Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819

Summary

Здесь мы описываем метод набора реплик, подход к количественной мерой C. elegans жизни/выживание и healthspan высокой пропускной способности и надежным образом, таким образом позволяя скрининг многих условий без ущерба для качества данных. Этот протокол подробности стратегии и представляет собой программное обеспечение инструмент для анализа данных набора реплик.

Abstract

Метод набора реплик является подход к количественно измерить продолжительность жизни или выживание нематоды Caenorhabditis elegans в духе высокой пропускной способности, таким образом позволяя один следователь на экран более лечения или условий за то же количество время без потери качества данных. Этот метод требует общего оборудования в большинстве лабораторий, работающих с C. elegans и таким образом просто принять. Этот подход центров на опробование независимых выборок населения в каждой точке наблюдения, а не один пример со временем как с традиционными методами продольной. Озвучивание влечет за собой добавление жидкости к скважинам несколькими хорошо плиты, которая стимулирует C. elegans для перемещения и облегчает количественного определения изменений в healthspan. Другие основные преимущества метода набора реплик включают снижение воздействия агар поверхностей переносимых по воздуху загрязнителей (например плесень или грибок), минимальная обработка животных, и надежность на спорадические неправильно озвучивание (например вызов животного как мертвый, когда он по-прежнему жив). Надлежащим образом анализировать и визуализировать данные из набора реплик стиль эксперимент, был также разработан инструмент заказного программного обеспечения. Текущие возможности программного обеспечения включают в себя предоставление кривых выживания как набора реплик и традиционных (Каплана-Мейера) эксперименты, а также статистический анализ для набора реплик. Протоколы, представленная здесь описать традиционные экспериментальный подход и метод набора реплик, а также обзор соответствующего анализа данных.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Одним из наиболее трансформативных технологических достижений на пути к пониманию генетическую основу старения является развитие на основе кормления RNAi в C. elegans1; до экспериментального использования РНК-интерференции многие фенотипов старения не были генетически шансов справиться с возникающими. Кормление-на основе RNAi достигается за счет производства двуцепочечной ДНК в E. coli , который соответствует эндогенных C. elegans мРНК: IPTG индуцирует двунаправленный транскрипции через вставки либо C. elegans cDNA или часть кадр в открытом чтения в плазмиду2. Когда C. elegans питаются нетронутыми двуцепочечной ДНК кишечной палочки, производится бактериями перевезены из просвета в кишечной клетки через белка трансмембранного SID-23и затем распространяются через остальную часть животного через SID-14. В каждой ячейке, экзогенных dsRNA обрабатывается Dicer комплекс в siRNA, которые взаимодействуют с зрелой мРНК через дополнительные низкопробный спаривать для создания нового малых интерферирующих РНК мРНК дуплекс. Этот дуплекс признан комплекса RISC и расщепляется, тем самым унижающего достоинство эндогенного мРНК5. Таким образом просто изменив Вставка плазмида, один можно инактивировать функции практически любого гена в геном C. elegans . Это открытие привело к созданию нескольких крупных RNAi кормления-на основе библиотек коллекции преобразован E. coli запасов, которые могут быть объединены для достижения охвата примерно 86% известных C. elegans генов6, 7.

С выдвижением на основе кормления интерференции всеобъемлющей экраны в C. elegans привели к открытию более чем 900 генов, которые изменяют жизни когда инактивированных (что подтверждается RNAi фенотип ассоциаций, куратор в WormBase), который мы называем в качестве gerogenes. Роль для большинства gerogenes в долголетия управления был обнаружен путем кормления-на основе RNAi в нескольких докладах семенных (см. Рисунок 1A и дополнительный файл 1 для подробной информации). В некоторых случаях эти gerogenes были определены на основе измерения жизнеспособности на один или несколько пунктов времени, который не обеспечивает количественной мерой изменения в жизни с лечением RNAi. В других случаях эти гены были количественно оценены изменения в жизни, а также дополнительные связанные возраст фенотипов. К примеру мы определили ранее 159 генов, которые необходимы для нормальной и повышенной продолжительность жизни животных с снижение инсулина/IGF-1 сигнализации и количественно изменения в healthspan. Из них 103 гена inactivations привести к progeric фенотип, поскольку потери привели к один или более признаков преждевременного старения8.

Хотя некоторые gerogenes были связаны с или более 100 исследований (например, daf-16, daf-2, сэр-2.1), свыше 400 gerogenes имеют 10 или меньше цитаты (рис. 1Bи дополнительный файл 2). Таким образом хотя всеобъемлющий кормления-на основе экранов RNAi обнаружили и бегло охарактеризовал сотни предполагаемого gerogenes, как эти функции генов долголетия управления и генетических взаимосвязей между этими продукты гена остаются плохо изучал. Полный продольного анализа для возраста связанные фенотипов является необходимым условием для выявления генетических взаимодействий между gerogenes (например epistatic взаимодействия, asynthetic взаимодействия, и т.д.). Получить более глубокое понимание генетических взаимосвязей между gerogenes требует высокой пропускной способности количественный метод, который также использует преимущества кормления-на основе RNAi.

Наиболее распространенными суррогатной старения определяется продолжительность жизни. Традиционный подход для измерения смертности C. elegans отслеживает гибели отдельных животных со временем в рамках небольшой выборки. Относительно небольшое количество животных идут с течением времени и периодически осторожно ткнул с провода платины или ресниц, с движением как показатель жизнеспособности (рис. 2A). Этот метод широко используется, поскольку она обеспечивает простой, прямые измерения средняя и максимальная продолжительность жизни. Однако этот традиционный метод требует много времени и относительно низкой пропускной способностью, которая ограничивает количество животных и условий, которые могут быть измерены одновременно контролируемым образом. Недавнее исследование моделирование показало, что многие исследования C. elegans жизни не пробирного достаточно большое количество животных, чтобы иметь возможность надежно обнаружить небольшие изменения между условия9. Кроме того этот традиционный метод предполагает неоднократно обработка же когорты животных с течением времени, который в свою очередь может ввести загрязнение и может повредить или убивать животных, неустойчивое, возрасте.

Мы разработали альтернативные «набора реплик» методологию для измерения C. elegans продолжительность жизни. С этой целью большое население возраста синхронизированы, isogenic животных делятся на ряд небольших групп населения (или реплик). Образцы достаточно реплики создаются для покрытия каждый момент запланированного эксперимента. В каждый момент времени наблюдения одна из реплик забил на количество живых мертвецов и цензуре животных, а затем животных в пределах этой репликации удаляются. Таким образом над ожидаемой продолжительность жизни населения в целом, ряд независимых субпопуляций периодически пробы (рис. 2B). В использовании наборов реплик есть нет повторяющихся подталкивая животных и не многократное воздействие потенциального загрязнения окружающей среды. Жизнеспособность, наблюдается в одноразовый точке является полностью независимым от каждого наблюдения, которая минимизирует обработки и увеличивает пропускную способность, по крайней мере на порядок. Это позволило нам чтобы quantitate изменения в жизни для сотни RNAi клоны одновременно8,10.

Здесь мы представляем подробные протоколы для проведения C. elegans жизни через набора реплик и традиционные методы для озвучивания C. elegans долголетия. Мы демонстрируем, что аналогичные результаты получены между методами. У нас есть разработки программного обеспечения для оказания помощи в графическом анализе срок службы данных, получаемых через любой подход, который мы свободно предоставляют под лицензией GPL V3 (см. таблицу материалов). «WormLife» написана в R-11и включает в себя графический интерфейс пользователя (GUI) для построения данных, которая была протестирована в Mac OS и Linux. Наконец мы сравнить и противопоставить недостатки каждого метода и выделить другие соображения при выборе между подходами для измерения количественных изменений в C. elegans продолжительность жизни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. традиционный метод для скоринга C. elegans долголетия

  1. Подготовка реагентов
    1. Определите гены инактивированной через систему РНК-интерференции на основе кормления. Приобрести преобразованные запасы HT115 E. coli2 содержащий RNAi клон интерес. Кроме того subclone кДНК гена интереса в multicloning сайт L4440 плазмиды.
      Примечание: HT115 является штамм РНКазы III-недостаточным E. coli с IPTG-индуцибельной T7 полимеразной активности, который используется для предотвращения деградации двуцепочечной ДНК внутри бактерии. Срок службы исследований, которые не используют систему РНК-интерференции на основе кормления HT115 или ОР50 E. coli на стандартных NGM пластины может быть используемым.
    2. Подготовка 3 – 6 (или более) 6 см пластины RNAi в условие теста (дополнительные 3 файла для рецепта). Храните RNAi пластины на 4 ° C до посева бактерии до нескольких месяцев.
    3. Растут преобразованные E. coli на ночь (16 – 20 ч, 37 ° C, пожимая инкубатор на 180 – 220 об/мин).
      Примечание: HT115 E. coli выращивается в LB с ампициллин (50 мг/мл). Стандартный ОР50 E. coli не устойчивые к антибиотикам и выращивается без ампициллина. Объем культуры зависит # пластин, но, как правило, между 8 и 100 мл фунтов, в зависимости от экспериментальный дизайн.
      1. Концентрат бактерий центрифугированием в 3000 x g 15 – 20 мин в центрифуге benchtop. Аспирационная супернатанта и вновь приостановить гранулы на 1/10 Начиная объема (т.е. 10 x) в LB с ампициллина HT115 (или без ампициллин для стандартных ОР50).
      2. Аликвота 200 мкл сосредоточено 10 x бактерий для каждой пластины 6 см. Подготовка 3 – 4 реплицирует на условие теста, 2 дополнительных резервных пластинами, которые будут использоваться в случае загрязнения. При подготовке пластины, маркировать их, так что экспериментатор, скоринг пробирного слепых в экспериментальных условиях, используя код цвета или аналогичные схемы кодирования. Убедитесь, что код записывается.
      3. Позволяет открыть пластины сухой в чистой среде, например скамейке ламинарного потока до тех пор, пока впитала все жидкости или разрешить покрыты пластины для просушки на скамейке на ночь. Контролировать пластин во время сушки, что обеспечивает агар сухой без чрезмерного высыхания.
        Примечание: Чрезмерное сушки пластин приводит к растрескиванию, что приведет к C. elegans рыть в агар агар. Мокрой поверхности агара также поощрять рыться.
    4. Храните сушеные пластины в червь поле на ночь (до 24 ч) при комнатной температуре, чтобы позволить индукции производства двуцепочечной ДНК. После 1 дня на RT Храните пластины на 4 ° C на срок до 2 недель в запечатанном zip-lock мешок (для предотвращения высыхания плиты). Перед использованием возвращение пластины в комнатной температуре внутри zip-lock мешок, чтобы предотвратить конденсацию от введения воздуху грибковых загрязнителей.
  2. Синхронизация C. elegans с гипохлоритом лечения
    Примечание: Смотрите дополнительные 3 файла для M9 и гипохлорита раствор рецепты.
    1. Собирайте беременных взрослых животных с M9. Используйте подключен стеклянной пипетки для перемещения 2 х 15 мл пробирок.
    2. Спин трубы для 30» в ~ 2000 об/мин. Проверьте наличие резерва на нематод в нижней части трубки. Аспирационная супернатант. Мыть два раза раствором M9, повторяя спин и аспирации.
    3. Вновь приостановите C. elegans в 4 мл M9. Добавьте 2 мл раствора гипохлорита. Сразу же вихрь ~ 3 мин, с периодические энергичные встряхивания. После 3 минут ищите облако яйца под микроскопом рассечения. Вихревой дополнительные 10 – 20 s если яйца не были выпущены через 3 мин.
      Примечание: Сроки лечения гипохлорит имеет важное значение. Яйца в пределах беременных взрослых являются, что выжить лечения. После ~ 3 мин вскрывать беременных взрослых и яйца проливаться. Однако если яйца находятся в растворе гипохлорита слишком долго после освобождения они умрут. И наоборот если беременных взрослых не осталось гипохлорита раствор достаточно долго, без яиц будет выпущен.
    4. Быстро промойте раствором M9 дважды как шаг 2.1.2.
    5. Вновь приостановите C. elegans яйцо Пелле в 3 мл M9 и передачи новой трубки 15 мл. Позволить эмбрионов люк на ночь в 3 мл раствора M9 с вращением на 20 ° C.
    6. Рассчитать плотность L1 животных (или эмбрионы) за мкл, сбрасывая 10 мкл раствора L1 3 x 6 см пластины и подсчитать количество животных L1, чтобы вычислить среднее количество Л1С/мкл.
      Примечание: L1 животных будет урегулировать с течением времени. Таким образом следует периодически смешанного решения L1.
    7. Семя 50 L1 животных за тарелку. Инвертировать пластины и уплотнения с резинкой. Поместите пластины в пластиковой червь ящик. Уплотнение коробки в большой zip-lock мешок. Перейти к 20 ° C инкубатора.
  3. Предотвращение производства потомства путем добавления 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR)
    1. Расти животных до стадии L4 при 20 ° C. Проверить, чтобы увидеть ли синхронизироваться животные разработали для L4 приблизительно 40 h после посева (шаг 2.1.7).
      Примечание:C. elegans развития время будет отличаться при различных температурах,12 и темпы роста мутанта животных, для которых не характеризовались ставки должны испытываться эмпирически.
      1. Мкл 160 50 x FUdR для каждой пластины 6 см с животными L4.
        Примечание: Важно, чтобы добавить FUdR на стадии L4. Для удобства сделайте 1000 x запасы FUdR, растворяя 1 g FUdR в 10 мл сверхчистого H2O. фильтр-стерилизуйте фондовая FUdR с 0,2 мкм фильтром и 10 cc шприца. Аликвота ~ 1 мл бульона в стерильных 1.5 мл пробирок. Заморозить и хранить при температуре от-20 ° C.
    2. Осмотрите пластины для присутствия мужчин C. elegans. Удалите все мужчины.
      Примечание: срок службы обычно измеряется гермафродитки и не мужчин. Гермафродитки, которые спариваются живут меньше, чем unmated животных, даже в присутствии FUdR13. Самцы меньше и тоньше затем гермафродиты и может быть легко идентифицирован отличительной хвост подключили14.
    3. Установите флажок в zip-lock мешок. Возвращение в 20 ° C инкубатора.
  4. Озвучивание жизнеспособность
    1. Оценка жизнеспособности ежедневно нежно прикасаясь животное на голове с помощью провода платины или ресниц. Оценка животных, которые не в состоянии двигаться как мертвые и удалить их из пластины (рисунок 2A). Запишите номер, наблюдается мертв для каждого условия для каждой точки время наблюдения.
      Примечание: Для снижения риска скоринга предвзятости, экспериментатор должен оставаться слепым в экспериментальных условиях и аналогичным образом не должна ссылаться на результаты от предыдущих точек времени во время озвучивания.
    2. Цензор животных, которые разрыв, умирают от других очевидных развития дефектов, или обхода вверх на стороне блюдо: удаление этих животных и запись, номер на каждой отмечено время точкой для рассмотрения в рамках статистического анализа. Кроме того если мужчины будут найдены, удалите их и записать номер наблюдается.
    3. Повторите шаг 1.4.1 ежедневно до тех пор, пока не животные остаются живыми.
      Примечание: Если газон E. coli существенно уменьшится или грибок начинает расти на пластину, передать все остальные животные свежие пластины с соответствующим RNAi и FUdR.
  5. Данные анализа - черчения и статистика
    1. Ввод или открыть записанные наблюдения данные в программное обеспечение поддерживает анализ выживаемости с непараметрические Каплана-Мейера оценщик15 и лог ранг теста16 ( дополнительный файл 3см). Не забудьте включить цензуре животных. Не включают мужчин, которые были замечены, если таковые имеются.
      Примечание: форматы данных могут отличаться между программного обеспечения, но общий формат для записи каждого отдельного животного, наблюдается на отдельной строке. Экспериментальная timepoint, в которой животное было отмечено как мертвые это время «событие». Если цензуре, время «события» является timepoint, в которой животное была подвергнута цензуре. Обычно существует поле или флажок, чтобы указать цензуре наблюдений.
    2. Участок Каплана-Мейера кривых выживания. Выберите меньше шести условий для одного участка, если много условий дубликатах для улучшения читабельности.
      1. Проверить наличие данных вопросов, которые визуально ясно отсутствующих наблюдений, управления неожиданные результаты и т.д. — и решения этих проблем до статистического анализа.
    3. Используйте функцию тест лог ранг в ваше программное обеспечение для попарного выполнения статистических сопоставлений. Убедитесь, что любые имеющиеся варианты для лечения цензуре результаты надлежащим образом установлены для право цензуре данных.

2. реплики метод Set для скоринга C. elegans долголетия

Примечание: в то время как традиционный метод требует 3 – 6 пластин за состояние (1.1.2 см. выше), метод набора реплик требует много больше (см. шаг 2.2.2 ниже). Традиционный метод следующим животных на пластину же на протяжении всего эксперимента (рис. 2A). В отличие от этого, с набора реплик животных забил только один раз: многие идентичные реплицирует настроены в начале эксперимента, чтобы реплицировать один забил в каждый момент времени (за судебного разбирательства) (рис. 2B).

  1. Настройка библиотеки.
    Примечание: Дополнительные подробности о передаче RNAi клоны покрыта здесь, как набора реплик, протокол поддается одновременное скоринга много RNAi клонов, и может быть расширена до более чем 100 клоны одновременно. Коллекции RNAi клонов сохранились как глицерин запасов в 96-луночных формат плиты. Реплика набора экспериментов используйте 24-ну пластины. Каждый хорошо это условие различных теста, которые могут соответствовать коллекции RNAi клоны, различных химических обработок, животных штаммов, и так далее.
    1. Соберите макет sublibrary для коллекций RNAi клонов, таким образом, что выполнены следующие условия:
      1. Убедитесь, что в течение 96-луночных коллекции, хорошо A1 пустой вектор отрицательного контроля.
      2. Вставка элемента дополнительные пустой вектор случайным образом в течение каждого 24 скважины.
      3. 96-луночных пластины можно разбить блоки 24 скважин, таким образом, что каждый 24-ну пластины в одном случайно вставила отрицательный контроль (рис. 2 c).
      4. Вставка элемента позитивного управления случайным образом в каждой группе 24-Уэллс (рис. 2 c).
        Примечание: Положительный контроль зависит от экспериментальных вопрос. Например когда глядя на коллекцию RNAi клонов, увеличение продолжительности жизни, daf-2(RNAi) часто включается. И наоборот при взгляде на сокращенный срок службы, часто используется daf-16(RNAi) .
  2. Подготовка наборов реплик
    Примечание: количество необходимых реплицирует равен минимальное количество времени точек (рис. 2B). Надо знать a posteriori сколько нужно измерить продолжительность жизни до начала эксперимента, а также озвучивание частоты (например реплика набора эксперимент работает 40 дней с каждый забил день требует подготовки минимум 20 наборов для Каждое условие в начале эксперимента). Это целесообразно сделать ~ 5 дополнительных резервных наборов данных (см. 2.2.2 и 2.2.2.3 ниже).
    1. Чтобы создать свежие штамп sublibrary интерференции, инокуляции 200 мкл LB + Amp в колодец в формате 96-луночных (600 мкл пластины) с помощью репликатора 96-контактные пластины, следующие шаги:
      1. Стерилизуйте 96 пластина репликатор ПИН, последовательно погружая контакты в отбеливатель 50% сверхчистого H2O и этанола. Храните контакты погружаются на по крайней мере 30 s за шаги, дезинфицирующие средства и этанола.  После погружения в этаноле пламя советы кратко. Повторите эти действия.
        Примечание: не забудьте смыть всех отбеливателя и не оставляйте контакты подвергаются отбеливатель для длительных периодов времени, как отбеливатель может разъедать контакты из нержавеющей стали.
      2. Осторожно снимите крышку клей фольги из замороженных 96-луночных глицерин фондовых библиотек плиты и мягко, но твердо молоть советы репликатору стерилизованные пластины в колодцы запасов до сих пор замороженных глицерина. Инокуляции 200 мкл LB + Amp культур и печатью привитых пластины с проницаемой мембраны. Разрешить культур расти на ночь на benchtop.
      3. Стерилизовать репликатору пластины как шаг 2.1.1, тщательно удалить уплотнение из жидкого культуры пластины после ночи роста и погружать советы репликатор контактов. Применять советы с даже давление к прямоугольной LB amp + плита агара тет и передачи бактерий из контактов к пластине нежно с небольшое круговое движение, обеспечивая оставить достаточное пространство между соседними точками. Разрешить колоний расти на ночь на пластину агар на 37 ° C. Увидеть дополнительные 3 файла для приготовления LB + Amp/Tet пластины.
      4. Перед использованием Храните плита агара на 4 ° C Перевернутый (крышка стороной вниз), завернутые в фильме парафина.
        Примечание: Хранение колонии сторону крышку позволит конденсации кросс загрязнить RNAi клоны! Колонии E. coli могут храниться для 2-8 недель при 4 ° C, в зависимости от конкретного RNAi клоны, как клоны RNAi сохранять эффективность в стимулировании двуцепочечной ДНК после индукции IPTG для переменной длины времени. Для небольших коллекций RNAi клонов, RNAi эффективность должна быть эпирически определяется RT-ПЦР для подтверждения нокдаун.
    2. Вычислить минимальное количество 24-ну пластин, необходимых для одного разбирательства эксперимента: (# пластины в наборе реплик) x (ожидаемый # время очков). Убедитесь, что несколько наборов дополнительных реплик включены для рассмотрения таких вопросов, как загрязнение (Рисунок 2Б).
      Примечание: Общее количество клонов RNAi определяют количество пластин 24-хорошо сделать один набор реплик для каждой точки времени (рис. 2 c).
      1. Подготовка 24-ну пластины, как шаг 1.1.2 (дополнительные 3 файла для рецепта). Этикетке плиты при подготовке их так экспериментатор, скоринг пробирного будет слепой в экспериментальных условиях, используя код цвета или аналогичные схемы кодирования.
      2. Прививать один набор 1,5 мл LB + Amp культур для каждые 10 реплик (см. 2.2.2). Прививать культуру в 96 хорошо штанхглубинных пластины с помощью репликатора пластины (как 2.1.3) и бактериальных колоний от 2.1.4 (рис. 2 c, слева). Печать с дышащая мембрана, расти 20 h (37 ° C) при встряхивании.
      3. Семя 120 мкл ночь культуры для каждой пластины с помощью 6-ну многоканальные пипетки с регулируемым кончиком интервал (рис. 2 c, справа). Сухой плиты выявленных в Ламинарный шкаф до впитывания все жидкости. Не слишком сухой. Хранить пластины на ночь при комнатной температуре.
  3. Синхронизация C. elegans с использованием гипохлорита лечение
    1. Рассчитать минимальное количество животных, необходимых для эксперимента: минимальное число необходимых Л1С = (15-20 животных/хорошо) (24 скважин/плита) (X набора пластин/реплик)(Y replica sets).
      Примечание: метод набора реплик требует больше животных, чем традиционный метод. Одна пластина 10 см, полная беременных червей могут предоставить 20 000 – 50 000 L1 животных в зависимости от плотности беременных взрослых. Аналогичным образом двадцать 6 см пластины принести вокруг ~ 30000 L1 животных. План для подготовки яиц подготовки, которая удваивает минимальное количество животных необходимо. Если население в подготовке голодали, повторно корма или кусок к новой плите и позволяют по крайней мере три поколения на питание до возложат17,18. Убедитесь в том заморозить обратно оставшихся Л1С.
    2. Выполните шаги 1.2 для 1.2.6 как традиционный метод для получения синхронизированы L1 животных. Семян 15 – 20 L1 животных в каждой хорошо с помощью 6-хорошо регулируемые интервалы пипетки и реагента водохранилище, аналогичны 1.2.7. Периодически перемешивают L1, решение не допустить расселения животных.
  4. Предотвращение производства потомства с добавлением 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR)
    1. Выполните шаг 1.3.1.  Подготовить стерильные 50 x FUdR запасов (см. шаг 1.3.1.1).
    2. Когда животные досягаемости L4, 25 мкл 50 x FUDR в каждую лунку 24-ну пластины с помощью пипетки регулируемый интервал 6-канальный.
  5. Оценка жизнеспособности
    1. Удалите один из набора репликации пластин и наводнения скважин с M9 решения, запись всего животных в колодец и затем нежно коснуться-перемещение животных на голове с забрать червя (рис. 2B). Животные, не двигаться забил как мертвые. Выбросите забил пластины. Запись жизнеспособность ежедневно.
      Примечание: Животные, которые разрыв, Показать брутто морфологических дефектов, удалось разработать, или пополз вверх на стороне хорошо должны подвергаться цензуре, исключая их из мертвых и общего значения.
      1. Запишите количество животных, которые подвергаются цензуре в пределах каждой скважины в каждый момент времени отдельно от других значений.
      2. Не забиваешь скважин, которые не имеют продовольствия или загрязнены (например гриб или слизь); такие скважины считаются цензуре. Кроме того цензор хорошо, если отображение всех животных морфологические или развития дефектов. Запишите событие цензуры для этой интерференции клон/хорошо в этот момент времени.
      3. После забив реплицировать пластины, отменить его. Продолжить озвучивание новых репликации набора каждый день до тех пор, пока все животные во всех скважин мертвы. Для снижения риска скоринга предвзятости, экспериментатор должен оставаться слепым в экспериментальных условиях и аналогичным образом не должна ссылаться на результаты от предыдущих точек времени во время озвучивания.
      4. Если все животные в рамках хорошо были мертвым в данный момент, а затем забив в тот день, рассмотреть ли все животные были забил как мертвый для двух раз подряд точек для данной скважины. Если это так, забив жизнеспособность больше не требуется для этого хорошо в последующее время точек.
      5. Проведение испытаний дополнительный независимый эксперимент. Отслеживать результаты последовательных испытаний отдельно от тех, которые в предыдущих исследованиях, с номером суда отметил.

3. граф данных

Примечание: С набора реплик применяется метод кривой подходят для Приблизительная средняя и максимальная продолжительность жизни. Параметры для оценки смертности C. elegans подходят логит кривой19.  Поскольку большинство средств выживания не поддерживают логит кривой, Новая программа была разработана для построения кривых логит (для набора реплик); Также поддерживаются Каплана-Мейера кривых (для традиционного метода).

  1. Начать работу с программным обеспечением. Скачайте zip-файл релиз для текущей версии (см. Раздел материалы). Распакуйте zip-файл в папку. Просмотреть файл «readme» в выведенном папки для дополнительных инструкций по установке.
  1. Начало построения интерфейса. Найти местоположение каталога «код» в папке извлечения из zip-файла (например  «/ Пользователи/имя пользователя /Desktop/WormLife/код»).
    1. Введите следующие команды в консоли R, подставляя для только что определили путь к папке. Нажмите клавишу ВВОД или вернуться после каждой строки: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. Дать время для интерфейса для загрузки в новом окне, принося вверх экрана по умолчанию, как показано на рисунке 3A. Пусть R в фоновом режиме.
  2. Данные в формате с разделителями-запятыми (CSV) или табуляцией (TSV) файлов. Укажите имена, зависит от типа анализа и столбцы. Просмотреть дополнительные файл 4 (набора реплик) и дополнительных файлов 5 (традиционные/Каплана-Мейера) отформатированные пример данных.
    Примечание: данных должен быть указан в формате «длинный», то есть по одной строке на штамм/лечение за время очко за судебного разбирательства. CSV-файлы, рекомендуется для лучшей совместимости между платформами.
    1. Удалите строки, соответствующие замечания, которые были пропущены или цензуре. Проверьте отсутствие отсутствующие или нечисловые значения, как это может привести к ошибке при импорте данных.
    2. Для традиционного анализа стиля Каплана-Мейера, не объединить данные из независимых испытаний сюжет их отдельно. Для анализа набора реплик, объединять данные из нескольких испытаний, а затем исследовать, используя функцию «TrialView» (см. 6.3.3.4).
  3. С помощью построения интерфейса
    1. Загрузить файл данных («импорт» в меню «Файл») с помощью диалогового окна. Чтобы открыть файлы «CSV», измените тип файла в раскрывающемся «.csv» (по умолчанию — «.txt/.tsv»), перейдите к папке с файлом данных. Вот файл данных примера набора реплик (дополнительный файл 4).
      Примечание: Импорт файла, когда набор данных уже открыт заменит текущий набор данных.
    2. Выберите файл для импорта для запуска мастера импорта, который ходит через определение столбцов выбранного файла (Рисунок S1A для набора реплик). Если входных данных соответствует набора реплик эксперимент, выберите «Логистическая регрессия» для изучения типа.
      Примечание: Процесс импорта отличается от набора реплик (S1 рисунокA) и традиционные (Каплана-Мейера) (S1 рисунокB).
    3. «Диаграмма». Выберите «Добавить строку» приступить к печати данных. (Линия соответствует одному набору условий. Есть функции, чтобы помочь с эксперименты где были испытаны много условий).
      1. Участок контроля условий-в случае примера данных N2 (WT) с L4440 (пустой вектор) RNAi являются подходящими. Выберите «Добавить строку» в меню «Графики» для запуска мастера добавления линии: выберите условие сюжет и графические параметры для представления строки.
        1. Чтобы вручную добавить кривую для различных условий, повторите шаги в 3.3.3.1
        2. Чтобы изменить цвет или участок символ для линии, выберите «Изменить линию» меню «граф».
        3. Чтобы удалить линию без очистки всех строк, выберите «Удалить строку» в меню «граф».
        4. Чтобы удалить все строки в текущем сюжет, выберите «Очистить линию» меню «граф».
        5. Для переопределения автоматически выбирается максимальная (время) по оси x, используйте «Набор X шкала» меню «граф».
          Примечание: по оси y (сохранившихся фракция) всегда отображается 100% (вверху) до 0% (внизу) с шагом в 20%. Оси x всегда отображается с шагом 5. Метки оси, не выводятся для обеспечения гибкости в маркировке после сохранения участок изображения.
      2. Для сохранения изображений JPEG-формат отображаемой участка, используйте параметр «Сохранить участок» в меню «файл»; сохраняется только текущий график.
      3. Для создания отдельных участков для многих различных условий в одном эксперименте, программное обеспечение позволяет определение и построение «серии».
        Примечание: Реализация концепции серии повышает эффективность при работе с большими экспериментов.
        1. Если начиная с пустой участок рабочей области, добавьте линии, соответствующие управления условий, которые должны быть согласованы во всех участков в серии (см. 3.3.3.1).
        2. Определите серии с «Определить серии» в меню «графики». Выберите условие соответствует линии для отображения впервые в серии; может быть выбран только один. Выбираете графические параметры (линия цвет и сюжет символ) на линии, как показано 3.3.3.1.
        3. Обзор участков для различных тестовых условий. Переключение отображения «серии линии» между условий с помощью кнопок влево/вправо стрелки по бокам окна основной сюжет, а также в верхнем меню (Рисунок 3А-C).
          Примечание: Если выбранный серии линии то же состояние, как один из ранее добавленный элемент управления/опорных линий, Новая линия может появиться накладными.
        4. Определите серию сделать некоторые другие функции, доступные (сохранить серии участков и Trialview ЮВЕ 3.3.3.4 для последнего). После определения серии, используйте параметр «Сохранить серии участки» из меню «Файл» для сохранения файлов изображений отдельных участка для каждого участка в серии в новой папке.
      4. Trialview — визуализация результаты независимых испытаний набора реплик эксперимента. Если для одной или нескольких групп образца были запущены несколько испытаний, участок данные из отдельных исследований и объединения данных из всех испытаний отдельно для оценки согласованности между независимых испытаний (см. Рисунок 3D).
        1. Создана серия, как описано в 3.3.3.3. Различные испытания будут отображаться для каждой группы «различных» образца в другое изображение за соответствующие испытания для указанной ссылки/контрольных образцов.
        2. Чтобы сохранить изображения TrialView, перейдите к «Печать TrialViews» в меню "данные"; изображение JPEG, которое будет выводиться для каждого участка в серии.
          Примечание: Пример результатов в рисунке 3D является для случая с два испытания.
    4. Средний срок службы Сводная таблица для набора реплик данных. Визуально осмотрите кривых для обеспечения разумного соответствия данных, а затем выберите Сводная таблица »» параметр в меню данные, чтобы сохранить таблицу значений (время на 50% выживания на кривой логит) средний срок для каждого образца типа.
  4. Статистический анализ данных, полученных через метод набора реплик
    1. Для статистического анализа между двумя группами из набора реплик эксперимент, изменения и выполнить сценарий R, в zip-файл выпуска (см «WormLife статистического анализа шаблон сценария. «««Р»).
      Примечание: Знание R не требуется для запуска сценария. Дополнительная документация находится в комментариях в файле. Скрипт готов для анализа примера данных набора реплик. Пользователя генерируемые данные в соответствующем формате (см. дополнительные 4 файла) может также быть проанализированы.
      1. Откройте файл сценария в R (R GUI или RStudio).
        Примечание: Это будет отображать сценарий без его запуска.
      2. Измените расположение необходимых файлов соответствует папке на вашем компьютере.
        Примечание: Эти пути файлов должно быть «полным» (то есть должен включать полный файл местоположения, включая папки).
        1. Измените пути (расположения файлов/папок) для «wlDir» (местоположение каталога), «dataFile» (набора реплик файл данных для анализа), «compFile» (спецификация сопоставления для запуска, если применимо) и «outputPath» (местоположение, где будут записаны файлы результатов ««««к).
      3. Задайте имена столбцов в разделе «Укажите столбцы в файле данных», если имена столбцов в файле для проведения анализа отличаются от пример файла. Укажите столбец для каждого параметра. Если исследование имеет несколько штаммов, но не интерференции (или других) включать столбец в файле данных с пустых записей или же для всех строк (например «no_treatment» и др.).
      4. Установите значение параметра «compFile». Если параметр «compFile» присвоено NA, будут выполняться все возможные попарного сравнения групп.
        Примечание: Группа определяется сочетанием штамм/генотип и лечения, которые объединяются и отображаются как «strain_treatment». Для более крупных исследований со многими группами могут быть предоставлены в CSV-файл, указав сравнений. Смотрите пример файл «comps_rsm_example.csv».
      5. Задать число итераций для Монте-Карло передискретизации («k.resamp», значение по умолчанию — 1000).
        Примечание: P-значения 0 могут быть возвращены при выполнении слишком несколько итераций; в таких случаях уместно сообщить «p < 0.01» (если k.resamp = 100), или «p < 0,001"(если k.resamp = 1000), и т.д.
      6. Запустите сценарий: кнопку «Источник» в RStudio (в правом верхнем углу окна редактирования) или «исходный документ» в меню «Правка» в R GUI. (Выполнение может занять некоторое время).
      7. Когда индикатор R «занят» больше не отображается, откройте выходной каталог там будет таблицу с результатами каждого сравнения (медиана выживаемости, p значения, % средний срок изменения).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В развитии любой новой методологии важно, что новый метод резюмирует принятые результаты предыдущих подходов и соответствует стандарту в поле. Мы ранее показали эпирически что набора реплик и традиционные методы для assaying C. elegans жизни производят аналогичные результаты20. Одичал тип C. elegans (N2) поддерживается при 20 ° C, обычно живут между 20 и 25 дней, которые мы наблюдали с традиционными (рис. 4A, чёрная линия) и набора реплик подход (рис. 4б, черный). Таким образом оба метода разумно приблизительное одичал тип жизни. Важно также, что новый метод имеет разрешение для точного количественного определения изменения условий теста и статистической мощностью, чтобы обнаружить существенные изменения. В наших предыдущих исследований мы обнаружили, что семейства Myc транскрипционных факторов являются определяющими факторами в C. elegans долголетия. MML-1 и mxl 2 кодировать C. elegans гомолог млекопитающих Mondo A / углеводов ответ элемент binding белки (ChREBP) и Mlx, соответственно. В C. elegans и млекопитающих, членов heterodimerize эти семейства Myc регулировать транскрипции. Мы обнаружили, что потеря mml-1 или mxl-2 значительно уменьшается нормальной жизни, измеренного путем либо традиционной жизни пробирного или набора реплик (рис. 4A-B, желтый и темно-бордовый). В отличие от комплекса MML-1::MXL-2 мы обнаружили, что потеря mdl-1 (гомологичных млекопитающих Mad) или mxl-1 (Макс.) значительно увеличить продолжительность жизни C. elegans как измеряется либо методологии (Рисунок 4 фиолетовый и синий, соответственно, в обеих панелей).

Серьезным ограничением для традиционного подхода для оценки долговечности является пропускная способность. Оба метода полагаются на движения звонить ли животное является живым или мертвым, которых становится все более трудно оценить. Молодые животные будут двигаться по всей пластине в отсутствие стимулов и таким образом легко забить. Старение C. elegans становятся все более сидячий но будет реагировать легкого прикосновения к голове движением вспять на тарелку. Однако как животные становятся старше возможность двигаться вперед уменьшается и становится все более нескоординированных. В конечном итоге животных стал парализованным, фенотип, сильно напоминающее саркопения и когда забил через традиционный метод жизнеспособности могут определяться только путем наблюдать тонкие дергаться на передней оконечности животного. В отличие от этого когда забил жизнеспособности через метод набора реплик, жидкость добавляется колодец, который выступает в качестве стимула, который генерирует обмолота ответ, который может быть определена количественно как индикация healthspan8. Движение в жидкости проще соблюдать даже старых животных: хронологически возраст соответствует дряхлый животных производят тонкие движения головы на сухой плиты, но более выраженным (хотя и медленный) изгиб тела в жидкости. Наконец когда забил набора реплик, и весь находится в поле зрения (~1.1 см в диаметре) и все животные, одновременно находятся в подвеска - позволяя наблюдения всех животных. В противоположность этому, когда забил 6 см пластины через традиционный метод, один необходимо сканировать через весь пластины - Поиск через бактериальный газон и по краям для животных. Чистая следствием этих различий является то, что пропускная способность при использовании метода набора реплик по крайней мере на порядок больше, чем традиционный подход, который делает возможным одновременно количественную оценку изменений в жизни через более чем 100 условия в одном эксперименте с одного следователя. Например, с геном-на основе кормления RNAi Широкоэкранные мы ранее выявленных 159 генов, которые необходимы для увеличения продолжительности жизни, предоставленных сократилось daf-2 /инсулиноподобный сигнализации8. В том, что анализ, мы количественно изменения в жизни в одичал тип и долгоживущих daf-2(e1370) мутанта, недолго daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) двойной мутанта животных (Рисунок 5A), которые позволили нам расшифровать генетический отношения между инсулиноподобный сигнализации и более 100 progeric гена inactivations. Кроме того мы оценили, как эти progeric гена inactivations изменены healthspan (в то время под названием «activespan»), наблюдая за снижение в C. elegans обмолота через реплицирует со временем (Рисунок 5B).

Figure 1
Рисунок 1: появление кормления на основе свинца RNAi в эпоху открытия гена в старение научных исследований, но большинство gerogenes остается малоизученных. (A) многие gerogenes изначально были обнаружены от крупномасштабных функциональных геномной экранов. Из более чем 900 C. elegans gerogenes обнаружили на сегодняшний день многие были определены с использованием на основе кормления интерференции, подчеркнув значение функциональной геномной подходов в открытие гена. График показывает количество gerogenes обнаружил в рукопись с помощью РНК-интерференции, основанная на фенотип аннотации (см. таблицу материалов) фенотип онтологии условия расширенной продолжительности жизни, сократить продолжительность жизни, и жизни вариант. Просмотреть Дополнительные файл 1 полный список исследований, которые обнаружили gerogenes. (B) большинство gerogenes остаются плохо изучены. В отличие от в хорошо изученных gerogenes как daf-16/FOXO (стрелка), который имеет более чем 800 ссылки, большинство gerogenes имеют менее 10 ссылок (общая ссылка не обязательно сосредоточена на продолжительность жизни). Надежные методы высок объём будет необходимо получить более глубокое понимание генетических взаимосвязей между gerogenes. Граф на основе сопоставлений между публикациями в PubMed и C.elegans gerogenes, обнаружил от интерференции фенотипов. Увидеть дополнительный файл 2 полный список gerogenes и количество исследований, связанных с каждым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Традиционный и метод Set реплики для озвучивания C.elegans жизни (A). Традиционный метод для озвучивания C. elegans продолжительность жизни. Несколько небольших синхронизированные популяций isogenic животных каждого состояния выполняются со временем. В ходе исследования следует же популяции животных. Движение, которое может быть поддержано, нежный подталкивая оценивается жизнеспособность. Животные, которые не в состоянии двигаться забил как мертвые и будут удалены (аспирация показано) до тех пор, пока остаются отсутствие жизнеспособных животных. (B). задать метод реплики для скоринга C. elegans продолжительность жизни. Большое количество синхронизированы возраст isogenic животных распределены количество идентичных реплицировать пластин. В каждый момент времени, забил один репликации: мягкая буфферезированный раствор (M9) добавляется, который стимулирует движение. Животные, которые не в состоянии двигаться спонтанно после затопления скважин также оцениваются через сенсорных стимулов. Скоринг продолжительность эксперимента определяется до начала. Каждое животное забил только один раз и долговечность для большего населения является производным от многих независимых наблюдений. (C). набор реплик подход является методом высокую пропускную способность количественно измерить продолжительность жизни C. elegans . 100 или более независимых RNAi клоны могут быть отслежены одновременно. Показана HT115 E. coli выражая двуцепочечной ДНК для заданного клон RNAi. Практически каждые 24 пробы из 96-луночных плиты делятся на одной пластине 24-хорошо. Каждый полученный 24-ну пластина имеет отрицательный (то есть пустой вектор, красный хорошо) и положительный контроль (зеленый хорошо) случайным образом распределены в коллекции RNAi клонов (желтый скважин). Как правило первая скважина (А1) в коллекции содержит пустой вектор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : графический интерфейс пользователя (GUI). (A). интерфейс окна основной сюжет, показать экран приветствия по умолчанию. Это то, что отображается при открытии программного обеспечения. Различия между платформами должна быть минимальной из-за использования инструментария оконной платформо независимые. (B). обзор вариантов меню, раскрывающихся меню доступны из окна основной сюжет. (C). пример вывода сюжет для оба набора реплик стиль (слева) и традиционный стиль Каплана-Мейера (справа) данных. Отображаемые данные собирались в независимых экспериментах. Экспортированные участки не включают предварительно диаграмме оси, для максимальной гибкости при добавлении таких ярлыков. Чтобы облегчить это, оси всегда делятся с шагом 20% для оси y и с шагом 5 для оси x. В этом примере метки оси и линии (штамм/лечение) были добавлены на сохраненные участки, используя очень простой и общий инструмент для редактирования изображений. (D). пример вывода из «TrialView» функциональность, позволяя для визуального сравнения между результаты независимых испытаний для набора реплик стиль наборов данных. Этот график показывает результат между двух различных испытаний и соответствующие Объединенные результаты для daf-2 EV(RNAi) (синий, закрытых кругах), N2 EV (RNAi) (черный, закрытых кругах) и daf-2 с daf-16 (RNAi) (красный, открытых алмазы). TrialView позволяет быстро проверки для разбирательства конкретных данных вопросов, которые могут повлиять на качество fit объединенного набора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: методы традиционной и набора реплик производят аналогичные результаты. Потеря любого компонента гетеродимера MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) увеличивает срок службы. В отличие от потери либо компонента MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) уменьшается продолжительность жизни, эта цифра перепечатана из20 ссылки с разрешения через лицензию Creative Commons Attribution (CC-BY) (см. материалы). (A). Каплана-Мейера результаты с традиционным методом. (B). кривой логистическая регрессия с использованием метода набора реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Набор реплик, метод может расшифровать генетических взаимодействий на основе изменений в жизни (A) и изменения в healthspan (B) для более чем 100 RNAi клоны одновременно. Эта цифра перепечатана из8 с разрешения и под Creative Commons Attribution-некоммерческих 4.0 международной лицензии (CC, NC) (см. материалы). (A) анализ генетических срок progeric гена inactivations в контексте снижения инсулиноподобный сигнализации (ILS) (daf-2, ось x) и в отсутствие daf-16/FoxO (ось y), Центральный transcriptional эффекторных ILS21 . Джин inactivations с аналогичными функциями как daf-16 не далее сократить продолжительность жизни в отсутствие daf-16 (черные точки). Джин inactivations с функциями полностью независимы от daf-16 укоротить оба генетических стола аналогично (серый). Джин inactivations, где отрицательное воздействие на продолжительность жизни в daf-2 > daf-2; daf-16, предлагает функцию параллельно (белый). (B) изменения в ставках обмолота с течением времени можно получить среднее healthspan для многих генетических возмущений (ось x) при оценке изменений в жизни (ось y). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок S1: рабочие процессы в WormLife. Иллюстрация шаги некоторых руководствоваться рабочих процессов (иногда называется «мастера»). В каждом из этих случаев, после последнего шага в рабочем процессе фокус возвращается обратно в окно основной сюжет. (A) данных импорта рабочего процесса для набора реплик стиль наборов данных (B) данные импорта рабочего процесса для традиционных Каплана-Мейера стиль наборов данных. (C) рабочий процесс для добавления линий на участок для набора реплик стиль наборов данных. (D) рабочий процесс для добавления линий на участок для традиционных Каплана-Мейера стиль наборов данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: исследования, которые выявили gerogenes. На основе кормления RNAi приход к эпохе открытие гена для фенотипов, которых не было шансов справиться с возникающими вперед генетикой, включая старение. В списке, порядке количество gerogenes обнаружил, являются независимые исследования, которые идентифицированы гены, деятельность которых изменен срок. Обратите внимание, что исследование, в котором определены наиболее gerogenes использовать репликацию метод set8. Природа как ген inactivations изменен срок указывается также: долговечность и progeric генов являются те, которые увеличивается или уменьшается продолжительность жизни, когда инактивированная, соответственно. «Продолжительность жизни вариант» относится к случаям где направленность изменений (то есть увеличивается или уменьшается продолжительность жизни) не был указан или не куратор. Данные из WormBase WS262 (января 2018) (см. материалы), с добавлением RNAi лечение продолжительность жизни является результатом ссылка10, которые еще не включены в коллекции куратор WormBase RNAi фенотипов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: количество исследований, связанных с каждой gerogene. Большинство gerogenes плохо изучены. Хотя некоторые гены, как daf-16/FoxO, были предметом пристального внимания исследованиям, более чем 400 gerogenes имеют менее 10 связанных публикаций. Данные из WormBase WS262 (января 2018), с добавлением RNAi лечения срок результаты из10 , которые еще не включены в коллекции куратор WormBase RNAi фенотипов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: подготовка общих реагентов для C. elegans экспериментов. (A). рецепт для стандартной плиты НГМ и интерференции. (B). рецепт буфера и гипохлорита раствор M9. (C). подготовка LB + Amp/Tet пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: набора реплик данные примера. Пример набора данных из набора реплик эксперимент жизни. Этот набор данных уже отформатирован, чтобы быть пригодным для анализ импорта. Включает в себя два испытания за состояние (сочетание штамм/генотип и интерференции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: традиционный пример продольных данных. Пример набора данных из традиционных продольной жизни эксперимент, с правой цензуры, отформатирован для готовых импорта/анализа с использованием Каплана-Мейера выживания участок функциональность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Набор методы традиционной и реплики требуется синхронизация хронологическом возрасте животных. Мы включить метод, который синхронизирует животных с использованием гипохлорита лечения взрослых, беременных, где только оплодотворенные яйца с беременных взрослого выжить лечения. Эти эмбрионы люк в жидкой суспензии и развивающих арест на первом личиночной стадии (L1). После посева L1 животных на продукты (например E. coli выражая двуцепочечной ДНК ген интереса), животные возобновление развития. Синхронизация L1 животных гипохлорита лечение беременных взрослых имеет то преимущество, что остатки unseeded L1 животных можно замороженные и бесконечно храниться в жидком азоте или морозильник-80 ° C. Таким образом сохраняется образец каждого штамма во время экспериментальной установки, создание ценного ресурса для будущих исследований и улучшения воспроизводимость. Однако в то время как гипохлорит лечение беременных взрослых животных является распространенным способом для получения синхронизированные животных для старения исследований22, L1 арест является ответом голода. Таким образом некоторые лаборатории предпочитают либо разрешить штриховкой происходят на тарелки, или же отказаться от лечения гипохлоритом и разрешить несколько беременных взрослых откладывают яйца на несколько часов (т.е. яйцо лежал). В последнем случае родители, удаляются и затем продолжительность жизни потомства. В меру наших знаний не очевидные различия в продолжительности жизни между животными, которые были синхронизированы в M9, вылупился на пластины или потомства от яйца лежали не поступало. Однако учитывая, что изменения в доступности питательных веществ тесно связаны с изменениями в жизни, есть преимущество, что конкретных генетических стола может производить различные результаты между этими подходами синхронизации. Для устранения этой теоретической озабоченность требуется более тщательный анализ.

Независимо от метода, используемого для синхронизации начальной населения необходимо предпринять шаги для либо предотвращения производства потомства или отделить синхронизированные начиная населения от будущего потомства. В нашем протокол, мы наметим как использовать FUdR для предотвращения производства потомства, как разделение животных не является жизнеспособным вариантом для метода набора реплик. Это также возможно для предотвращения производства потомства генетически с помощью феминизированные генетический фон (например fer-15(b26);fem-1(hc17), который является температур зависимая Стерильные штамм23). Однако, ни один не без недостатков: использование генетических стола может осложнить последующего анализа, и в некоторых генетических стола FUdR может изменить долголетия24,25,26.

В качестве альтернативы для предотвращения потомства производства путем химической или генетических означает, взрослых животных можно периодически переехал в свежий RNAi пластины чтобы изолировать их от их потомства. Это упрощает фон соображения за счет пропускной способности. Периодически перемещение животных свежая еда имеет дополнительные преимущества предотвращения возможного голода и обновление подверженности малым интерферирующим РНК. Однако, некоторые генетических взаимодействий, которые влияют на продолжительность жизни только были открыны, когда тормозится производства потомства: ранний анализ TGFβ путь для жизни фенотип ошибочно пришел к выводу, что снижение TGFβ сигнализации влияние C. elegans срок формирования но не старения27,28. Однако следить за исследование, в котором используется FUdR показало, что что уменьшилось TGFβ сигнализации увеличение продолжительности жизни через инсулина, сигнализации29. Почему более ранних исследований не видеть увеличение продолжительности жизни в TGFβ мутанта животных? TGFβ путь мутации производят небольшие откладки дефекта (egl) и расширить репродуктивные долголетия, который вызывает внутреннюю штриховкой потомства позднее в жизни, которая убивает родителей. Вполне вероятно, что долгоживущих TGFβ мутанта животных появились иметь нормальный срок из-за egl фенотип убитых животных примерно в то время, когда одичал тип животных обычно умирают. Это может быть отношение к другие генетические пути, связанные с DR, как голодали одичал тип животных также проявляются egl фенотип, возможно как преимущество адаптивной выживание потомства в условиях низкой пищи. Это подчеркивает основные сложности в адаптационного реагирования, которую животные проходят в условиях стресса и необходимость тщательного анализа и рассмотрения, при проектировании срок жизни экспериментов.

В разработке и проведении экспериментов срок либо методом важно избежать предвзятости. Эксперименты должны проводиться на основе двойного слепого: как образцы были ранее забил в предыдущие моменты времени и личность условие теста должен быть неизвестен экспериментатора. Кроме того это всегда необходимо включать как позитивные, так и негативные элементы управления; в случае метод set реплики они случайно вставляются в 24-ну тарелку. E. coli , выражая плазмида, который не содержит инструкции insert с последовательностью в C. elegans генома соответствует пустой вектор отрицательный контроль (т.е. «L4440»-см материалы). Позитивные элементы зависят от конкретного характера эксперимента. К примеру daf-2 кодирует C. elegans инсулин/IGF-1 рецепторов, и инактивации daf-2 через систему РНК-интерференции на основе кормления надежно увеличивает продолжительность жизни по крайней мере два раза в одичал тип животных27. Таким образом daf-2(RNAi) может служить положительный контроль при поиске гена inactivations, которые увеличивают продолжительность жизни. И наоборот daf-16 кодирует FOXO транскрипционным фактором orthologue30. DAF-16 является важным компонентом многих парадигм долголетия и одичал тип животных (N2) лечили daf-16(RNAi) недолго и признаки Прогерия31.

Основными преимуществами традиционной продольной жизни подход, что очень хорошо известно, и эксперименты легко настроить. Относительно небольшое число животных необходимо всего несколько пластин для каждого условия теста. Таким образом могут быть легко проверены штаммов, которые растут плохо или требуют балансировки для распространения. Традиционный подход является очень гибкой и может использоваться с любой из имеющихся подходов для обработки производства потомства, включая лечение с FUdR, пересечение в феминизированных генетический фон или периодически перемещение взрослых животных новой пластинки в период яйцекладки. Хотя перемещение животных значительно снижает пропускную способность, работая с мутант фон никогда не является идеальным, и хотя FUdR не изменяет жизни одичал тип32,,3334, это может повлиять на продолжительность жизни и возраст соответствующих фенотипов в некоторых генетических стола35,25,26. Обратите внимание, что присутствие мужчин, даже с использованием FUdR, значительно сократит Гермафродит срок13, таким образом, пластина, которая содержит мужчины после гермафродитки L4 непригодна. Кроме того анализ через оценщик Каплана-Мейера и связанные кривых и лог ранг тест, хорошо установленных для данных о смертности. Однако есть несколько недостатков анализ традиционной жизни. Повторил обработка пластин (т.е. Разоблачение пластины для воздуха) облегчает введение грибковых обсемененности. Кроме того, неоднократные тыча может повредить или убивать животных, особенно населения опережает в возрасте и становятся хрупкими. Старых животных становится значительной степени парализована и погряз в E. coli, в то время как E. coli становится оппортунистических патогенов (колонизировать просвета и упаковки глотки)36. Очень старый живых животных может быть идентифицирован только тонкие движения головы. Таким образом это легко классифицировать дряхлый живое животное как мертвые. И наконец традиционный подход ограничивается пропускной способности.

Метод набора реплик является высокая пропускная способность и количественные. Однако недостатком этого метода является больших инвестиций времени и ресурсов в первоначальный набор. Умеренно большой эксперимент для изучения 100 RNAi клоны, свыше 20 очков время требует 30000 L1 животных (где примерно 15 животных рассматриваются за RNAi клон на момент времени), который в то время, как это легко для большинства штаммов, может быть проблематичным в некоторых случаях. Например, без крупных частиц сортировщик («червь сортировщик») штаммов, которые должны поддерживаться с балансиры или трансгенных линий ношение плохо передаваемых экстра хромосомных массив не может рассматриваться легко этим методом. Второй недостаток — что необходимо тормозится производства потомства, который требует использования FUdR или феминизации генетический фон. Наконец необходимо знать время assay будет работать, как одна необходимо подготовить набора репликации для каждой точки время в начале эксперимента. Однако преимущества этого метода являются многочисленными. Прежде всего, забив жизнеспособность намного быстрее, и одно может легко следовать животных над 100 тестовых условий одновременно (т.е. клоны интерференции). Поскольку набор реплик только забил один раз то отбрасываются, отсутствует неоднократные обработка пластин или тыкать животных, который минимизирует вероятность возникновения грибковых загрязнения и устраняет смертности, вызванной иногда грубый подталкивание с червь выбрать. Кроме того добавление жидкости к скважине значительно облегчает скоринга. Освобождения старых животных от плиты и окружающих бактерий помогает позволяя тонкие движения головы к более легко забил. Добавление жидкости также обеспечивает возможность измерения скорости обмолота как мера Фитнес (например , healthspan8,37).

Старение представляет собой сложное явление, с участием нескольких причинно-следственных механизмах, которые требуют использования систем биологического подходов к разгадать. Часто эти подходы включают данными моделирования, с использованием больших объемов данных геномных/транскриптомики и требуют дополнительных надежных и высокопроизводительных методов для измерения продолжительности жизни и healthspan. Метод набора реплик высок объём позволит сравнивать много клонов RNAi продольно, минимизируя пакет эффектов и технические ошибки, способствуя тем самым разработке динамических моделей, которые можно вывести взаимодействие между причинной пути в количественном выражении. Кроме того интеграция нескольких генома общесистемной геномики подходов с методом набора реплик, возможно потому что большой популяции животных, возраст синхронизированы разделен на несколько небольших групп населения.

Чтобы улучшить пропускную способность C. elegans жизни экспериментов, часто упором на адаптации традиционного подхода продольной ранее разработаны другие методы (т.е. после тот же набор животных с течением времени) до автоматизированных наблюдения и записи с помощью общих планшетные сканеры38,39, или более специализированного оборудования, такого как microfluidic плиты40. Подходы на основе сканера использовать свет как стимул и сравнить последовательно захваченного изображения, чтобы определить статус жив/мертвые, основанная на движении для нескольких пластин в одно время; Хотя такие подходы не требуют собственной научной аппаратуры, время участвует в создании рабочих процессов может быть существенной зависимости от желаемого масштаба. Кроме того продолжительность жизни экспериментов в пользовательских microfluidic приборы позволяют для углубленного фенотипические характеристики одиночные животные с течением времени и без лечения для предотвращения потомства, но требуют изготовление microfluidic пластины и приобретение связанные microfluidic насосов и оборудования для формирования изображений. В отличие от этого метод набора реплик, в сочетании с программным обеспечением, описанные здесь, позволяет значительно улучшить пропускную способность, с помощью инструментов, которые уже распространены в лабораториях, работающих с C. elegans.

WormLife программное обеспечение будет улучшена в будущем легче доступ статистического сравнения, и совместимость с дополнительных платформ. Наиболее актуальной документации для программного обеспечения можно найти на странице GitHub, включая инструкции по установке для платформ, на которых был протестирован программного обеспечения. Будет также разработана веб-версия для включения удобный доступ без необходимости устанавливать любое программное обеспечение.

Таким образом сочетание метода набора реплик и свободно доступного программного обеспечения, описанные здесь предоставляет мощную платформу для повышения пропускной способности и надежности жизни экспериментов и широкого круга основанных на выживание анализов (например стресс, терпимость, токсикологических исследований, healthspan и т.д.). Особенно в сочетании с функциональной геномики, этот подход использует множество преимуществ системы многоклеточные модель C. elegans для расшифровки множества генетических взаимодействий, которые способствуют прогрессирование старения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Финансирование для этой работы, описанные в этой рукописи была предоставлена: Университет Рочестер Канцелярии Прево и школа медицины и стоматологии деканат через медицинских наук центр вычислительной инноваций (HSCCI); Эллисон медицинский фонд новых ученых в старения стипендий (АГ-NS-0681-10) спонсоров было никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395, (6705), 854 (1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2, (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579, (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14, (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21, (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8, (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51, (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343, (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103, (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910, (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50, (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14, (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A, (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10, (4), e1004278 (2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389, (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1, (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132, (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9, (1), e85964 (2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131, (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17, (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41, (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278, (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12, (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13, (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34, (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46, (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10, (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12, (3), 398-409 (2013).
Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой <em>Caenorhabditis elegans</em> продолжительность жизни
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter