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Genetics

प्रतिकृति सेट विधि: मात्रात्मक माप करने के लिए एक उच्च-प्रवाह Approach Caenorhabditis एलिगेंस आयुष्यात

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Summary

यहाँ हम प्रतिकृति सेट विधि का वर्णन, मात्रात्मक उपाय करने के लिए एक दृष्टिकोण एक उच्च प्रवाह और मजबूत तरीके से, इस प्रकार डेटा की गुणवत्ता का त्याग के बिना कई शर्तों की स्क्रीनिंग की अनुमति सी. एलिगेंस उंर/ इस प्रोटोकॉल रणनीति विवरण और प्रतिकृति सेट डेटा के विश्लेषण के लिए एक सॉफ्टवेयर उपकरण प्रदान करता है ।

Abstract

प्रतिकृति सेट विधि मात्रात्मक उपाय या Caenorhabditis एलिगेंस सूत्रकृमि के एक उच्च प्रवाह तरीके से अस्तित्व को मापने के लिए एक दृष्टिकोण है, इस प्रकार की अनुमति एक ही अंवेषक के लिए एक ही राशि से अधिक उपचार या शर्तों स्क्रीन डेटा की गुणवत्ता की हानि के बिना समय । विधि आम एलिगेंस के साथ काम कर रहे अधिकांश प्रयोगशालाओं में पाया उपकरण की आवश्यकता है और इस तरह अपनाने के लिए सरल है । प्रत्येक अवलोकन बिंदु पर एक जनसंख्या के स्वतंत्र नमूनों की परख पर दृष्टिकोण केंद्र, बल्कि पारंपरिक अनुदैर्ध्य तरीकों के साथ के रूप में समय के साथ एक एकल नमूना से । स्कोरिंग एक बहु अच्छी तरह से प्लेट, जो सी. एलिगेंस को उत्तेजित करता है और ले जाने के लिए healthspan में परिवर्तन को बढ़ाता है की कुओं को तरल जोड़ने पर जोर देता है । अन्य प्रमुख लाभ प्रतिकृति सेट विधि के कम जोखिम में शामिल हैं आगर हवाई प्रदूषित पदार्थों (जैसे मोल्ड या कवक), पशुओं की न्यूनतम हैंडलिंग, और छिटपुट गलत स्कोरिंग करने के लिए मजबूती (जैसे कि जब यह अभी भी है मृत के रूप में एक जानवर बुला के रूप में जिंदा) । उचित विश्लेषण और एक प्रतिकृति सेट शैली प्रयोग से डेटा visualize करने के लिए, एक कस्टम सॉफ़्टवेयर उपकरण भी विकसित किया गया था । सॉफ्टवेयर की वर्तमान क्षमताओं दोनों प्रतिकृति सेट और पारंपरिक (कापलान-Meier) प्रयोगों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिकृति सेट के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अस्तित्व curves की साजिश रचने शामिल हैं । यहां दिए गए प्रोटोकॉल पारंपरिक प्रायोगिक दृष्टिकोण और प्रतिकृति सेट विधि का वर्णन करते हैं, साथ ही साथ संगत डेटा विश्लेषण का अवलोकन करते हैं ।

Introduction

उंर बढ़ने के आनुवंशिक आधार को समझने की दिशा में सबसे परिवर्तनकारी तकनीकी प्रगति में से एक- C. एलिगेंस1में खिला आधारित RNAi का विकास किया गया था; RNAi के प्रायोगिक उपयोग से पहले, उंर बढ़ने के कई phenotypes आनुवंशिक रूप से नहीं थे । खिलाने आधारित RNAi ई. कोलाई के भीतर dsRNA के उत्पादन के माध्यम से हासिल की है कि एक अंतर्जात ग. एलिगेंस mRNA मैच: IPTG या तो सी. एलिगेंस सीडीएनए या एक के एक हिस्से की एक डालने भर में द्वि-दिशा प्रतिलेखन लाती है एक प्लाज्मिड2के भीतर ओपन रीडिंग फ्रेम । जब C. एलिगेंस बरकरार ई. कोलाई पर फ़ीड, बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित dsRNA के माध्यम से आंतों की कोशिकाओं में लुमेन से ले जाया जाता है सिड-2 transmembrane प्रोटीन3, और फिर sid के माध्यम से पशु के बाकी के माध्यम से वितरित-14. प्रत्येक कोशिका के भीतर, exogenous dsRNA Dicer परिसर द्वारा सिरना, जो एक नया mRNA-सिरना द्वैध बनाने के लिए पूरक आधार बाँधना के माध्यम से एक परिपक्व mRNA के साथ बातचीत में संसाधित है. इस द्वैध RISC परिसर और सट द्वारा मांयता प्राप्त है, जिससे अंतर्जात mRNA5अपमानजनक । इस प्रकार, केवल प्लाज्मिड डालने बदल कर, एक सी एलिगेंस जीनोम के भीतर लगभग किसी भी जीन के समारोह को निष्क्रिय कर सकते हैं । यह खोज कई बड़े भोजन के निर्माण के लिए नेतृत्व में RNAi पुस्तकालयों आधारित-बदल ई. कोलाई शेयर कि ज्ञात सी एलिगेंस जीन6के लगभग ८६% की कवरेज प्राप्त करने के लिए संयुक्त किया जा सकता है के संग्रह, 7.

खिला-RNAi आधारित, सी एलिगेंस में व्यापक स्क्रीन की उंनति के बाद से अधिक ९०० जीन की खोज करने के लिए नेतृत्व किया है कि जब निष्क्रिय उंर बदल (के रूप में RNAi-phenotype WormBase में उपपादरी संघों द्वारा सबूत), जो हम देखें के रूप में gerogenes । दीर्घायु नियंत्रण में gerogenes के बहुमत के लिए एक भूमिका के माध्यम से की खोज की थी खिला-सिर्फ कुछ लाभदायक रिपोर्टों में RNAi आधारित ( चित्र 1a और पूरक फ़ाइल विवरण के लिए 1 देखें) । कुछ मामलों में, इन gerogenes एक एकल या कुछ समय बिंदुओं पर व्यवहार्यता को मापने के आधार पर पहचान की गई है, जो RNAi उपचार के साथ जीवन में परिवर्तन का एक quantifiable उपाय प्रदान करने में विफल रहता है । अन्य मामलों में, इन जीनों की उम्र में परिवर्तन के लिए मात्रात्मक मूल्यांकन किया गया है, साथ ही अतिरिक्त आयु-संबद्ध phenotypes. उदाहरण के लिए, हम पहले से पहचान की १५९ जीन है कि दोनों सामांय और वृद्धि हुई इंसुलिन के साथ पशुओं की उंर बढ़ी/IGF-1 संकेत, और healthspan में quantified परिवर्तन के लिए आवश्यक थे । इनमें से, १०३ जीन निष्क्रियता एक progeric phenotype में परिणाम, के रूप में नुकसान समय से पहले8उंर बढ़ने के एक या अधिक संकेत में हुई ।

जबकि कुछ gerogenes १०० या अधिक अध्ययन (जैसे डीएएफ-16, डीएएफ-2, सर-२.१) के साथ संबद्ध किया गया है, ४०० gerogenes से अधिक 10 या कम प्रशस्ति पत्र (आंकड़ा 1b, और पूरक फ़ाइल 2) है । इस प्रकार, जबकि व्यापक खिला आधारित RNAi स्क्रीन की खोज की है और cursorily ख्यात gerogenes, कैसे इन जीन दीर्घायु नियंत्रण में समारोह के सैकड़ों विशेषता है, और इन जीन उत्पादों के बीच आनुवंशिक संबंध खराब रहना अध्ययन. उंर के लिए पूर्ण अनुदैर्ध्य विश्लेषण-संबद्ध phenotypes gerogenes (जैसे epistatic बातचीत, asynthetic बातचीत, आदि) के बीच आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए एक शर्त है । gerogenes के बीच आनुवंशिक संबंध में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के एक उच्च प्रवाह मात्रात्मक विधि है, जो भी खिलाने के लाभों का लाभ उठाने आधारित RNAi की आवश्यकता है ।

उंर बढ़ने का सबसे आम किराए का उपाय है । C. एलिगेंस मृत्यु दर को मापने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण एक छोटी आबादी के नमूने के भीतर समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की मौतों पटरियों । पशुओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या समय पर पीछा कर रहे है और आवधिक रूप से या तो एक प्लैटिनम तार या बरौनी के साथ, व्यवहार्यता का एक संकेतक के रूप में आंदोलन के साथ prodded है (चित्रा 2a) । इस विधि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, के रूप में यह सरल प्रदान करता है, औसत और अधिकतम उंर के प्रत्यक्ष माप । हालांकि, इस पारंपरिक विधि समय लेने और अपेक्षाकृत कम प्रवाह है, जो जानवरों और शर्तों है कि एक साथ एक नियंत्रित तरीके से मापा जा सकता है की संख्या सीमा है । हाल ही में एक सिमुलेशन अध्ययन में पाया गया कि कई सी. एलिगेंस आयुष्यात अध्ययन नहीं परख पशुओं की एक बड़ी संख्या पर्याप्त करने के लिए मज़बूती से9शर्तों के बीच छोटे परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम हो । इसके अलावा, इस पारंपरिक विधि बार बार है, जो बारी में संदूषण परिचय कर सकते हैं, और नुकसान या तेजी से कमजोर, वृद्ध पशुओं को मार सकता है पर पशुओं के समान पलटन हैंडलिंग शामिल है ।

हम एक वैकल्पिक "प्रतिकृति सेट" सी एलिगेंस उंर मापने के लिए पद्धति विकसित की है । यह अंत करने के लिए, उंर की एक बड़ी आबादी-सिंक्रनाइज़, isogenic पशुओं छोटी आबादी (या प्रतिकृतियां) की एक संख्या में विभाजित हैं । पर्याप्त प्रतिकृति नमूने नियोजित प्रयोग में प्रत्येक समय बिंदु को कवर करने के लिए उत्पन्न होते हैं । प्रत्येक अवलोकन समय बिंदु पर, प्रतिकृतियों में से एक रहते हैं, मृत और सेंसर जानवरों की संख्या के लिए बनाए गए है, तो है कि दोहराने के भीतर जानवरों को खारिज कर रहे हैं । इस प्रकार, एक पूरी, स्वतंत्र उपआबादी की एक श्रृंखला के रूप में जनसंख्या की उंमीद की उंर से अधिक समय-अवधि (चित्रा बी) नमूना है । प्रतिकृति का उपयोग कर में सेट वहाँ जानवरों की कोई दोहराया उकसाने है और संभावित पर्यावरणीय संदूषण के लिए कोई दोहराया जोखिम. व्यवहार्यता एक समय बिंदु पर मनाया हर दूसरे प्रेक्षण के पूरी तरह से स्वतंत्र है, जो से निपटने को कम से कम और परिमाण के एक आदेश के द्वारा प्रवाह बढ़ जाती है । यह हमें RNAi क्लोनों के सैकड़ों के लिए एक साथ8,10के लिए उंर में परिवर्तन quantitate करने की अनुमति दी है ।

यहां हम दोनों प्रतिकृति सेट और c. एलिगेंस दीर्घायु स्कोरिंग के लिए पारंपरिक तरीकों के माध्यम से c. एलिगेंस उंर के संचालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम इस तरह के परिणामों के तरीकों के बीच प्राप्त कर रहे है कि प्रदर्शन । हम जीवन के लिए या तो दृष्टिकोण है, जो हम आज़ादी से एक जीपीएल V3 लाइसेंस के तहत उपलब्ध कराने के माध्यम से उत्पंन डेटा की चित्रमय विश्लेषण में सहायता करने के लिए सॉफ्टवेयर विकसित किया है ( सामग्री की तालिकादेखें) । "WormLife"11आर में लिखा है, और डेटा है, जो मैक ओएस और लिनक्स में परीक्षण किया गया है की साजिश रचने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) भी शामिल है । अंत में, हम तुलना करें और प्रत्येक विधि की सीमाओं के विपरीत और अंय बातों पर प्रकाश डाला जब दृष्टिकोण के लिए सी एलिगेंस उंर में मात्रात्मक परिवर्तन उपाय के बीच चुनने ।

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Protocol

1. स्कोरिंग के लिए पारंपरिक विधि C. एलिगेंस दीर्घायु

  1. रिएजेंट की तैयारी
    1. पहचान जीन खिला-आधारित RNAi के माध्यम से निष्क्रिय किया जा करने के लिए । HT115 ई. कोलाई2 ब्याज की RNAi क्लोन युक्त के शेयरों में तब्दील खरीद । वैकल्पिक रूप से, L4440 प्लाज्मिड के multicloning साइट में ब्याज की जीन के सीडीएनए उपक्लोन ।
      नोट: HT115 एक RNase III-IPTG के साथ ई. कोलाई तनाव-inducible T7 पोलीमरेज़ गतिविधि है, जो बैक्टीरिया के भीतर dsRNA के क्षरण को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है की कमी है । उंर के अध्ययन के लिए है कि भोजन का उपयोग नहीं करते आधारित RNAi, या तो HT115 या OP50 ई. कोलाई मानक NGM प्लेटों पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. 3-6 (या अधिक) 6 सेमी RNAi प्लेटें परीक्षण शर्त प्रति (पूरक फ़ाइल 3 रेसिपी के लिए) तैयार करें । कई महीनों तक बैक्टीरिया के साथ बोने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर RNAi प्लेट्स को स्टोर करें ।
    3. बढ़ते ई. कोलाई रातोंरात (16-20 एच, ३७ ° सी मिलाते हुए 180 से कम-220 RPM) ।
      नोट: HT115 ई. कोलाई एम्पीसिलीन के साथ पौंड में उगाया जाता है (५० मिलीग्राम/एमएल) । मानक OP50 ई. कोलाई एंटीबायोटिक प्रतिरोधी नहीं है और एम्पीसिलीन के बिना हो गया है । संस्कृति की मात्रा प्लेटों के # पर निर्भर करता है, लेकिन आम तौर पर 8 और १०० मिलीलीटर पौंड के बीच है, प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है ।
      1. 15 के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा बैक्टीरिया ध्यान केंद्रित-एक benchtop केंद्रापसारक में 20 मिनट । महाप्राण supernatant, और फिर से 1 पर गोली सस्पेंड/10 वीं शुरू की मात्रा (यानी 10x) एम्पीसिलीन के साथ पौंड में HT115 के लिए (या मानक एम्पीसिलीन के लिए OP50 के बिना) ।
      2. Aliquot २०० प्रत्येक 6 सेमी प्लेट को केंद्रित 10x बैक्टीरिया की µ एल । संदूषण के मामले में इस्तेमाल किया जा करने के लिए 2 अतिरिक्त बैकअप प्लेटों के साथ, परीक्षण की स्थिति के अनुसार 3-4 प्रतिकृति तैयार करते हैं । जब प्लेटें तैयार करने, उंहें लेबल तो प्रयोग परख स्कोरिंग प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अंधा है, एक रंग कोड या इसी तरह कोडिंग योजना का उपयोग कर । सुनिश्चित करें कि कोड रिकॉर्ड किया गया है ।
      3. खुली प्लेटें एक स्वच्छ वातावरण में ऐसे लामिना प्रवाह पीठ के रूप में शुष्क करने के लिए अनुमति दें जब तक सभी तरल अवशोषित किया गया है या कवर प्लेटों रात बेंच पर शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं । प्लेटों पर नजर रखने के लिए सुनिश्चित करें कि आगर सूख बिना सूख रहा है ।
        नोट: अधिक सुखाने प्लेटों आगर कि एलिगेंस में चिपमंक करने के लिए कारण होगा कि आगर के खुर की ओर जाता है । गीला आगर सतहों को भी बढ़ावा burrowing ।
    4. स्टोर dsRNA उत्पादन की प्रेरण की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर एक कीड़ा बॉक्स (अप करने के लिए 24 घंटे) के भीतर प्लेटें सूख । आरटी पर 1 दिन के बाद, एक सील ज़िप-लॉक बैग में 2 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की दुकान (बाहर सुखाने से प्लेटों को रोकने के लिए) । उपयोग करने से पहले, ज़िप लॉक बैग के भीतर कमरे के तापमान को वापस प्लेटें हवाई कवक दूषित पदार्थों को शुरू करने से रोकने के लिए ।
  2. हाइपोक्लोराइट उपचार के साथ C. एलिगेंस का सिंक्रनाइज़ेशन
    नोट: M9 और हाइपोक्लोराइट समाधान व्यंजनों के लिए पूरक फ़ाइल 3 देखें.
    1. M9 के साथ gravid वयस्क जानवरों को इकट्ठा । 2x 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक प्लग ग्लास पिपेट का प्रयोग करें ।
    2. 30 के लिए स्पिन ट्यूबों "~ २,००० rpm पर । ट्यूब के तल पर सूत्रकृमि में से एक पूल के लिए जांच करें । महाप्राण supernatant । M9 समाधान के साथ दो बार धो, स्पिन और आकांक्षा दोहरा ।
    3. M9 के 4 मिलीलीटर में सी. एलिगेंस को पुनः निलंबित करना । हाइपोक्लोराइट समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें । तुरंत के लिए भंवर ~ 3 मिनट, आवधिक जोरदार झटकों के साथ । 3 मिनट के बाद, एक विदारक खुर्दबीन के नीचे अंडे के एक बादल के लिए देखो । भंवर एक अतिरिक्त 10-20 एस अगर अंडे 3 मिनट के बाद जारी नहीं किया गया है ।
      नोट: समय हाइपोक्लोराइट उपचार आवश्यक है । gravid वयस्कों के भीतर अंडे क्या इलाज बच रहे हैं । ~ 3 मिनट के बाद gravid वयस्कों खुला और अंडे बाहर फैल तोड़ । हालांकि, अगर अंडे हाइपोक्लोराइट समाधान में बहुत लंबे समय के बाद रिलीज वे मर जाएगा रहे हैं । इसके विपरीत, यदि gravid वयस्कों हाइपोक्लोराइट समाधान में लंबे समय तक नहीं छोड़ा जाता है, कोई अंडे जारी किया जाएगा ।
    4. जल्दी से M9 समाधान दो बार के रूप में चरण 2.1.2 में धोने ।
    5. फिर से निलंबित C. एलिगेंस egg गोली 3 मिलीलीटर M9 में और एक नया 15 एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । अनुमति भ्रूण 20 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ M9 समाधान के 3 मिलीलीटर में रातोंरात हैच करने के लिए ।
    6. एक 6 सेमी प्लेट पर L1 समाधान 3x के 10 µ एल छोड़ने के लिए और L1 पशुओं की संख्या की गणना करने के लिए µ एल के प्रति L1 पशुओं (या भ्रूण) के घनत्व की गणना करने की औसत संख्या का परिकलन करने के लिए L1s/µ l
      नोट: L1 जानवरों समय के साथ बसा होगा । इसलिए, L1 समाधान आवधिक रूप से मिलाया जाना चाहिए ।
    7. थाली प्रति बीज ५० L1 पशु । एक रबर बैंड के साथ प्लेटें और सील उलटा । एक प्लास्टिक वर्म बॉक्स में प्लेट रखें । एक बड़ी ज़िप-ताला बैग में सील बॉक्स । एक 20 डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए कदम ।
  3. ५-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) के अलावा संतति उत्पादन को रोकना
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर L4 चरण तक जानवरों को विकसित । यह देखने के लिए जांचें कि क्या सिंक्रनाइज़ किए गए पशुओं को L4 (step 2.1.7) बोने के बाद लगभग ४० h तक विकसित किया गया है ।
      नोट:C. एलिगेंस विकास के समय विभिन्न तापमानों12 और उत्परिवर्ती जानवरों के लिए जो दरों empirically परीक्षण किया जाना चाहिए विशेषता नहीं किया गया है की वृद्धि दर पर भिन्न हो जाएगा.
      1. L4 जानवरों के साथ प्रत्येक 6 सेमी प्लेट के लिए 50x FUdR के १६० µ एल जोड़ें ।
        नोट: यह L4 मंच पर FUdR जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । सुविधा के लिए, 1 ग्राम FUdR को 10 एमएल ultrapure एच2ओ में भंग करके FUdR के 1, 000x स्टॉक्स बनाएं । फ़िल्टर-एक ०.२ FUdR फिल्टर और एक 10 सीसी सिरिंज के साथ स्टॉक µm निष्फल । Aliquot ~ 1 बाँझ १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में स्टॉक की मिलीलीटर । फ्रीज और स्टोर-20 ° c ।
    2. पुरुष सी. एलिगेंस की उपस्थिति के लिए प्लेटों का निरीक्षण किया । सभी पुरुषों को निकालें ।
      ध्यान दें : उंर आम तौर पर hermaphrodites और नहीं पुरुषों के लिए मापा जाता है । Hermaphrodites है कि मेट FUdR13की उपस्थिति में, यहां तक कि unवाशिंदों जानवरों की तुलना में कम रहते हैं । नर छोटे और पतले तो hermaphrodites है और आसानी से एक विशिष्ट कांटे की पूंछ14से पहचाना जा सकता है ।
    3. ज़िप-ताला बैग में वापस बॉक्स रखो । 20 डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए लौटें ।
  4. स्कोरिंग व्यवहार्यता
    1. स्कोर व्यवहार्यता दैनिक एक प्लैटिनम तार या बरौनी के साथ सिर पर जानवर को छूने से धीरे । मृत के रूप में ले जाने और उन्हें प्लेट (चित्रा 2a) से हटाने के लिए असफल जानवरों है कि स्कोर । हर अवलोकन समय बिंदु के लिए प्रत्येक शर्त के लिए मृत मनाया संख्या रिकॉर्ड ।
      नोट: स्कोरिंग पूर्वाग्रह के जोखिम को कम करने के लिए, प्रयोगकर्ता प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अंधा रहना चाहिए और इसी तरह स्कोरिंग के दौरान पिछले समय अंक से परिणाम का संदर्भ नहीं होना चाहिए.
    2. सेंसर कि टूटना, अंय स्पष्ट विकास दोष से मर जाते हैं, या पकवान के पक्ष में क्रॉल: इन जानवरों को हटाने और सांख्यिकीय विश्लेषण में विचार के लिए प्रत्येक मनाया समय बिंदु पर संख्या रिकॉर्ड । इसके अतिरिक्त, यदि नर पाए जाते हैं, उन्हें हटा दें और स्वीकार्य संख्या रिकॉर्ड करें ।
    3. कदम 1.4.1 से दोहराएं जब तक कोई जानवर जिंदा नहीं रहेगा ।
      नोट: ई. कोलाई के लॉन काफी कम या कवक के लिए थाली पर बढ़ने शुरू होता है, उपयुक्त RNAi और FUdR के साथ एक ताजा थाली के लिए सभी शेष पशुओं हस्तांतरण करना चाहिए ।
  5. डेटा विश्लेषण-प्लॉटिंग और सांख्यिकी
    1. गैर-पैरामीट्रिक कापलान-Meier अनुमानक15 और लॉग-रैंक परीक्षण16 के साथ जीवन रक्षा विश्लेषण का समर्थन सॉफ्टवेयर में इनपुट या ओपन दर्ज प्रेक्षण डेटा ( पूरक फ़ाइल 3देखें) । सेंसर्ड जानवरों को शामिल करना सुनिश्चित करें । पुरुषों कि देखा, अगर कोई भी शामिल नहीं है ।
      नोट: डेटा स्वरूप सॉफ़्टवेयर के बीच भिंन हो सकते हैं, लेकिन एक सामांय स्वरूप एक अलग पंक्ति पर स्वीकार्य प्रत्येक पशु को रिकॉर्ड करना है । प्रयोगात्मक timepoint जिस पर एक जानवर मृत के रूप में मनाया गया था "घटना" समय है । यदि सेंसर किया, "घटना" समय timepoint जिस पर पशु सेंसर था । सेंसर टिप्पणियों को इंगित करने के लिए आमतौर पर एक फ़ील्ड या चेकबॉक्स होता है.
    2. प्लाट कापलान-Meier अस्तित्व घटता. यदि पठनीयता में सुधार के लिए कई शर्तों की परख की गई हो तो किसी एकल भूखंड के लिए छह से कम शर्तों का चयन करें ।
      1. नेत्रहीन स्पष्ट-गुम अवलोकन, अनपेक्षित नियंत्रण परिणाम, आदि डेटा समस्याओं के लिए जाँच करें । -और सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले इन पते ।
    3. pairwise सांख्यिकीय तुलना करने के लिए अपने सॉफ़्टवेयर में लॉग-रैंक परीक्षण फ़ंक्शन का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि सेंसर किए गए परिणामों के उपचार के लिए कोई भी उपलब्ध विकल्प सही-सेंसर्ड डेटा के लिए उचित रूप से सेट हैं.

2. प्रतिकृति स्कोरिंग के लिए विधि सेट C. एलिगेंस दीर्घायु

नोट: जबकि पारंपरिक विधि की आवश्यकता है 3-6 शर्त प्रति प्लेट (ऊपर 1.1.2 देखें.), प्रतिकृति सेट विधि कई और अधिक की आवश्यकता है (नीचे चरण -8 देखें) । पारंपरिक विधि एक प्रयोग (चित्रा 2a) भर में एक ही थाली पर जानवरों के बाद । इसके विपरीत, के साथ प्रतिकृति सेट जानवरों केवल एक बार रन बनाए हैं: कई समान प्रतिकृति प्रयोग की शुरुआत में स्थापित कर रहे है ताकि एक दोहराने प्रत्येक समय बिंदु (प्रति परीक्षण) (चित्रा बी) में रन बनाए हैं ।

  1. लाइब्रेरी सेटअप ।
    नोट: RNAi क्लोन सौंपने पर अतिरिक्त विस्तार यहां शामिल है, के रूप में प्रतिकृति सेट प्रोटोकॉल कई RNAi क्लोन के एक साथ स्कोरिंग के लिए उत्तरदाई है, और अच्छी तरह से एक समय में १०० क्लोनों को बढ़ाया जा सकता है । RNAi क्लोनों के संग्रह ग्लिसरॉल एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट में बनाए रखा शेयरों के रूप में संरक्षित कर रहे हैं । प्रतिकृति सेट प्रयोगों 24-well प्लेट्स का उपयोग करें । प्रत्येक अच्छी तरह से एक अलग परीक्षण हालत है, जो RNAi क्लोन, विभिंन रासायनिक उपचार, पशु उपभेदों, और बहुत आगे का एक संग्रह के अनुरूप हो सकता है ।
    1. RNAi क्लोन के संग्रह के लिए उपपुस्तकालय के लेआउट को इकट्ठा, ऐसी है कि निंनलिखित शर्तों को पूरा कर रहे हैं:
      1. सुनिश्चित करें कि एक ९६ के भीतर अच्छी तरह से संग्रह, अच्छी तरह से A1 एक खाली वेक्टर नकारात्मक नियंत्रण है ।
      2. प्रत्येक 24 कुओं के भीतर बेतरतीब ढंग से एक अतिरिक्त खाली वेक्टर नियंत्रण डालें ।
      3. विभाजित ९६-well प्लेट 24 कुओं के ब्लॉक में, इस तरह कि प्रत्येक 24 अच्छी तरह से थाली में एक बेतरतीब ढंग से डाला नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 2c) है ।
      4. 24 कुओं के हर समूह के भीतर बेतरतीब ढंग से एक सकारात्मक नियंत्रण डालें (चित्रा 2c).
        नोट: सकारात्मक नियंत्रण प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, जब RNAi क्लोनों का एक संग्रह देख रहा है कि उंर बढ़ाने के लिए, डीएएफ-2 (RNAi) अक्सर शामिल है । इसके विपरीत, जब छोटा उंर में देख, डीएएफ-16 (RNAi) अक्सर प्रयोग किया जाता है ।
  2. प्रतिकृति सेट की तैयारी
    नोट: आवश्यक प्रतिकृतियों की संख्या समय बिंदुओं (चित्र b) की ंयूनतम संख्या के बराबर है । एक posteriori कैसे लंबे समय से पहले प्रयोग की शुरुआत करने के लिए उपाय करने के लिए पता होना चाहिए, साथ ही स्कोरिंग आवृत्ति (उदाहरण के लिए एक प्रतिकृति सेट प्रयोग हर दूसरे दिन स्कोरिंग के साथ ४० दिन चल रहा है के लिए 20 प्रतिकृति सेट की एक न्यूनतम तैयारी की आवश्यकता है प्रयोग के प्रारंभ में प्रत्येक शर्त). यह ~ 5 अतिरिक्त बैकअप सेट बनाने के लिए सलाह दी जाती है (देखें -8 और नीचे 2.2.2.3).
    1. RNAi उपपुस्तकालय के एक ताजा स्टांप बनाने के लिए, inoculate २०० µ एल पौंड + एक ९६ अच्छी तरह से प्रारूप (६०० µ एल प्लेट) में अच्छी तरह से एक ९६-पिन प्लेट का उपयोग कर निम्न चरणों द्वारा रेप्लिकेटर:
      1. ९६ पिन प्लेट रेप्लिकेटर क्रमिक रूप से ५०% ब्लीच, ultrapure एच2ओ, और इथेनॉल में पिन विसर्जित करके निष्फल । ब्लीच और इथेनॉल चरणों के लिए कम से कम 30 एस के लिए डूबे पिंस रखें ।  इथेनॉल में विसर्जन के बाद, युक्तियां संक्षेप में लौ । दोहराएँ.
        नोट: सभी ब्लीच से कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित हो, और पिन विस्तारित अवधि के लिए ब्लीच करने के लिए उजागर नहीं छोड़, के रूप में ब्लीच स्टेनलेस स्टील पिंस को जीर्णशीर्ण कर सकते हैं ।
      2. ध्यान से हटाने चिपकने वाला पंनी जमे हुए ९६ से कवर-अच्छी तरह से ग्लिसरॉल स्टॉक लाइब्रेरी प्लेट और धीरे लेकिन दृढ़ता से अभी भी जमे हुए ग्लिसरॉल शेयरों के कुओं में रेप्लिकेटर निष्फल प्लेट के सुझावों पीसने । Inoculate २०० µ एल पौंड + Amp संस्कृतियों और एक पारगंय झिल्ली के साथ inoculated प्लेट सील । संस्कृतियों benchtop पर रातोंरात बढ़ने की अनुमति दें ।
      3. इस प्लेट रेप्लिकेटर के रूप में 2.1.1 कदम में, ध्यान से रात के विकास के बाद तरल संस्कृति प्लेट से सील हटाने और रेप्लिकेटर पिन के सुझावों विसर्जित कर दिया । एक आयताकार पौंड amp + tet आगर प्लेट के लिए भी दबाव के साथ सुझाव लागू करें, और एक छोटे परिपत्र गति के साथ धीरे से प्लेट के लिए पिन से जीवाणुओं हस्तांतरण, यह सुनिश्चित करना है कि पर्याप्त जगह आसंन स्थानों के बीच छोड़ दिया है । कालोनियों को ३७ डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेट पर रातोंरात बढ़ने की अनुमति दें । LB + Amp/Tet प्लेट्स की तैयारी के लिए पूरक फ़ाइल 3 देखें ।
      4. का उपयोग करने से पहले, स्टोर आगर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट औंधा (ढक्कन की ओर नीचे), आयल फिल्म में लिपटे ।
        नोट: भंडारण कालोनियों ढक्कन पक्ष ऊपर के लिए संघनित्र पार-दूषित RNAi क्लोन की अनुमति देगा! ई कोलाई के कालोनियों 2 के लिए संग्रहीत किया जा सकता है-8 सप्ताह में 4 डिग्री सेल्सियस, विशेष रूप से RNAi क्लोन पर निर्भर करता है, के रूप में RNAi क्लोन समय के चर लंबाई के लिए IPTG प्रेरण के बाद dsRNA उत्प्रेरण में प्रभावकारिता बनाए रखने । RNAi क्लोन के छोटे संग्रह के लिए, RNAi क्षमता पछाड़ना पुष्टि करने के लिए RT-qPCR द्वारा निर्धारित empirically किया जाना चाहिए ।
    2. प्रयोग के एक परीक्षण के लिए आवश्यक 24-well प्लेट्स की ंयूनतम संख्या की गणना करें: (# प्रति प्रतिकृति सेट प्लेट्स) x (# समय अंक की उंमीद) । सुनिश्चित करें कि कुछ अतिरिक्त प्रतिकृति सेट दूषित (चित्रा बी) जैसे मुद्दों से निपटने के लिए शामिल किए गए हैं ।
      नोट: RNAi क्लोनों की कुल संख्या 24-well प्लेटों की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रतिकृतियां का एक सेट (चित्रा 2c) बनाने के लिए ।
      1. तैयार 24-well प्लेट्स, के रूप में कदम 1.1.2 (नुस्खा के लिएपूरक फ़ाइल 3 ) । लेबल प्लेटें जब उंहें तैयारी तो प्रयोगकर्ता परख स्कोरिंग प्रयोगात्मक शर्तों को अंधा हो जाएगा, एक रंग कोड या इसी तरह कोडिंग योजना का उपयोग कर ।
      2. Inoculate हर 10 प्रतिकृतियां के लिए १.५ मिलीलीटर पौंड + Amp संस्कृतियों का एक सेट (देखें -8) । ९६ में Inoculate संस्कृतियों अच्छी तरह से गहरी प्लेट रेप्लिकेटर (2.1.3 में के रूप में) और 2.1.4 से बैक्टीरियल कालोनियों (चित्रा 2c, बाएं) का उपयोग कर प्लेटें । सांस की झिल्ली के साथ सील, झटकों के साथ 20 ज (३७ डिग्री सेल्सियस) हो जाना ।
      3. बीज १२० समायोज्य टिप रिक्ति के साथ एक 6 अच्छी तरह से मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक थाली के लिए एक रात संस्कृति के µ एल (आंकड़ा 2c सही) । सूखी प्लेटें एक लामिना प्रवाह हूड में खुला जब तक सभी तरल अवशोषित किया गया है । अधिक शुष्क मत करो । कमरे के तापमान पर रात भर स्टोर प्लेट ।
  3. हाइपोक्लोराइट उपचार का उपयोग कर C. एलिगेंस का सिंक्रनाइज़ेशन
    1. प्रयोग के लिए आवश्यक पशुओं की न्यूनतम संख्या की गणना करें: L1s की आवश्यक न्यूनतम # = (15-20 पशु/well) (24 कुओं/प्लेट) (X प्लेटें/प्रतिकृति सेट) (Y प्रतिकृति सेट) ।
      नोट: प्रतिकृति सेट विधि पारंपरिक विधि से अधिक जानवरों की आवश्यकता है । १ १० cm gravid कीड़े से भरी थाली gravid वयस्कों के घनत्व के आधार पर 20000-50000 L1 पशु प्रदान कर सकते हैं । इसी तरह, बीस 6 सेमी प्लेटें चारों ओर उपज ~ ३०,००० L1 जानवरों । एक अंडा तैयार करने की योजना है कि जानवरों की जरूरत है की ंयूनतम संख्या डबल्स तैयार । यदि तैयारी में आबादी भूखे, फिर से फ़ीड या एक नई थाली के लिए हिस्सा है और17proceding,18से पहले भोजन पर कम से कम तीन पीढ़ियों की अनुमति । हो वापस बचे L1s फ्रीज यकीन है ।
    2. सिंक्रनाइज़ L1 पशुओं को प्राप्त करने के लिए पारंपरिक विधि में के रूप में 1.2.6 करने के लिए १.२ चरणों का पालन करें । 15 बीज-20 L1 पशु प्रत्येक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से समायोज्य-रिक्ति पिपेट और एजेंट जलाशय, 1.2.7 के लिए इसी तरह का उपयोग कर । आवधिक मिश्रण L1 पशुओं के बसने को रोकने के समाधान ।
  4. 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) के अलावा संतान उत्पादन की रोकथाम
    1. स्टेप 1.3.1 का पालन करें ।  तैयार बाँझ 50x FUdR शेयर (स्टेप 1.3.1.1 देखें).
    2. जब जानवरों L4 तक पहुंचने के लिए, एक 24-अच्छी तरह से एक 6-चैनल समायोज्य-रिक्ति पिपेट का उपयोग कर प्लेट की प्रत्येक अच्छी तरह से 50x FUDR के 25 µ एल जोड़ें ।
  5. स्कोर व्यवहार्यता
    1. M9 समाधान के साथ प्लेटों और बाढ़ कुओं की प्रतिकृति का एक सेट निकालें, प्रति अच्छी तरह से रिकॉर्ड कुल पशुओं, और फिर धीरे एक कीड़ा लेने के साथ सिर पर गैर चलती जानवरों को छूने (चित्रा बी#). ले जाने में नाकाम रहने वाले जानवरों के रूप में मरे रन बनाए हैं । छोड़ें प्लेटें बनाए । अभिलेख व्यवहार्यता दै.
      ध्यान दें: जानवरों कि टूटना, सकल रूपात्मक दोषों को दिखाने के लिए, विकसित करने में विफल रहा है, या अच्छी तरह के पक्ष पर क्रॉल करने के लिए उन्हें दोनों मृत और कुल मूल्यों से छोड़कर द्वारा सेंसर किया जा रहे हैं.
      1. जानवरों की संख्या है कि प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक समय बिंदु पर अंय मूल्यों से अलग के भीतर सेंसर कर रहे है रिकॉर्ड ।
      2. कुओं स्कोर नहीं है कि भोजन नहीं है या दूषित कर रहे हैं (जैसे कवक या कीचड़); ऐसे कुओं को सेंसर माना जाता है. इसके अलावा, एक अच्छी तरह से सेंसर अगर जानवरों के सभी रूपात्मक या विकासात्मक दोष प्रदर्शित करते हैं । इस समय बिंदु पर इस RNAi क्लोन के लिए सेंसरशिप घटना रिकॉर्ड/
      3. एक दोहराने की थाली स्कोरिंग के बाद, इसे त्यागें । सभी कुओं भर में सभी जानवरों मर चुके हैं जब तक एक नई प्रतिकृति सेट प्रत्येक दिन स्कोरिंग जारी. स्कोरिंग पूर्वाग्रह के जोखिम को कम करने के लिए, प्रयोगकर्ता प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अंधा रहना चाहिए और इसी तरह स्कोरिंग के दौरान पिछले समय अंक से परिणाम का संदर्भ नहीं होना चाहिए.
      4. यदि एक अच्छी तरह के भीतर सभी जानवरों को एक निश्चित समय बिंदु पर मर गए थे, तो उस दिन के स्कोरिंग के बाद, जांच करें कि सभी जानवरों के लिए एक अच्छी तरह से दिया के लिए दो लगातार समय अंक के लिए मर के रूप में बनाए गए हैं । यदि हां, तो स्कोरिंग व्यवहार्यता अब बाद के समय अंक में है कि अच्छी तरह के लिए की जरूरत है ।
      5. अतिरिक्त स्वतंत्र प्रयोग परीक्षण आचरण । पिछले परीक्षणों में उन से अलग से लगातार परीक्षणों के परिणाम ट्रैक, परीक्षण संख्या के साथ उल्लेख किया ।

3. ग्राफ डेटा

नोट: प्रतिकृति सेट विधि के साथ एक वक्र फिट अनुमानित माध्य और अधिकतम आयु के लिए लागू किया जाता है । C. एलिगेंस मृत्यु दर का आकलन करने के लिए पैरामीटर्स एक logit वक्र19फिट ।  सबसे अस्तित्व उपकरण logit वक्र फिटिंग का समर्थन नहीं करते हैं, एक नया कार्यक्रम logit curves (प्रतिकृति सेट के लिए) की साजिश रचने के लिए विकसित किया गया था; कापलान-Meier curves (पारंपरिक विधि के लिए) भी समर्थन कर रहे हैं ।

  1. सॉफ्टवेयर के साथ शुरू हो जाओ । वर्तमान संस्करण के लिए जारी ज़िप फ़ाइल डाउनलोड करें ( सामग्री अनुभागदेखें) । किसी फ़ोल्डर में ज़िप फ़ाइल निकालें । अतिरिक्त स्थापना निर्देशों के लिए निकाले गए फ़ोल्डर में "रीडमी" फ़ाइल देखें ।
  1. प्लॉटिंग इंटरफ़ेस प्रारंभ करें । ज़िप फ़ाइल से निकाले गए फ़ोल्डर में "कोड" निर्देशिका के स्थान का पता लगाएं (उदा.  "/Users/UserName/Desktop/WormLife/code").
    1. अभी पहचाने गए फ़ोल्डर पथ के लिए प्रतिस्थापन R कंसोल में निंन आदेश दर्ज करें । प्रत्येक दर्ज की गई पंक्ति के बाद enter या return दबाएं: 1) setwd ("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) स्रोत ("plotGUI. R"), 3) openMain () ।
    2. एक नई विंडो में लोड करने के लिए इंटरफेस के लिए समय की अनुमति दें, चित्र 3ए में दिखाया गया के रूप में डिफ़ॉल्ट स्क्रीन लाने. पृष्ठभूमि में R चलाने दें ।
  2. डेटा को कॉमा सेपरेटेड वैल्यू (CSV) या टैब-सेपरेटेड वैल्यू (TSV) फ़ाइलों के रूप में स्वरूपित करें । विश्लेषण के प्रकार पर निर्भर स्तंभ और नाम निर्दिष्ट करें । पूर्व स्वरूपित उदाहरण डेटा के लिए पूरक फ़ाइल 4 (प्रतिकृति सेट) और पूरक फ़ाइल 5 (पारंपरिक/कापलान-Meier) देखें ।
    नोट: डेटा को एक "लंबे" स्वरूप में निर्दिष्ट किया जाना चाहिए, यानी प्रति परीक्षण प्रति समय बिंदु प्रति एक पंक्ति/ प्लेटफ़ॉर्म के बीच सर्वश्रेष्ठ संगतता के लिए CSV फ़ाइलें अनुशंसित की जाती हैं ।
    1. छोड़े गए या सेंसर किए गए टिप्पणियों के संगत पंक्तियों को निकालें । अनुपलब्ध या गैर-संख्यात्मक मानों की अनुपस्थिति के लिए जाँच करें, क्योंकि यह डेटा आयात किए जाने पर त्रुटि में परिणाम दे सकता है.
    2. पारंपरिक कापलान-Meier शैली विश्लेषण के लिए, नहीं पूल डेटा स्वतंत्र परीक्षणों से-उंहें अलग से साजिश । प्रतिकृति सेट विश्लेषण के लिए, एकाधिक परीक्षणों से पूल डेटा, और फिर "TrialView" कार्यक्षमता (देखें 6.3.3.4) का उपयोग कर की जाँच करें ।
  3. प्लॉटिंग इंटरफ़ेस का उपयोग करना
    1. एक डेटा फ़ाइल लोड ("फ़ाइल" मेनू के तहत "आयात") संवाद बॉक्स का उपयोग कर । ". csv" फ़ाइलों को खोलने के लिए, ड्रॉप डाउन में फ़ाइल प्रकार को ". csv" में बदलें (डिफ़ॉल्ट है ". txt/. tsv"), डेटा फ़ाइल के साथ फ़ोल्डर में नेविगेट करें । यहां फ़ाइल प्रतिकृति सेट उदाहरण डेटा (पूरक फ़ाइल 4) है ।
      नोट: कोई dataset पहले से खुला है जब कोई फ़ाइल आयात कर रहा है वर्तमान dataset बदल देगा ।
    2. आयात विज़ार्ड प्रारंभ करने के लिए आयात करने के लिए किसी फ़ाइल का चयन करें, जो चयनित फ़ाइल के स्तंभों की पहचान करने के माध्यम से चलता है (प्रतिकृति सेट के लिएआरेख S1A ) । यदि इनपुट डेटा एक replica-सेट प्रयोग करने के लिए संगत है, का चयन करें "Logit" के लिए अध्ययन प्रकार ।
      नोट: आयात कार्यप्रवाह प्रतिकृति सेट (चित्रा एसए) और पारंपरिक (कापलान-Meier) (चित्रा एसबी) के बीच अलग है ।
    3. "प्लॉट डेटा" । डेटा प्लॉट करना शुरू करने के लिए "लाइन जोड़ें" चुनें. (एक पंक्ति शर्तों के एक सेट से मेल खाती है । वहां सुविधाओं के प्रयोगों के साथ मदद जहां कई शर्तों का परीक्षण किया गया) ।
      1. भूखंड नियंत्रण शर्तों-उदाहरण के मामले में डेटा N2 (WT) के साथ L4440 (खाली सदिश) RNAi उपयुक्त हैं । चुनें "लाइन जोड़ें" के अंतर्गत "रेखांकन" मेनू जोड़ने लाइन विज़ार्ड आरंभ करने के लिए: प्लॉट करने के लिए शर्त और सुचित्रित पैरामीटर पंक्ति का प्रतिनिधित्व करने के लिए का चयन करें ।
        1. मैंयुअल रूप से किसी भिंन शर्त के लिए वक्र जोड़ने के लिए, 3.3.3.1 में दिए चरणों को दोहराएं
        2. एक लाइन के लिए रंग या भूखंड प्रतीक बदलने के लिए, "ग्राफ मेनू" के तहत "संशोधित लाइन" का चयन करें ।
        3. सभी लाइनों को साफ़ करने के बिना एक पंक्ति को हटाने के लिए "ग्राफ़ मेनू" के अंतर्गत "हटाएँ रेखा" का चयन करें ।
        4. वर्तमान प्लॉट में सभी पंक्तियों को साफ़ करने के लिए, "ग्राफ़ मेनू" के अंतर्गत "स्पष्ट रेखा" का चयन करें ।
        5. स्वचालित रूप से चयनित अधिकतम x-अक्ष (समय) मान को ओवरराइड करने के लिए, "ग्राफ़ मेनू" के अंतर्गत "सेट x स्केल" का उपयोग करें.
          नोट: y-अक्ष (अंश जीवित) को हमेशा 20% की वृद्धि में 0% (नीचे) १००% (ऊपर) प्रदर्शित करता है । x-अक्ष हमेशा 5 की किश्तों में प्रदर्शित होता है । प्लॉट छवियां सहेजने के बाद लेबलिंग में लचीलापन सक्षम करने के लिए अक्ष लेबल्स प्लॉट नहीं किए जाते हैं ।
      2. वर्तमान में प्रदर्शित प्लॉट की JPEG-format छवियां सहेजने के लिए, "फ़ाइल मेनू" में "प्लॉट सहेजें" विकल्प का उपयोग करें; केवल वर्तमान प्लॉट सहेजा गया है ।
      3. एक प्रयोग में कई विभिंन स्थितियों के लिए व्यक्तिगत भूखंड बनाने के लिए, सॉफ्टवेयर को परिभाषित करने और एक "श्रृंखला" की साजिश रचने की अनुमति देता है ।
        नोट: श्रृंखला अवधारणा के कार्यांवयन दक्षता में सुधार जब बड़े प्रयोगों के साथ काम कर रहे ।
        1. यदि किसी रिक्त प्लॉट कार्यस्थान से प्रारंभ कर रहा है, तो श्रृंखला में सभी भूखंडों पर संगत होना करने के लिए संगत नियंत्रण शर्तों (देखें 3.3.3.1) लाइनों जोड़ें ।
        2. रेखांकन मेनू में "परिभाषित श्रृंखला" के साथ श्रृंखला को परिभाषित करें । श्रृंखला में पहले प्रदर्शित करने के लिए पंक्ति के संगत किसी शर्त का चयन करें; केवल एक को चुना जा सकता है । 3.3.3.1 के रूप में, लाइन के लिए ग्राफिकल पैरामीटर (लाइन रंग और साजिश प्रतीक) चुनें ।
        3. विभिंन परीक्षण शर्तों के लिए भूखंडों की समीक्षा करें । मुख्य भूखंड खिड़की के पक्षों पर और साथ ही शीर्ष मेनू पट्टी (3सी-सी) में पाया वाम/सही तीर बटन का उपयोग शर्तों के बीच "श्रृंखला लाइन" के प्रदर्शन स्विच ।
          नोट: यदि चयनित श्रृंखला पंक्ति पहले जोड़ा नियंत्रण/संदर्भ पंक्तियों में से एक के रूप में एक ही शर्त है, नई पंक्ति मढ़ा प्रकट हो सकता है ।
        4. श्रृंखला को परिभाषित करने के लिए कुछ अंय कार्य उपलब्ध बनाने के (श्रृंखला भूखंडों और Trialview बचाने के बाद के लिए 3.3.3.4 देखें) । एक श्रृंखला को परिभाषित करने के बाद, एक नए फ़ोल्डर में श्रृंखला में प्रत्येक भूखंड के लिए व्यक्तिगत भूखंड छवि फ़ाइलों को बचाने के लिए "फ़ाइल" मेनू से "श्रृंखला भूखंडों सहेजें" विकल्प का उपयोग करें ।
      4. Trialview — एक प्रतिकृति सेट प्रयोग के स्वतंत्र परीक्षणों से परिणाम visualizing । यदि एकाधिक परीक्षण एक या अधिक नमूना समूहों के लिए चलाए गए थे, व्यक्तिगत परीक्षणों से डेटा प्लॉट और सभी परीक्षणों से परित डेटा स्वतंत्र परीक्षणों के बीच संगति का मूल्यांकन करने के लिए अलग से ( चित्रा 3 डीदेखें) ।
        1. 3.3.3.3 में वर्णित के रूप में एक श्रृंखला सेट करें । विभिंन परीक्षणों में से प्रत्येक के लिए साजिश रची जाएगी "अलग" नमूना समूह निर्दिष्ट संदर्भ के लिए संबंधित परीक्षणों पर किसी भिंन छवि में/
        2. TrialView छवियों को बचाने के लिए, डेटा मेनू में "प्रिंट TrialViews" पर जाएं; एक JPEG छवि श्रृंखला में प्रत्येक भूखंड के लिए उत्पादन किया जाएगा ।
          नोट: चित्र 3 डी में उदाहरण के परिणाम दो परीक्षणों के साथ एक मामले के लिए है ।
    4. माध्य आयु सारांश तालिका प्रतिकृति सेट डेटा के लिए । नेत्रहीन डेटा के उचित फिट सुनिश्चित करने के लिए घटता का निरीक्षण किया, तो प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए औसत जीवन मूल्यों (logit वक्र पर ५०% अस्तित्व पर समय) की एक तालिका को बचाने के लिए डेटा मेनू में "सारांश तालिका" विकल्प का चयन करें.
  4. प्रतिकृति सेट विधि के माध्यम से जनरेट किया गया डेटा का सांख्यिकीय मूल्यांकन
    1. एक प्रतिकृति सेट प्रयोग से दो समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, संशोधित करें और एक आर स्क्रिप्ट चलाने के लिए, जारी ज़िप फ़ाइल में प्रदान की (देखें "WormLife सांख्यिकीय विश्लेषण टेम्पलेट स्क्रिप्ट. आर ") ।
      नोट: R में प्रवीणता स्क्रिप्ट चलाने के लिए आवश्यक नहीं है । अतिरिक्त दस्तावेज़ीकरण फ़ाइल में टिप्पणियों में है । स्क्रिप्ट उदाहरण प्रतिकृति सेट डेटा के विश्लेषण के लिए तैयार है । उपयोगकर्ता-जनरेटेड डेटा उपयुक्त स्वरूप में (देखें पूरक फ़ाइल 4) भी विश्लेषण किया जा सकता है ।
      1. r (r GUI या RStudio) में स्क्रिप्ट फ़ाइल खोलें ।
        नोट: यह स्क्रिप्ट चला रहे बिना प्रदर्शित करेगा ।
      2. आपके कंप्यूटर पर स्थान से मेल करने के लिए आवश्यक फ़ाइलों के स्थान को संशोधित करें ।
        नोट: ये फ़ाइल पथ होना चाहिए "पूरी तरह क्वालीफ़ाइड" (यानी पूरा फ़ाइल स्थान, फ़ोल्डर सहित शामिल होना चाहिए) ।
        1. पथ संशोधित करें (फ़ाइल/फ़ोल्डर स्थान) के लिए "wlDir" (निर्देशिका का स्थान), "dataFile" (प्रतिकृति सेट डेटा फ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए), "compFile" (तुलना का विनिर्देश चलाने के लिए, यदि लागू हो), और "outputPath" (स्थान जहां परिणाम फ़ाइलें लिखी जाएंगी करने के लिए) ।
      3. यदि फ़ाइल में स्तंभ नाम विश्लेषण किया जा करने के लिए उदाहरण फ़ाइल से भिन्न हैं, तो स्तंभ नाम "डेटा फ़ाइल में स्तंभ निर्दिष्ट करें" अनुभाग में सेट करें । प्रत्येक पैरामीटर के लिए कोई स्तंभ निर्दिष्ट करें । यदि एक अध्ययन में एकाधिक उपभेदों है, लेकिन कोई RNAi (या अंय उपचार) रिक्त प्रविष्टियों के साथ डेटा फ़ाइल में एक स्तंभ या सभी पंक्तियों के लिए एक ही शामिल है (जैसे "no_treatment", आदि.) ।
      4. "compFile" पैरामीटर सेट करें । यदि "compFile" पैरामीटर एनए पर सेट है, तो सभी संभव pairwise समूहों की तुलना चलाया जाएगा ।
        नोट: एक समूह तनाव/जीनोटाइप और उपचार, जो श्रेणीबद्ध और "strain_treatment" के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं के संयोजन के द्वारा परिभाषित किया गया है । कई समूहों के साथ बड़े अध्ययनों के लिए, तुलना निर्दिष्ट करने वाली एक CSV फ़ाइल प्रदान की जा सकती है । उदाहरण फ़ाइल "comps_rsm_example. csv" देखें ।
      5. ("k. resamp", डिफ़ॉल्ट १,००० है) मोंटे कार्लो रिनमूनािंग के लिए पुनरावृत्तियों की संख्या निर्धारित करें ।
        नोट: जब भी कुछ पुनरावृत्तियां की जाती है तब P-मान 0 लौटाया जा सकता है; ऐसे मामलों में, "p < 0.01" (यदि k. resamp = १००), या "p < 0.001" (यदि k. resamp = १,०००), आदि की रिपोर्ट करना उचित है ।
      6. भागो स्क्रिप्ट: "स्रोत" RStudio में बटन (संपादन विंडो के ऊपर सही) या "संपादित करें" मेनू में आर जीयूआई में "स्रोत दस्तावेज़" । (निष्पादन में कुछ समय लग सकता है.)
      7. जब आर "व्यस्त" संकेतक अब प्रदर्शित नहीं है, उत्पादन निर्देशिका खुला-वहां एक तुलना (औसत अस्तित्व, पी के परिणाम के साथ एक मेज होगा, मान,% औसत उंर परिवर्तन) ।

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Representative Results

किसी भी नई पद्धति के विकास में यह जरूरी है कि नई विधि पिछले दृष्टिकोण से परिणाम स्वीकार recapitulates और एक क्षेत्र के भीतर मानक को पूरा करता है । हम पहले empirically कि प्रतिकृति सेट और एलिगेंस उंर के समान परिणाम20परख के लिए पारंपरिक तरीकों का उत्पादन दिखाया है । जंगली-प्रकार c. एलिगेंस (N2) 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा आमतौर पर 20 और 25 दिन, जो हम दोनों के पारंपरिक (चित्रा 4a, काली रेखा) और प्रतिकृति सेट दृष्टिकोण (चित्रा 4B, काला) के साथ मनाया के बीच रहते हैं । इस प्रकार, दोनों तरीकों यथोचित लगभग जंगली प्रकार की उंर । यह भी आवश्यक है कि एक नई विधि के लिए सही परीक्षण की स्थिति और सांख्यिकीय शक्ति महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाने के बीच परिवर्तन को बढ़ाता है संकल्प किया है । हमारे पिछले अध्ययन में, हमें पता चला कि प्रतिलेखन कारकों के Myc परिवार सी. एलिगेंस दीर्घायु के निर्धारक हैं. mml-1 और mxl-2 सांकेतिक शब्दों में बदलना C. एलिगेंस homologs of स्तनधारी Mondo A/कार्बोहाइड्रेट प्रतिसाद तत्व बाइंडिंग प्रोटीन (ChREBP) और Mlx, क्रमशः । दोनों सी. एलिगेंस और स्तनधारी, इन Myc-परिवार के सदस्यों को प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए heterodimerize । हमने पाया है कि या तो mml-1 या mxl-2 के नुकसान काफी सामांय उंर कम हो जाती है, के रूप में या तो एक पारंपरिक जीवन परख या प्रतिकृति सेट द्वारा मापा (4a-बी, पीले और लाल रंग की चित्रा) । MML के विपरीत-1:: MXL-2 परिसर में, हम या तो mdl-1 के नुकसान पाया (मुताबिक़ स्तनधारी पागल) या MXL-1 (मैक्स) काफी बढ़ ग. एलिगेंस उम्र के रूप में या तो पद्धति द्वारा मापा (चित्रा 4 बैंगनी और नीला, क्रमशः, दोनों पैनलों में).

दीर्घायु को मापने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण के लिए एक गंभीर सीमा का प्रवाह है । दोनों तरीकों आंदोलन पर भरोसा करने के लिए फोन है कि क्या एक जानवर जीवित या मर चुका है, जो तेजी से आकलन मुश्किल हो जाता है । युवा जानवरों उत्तेजनाओं के अभाव में एक थाली भर में कदम है और इस तरह स्कोर करने के लिए आसान हो जाएगा । बूढे सी. एलिगेंस तेजी से आसीन हो जाते हैं लेकिन एक प्लेट पर उलटा आंदोलन करके सिर को हल्का छूने का जवाब देंगे । हालांकि, के रूप में पशुओं के लिए पिछड़े कदम की क्षमता कम हो जाता है और तेजी से बेबुनियाद हो जाता है । अंततः जानवरों झोले के साथ, एक phenotype जोरदार sarcopenia जैसी हो, और जब पारंपरिक विधि व्यवहार्यता के माध्यम स्कोरिंग केवल पशु के चरम पूर्वकाल टिप पर सूक्ष्म चिकोटी देख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । इसके विपरीत, जब प्रतिकृति सेट विधि के माध्यम से व्यवहार्यता स्कोरिंग, तरल अच्छी तरह से जोड़ा है, जो एक उत्तेजना है कि एक पिटाई प्रतिक्रिया है कि healthspan8के एक readout के रूप में quantified जा सकता है उत्पंन के रूप में कार्य करता है । तरल में आंदोलन भी पुराने जानवरों के लिए निरीक्षण करने के लिए आसान है: कालक्रम के अनुसार उम्र-मिलान पुराना जानवरों सूखी प्लेटों पर सूक्ष्म सिर आंदोलनों का उत्पादन लेकिन एक अधिक स्पष्ट (हालांकि धीमी गति से) शरीर तरल में मोड़. अंत में, प्रतिकृति सेट स्कोरिंग करते हैं, पूरी तरह से देखने के क्षेत्र के भीतर है (~ व्यास में १.१ सेमी) और सभी जानवरों के निलंबन में हैं एक साथ सभी जानवरों की अनुमति अवलोकन. इसके विपरीत, जब पारंपरिक विधि के माध्यम से एक 6 सेमी प्लेट स्कोरिंग, एक पूरी थाली में स्कैन-बैक्टीरियल लॉन के माध्यम से और जानवरों के लिए किनारों के साथ खोज करना चाहिए । इन मतभेदों का शुद्ध परिणाम यह है कि जब प्रतिकृति सेट विधि का उपयोग करते हुए प्रवाह कम से अधिक परिमाण के एक आदेश पारंपरिक दृष्टिकोण से अधिक है, जो बनाता है यह एक साथ अधिक से अधिक १०० में उंर में परिवर्तन यों तो हो सकता है एक अंवेषक के साथ एक ही प्रयोग में शर्तें । उदाहरण के लिए, एक जीनोम-व्यापक खिला आधारित RNAi स्क्रीन हम पहले से पहचान की १५९ जीन है कि वृद्धि हुई उंर के लिए आवश्यक थे द्वारा प्रदत्त डीएएफ-2/ कि विश्लेषण में, हम quantified में उंर में परिवर्तन-प्रकार, एक लंबे समय से डीएएफ-2 (e1370) उत्परिवर्ती रहते थे, और लघु डीएएफ-2 (e1370);d वायुसेना-16 (mgDf47) डबल उत्परिवर्ती पशु (आंकड़ा 5), जो हमें आनुवंशिक समझने के लिए अनुमति दी इंसुलिन की तरह संकेत और १०० से अधिक progeric जीन निष्क्रियता के बीच संबंध । इसके अलावा, हमने आकलन किया कि कैसे इन progeric जीन निष्क्रियता healthspan बदल (समय "activespan" कहा जाता है) सी. एलिगेंस में गिरावट को देख कर समय के साथ प्रतिकृति के पार (चित्रा 5B) ।

Figure 1
चित्रा 1: बुढ़ापे अनुसंधान में जीन डिस्कवरी के युग के लिए RNAi नेतृत्व आधारित खिला के आगमन, अभी तक ज्यादातर gerogenes खराब अध्ययन किया । (क) कई gerogenes शुरू में बड़े पैमाने पर कार्यात्मक जीनोमिक स्क्रीन से पता चला रहे थे । से अधिक ९०० ग. एलिगेंस gerogenes तारीख की खोज की, कई खिला का उपयोग कर की पहचान की गई आधारित RNAi, जीन डिस्कवरी में कार्यात्मक जीनोमिक दृष्टिकोण के मूल्य पर प्रकाश डाला । ग्राफ gerogenes की संख्या RNAi का उपयोग पांडुलिपि प्रति की खोज की, phenotype एनोटेशन के आधार पर पता चलता है ( सामग्री की तालिकादेखें) phenotype आंटलजी शब्दों के लिए विस्तारित जीवन काल, छोटा जीवन काल, और जीवन काल संस्करण । gerogenes की खोज की है कि अध्ययन की पूरी सूची के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें । (ख) अधिकांश gerogenes खराब अध्ययन करते रहते हैं. डीएएफ की तरह अच्छी तरह से अध्ययन gerogenes के विपरीत -16/FOXO (तीर), जो ८०० से अधिक संदर्भ है, gerogenes के बहुमत से कम 10 संदर्भ है (सामांय संदर्भ-उंर पर ध्यान केंद्रित नहीं जरूरी) । विश्वसनीय उच्च प्रवाह तरीकों को आनुवंशिक अंतर में गहरी अंतर्दृष्टि gerogenes के बीच संबंधों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । ग्राफ PubMed में प्रकाशनों और C. एलिगेंस gerogenes RNAi phenotypes से खोजा के बीच मैपिंग पर आधारित है । gerogenes और प्रत्येक के साथ जुड़े अध्ययनों की संख्या की पूरी सूची के लिए पूरक फ़ाइल 2 देखें. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: पारंपरिक और प्रतिकृति सेट C. एलिगेंस आयु (A) स्कोरिंग के लिए विधि । C. एलिगेंस आयु स्कोरिंग के लिए पारंपरिक विधि । हालत प्रति isogenic पशुओं के कई छोटे सिंक्रनाइज़ आबादी समय के साथ पालन कर रहे हैं । जानवरों की एक ही आबादी अध्ययन पाठ्यक्रम भर में पालन किया जाता है । व्यवहार्यता आंदोलन द्वारा मूल्यांकन किया है, जो कोमल उकसाने द्वारा उत्तेजित हो सकता है । जानवरों है कि जाने के लिए असफल मरे के रूप में बनाए गए है और हटा (दिखाया आकांक्षा) जब तक कोई व्यवहार्य जानवर रहते हैं । (B). प्रतिकृति स्कोरिंग C. एलिगेंस आयु के लिए विधि सेट करें । उंर की एक बड़ी आबादी-सिंक्रनाइज़ isogenic पशुओं समान की एक संख्या में वितरित कर रहे है दोहराने प्लेटों । हर बार बिंदु पर, एक एकल दोहराने रन बनाए हैं: एक हल्के बफर समाधान (M9) जोड़ा है, जो आंदोलन को उत्तेजित करता है । जानवरों कि बाढ़ कुओं के बाद अनायास स्थानांतरित करने के लिए असफल भी स्पर्श उत्तेजना के माध्यम से मूल्यांकन कर रहे हैं । प्रयोग के लिए स्कोरिंग अवधि प्रारंभ करने से पहले निर्धारित की जाती है. प्रत्येक जानवर केवल एक बार और बड़ी आबादी के लिए दीर्घायु बनाए है कई स्वतंत्र टिप्पणियों से प्राप्त होता है । (c). प्रतिकृति सेट approach मात्रात्मक माप करने के लिए एक उच्च प्रवाह पद्धति है c. एलिगेंस आयुष्यात. १०० या अधिक स्वतंत्र RNAi क्लोन एक साथ ट्रैक किया जा सकता है । HT115 ई. एक दिया RNAi क्लोन के लिए dsRNA व्यक्त कोलाई दिखाया गया है । व्यावहारिक रूप से, ९६-खैर प्लेट से हर 24 नमूने एक 24 अच्छी तरह से थाली में विभाजित कर रहे हैं । परिणामस्वरूप प्रत्येक 24 अच्छी तरह से थाली एक नकारात्मक (यानी खाली वेक्टर, लाल अच्छी तरह से) और सकारात्मक नियंत्रण (हरी अच्छी तरह से) बेतरतीब ढंग से RNAi क्लोन (पीले कुओं) का एक संग्रह के भीतर वितरित किया है । सामांयतया, किसी संग्रह में पहले well (A1) रिक्त वेक्टर होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
आरेख 3: ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) । (A). मुख्य प्लॉट विंडो इंटरफ़ेस डिफ़ॉल्ट स्वागत स्क्रीन दिखा रहा है । यह वही है जो सॉफ्टवेयर खोलने पर प्रदर्शित होता है । प्लेटफार्मों के बीच उपस्थिति में अंतर एक मंच स्वतंत्र विंडोिंग toolkit के उपयोग की वजह से कम होना चाहिए । (B). मेनू विकल्पों का ओवरव्यू, मुख्य प्लॉट विंडो से उपलब्ध ड्रॉप-डाउन मेनू के लिए । (C). दोनों प्रतिकृति सेट शैली (बाएँ) और पारंपरिक कापलान-Meier शैली (दाएँ) डेटा के लिए उदाहरण प्लॉट आउटपुट । प्रदर्शित डेटा स्वतंत्र प्रयोगों में एकत्र किया गया था । निर्यात किए गए प्लॉट में ऐसे लेबल्स जोड़ने में अधिकतम लचीलेपन के लिए पूर्व-प्लॉट किए गए अक्ष लेबल्स शामिल नहीं होते हैं । इसे सुविधाजनक बनाने के लिए, अक्ष हमेशा Y-अक्ष के लिए 20% की वृद्धि में विभाजित होते हैं, और X-अक्ष के लिए 5 की वृद्धि होती है । इस उदाहरण में, एक बहुत ही सरल और सामान्य छवि संपादन टूल का उपयोग करके, सहेजे गए प्लॉट में अक्ष और रेखा लेबल (तनाव/ (D). "TrialView" कार्यक्षमता से आउटपुट का एक उदाहरण, प्रतिकृति सेट शैली डेटासेट के लिए स्वतंत्र परीक्षणों के परिणामों के बीच दृश्य तुलना के लिए अनुमति देता है । यह प्लॉट दो भिंन परीक्षणों और डीएएफ-2 ev (RNAi) (नीला, बंद वृत्त), N2 ev (RNAi) (काले, बंद वृत्त), और डीएएफ- 2 के साथ डीएएफ- 16 (RNAi) (लाल, खुले हीरे) के लिए परिणाम प्रदर्शित करता है । TrialView की अनुमति देता है जल्दी से परीक्षण-विशिष्ट डेटा समस्याओं के लिए जो पूलिंग dataset के फ़िट की गुणवत्ता को प्रभावित हो सकता है की जाँच करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: पारंपरिक और प्रतिकृति सेट विधियाँ समान परिणाम उत्पन्न करते हैं । MDL-1 (Mad) के या तो घटक की हानि:: MXL-1 (Max) heterodimer बढ़ता है । इसके विपरीत, MML के या तो घटक के नुकसान-1 (Mondo/ChREBP):: MXL-2 (Mlx) आयु कम कर देता है यह आंकड़ा संदर्भ20 से एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण (सीसी द्वारा) लाइसेंस के माध्यम से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है (सामग्री देखें) । (क). कापलान-Meier पारंपरिक विधि के साथ परिणाम है । (B). Logit वक्र प्रतिकृति सेट विधि का उपयोग कर फ़िट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिकृति सेट विधि एक साथ १०० से अधिक RNAi क्लोनों के लिए (A) और healthspan में परिवर्तन के आधार परआनुवंशिक बातचीत को समझने में कर सकते हैं । यह आंकड़ा8 से क्रिएटिव कॉमंस रोपण-गैर वाणिज्यिक ४.० अंतरराष्ट्रीय लाइसेंस (CC-BY-नेकां) (सामग्री देखें) के तहत अनुमति के साथ reprinted है । (क) आनुवंशिक आयु विश्लेषण progeric जीन निष्क्रियता के संदर्भ में कम इंसुलिन की तरह संकेत (आईएलएस) (डीएएफ-2, x-अक्ष) और डीएएफ के अभाव में -16/FoxO (Y-अक्ष), transcriptional 21 के एक केंद्रीय आईएलएस प्रभाव . डीएएफ-16 के रूप में इसी तरह के कार्यों के साथ जीन निष्क्रियता आगे डीएएफ-16 (काले डॉट्स) के अभाव में उंर छोटा नहीं है । डीएएफ से पूरी तरह से स्वतंत्र कार्यों के साथ जीन निष्क्रियता -16 दोनों आनुवंशिक पृष्ठभूमि इसी तरह (ग्रे) छोटा । जीन निष्क्रियता जहां डीएएफ में उंर पर नकारात्मक प्रभाव -2 > डीएएफ-2; डीएएफ-16, समानांतर में समारोह (सफेद) पता चलता है । (ख) समय के साथ दर पिटाई में परिवर्तन कई आनुवंशिक perturbations (x-अक्ष) के लिए औसत healthspan प्राप्त कर सकते हैं, जबकि उंर में परिवर्तन का आकलन (y-अक्ष) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र s: WormLife में कार्यप्रवाह । कुछ निर्देशित वर्कफ़्लोज़ के चरणों का चित्रण (कभी-कभार "विज़ार्ड") । प्रत्येक इन मामलों में, वर्कफ़्लो में अंतिम चरण के बाद, फ़ोकस मुख्य प्लॉट विंडो में वापस लौटाया जाता है । (A) डेटा आयात वर्कफ़्लो प्रतिकृति सेट शैली datasets के लिए (B) डेटा आयात वर्कफ़्लो पारंपरिक कापलान Meier शैली datasets के लिए । (C) प्रतिकृति सेट शैली datasets के लिए एक प्लॉट करने के लिए पंक्तियाँ जोड़ने के लिए वर्कफ़्लो । (D) पारंपरिक कापलान Meier शैली datasets के लिए किसी प्लॉट में पंक्तियाँ जोड़ने के लिए वर्कफ़्लो. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 1: अध्ययन है कि gerogenes की पहचान की है । खिला के आगमन आधारित RNAi phenotypes के लिए जीन डिस्कवरी के युग का नेतृत्व किया है कि आगे आनुवंशिकी द्वारा उंर बढ़ने सहित, नहीं थे । सूचीबद्ध, gerogenes की संख्या के क्रम में पता चला, स्वतंत्र अध्ययन कर रहे है कि पहचान की जीन जिनकी गतिविधि बदल उंर । ध्यान दें कि अध्ययन की पहचान की सबसे gerogenes उपयोग प्रतिकृति सेट विधि8। कैसे जीन निष्क्रियता बदल उंर की प्रकृति भी संकेत दिया है: दीर्घायु और progeric जीन उन है कि वृद्धि हुई है या कम उंर जब निष्क्रिय, क्रमशः रहे हैं । "जीवन काल संस्करण" मामलों को संदर्भित करता है जहां परिवर्तन की दिशात्मकता (यानी वृद्धि हुई है या कम उम्र) निर्दिष्ट नहीं किया गया था या उपचारात्मक नहीं किया गया है । WormBase WS262 (जनवरी २०१८) से डेटा (सामग्री देखें), संदर्भ10से RNAi-उपचार आयु परिणाम के अलावा के साथ, जो अभी तक WormBase RNAi phenotypes के उपचारात्मक संग्रह में शामिल नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 2: प्रत्येक gerogene के साथ संबद्ध अध्ययनों की संख्या । ज्यादातर gerogenes खराब अध्ययन कर रहे हैं । जबकि कुछ जीन, जैसे डीएएफ-16/FoxO, ज्यादा शोध ध्यान का विषय रहा है, ४०० से अधिक gerogenes से कम 10 संबद्ध प्रकाशनों है । WormBase WS262 से डेटा (जनवरी २०१८), RNAi के अलावा के साथ-उपचार आयु10 से परिणाम जो अभी तक WormBase RNAi phenotypes के उपचारात्मक संग्रह में शामिल नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 3: के लिए आम एजेंट की तैयारी ग. एलिगेंस उपाययोजना. (क). मानक NGM और RNAi प्लेटों के लिए नुस्खा । (ख). M9 बफर और हाइपोक्लोराइट समाधान के लिए नुस्खा । (ग). LB + Amp/Tet प्लेट्स की तैयारी । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 4: प्रतिकृति उदाहरण डेटा सेट करें । एक उदाहरण डेटासेट से एक प्रतिकृति सेट आयु प्रयोग । यह dataset पहले से ही आयात/विश्लेषण के लिए उपयुक्त होने के लिए स्वरूपित है । शर्त प्रति दो परीक्षण शामिल है (तनाव का संयोजन/जीनोटाइप और RNAi) । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 5: पारंपरिक अनुदैर्ध्य उदाहरण डेटा । एक पारंपरिक अनुदैर्ध्य उंर प्रयोग से एक उदाहरण डेटासेट, सही सेंसर के साथ, तैयार आयात/कापलान-Meier अस्तित्व भूखंड कार्यशीलता का उपयोग विश्लेषण के लिए स्वरूपित । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

दोनों पारंपरिक और प्रतिकृति सेट विधियों कालानुक्रमिक आयु वर्ग के पशुओं के तुल्यकालन की आवश्यकता है । हम एक विधि है कि सिंक्रनाइज़ gravid वयस्कों, जहां केवल gravid वयस्क के साथ अंडे निषेचित उपचार के हाइपोक्लोराइट उपचार का उपयोग कर पशुओं को शामिल करता है । इन भ्रूण तरल निलंबन में हैच और पहले लार्वा चरण (L1) में विकास की गिरफ्तारी । भोजन पर L1 पशुओं बोने के बाद (जैसे ई. कोलाई व्यक्त dsRNA ब्याज की एक जीन के लिए), पशुओं के विकास को फिर से शुरू । gravid वयस्कों के हाइपोक्लोराइट उपचार द्वारा L1 पशुओं तुल्यकालन बचे हुए बीज L1 जानवरों जम और तरल नाइट्रोजन या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में अनिश्चित काल तक जमा किया जा सकता है कि लाभ है । इस तरह, प्रयोगात्मक सेटअप के समय में प्रत्येक तनाव का एक नमूना संरक्षित है, भविष्य के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान संसाधन बनाने और reproducibility में सुधार. हालांकि, जबकि gravid वयस्क पशुओं के हाइपोक्लोराइट उपचार एक आम तरीका22अनुसंधान उंर बढ़ने के लिए सिंक्रनाइज़ जानवरों को प्राप्त है, L1 गिरफ्तारी एक भुखमरी प्रतिक्रिया है । इस प्रकार, कुछ प्रयोगशालाओं या तो करने के लिए प्लेटें, या छोड़ हाइपोक्लोराइट उपचार पूरी तरह से हो और कुछ gravid वयस्कों कई घंटे (यानी एक अंडा रखना) के लिए अंडे देना करने की अनुमति सेने की अनुमति के लिए पसंद करते हैं । उत्तरार्द्ध मामले में माता-पिता को हटा दिया जाता है और संतान की उम्र का पालन किया जाता है । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, उम्र में कोई स्पष्ट मतभेद जानवरों है कि M9 में सिंक्रनाइज़ किए गए थे के बीच रिपोर्ट किया गया है, प्लेटों पर रची, या एक अंडे से संतान रखना. हालांकि, यह देखते हुए कि पोषक तत्वों की उपलब्धता में परिवर्तन निकट उंर में परिवर्तन से जुड़े हुए हैं, वहां तरजीह है कि विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि इन तुल्यकालन दृष्टिकोण के बीच विभिंन परिणामों का उत्पादन कर सकता है । इस सैद्धांतिक चिंता को हल करने के लिए अधिक सावधानी से विश्लेषण की आवश्यकता है ।

प्रारंभिक जनसंख्या को सिंक्रनाइज़ करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि के बावजूद, संतति उत्पादन को रोकने के लिए या भविष्य की संततियों से सिंक्रनाइज़ होने वाली जनसंख्या को अलग करने के लिए कदम उठाए जाने चाहिए । हमारे प्रोटोकॉल में, हम कैसे FUdR का उपयोग करने के लिए संतति उत्पादन को रोकने के लिए रूपरेखा, के रूप में जानवरों को अलग प्रतिकृति सेट विधि के लिए एक व्यवहार्य विकल्प नहीं है । यह भी एक feminized आनुवंशिक पृष्ठभूमि के उपयोग के माध्यम से संतति उत्पादन को रोकने के लिए संभव है (जैसे fer-15 (b26); स्त्री-1 (hc17), जो एक तापमान निर्भर बाँझ तनाव23) है । हालांकि, न तो कमियों के बिना है: आनुवंशिक पृष्ठभूमि के उपयोग के बाद विश्लेषण जटिल कर सकते हैं, और कुछ आनुवंशिक पृष्ठभूमि में FUdR दीर्घायु24,25,26बदल सकते हैं ।

रासायनिक या आनुवांशिक साधनों के माध्यम से संतति उत्पादन को रोकने के विकल्प के रूप में वयस्क पशुओं को अपनी संततियों से अलग करने के लिए आवधिक रूप से ताजी RNAi प्लेटें ले जाई जा सकती हैं. यह प्रवाह की कीमत पर पृष्ठभूमि विचार सरल करता है । समय पर ताजा भोजन के लिए पशुओं को ले जाने के संभावित भुखमरी को रोकने और dsRNA के लिए प्रदर्शन के नवीकरण के अतिरिक्त लाभ है । हालांकि, कुछ आनुवंशिक बातचीत है कि उंर को प्रभावित ही की खोज की थी जब संतति उत्पादन बाधित किया गया था: एक उंर के लिए TGFβ मार्ग के प्रारंभिक विश्लेषण phenotype ग़लती से निष्कर्ष निकाला कि TGFβ कम संकेत प्रभावित सी एलिगेंस dauer गठन लेकिन नहीं एजिंग27,28। हालांकि, एक अध्ययन है कि इस्तेमाल किया FUdR से पता चला है कि29संकेत इंसुलिन के माध्यम से बढ़ी हुई दीर्घायु संकेत TGFβ कम । क्यों पहले अध्ययन किया TGFβ उत्परिवर्ती पशुओं में वृद्धि की उंर को देखने में विफल? TGFβ मार्ग उत्परिवर्तनों एक मामूली अंडे बिछाने दोष (egl) का उत्पादन और प्रजनन दीर्घायु, जो जीवन में बाद में संतान की आंतरिक सेने का कारण बनता है कि माता पिता को मारता है । यह संभावना है कि लंबे समय तक रहते थे TGFβ उत्परिवर्ती जानवरों egl phenotype की वजह से एक सामांय उंर है दिखाई जब जंगली प्रकार के पशुओं को आम तौर पर मर जाते हैं । यह डॉ से जुड़े अन्य आनुवंशिक रास्ते के लिए प्रासंगिक हो सकता है, भूखे जंगली प्रकार के जानवरों के रूप में भी एक egl phenotype प्रकट, शायद कम भोजन की शर्तों के तहत संतान के लिए एक अनुकूली अस्तित्व लाभ के रूप में. यह अनुकूली प्रतिक्रियाओं जानवरों में अंतर्निहित जटिलता पर प्रकाश डाला गया तनाव की स्थिति के तहत गुजरना, और सावधान विश्लेषण और विचार के लिए की जरूरत है जब उंर के प्रयोगों डिजाइनिंग ।

डिजाइनिंग और या तो विधि यह पूर्वाग्रह से बचने के लिए महत्वपूर्ण है द्वारा उंर के प्रयोगों का आयोजन । प्रयोगों को एक डबल-ब्लाइंड तरीके से किया जाना चाहिए: पहले पिछले समय बिंदुओं पर नमूने कैसे बनाए गए थे और परीक्षण शर्त की पहचान प्रयोगकर्ता को अज्ञात होना चाहिए । इसके अलावा, यह हमेशा दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है; प्रतिकृति सेट विधि के मामले में, ये बेतरतीब ढंग से एक 24 अच्छी तरह से थाली में डाला जाता है । ई. कोलाई एक प्लाज्मिड कि C. एलिगेंस जीनोम के लिए संगत अनुक्रम के साथ एक संमिलित नहीं है एक्सप्रेस खाली वेक्टर नकारात्मक नियंत्रण है (यानी "L4440"-सामग्री देखें) । सकारात्मक नियंत्रण एक प्रयोग की विशिष्ट प्रकृति पर निर्भर हैं । उदाहरण के लिए, डीएएफ-2 encodes C. एलिगेंस इंसुलिन/IGF-1 रिसेप्टर, और डीएएफ-2 निष्क्रियता के माध्यम RNAi मजबूती से उम्र बढ़ जाती है के माध्यम से दो-जंगली प्रकार जानवरों27में कम से गुना. इस प्रकार डीएएफ-2 (RNAi) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा जब जीन निष्क्रियता की तलाश में है कि उंर में वृद्धि हो सकती है । इसके विपरीत, डीएएफ-16 encodes FOXO प्रतिलेखन कारक30orthologue । डीएएफ-16 कई दीर्घायु मानदंड और जंगली प्रकार के जानवरों (N2) डीएएफ-16 (RNAi) के साथ इलाज के एक आवश्यक घटक कम रहते है और31कालपूर्वजरा के लक्षण दिखा रहे हैं ।

पारंपरिक अनुदैर्ध्य आयु दृष्टिकोण के प्राथमिक लाभ यह है कि यह बहुत अच्छी तरह से स्थापित है, और प्रयोगों को स्थापित करने के लिए आसान कर रहे हैं । अपेक्षाकृत कुछ जानवरों के प्रत्येक परीक्षण शर्त के लिए बस कुछ प्लेटों पर की जरूरत है । इस प्रकार, उपभेदों कि खराब हो जाना या आसानी से परीक्षण किया जा सकता है प्रचार के लिए बैलेंसर की आवश्यकता है । पारंपरिक दृष्टिकोण अत्यधिक अनुकूलनीय है और संतति उत्पादन से निपटने के लिए उपलब्ध दृष्टिकोणों में से किसी एक के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, FUdR के साथ उपचार सहित, एक feminized आनुवंशिक पृष्ठभूमि में पार, या समय पर नई प्लेटों के लिए वयस्क जानवरों को ले जाने अंडा बिछाने की अवधि के दौरान । जबकि पशुओं चलती बहुत प्रवाह कम कर देता है, एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ काम कर कभी आदर्श नहीं है, और हालांकि FUdR जंगली प्रकार की उंर३२,३३,३४बदल नहीं करता है, यह उंर और आयु से संबंधित प्रभावित कर सकते है phenotypes कुछ आनुवंशिक पृष्ठभूमि में३५,25,26। ध्यान दें कि पुरुषों की उपस्थिति, यहां तक कि FUdR के उपयोग के साथ, काफी द्विलिंग उंर13छोटा होगा, इस प्रकार एक थाली है कि hermaphrodites तक पहुंच के बाद पुरुषों निहित L4 व्यर्थ है । इसी तरह, कापलान-Meier अनुमानक और जुड़े curves के माध्यम से विश्लेषण, और लॉग रैंक परीक्षण, अच्छी तरह से मृत्यु के आंकड़ों के लिए स्थापित है । हालांकि, पारंपरिक जीवन के विश्लेषण के लिए कई नुकसान कर रहे हैं । प्लेटों की दोहराया हैंडलिंग (यानी हवा के लिए प्लेटों को उजागर) हवाई कवक संदूषण की शुरूआत की सुविधा । इसके अतिरिक्त, दोहराया poking नुकसान या जानवरों को मार सकते हैं, विशेष रूप से उंर में जनसंख्या अग्रिम के रूप में और नाजुक हो जाते हैं । पुराने पशुओं बड़े पैमाने पर पंगु बना हुआ है और ई. कोलाई में mired, जबकि ई कोलाई एक अवसरवादी रोगज़नक़ हो जाता है (लुमेन बस्तियां और ग्रसनी पैकिंग)३६। बहुत पुराने रहने वाले जानवरों को केवल सूक्ष्म सिर आंदोलनों द्वारा पहचाना जा सकता है । इस प्रकार, यह मृत के रूप में एक पुराना जीवित जानवर वर्गीकृत करने के लिए आसान है । अंत में, पारंपरिक दृष्टिकोण प्रवाह द्वारा सीमित है ।

प्रतिकृति सेट विधि उच्च प्रवाह और मात्रात्मक है । हालांकि, इस विधि का नुकसान प्रारंभिक सेट अप में समय और संसाधनों का एक बड़ा निवेश है । एक मामूली बड़े प्रयोग के लिए 20 समय अंक पर १०० RNAi क्लोनों की जांच ३०,००० L1 जानवरों की आवश्यकता है (जहां लगभग 15 पशुओं RNAi क्लोन प्रति समय बिंदु के अनुसार जांच कर रहे हैं), जो सबसे उपभेदों के लिए आसान है, जबकि कुछ मामलों में समस्याग्रस्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक बड़े कण सॉर्टर के बिना ("कृमि सॉर्टर") उपभेदों है कि बैलेंसर या ट्रांसजेनिक एक खराब प्रेषित अतिरिक्त गुणसूत्र सरणी ले जा लाइनों के साथ बनाए रखा जाना चाहिए आसानी से इस पद्धति से जांच नहीं की जा सकती । एक दूसरा नुकसान यह है कि संतति उत्पादन को रोकना होगा, जिसके लिए FUdR या एक feminized आनुवांशिक पृष्ठभूमि के उपयोग की आवश्यकता है. अंत में, एक समय परख चलेंगे की लंबाई पता होना चाहिए, के रूप में एक एक प्रतिकृति प्रयोग की शुरुआत में हर बार बिंदु के लिए सेट तैयार करना होगा । हालांकि, इस विधि के लाभ कई हैं । सबसे महत्वपूर्ण, स्कोरिंग व्यवहार्यता बहुत तेजी से है और एक आसानी से १०० परीक्षण शर्तों पर एक साथ जानवरों का पालन कर सकते है (यानी RNAi क्लोन) । के बाद से एक प्रतिकृति सेट केवल एक बार फिर खारिज कर दिया है, वहां प्लेटों या पशुओं की poking, जो कवक संदूषण की संभावना को कम करने और एक कीड़ा लेने के साथ सामयिक किसी न किसी उकसाने के कारण मृत्यु दर को समाप्त की कोई दोहराया हैंडलिंग है । इसके अलावा, तरल के अतिरिक्त अच्छी तरह से बहुत स्कोरिंग की सुविधा । थाली और आसपास बैक्टीरिया से पुराने जानवरों को मुक्त सूक्ष्म सिर आंदोलनों और अधिक आसानी से रन बनाए जाने की अनुमति में मदद करता है । तरल के अलावा भी फिटनेस का एक उपाय (जैसे healthspan8,३७) के रूप में पिटाई की दरों को मापने का अवसर प्रदान करता है ।

उंर बढ़ने एक जटिल कई कारण तंत्र है जो सिस्टम जैविक दृष्टिकोण का उपयोग जानने की आवश्यकता को शामिल घटना है । इन दृष्टिकोण अक्सर डेटा-संचालित मॉडलिंग शामिल, जीनोमिक/transcriptomic डेटा की बड़ी मात्रा का उपयोग कर, और पूरक मजबूत और उच्च प्रवाह तरीकों की आवश्यकता के लिए उंर और healthspan उपाय । उच्च प्रवाह प्रतिकृति सेट विधि कई RNAi क्लोन longitudinally की तुलना की अनुमति देगा, जबकि बैच प्रभाव और तकनीकी त्रुटियों को कम करने, इस प्रकार गतिशील मॉडल है कि कारण रास्ते के बीच बातचीत का अनुमान कर सकते है के विकास को सुविधाजनक बनाने में एक मात्रात्मक तरीके से । इसके अतिरिक्त, प्रतिकृति सेट विधि के साथ कई जीनोम चौड़ा जीनोमिक्स दृष्टिकोण के एकीकरण संभव है क्योंकि उंर सिंक्रनाइज़ पशुओं की एक बड़ी आबादी छोटी आबादी की संख्या में विभाजित है ।

अंय तरीकों को पहले सी एलिगेंस उंर के प्रयोगों के प्रवाह में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है, अक्सर पारंपरिक अनुदैर्ध्य दृष्टिकोण अनुकूल (समय के साथ पशुओं के एक ही सेट के बादअर्थात् ) पर ध्यान केंद्रित स्वचालित अवलोकन और रिकॉर्डिंग आम flatbed स्कैनर३८,३९, या microfluidic प्लेटें४०के रूप में और अधिक विशेष उपकरणों का उपयोग कर । स्कैनर-आधारित दृष्टिकोण एक उत्तेजना के रूप में प्रकाश का उपयोग करें और एक समय में कई प्लेटों के लिए आंदोलन के आधार पर जीवित/मृत स्थिति निर्धारित करने के लिए क्रमिक रूप से कब्जा कर लिया छवियों की तुलना; जबकि ऐसे दृष्टिकोण मालिकाना वैज्ञानिक हार्डवेयर की आवश्यकता नहीं है, कार्यप्रवाह स्थापित करने में शामिल समय वांछित पैमाने पर निर्भर करता है पर्याप्त हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, कस्टम microfluidic उपकरणों में उंर के प्रयोगों में समय के साथ एकल पशुओं की गहराई phenotypic लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं, और उपचार के बिना संतान को रोकने के लिए, लेकिन microfluidic प्लेटों और अधिग्रहण के जरूरत निर्माण एसोसिएटेड microfluidic पंपों और इमेजिंग उपकरण । इसके विपरीत, प्रतिकृति सेट विधि, यहां विस्तृत सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में, बहुत सुधार उपकरण है कि पहले से ही सी एलिगेंसके साथ काम कर प्रयोगशालाओं में आम है का उपयोग कर का प्रवाह की अनुमति देता है ।

WormLife सॉफ्टवेयर भविष्य में सुधार किया जाएगा सांख्यिकीय तुलना करने के लिए आसान पहुंच प्रदान करते हैं, और अतिरिक्त प्लेटफार्मों के साथ संगतता । सॉफ्टवेयर के लिए सबसे अप करने की तारीख प्रलेखन GitHub पृष्ठ पर पाया जा सकता है, जिस पर सॉफ्टवेयर का परीक्षण किया गया है प्लेटफार्मों के लिए स्थापना के निर्देश भी शामिल है । एक वेब आधारित संस्करण भी किसी भी सॉफ्टवेयर स्थापित करने की आवश्यकता के बिना सुविधाजनक पहुँच सक्षम करने के लिए विकसित किया जाएगा.

सारांश में, प्रतिकृति सेट विधि और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का संयोजन यहां विस्तृत प्रवाह और जीवन की मजबूती में सुधार के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है और जीवित रहने की एक व्यापक रेंज आधारित परख (जैसे तनाव सहिष्णुता, विषविज्ञान अध्ययन, healthspan, आदि) । विशेष रूप से जब कार्यात्मक जीनोमिक्स के साथ संयुक्त, इस दृष्टिकोण आनुवंशिक बातचीत के असंख्य है कि उंर बढ़ने की प्रगति में योगदान को समझने के लिए metazoan मॉडल प्रणाली सी. एलिगेंस के कई लाभ leverages।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में वर्णित इस काम के लिए धन द्वारा प्रदान की गई: प्रोवोस्ट के रोचेस्टर कार्यालय के विश्वविद्यालय और चिकित्सा और दंत विज्ञान के डीन कार्यालय के माध्यम से अभिकलनी नवाचार (HSCCI) के लिए हेल्थ साइंसेज केंद्र; एलिसन मेडिकल फाउंडेशन एजिंग फैलोशिप में नए विद्वानों (एजी-एनएस-0681-10) funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

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आनुवंशिकी १३६ अंक उंर बढ़ने जीवन रक्षा विश्लेषण सी एलिगेंस उच्च प्रवाह मात्रात्मक phenotypes सॉफ्टवेयर के सांख्यिकीय विश्लेषण
प्रतिकृति सेट विधि: मात्रात्मक माप करने के लिए एक उच्च-प्रवाह Approach <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> आयुष्यात
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Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

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