון חדש, מעלה מסך ברירת המחדל, כפי שמוצג באיור 3 א. תן ה-R לפעול ברקע.
  2. נתונים בתבנית ערכים מופרדים באמצעות פסיק (CSV) או קבצי ערך מופרד באמצעות טאבים (TSV). ציין את העמודות ושמות, תלוי בסוג הניתוח. לקבלת נתוני לדוגמה מעוצב מראש, ראה 4 קובץ משלים (עותקים משוכפלים) וקובץ משלים 5 (מסורתי/קפלן-מאייר).
    הערה: יש לציין נתונים בתבנית "ארוך", דהיינו שורה אחת לכל זן/טיפול לכל נקודת זמן לכל משפט. קבצי CSV מומלץ עבור תאימות הטוב ביותר בין פלטפורמות.
    1. הסר את השורות התואמות תצפיות דילג או צנזורה. בדוק אם העדר ערכים חסרים או שאינם מספריים, כמו זה עלול לגרום לשגיאה בעת ייבוא הנתונים.
    2. עבור ניתוח בסגנון מסורתי של קפלן-מאייר, לא מאגר נתונים של ניסויים עצמאית-מגרש אותם בנפרד. לניתוח עותקים משוכפלים, מאגר נתונים מניסויים מרובים ולאחר מכן לחקור באמצעות הפונקציונליות "TrialView" (ראו 6.3.3.4).
  3. באמצעות ממשק ההתוויה
    1. טעינת קובץ נתונים ("ייבוא" תחת תפריט "קובץ") באמצעות תיבת הדו-שיח. כדי לפתוח קבצים ", ה-. csv", לשנות את סוג הקובץ בתיבה הנפתחת אל ". csv" (ברירת המחדל היא ".txt/.tsv"), נווט אל התיקיה בקובץ הנתונים. ? הנה הקובץ בנתונים לדוגמה עותקים משוכפלים (4 קובץ משלים).
      הערה: ייבוא קובץ כאשר dataset פתוח כבר יחליף את ערכת הנתונים הנוכחי.
    2. בחר קובץ לייבוא כדי להפעיל את אשף ייבוא, אשר מוביל דרך לזהות את העמודות של הקובץ הנבחר (איור S1A עבור עותקים משוכפלים). אם נתוני הקלט המתאים לניסוי משוכפלים, לבחור "Logit" עבור סוג המחקר.
      הערה: ייבוא זרימת העבודה היא שונה בין עותקים משוכפלים (איור S1A) מסורתי (קפלן-מאייר) (איור S1B).
    3. "להתוות נתונים". בחר "הוסף שורה" כדי להתחיל התוויית נתונים. (קו מקביל ערכה אחת של תנאים. קיימות תכונות כדי לסייע עם ניסויים שבהם נבדקו תנאים רבים).
      1. להתוות את השליטה תנאים-במקרה של הנתונים לדוגמה N2 (WT) עם L4440 (וקטורית ריק) RNAi מתאימים. בחר "הוסף קו" תחת תפריט "גרפים" ליזום האשף להוסיף קו: בחר את ה תנאי מגרש ואת הפרמטרים גרפי עבור המייצג את הקו.
        1. כדי להוסיף באופן ידני בסיבוב. של תנאי אחר, חזור על השלבים ב 3.3.3.1
        2. כדי לשנות את צבע או מגרש סמל עבור קו, בחר "לשנות את השורה" תחת תפריט"גרף".
        3. כדי להסיר קו שאבהיר את כל הקווים, בחר "למחוק את השורה" תחת תפריט"גרף".
        4. כדי לנקות את כל קווי העלילה הנוכחית, בחר "קו ברור" תחת תפריט"גרף".
        5. כדי לעקוף את ערך ציר x המירבי אוטומטית שנבחרה (זמן), השתמש "קבוצה X סולם" תחת תפריט"גרף".
          הערה: ציר ה-y (השבר ששרד) מציג תמיד 100% (למעלה) ל- 0% (למטה), במרווחים של 20%. ציר ה-x מוצג תמיד בהפרשים של 5. תוויות ציר מותוות לא לאפשר גמישות תיוג לאחר שמירת תמונות עלילה.
      2. כדי לשמור תמונות בפורמט JPEG של העלילה המוצגות כרגע, השתמש באפשרות "שמור מזימה" "בתפריט קובץ"; רק העלילה הנוכחית נשמר.
      3. עבור יצירת מגרשים בודדים עבור תנאים שונים בניסוי אחד, התוכנה מאפשרת הגדרת התוויית "סדרה".
        הערה: מימוש המושג סדרה משפר יעילות בעבודה עם ניסויים גדולים.
        1. אם מתחיל עם סביבת עבודה מגרש ריק, להוסיף שורות המתאים תנאים שליטה להיות עקבי לאורך כל העלילות בסדרה (ראה 3.3.3.1).
        2. הגדרת הסדרה עם "להגדיר סדרה" בתפריט גרפים. בחר תנאי התואם הקו כדי להציג לראשונה בסדרה; ניתן לבחור רק אחד. לבחור פרמטרים גרפי (קו עלילה וצבע -סמל) עבור הקו, כמו 3.3.3.1.
        3. סקור את המגרשים לבניית תנאי בדיקה שונים. לעבור את התצוגה של "קו סדרת" בין תנאי שימוש בלחצני החץ שמאלה/ימינה נמצאו בצדדים של החלון הראשי עלילה, כמו גם בתפריט הראשי בר (איור 3 א).
          הערה: אם הקו בסדרות הנבחרות באותו המצב כאחת הקווים שכבר נוספה בקרת/הפניה, ייתכן הקו החדש מופיעים הלשונית.
        4. הגדר את הסידרה כדי להפוך אחרים פונקציות מסוימות זמינות (להציל את מתווה סדרות, Trialview, לראות 3.3.3.4 האחרון). לאחר הגדרת סדרה, השתמש באפשרות "שמור מתווה סדרת" מתפריט "קובץ" לשמור קבצי תמונה עלילה נפרדים עבור כל חלקה בסדרה בתיקייה חדשה.
      4. Trialview — להמחיש תוצאות של ניסויים עצמאית של ניסוי העותקים המשוכפלים. אם ניסויים מרובים היו לפעול עבור אחד או יותר של קבוצות המדגם, להתוות את הנתונים מתוך מחקרים בודדים, הנתונים במאגר כל המבחנים בנפרד כדי להעריך את עקביות בין משפטי עצמאי (ראה איור תלת-ממד).
        1. לקבוע סדרה כמתואר ב- 3.3.3.3. מחקרים שונים יותוו לכל אחת הקבוצות מדגם "משתנה" תמונה שונה על הניסויים בהתאמה על הדגימות ההפניה שצוינה/בקרה.
        2. כדי לשמור את התמונות TrialView, עבור אל "הדפסה TrialViews" בתפריט נתונים; תמונת JPEG יהיה פלט עבור כל העלילה בסדרה.
          הערה: התוצאות למשל דמות תלת-ממד היא נרתיק עם שני ניסויים.
    4. תוחלת החיים החציוני טבלת סיכום של נתונים המשוכפלים. מבחינה ויזואלית לבדוק עיקולים על מנת להבטיח התאמה סבירה של הנתונים, ולאחר מכן בחר את "טבלת סיכום" אפשרות בתפריט נתונים כדי לשמור טבלה של ערכים תוחלת החיים החציוני (זמן ב- 50% הישרדות בעקומה logit) עבור כל סוג הדגימה.
  4. הערכות סטטיסטיות של נתונים שנוצרו באמצעות שיטת של עותקים משוכפלים
    1. לשם ניתוח סטטיסטי בין שתי קבוצות של ניסוי עותקים משוכפלים, לשנות והפעל קובץ script R, הניתנים קובץ ה-zip שחרור (ראה "WormLife ניתוח סטטיסטי בתבנית script. R").
      הערה: מיומנות ב R לא נדרש כדי להריץ את הסקריפט. תיעוד נוסף הוא בהערות בקובץ. קובץ ה-script מוכן לניתוח של הדוגמה נתונים המשוכפלים. גולשים נתונים בתבנית הנכונה (ראה קובץ משלימה 4) ניתן גם לנתח.
      1. פתח את קובץ ה-script ב- R (R GUI או RStudio).
        הערה: פעולה זו תציג את התסריט מבלי להפעיל אותו.
      2. לשנות את מיקומם של הקבצים הדרושים כדי להתאים את המיקום במחשב שלך.
        הערה: נתיבי קבצים אלה חייב להיות "מלא" (כלומר צריך לכלול את מיקום הקובץ המלא, כולל תיקיות).
        1. לשנות את הנתיבים (קובץ/תיקיה מיקומים) עבור "wlDir" (מיקום של הספריה), "קובץ נתונים" (עותקים משוכפלים קובץ הנתונים לניתוח), "compFile" (ציון של השוואות כדי להפעיל, אם הדבר ישים) ו "outputPath" (מיקום בו ייכתב התוצאה קבצים ל).
      3. להגדיר את שמות העמודות במקטע "ציין עמודות בקובץ הנתונים" אם שמות עמודות בקובץ כדי להיות מנותח שונים מהקובץ לדוגמה. ציין עמודה עבור כל פרמטר. אם מחקר יש זנים מרובים, אך אין RNAi (או טיפול אחר) לכלול עמודה מקובץ הנתונים עם ערכים ריקים או זהה עבור כל השורות (למשל "no_treatment", וכו ').
      4. להגדיר את הפרמטר "compFile". אם הפרמטר "compFile" מוגדר נה, ואז כל ההשוואות pairwise אפשרי של קבוצות תופעל.
        הערה: קבוצה מוגדרת על-ידי השילוב של זן/גנוטיפ וטיפול, אשר הם שרשור ומוצג כ- "strain_treatment". ללימודים גדול עם קבוצות רבות, ניתן לספק קובץ CSV ציון השוואות. ראה את קובץ הדוגמה "comps_rsm_example.csv".
      5. הגדר את מספר האיטראציות עבור דגימה מחדש מונטה קרלו ("k.resamp", ברירת המחדל היא 1,000).
        הערה: ערכי-P 0 ניתן להחזיר כאשר מתבצעות איטרציות מעט מדי; במקרים כאלה ראוי לדווח "p < 0.01" (אם k.resamp = 100), או "p < 0.001" (אם k.resamp = 1,000), וכו
      6. להריץ את הסקריפט: לחצן "קוד" ב- RStudio (למעלה מימין חלון עריכה) או "מסמך מקור" מתפריט "עריכה" ב- R GUI. (ביצוע יקח קצת זמן).
      7. כאשר מחוון "עסוק" R אינו מוצג, לפתוח את הפלט יש מדריך יהיה שולחן עם התוצאות של כל השוואה (חציון ההישרדות, ערכי-p, שינוי תוחלת החיים החציוני %).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פיתוח מתודולוגיה חדשה כלשהי, זה הכרחי כי השיטה החדשה recapitulates תוצאות מקובל הגישות הקודמות, פוגש את התקן בתוך שדה. בעבר הראינו מדעית כי העותקים המשוכפלים ואת שיטות מסורתיות assaying C. elegans תוחלת החיים לייצר תוצאות דומות20. פראי-סוג C. elegans (N2) ומתוחזק על 20 ° C בדרך כלל לחיות בין 20 ל 25 יום, אשר נצפו עם מסורתיים (איור 4A, קו שחור) והן בגישה עותקים משוכפלים (איור 4B, שחור). לכן, שתי השיטות אומדן סביר פראי-סוג תוחלת החיים. . זה גם הכרחי שיש שיטה חדשה את הרזולוציה כדי לכמת במדויק שינויים בין תנאי הבדיקה ואת הכוח סטטיסטי כדי לזהות שינויים משמעותיים. במחקר הקודם שלנו, גילינו כי גורמי שעתוק ממשפחת Myc הם גורמים לאריכות ימים C. elegans . mml-1 ו- mxl-2 לקודד את homologs C. elegans של יונקים Mondo / רכיב תשובה פחמימות איגוד חלבון (ChREBP) ו- Mlx, בהתאמה. C. elegans והן יונקים, אלה heterodimerize חברים ממשפחת Myc לווסת שעתוק. מצאנו כי אובדן או mml-1 או mxl 2 מקטין באופן משמעותי תוחלת חיים רגילה, כפי שהיא נמדדת על ידי גם assay תוחלת החיים המסורתי או עותקים משוכפלים (איור 4A-B, צהוב, חום-ערמוני). בניגוד המתחם MML-1::MXL-2, מצאנו כי אובדן mdl-1 (הומולוגית מאד יונקים) או mxl-1 (מרבי) הגדילה משמעותית את תוחלת החיים של C. elegans כפי שהיא נמדדת גם מתודולוגיה (איור 4 סגול, כחול, בהתאמה, בעוד שני לוחות).

מגבלה רצינית הגישה המסורתית למדידת אריכות ימים הוא התפוקה. שתי השיטות להסתמך על תנועה להתקשר אם חיים חי או מת, אשר הופך להיות יותר ויותר קשה להעריך. אפרוחי ינועו ברחבי צלחת בהעדר גירויים, ובכך קל להבקיע. הזדקנות C. elegans הופכים יותר ויותר אבל בישיבה יגיב במגע קל בראש ע י תנועה היפוך על צלחת. אולם, ככל חיות ישנות יותר היכולת לנוע אחורה פוחתת, הופך להיות יותר ויותר הקואורדינציה. בסופו של דבר חיות הופך משותק, הפנוטיפ חריפה דמוי sarcopenia, כאשר הבקיע באמצעות השיטה המסורתית הכדאיות יכול רק להיקבע על ידי התבוננות עדין מתקמט בקצה הקדמי קיצוני של החיה. לעומת זאת, כאשר הבקיע הכדאיות באמצעות שיטת של עותקים משוכפלים, הנוזל מתווסף הבאר, אשר משמש גירוי שיוצר תגובה בהלקאה ניתן לכמת כמו readout healthspan8. התנועה בתוך הנוזל קל יותר להתבונן לבעלי אפילו יותר מבוגר: כרונולוגית תואם גיל חיות יכול להמשיך לייצר עדינות תנועות ראש על צלחות יבש אבל בולטת יותר (אם כי איטי) כיפוף הגוף בנוזל. לבסוף, כאשר הבקיע עותקים משוכפלים, גם כל הוא בתוך שדה הראייה (~1.1 ס מ קוטר), כל החיות נמצאים ההשעיה - דבר המאפשר תצפית של כל בעלי החיים בו זמנית. לעומת זאת, כאשר הבקיע צלחת 6 ס מ באמצעות השיטה המסורתית, אחד חייב לסרוק על פני כל צלחת - חיפוש דרך הדשא חיידקי, לאורך שולי לבעלי חיים. התוצאה נטו של הבדלים אלה הוא התפוקה בעת שימוש בשיטת העותקים המשוכפלים הוא לפחות בסדר גודל גדול יותר הגישה המסורתית, אשר מאפשר לכמת בו-זמנית לשינויים תוחלת החיים על-פני יותר מ-100 תנאים בניסוי יחיד עם חוקר אחד. לדוגמה, ממסך הגנום כולו מבוסס על האכלה RNAi בעבר זוהו הגנים 159 היו נחוצים עבור תוחלת החיים מוגברת שהוענקו ירד הדף היומי-2 /איתות8דמויי אינסולין. זה ניתוח, אנחנו לכמת את השינויים בתוחלת חיים, פראי-סוג מוטציה מאריכים daf-2(e1370) , קצרת מועד daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) זוגי חיות (איור 5A), אשר אפשרה לנו לפענח את גנטי מערכות יחסים בין דמויי אינסולין איתות למעלה מ-100 ג'ין progeric inactivations. עוד, אנחנו העריך כמה inactivations ג'ין progeric אלה שינו healthspan (שבזמנו נקרא "activespan") על ידי התבוננות הירידה של C. elegans ומתפתלת על פני משכפל לאורך זמן (איור 5B).

Figure 1
איור 1: הופעתו של האכלה מבוסס RNAi להוביל עידן התגליות ג'ין במחקר הזדקנות, ועם זאת ברוב gerogenes להישאר לקוי למדה. (א) gerogenes רבים התגלו בתחילה מן למסכים גנומי פונקציונלי בקנה מידה גדול. של gerogenes C. elegans למעלה מ-900 שהתגלו עד כה, רבים זוהו באמצעות האכלה מבוססי RNAi, הדגשת הערך של גישות גנומיות פונקציונלי גילוי הגן. הגרף מציג את מספר gerogenes גילה לכל כתב היד באמצעות RNAi, המבוסס על פנוטיפ ביאור (ראה טבלה של חומרים) עבור פנוטיפ אונטולוגיה תנאי תוחלת החיים מורחב, קיצרה תוחלת החיים, תוחלת החיים משתנה. לקבלת רשימה מלאה של מחקרים גילו gerogenes, ראה 1 קובץ משלים . (B) gerogenes רוב נשארים למדה היטב. לעומת זאת gerogenes ל למד היטב כמו הדף היומי-16/FOXO (חץ), שבו יש יותר מ-800 הפניות, הרוב המכריע של gerogenes יש פחות מ-10 הפניות (כללי התייחסות-לא בהכרח התמקדו תוחלת החיים). שיטות תפוקה גבוהה אמין יהיה חיוני כדי להפיק בתובנה עמוקה יותר גנטי קשרי גומלין בין gerogenes. הגרף מבוסס על מיפויים בין פרסומים ב- PubMed על gerogenes C.elegans שהתגלו מן פנוטיפים RNAi. לקבלת רשימה מלאה של gerogenes ואת מספר מחקרים הקשורים לכל אחד, ראה 2 קובץ משלים . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: את המסורתית ואת שיטת להגדיר משוכפל עבור ניקוד תוחלת החיים C.elegans (א). השיטה המסורתית עבור ניקוד C. elegans תוחלת החיים. מספר אוכלוסיות מסונכרן קטן של בעלי חיים isogenic לכל תנאי עוקבים לאורך זמן. מאותה אוכלוסייה של חיות מלווה לאורך כל הקורס לימוד. הכדאיות מוערך על ידי תנועה, אשר עלול להיות מגורה על ידי לדרבן עדין. חיות שאינן מצליחות להעביר בשיירה למתה והם שהוסר (השאיפה המוצג) עד חיות בר קיימא לא להישאר. (B). עותק משוכפל להגדיר שיטת הניקוד תוחלת החיים C. elegans . אוכלוסיה גדולה של חיות isogenic גיל-מסונכרנות מפוזרים על פני מספר צלחות שכפל זהים. בכל נקודה בזמן, שכפול יחיד הוא הבקיע: פתרון במאגר מתון (M9) נוספת, אשר מעוררת את התנועה. חיות להיכשל להזיז באופן ספונטני לאחר בארות מציפים הם העריכו גם באמצעות מגע הגירוי. משך הניסוי הניקוד נקבע לפני התחלת. כל בעל חיים הוא הבקיע פעם אחת בלבד, אריכות-חיים עבור האוכלוסייה גדולה יותר נגזר תצפיות עצמאיות רבות. (ג)- הגישה העותקים המשוכפלים היא שיטה תפוקה גבוהה למדוד באופן כמותי את תוחלת החיים של C. elegans . שיבוטים RNAi 100 או יותר עצמאית ניתן לעקוב בו-זמנית. HT115 e. coli לבטא dsRNA עבור שיבוט RNAi נתון מוצג. למעשה, כל דגימות 24 מהצלחת 96-ובכן מחולקים צלחת 24-ובכן יחיד. כל צלחת 24-ובכן וכתוצאה מכך יש שלילי (כלומר ריק וקטורית, אדום טוב), בקרה חיובית (ירוק טוב) מופץ באופן אקראי בתוך אוסף של שיבוטים RNAi (בארות צהוב). בדרך כלל, הבאר הראשונה (A1) אוסף מכיל וקטור ריק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ממשק המשתמש הגרפי (GUI). (א). בממשק החלון העלילה הראשי מציג את מסך הפתיחה של ברירת המחדל. . זה מה שמוצג בעת פתיחת התוכנה. הבדלים במראה בין פלטפורמות צריך להיות מינימלי עקב השימוש ערכת כלים בחלונות בפלטפורמה. (B)- סקירה של אפשרויות התפריט, בתפריטים הנפתחים הזמינים מהחלון העלילה הראשי. (ג)- דוגמה מגרש פלט עבור שני העותקים המשוכפלים סגנון (משמאל) קפלן-מאייר מסורתי בסגנון נתונים (מימין). הנתונים המוצגים נאסף בניסויים עצמאית. מגרשים המיוצא אינם כוללים תוויות ציר המותווים מראש, גמישות מירבית תוך הוספת תוויות כאלה. כדי להקל על זה, הצירים תמיד מחולקים בהפרשים של 20% עבור ציר ה-y, בהפרשים של 5 לציר ה-x. בדוגמה זו, תוויות ציר וקו (זן/טיפול) נוספו החלקות שנשמרו, באמצעות תמונה פשוט מאוד נפוצים כלי לעריכת. (ד). דוגמה של פלט הפונקציונליות "TrialView", המאפשר השוואה חזותית בין תוצאות של ניסויים עצמאי עבור עותקים משוכפלים datasets סגנון. מגרש זה מראה את התוצאה בין שני ניסויים שונים במאגר התוצאות המתקבלות עבור הדף היומי-2 EV(RNAi) (עיגולים כחולים, סגור), N2 EV (RNAi) (עיגולים שחורים, סגור), ו- הדף היומי-2 עם הדף היומי-16 (RNAi) (יהלומים אדומים, פתוח). TrialView מאפשר בדיקת במהירות נתונים ספציפיים משפט בעיות העלולות להשפיע על איכות מתאים ערכת הנתונים במאגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: שיטות מסורתיות עותקים משוכפלים לייצר תוצאות דומות- אובדן או רכיב של heterodimer MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) הגדלת תוחלת החיים. לעומת זאת, אובדן או רכיב MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) מקטין את תוחלת חיים איור זה מודפס הפניה20 עם הרשאה באמצעות רשיון מלאי ייחוס (CC מאת) (ראה חומרים). (א). קפלן-מאייר תוצאות עם השיטה המסורתית. (B). עקומה Logit להתאים באמצעות השיטה העותקים המשוכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: קבוצת העותקים המשוכפלים שיטה יכולה לפענח אינטראקציות גנטי בהתאם לשינויים תוחלת החיים (A) ושינויים healthspan (B) עבור 100 RNAi שיבוטים בו זמנית. איור זה מודפס8 עם הרשאה תחת רישיון מלאי יצירתי ייחוס-מסחרי 4.0 הבינלאומי (CC-BY-NC) (ראה חומרים). (א) ניתוח גנטי תוחלת החיים של הגן progeric inactivations בהקשר של ירידה דמויי אינסולין איתות (ILS) (הדף היומי-2, ציר x), בהיעדר /FoxO הדף היומי-16(ציר y), אפקטור תעתיק המרכזי של ח21 . ג'ין inactivations עם פונקציות דומות כמו הדף היומי-16 לא לקצר עוד יותר תוחלת החיים בהיעדרו של הדף היומי-16 (נקודות שחורות). ג'ין inactivations עם פונקציות באופן עצמאי לחלוטין מן הדף היומי-16 לקצר הן רקע גנטי דומה (אפור). ג'ין inactivations איפה השלילי השפעה על תוחלת החיים הדף היומי - 2 > הדף היומי-2; הדף היומי-16, מרמז על הפונקציה במקביל (לבן). (B) שינויים בשערי בהלקאה לאורך זמן אפשר לגזור את healthspan הממוצע עבור רבים לפליטת גנטי (ציר x) בעת הערכת שינויים תוחלת החיים (ציר y). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור S1: זרימות עבודה ב- WormLife. איור של השלבים של כמה מודרכים זרימות עבודה (הנקרא לעתים "קוסמים"). בכל אחד מהמקרים הללו, לאחר השלב האחרון בתהליך העבודה, המוקד מוחזרת חזרה אל החלון העלילה הראשי. (א) הנתונים לייבא זרימת עבודה עבור עותקים משוכפלים datasets סגנון (ב') נתוני לייבא זרימת עבודה עבור datasets בסגנון מסורתי של קפלן מאייר. (ג) זרימת העבודה עבור הוספת קווי מגרש עבור עותקים משוכפלים datasets סגנון. (ד) זרימת העבודה עבור הוספת קווי מגרש עבור datasets בסגנון מסורתי של קפלן מאייר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה קובץ 1: מחקרים זיהו gerogenes. כניסתו של האכלה מבוססי RNAi הוביל עידן התגליות ג'ין עבור פנוטיפים שלא היו צייתן על ידי גנטיקה קדימה, כולל הזדקנות. מפורט, מסודר לפי מספר gerogenes שהתגלו הם מחקרים עצמאיים לזיהוי גנים שפעילותם שינו תוחלת החיים. שימו לב כי המחקר כי המזוהה ביותר gerogenes מנוצל את שיטת קביעת שכפל8. הטבע של מה גנים inactivations שינו תוחלת החיים גם ציין: אריכות ימים, גנים progeric הם אלה עלו או ירדו תוחלת החיים כאשר לא פעיל, בהתאמה. "תוחלת החיים משתנה" מתייחס מקרים שבו כיוון השינוי (כלומר עלו או ירדו תוחלת החיים) לא צוין או לא נאצרה. נתונים WormBase WS262 (בינואר 2018) (ראה חומרים), עם התוספת של תוחלת החיים RNAi-טיפול נובע מן ההתייחסות10, אשר אינם כלולים כבר באוסף אצר של פנוטיפים WormBase RNAi. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה קובץ 2: מספר מחקרים הקשורים עם כל gerogene. רוב gerogenes נלמדים בצורה גרועה. בעוד גנים מסוימים, כמו /FoxO הדף היומי-16, היה הנושא של תשומת לב רבה למחקר, gerogenes יותר מ-400 יש פרסומים הקשורים פחות מעשרה. נתונים WormBase WS262 (בינואר 2018), עם התוספת של RNAi-טיפול תוחלת החיים נובעת10 אשר אינם כלולים כבר באוסף אצר של פנוטיפים WormBase RNAi. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה קובץ 3: הכנת נפוצות ריאגנטים עבור C. elegans ניסויים. (א). מתכון סטנדרטי צלחות NGM ו- RNAi. (B)- מתכון מאגר M9 פתרון תת-כלורי. (ג)- הכנה של LB + צלחות המגבר/ט. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה 4 קובץ: נתוני לדוגמה עותקים משוכפלים. דוגמה dataset של ניסוי תוחלת החיים של עותקים משוכפלים. זה הנתונים (dataset) כבר מעוצב מתאים ייבוא/ניתוח. כולל שני ניסויים לכל תנאי (שילוב של זן/גנוטיפ RNAi). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה קובץ 5: נתוני לדוגמה האורך מסורתיים- Dataset דוגמה של ניסוי תוחלת החיים האורך מסורתי, עם זכות לצנזר, לעצב עבור מוכן ייבוא/ניתוח שימוש בפונקציונליות מגרש הישרדות קפלן-מאייר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שתי מסורתיים, עותק משוכפל קבע השיטות מחייבות את הסינכרון של בעלי חיים גיל כרונולוגי. אנו כוללים שיטה המסנכרנת בעלי החיים באמצעות טיפול תת-כלורי מבוגרים gravid, שבו רק הביצים עם המבוגר gravid לשרוד טיפול. אלה העוברים בוקעות ההשעיה נוזלי, מבחינת לעצור בשלב הזחל הראשון (L1). לאחר זריעה L1 חיות על גבי מזון (למשל e. coli לביטוי dsRNA אל הגן עניין), חיות לחדש את הפיתוח. סינכרון L1 בעלי חיים על ידי תת-כלורי טיפול של מבוגרים gravid יש יתרון כי החיות L1 שאריות unseeded יכול להיות קפוא, המאוחסנים ללא הגבלת זמן חנקן נוזלי או מקפיא-80 ° C. בדרך זו, נשמר מדגם של כל זן בזמנו של ההתקנה ניסיוני, יצירת משאב יקר ערך עבור מחקרים עתידיים ושיפור הפארמצבטית. אולם, בעוד תת-כלורי היחס לבעלי חיים למבוגרים gravid היא דרך נפוצה להשגת חיות מסונכרן עבור הזדקנות המחקר22, המעצר L1 הוא תגובה הרעבה. לפיכך, כמה מעבדות מעדיפים גם כדי לאפשר הבקיעה להתרחש על צלחות, או forgo טיפול תת-כלורי לחלוטין ולאפשר כמה מבוגרים gravid להטיל ביצים במשך מספר שעות (כלומר ביצה שכבה). במקרה האחרון, ההורים יוסרו, מלווה את תוחלת החיים של רומא. למיטב ידיעתנו, אין הבדל ברור בין תוחלת החיים דווחו בין חיות סונכרנו ב M9, בקעו על צלחות, או רומא מ שכב ביצה. עם זאת, בהתחשב בכך לשינויים זמינות חומרי הזנה הדוק לשינויים תוחלת החיים, יש קדימות רקע גנטי מסוים יכול להפיק תוצאות שונות בין גישות אלה סינכרון. ניתוח זהיר יותר נדרש כדי לפתור את חשש תיאורטי.

מבלי להתחשב בשיטה המשמשת לסינכרון האוכלוסייה ההתחלתי, יש לקחת צעדים גם למנוע ייצור רומא או להפריד בין האוכלוסייה המוצא מסונכרן מ רומא בעתיד. בפרוטוקול שלנו, אנחנו המתאר כיצד להשתמש FUdR כדי למנוע ייצור רומא, כמו הפרדת חיות אינה אפשרות מעשית עבור עותקים משוכפלים השיטה. זה גם אפשרי למנוע ייצור רומא גנטית באמצעות רקע גנטי נשי (למשל fer-15(b26);fem-1(hc17), אשר הוא זן סטרילי תלוית טמפרטורה23). עם זאת, גם הוא ללא חסרונות: השימוש רקע גנטי יכול לסבך את ניתוח מאוחר יותר, ב יש רקע גנטי FUdR יכול לשנות תוחלת החיים24,25,26.

כחלופה מניעת רומא ייצור באמצעות כימי או גנטית פירושו, למבוגרים בעלי חיים ניתן מעת לעת להעביר צלחות RNAi טריים כדי לבודד אותם מן הצאצאים שלהם. פעולה זו מפשטת רקע שיקולים על חשבון תפוקה. מעת לעת לעבור חיות מזון טרי יש יתרונות נוספים של מניעת רעב אפשרי וחידוש חשיפה dsRNA. עם זאת, כמה אינטראקציות גנטיים המשפיעים על תוחלת החיים רק התגלו כאשר ייצור רומא היה עכבות: ניתוח מוקדם של הנתיב TGFβ על הפנוטיפ תוחלת החיים בטעות הסיקו כי ירידה TGFβ איתות השפיעו על C. elegans מערך dauer אבל לא מזדקן27,28. עם זאת, המשך המחקר בשימוש FUdR גילה כי ירד TGFβ איתות אריכות ימים מוגבר באמצעות אינסולין איתות29. למה מחקרים מוקדמים יותר לא רואה מוגברת תוחלת חיים, חיות TGFβ? TGFβ מסלול מוטציות לייצר ביצה קלה הנחת פגם (egl) ותעלה הרבייה אריכות ימים, אשר גורם פנימי הבקיעה צאצאי בהמשך חייו שהורג האב. סביר כי החיות חיים ארוכים של מוטציה TGFβ הופיע יש תוחלת חיים נורמלית בגלל פנוטיפ egl הרג החיות בסביבות הזמן מתי פראי-סוג חיות מתות בדרך כלל. זו יכולה להיות רלוונטיים אחרים מסלולים גנטיים מקושר, ד ר, כמו חיות פראי-סוג מורעבים גם המתבטאים פנוטיפ של egl , אולי יש יתרון הישרדות מסתגלת רומא בתנאים של מזון נמוכה. זה מדגיש את המורכבות הבסיסית בתגובות גמישים בעלי חיים עוברים תחת תנאי לחץ, והצורך ניתוח זהיר והתחשבות בעת תכנון ניסויים תוחלת החיים.

בתכנון וביצוע ניסויים תוחלת החיים על-ידי אחת מהשיטות חיוני כדי למנוע הטיה. ניסויים שחייבת להתנהל בצורה עיוורת: כמה דגימות זכו בעבר בנקודות זמן קודמות, הזהות של תנאי המבחן חייב להיות ידוע הנסיין. יתר על כן, יש תמיד צורך לכלול פקדים חיוביות ושליליות; במקרה של שיטת ערכת עותקים משוכפלים, אלה מוכנסים באופן אקראי לתוך צלחת 24-. טוב. E. coli לבטא פלסמיד שאינו מכיל מוסף עם הרצף המקביל C. elegans הגנום הוא וקטור ריק שלילי הפקד (קרי "L4440"-ראה חומרים). פקדים חיובי תלויות הטבע מסוימת של ניסוי. לדוגמה, הדף היומי-2 מקודד הקולטן אינסולין/IGF-1 C. elegans ומגביר את הדף היומי-2 איון באמצעות האכלה מבוססי RNAi robustly תוחלת החיים לפחות כפולה חיות פראי-סוג27. לכן ייתכן daf-2(RNAi) לשמש פקד חיובית כאשר מחפשים inactivations גנים המגבירים את תוחלת החיים. לעומת זאת, הדף היומי-16 מקודד orthologue30פקטור שעתוק FOXO. הדף היומי-16 היא מרכיב חיוני של פרדיגמות אריכות ימים רבים ובעלי חיים פראי-סוג (N2) שטופלו daf-16(RNAi) זמן קצר להראות סימני פרוגריה31.

היתרונות העיקריים של הגישה המסורתית תוחלת החיים האורך הם כי היא מבוססת מאוד היטב, ניסויים הם קל להגדיר. בעלי חיים מעטים יחסית נחוצים על כמה לוחות עבור כל תנאי הבדיקה. לפיכך, זנים שגדלות לקוי או דורשים כוחות מאזנים להפיץ יכול בקלות להיבדק. הגישה המסורתית היא מאוד והוא יכול לשמש עם כל אחת הגישות זמינים עבור טיפול רומא הייצור, לרבות טיפול עם FUdR, שחוצים את רקע גנטי נשי או מעת לעת העברת בעלי חיים למבוגרים את לוחיות הרישוי במהלך תקופת להטלת ביצים. בזמן העברת בעלי חיים מאוד מפחית את התפוקה, עבודה עם רקע מוטציה היא אף פעם לא אידיאלי, למרות FUdR לא תשנה את תוחלת החיים פראי-סוג32,33,34, זה יכול להשפיע על תוחלת החיים, גיל פנוטיפים קשורים קצת רקע גנטי35,25,26. שים לב כי הנוכחות של הזכרים, אפילו עם השימוש של FUdR, תביא לקיצור משמעותי תוחלת החיים אנדרוגינוס13, ולכן צלחת שהכילה זכרים אנדרוגינוסים למגבלת L4 הוא לא שמיש. כמו כן, ניתוח דרך משערך קפלן-מאייר את עקומות משויך, ואת הבדיקה יומן-דרגה, מעוגנת היטב עבור נתוני התמותה. עם זאת, ישנם מספר חסרונות לניתוח תוחלת החיים המסורתי. לחזור על הטיפול של צלחות (כלומר לחשוף את הצלחות לאוויר) מקלה על כניסתה של זיהום פטרייתי באוויר. בנוסף, חוזר על עצמו מציץ יכול לפגוע או להרוג בעלי חיים, במיוחד כפי האוכלוסייה מקדמות בעידן ולהיות שביר. בעלי חיים בוגרים להפוך במידה רבה משותק השקועה e. coli, בעוד e. coli הופך הזדמנותית פתוגן (colonizing לומן ואריזה הלוע)36. ניתן לזהות חיות חיים מאוד ישן רק על ידי תנועות ראש עדין. לכן, קל כשידור לבעל חיים חלוש המלח. לבסוף, הגישה המסורתית הוא מוגבל על ידי תפוקה.

השיטה העותקים המשוכפלים היא תפוקה גבוהה, תפוקה. עם זאת, החיסרון של שיטה זו הוא השקעה גדולה של זמן ומשאבים ב הראשונית להגדיר. ניסוי גדול למדי לבחון 100 שכפולים RNAi מעל 20 נקודות זמן דורש 30,000 חיות L1 (איפה חיות כ 15 נבדקים לכל RNAi שיבוט לכל נקודת זמן), אשר אמנם קל עבור רוב זני, יכול להיות בעייתי במקרים מסוימים. למשל, בלי שמקודדים החלקיקים גדולים סדרן ("סדרן תולעת") חייבת להישמר עם כוחות מאזנים או קווים הטרנסגניים נושא מערך כרומוזומליות במיוחד לקוי מועברים לא יכול בקלות להיבדק על ידי שיטה זו. חיסרון נוסף הוא כי רומא הייצור חייב להיות מעוכבים, אשר דורש שימוש FUdR או רקע גנטי נשי. לבסוף, צריך לדעת את משך הזמן שוזמינותו תפעל, כל אחד חייב להכין עותק משוכפל עבור כל נקודת זמן בתחילת הניסוי. עם זאת, היתרונות של שיטה זו הם רבים. בראש ובראשונה, הבקיע הכדאיות הרבה יותר מהר וזה אחד יוכלו לעקוב בקלות אחר חיות מעל 100 בתנאים בו זמנית (קרי שיבוטים RNAi). מאחר משוכפלים רק הבקיע פעם אחת ולאחר מכן שנמחקו, יש אין טיפול חוזר ונשנה של צלחות או מציץ של בעלי חיים, אשר מצמצם את הסבירות של זיהום פטרייתי ומסלקת התמותה הנגרמת על ידי לדרבן קשה מדי פעם עם תולעת לבחור. יתר על כן, התוספת של נוזל אל הבאר מאוד מקל הניקוד. פינוי בעלי החיים הישן מהצלחת וסביב חיידקים מסייע ומאפשר תנועות ראש עדין כדי להיות קלע בקלות רבה יותר. תוספת של נוזל גם מספק את ההזדמנות כדי למדוד את המחירים בהלקאה כאמצעי של כושר (למשל healthspan8,37).

הזדקנות היא תופעה מורכבים המערבים מנגנונים סיבתי מרובים הדורשים שימוש של מערכות גישות ביולוגיות לפענח. גישות אלה לעיתים קרובות לשלב מודלים מונחי-נתונים, שימוש בנפחים גדולים של נתונים גנומית/transcriptomic, והן דורשות משלימים שיטות ועמיד תפוקה גבוהה כדי למדוד את תוחלת החיים של healthspan. השיטה העותקים המשוכפלים תפוקה גבוהה יאפשר השוואה של שיבוטים RNAi רבים longitudinally, תוך מזעור אפקטים אצווה של שגיאות טכניות, ובכך להקל על פיתוח מודלים דינמיים כי ניתן להסיק את האינטראקציות בין המסלולים סיבתי ב באופן כמותי. בנוסף, שילוב של מספר גישות גנומיקה הגנום כולו עם השיטה העותקים המשוכפלים הוא ריאלי כי אוכלוסיה גדולה של חיות גיל-מסונכרנות מחולק מספר אוכלוסיות קטנות.

שיטות אחרות פותחו בעבר כדי לשפר את התפוקה של C. elegans תוחלת החיים ניסויים, לעיתים קרובות התמקדות בהתאמת אורכי הגישה המסורתית (קרי בעקבות אותה קבוצה של בעלי חיים לאורך זמן) עד אוטומטיות תצפית והקלטה באמצעות נפוצות גרר סורקים38,39, או ציוד מיוחד יותר כגון צלחות microfluidic40. הגישות מבוססות הסורק לשמש אור גירוי ולהשוות תמונות שנתפסו ברצף כדי לקבוע מצב חי/מת מבוסס על תנועה עבור לוחות מרובים בבת אחת; ואילו גישות כאלה אינן דורשות חומרה מדעי קניינית, זמן מעורב הגדרת זרימות העבודה עשוי להיות ניכרת בהתאם לגודל הרצוי. לחלופין, תוחלת החיים ניסויים במכשירים microfluidic מותאם אישית מאפשרים מעמיק אפיון פנוטיפי של חיות יחיד עם הזמן וללא טיפול כדי למנוע רומא, אך מחייבים ייצור של לוחות microfluidic, רכישה microfluidic המשויך משאבות וציוד הדמיה. לעומת זאת, שיטת עותקים משוכפלים, בשילוב עם התוכנה מפורטות כאן, מאפשר קצב העברת נתונים משופר מאוד באמצעות כלים הנפוצים כבר במעבדות עובד עם C. elegans.

התוכנה WormLife ישתפר בעתיד להציע גישה קלה יותר השוואה סטטיסטית, ותאימות עם פלטפורמות נוספות. בתיעוד התוכנה העדכנית ביותר ניתן למצוא בדף GitHub, כולל הוראות התקנה עבור פלטפורמות שבו נבדק התוכנה. גירסה מבוססת-אינטרנט יתפתחו גם כדי לאפשר גישה נוחה ללא צורך להתקין כל תוכנה.

לסיכום, שילוב השיטה עותקים משוכפלים עם התוכנה זמינה בחופשיות מפורט כאן מספק פלטפורמה רב-עוצמה לשיפור את התפוקה ואת החוסן של ניסויים תוחלת החיים ובמגוון רחב של מבחני מבוסס-הישרדות (למשל דגש על סובלנות, טוקסיקולוגיה מחקרים, healthspan, וכו '). במיוחד כאשר בשילוב עם גנומיקה תפקודית, גישה זו מדגישה את היתרונות הרבים של מערכת מודל metazoan C. elegans עבור פענוח עצום של אינטראקציות גנטי שתורמים ההתקדמות של הזדקנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

מימון עבור עבודה זו המתוארת בכתב יד זה נמסר על ידי: המשרד אוניברסיטת רוצ'סטר של פרווסט, בית הספר לרפואה, רפואת שיניים ומבחנים באמצעות מרכז מדעי הבריאות עבור חישובית חדשנות (HSCCI); אליסון רפואי קרן חדשה חכמי הדת מלגת הזדקנות (AG-NS-0681-10) התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395, (6705), 854 (1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2, (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579, (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14, (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21, (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8, (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51, (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343, (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103, (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910, (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50, (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14, (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A, (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10, (4), e1004278 (2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389, (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1, (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132, (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9, (1), e85964 (2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131, (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17, (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41, (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278, (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12, (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13, (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34, (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46, (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10, (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12, (3), 398-409 (2013).
השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה <em>Caenorhabditis elegans</em> תוחלת החיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter