Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Den replika Set-metoden: En hög genomströmning strategi att kvantitativt mäta Caenorhabditis elegans livslängd

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819

Summary

Här beskriver vi metoden replikuppsättning, ett tillvägagångssätt att kvantitativt mäta C. elegans livslängd/överlevnad och healthspan i en hög genomströmning och robust sätt, vilket gör att screening av många villkor utan att offra datakvalitet. Detta protokoll Detaljer strategin och ger ett verktyg för analys av replikuppsättningen data.

Abstract

Den replikuppsättning metoden är en metod att kvantitativt mäta livslängd eller överlevnad Caenorhabditis elegans nematoder i en hög genomströmning sätt, vilket gör att en enskild utredare att skärmen mer behandlingar eller villkor över samma mängd helst utan förlust av datakvalitet. Metoden kräver gemensam utrustning finns i de flesta laboratorier som arbetar med C. elegans och är därmed enkel att anta. Metoden centers på testmetoder oberoende prover av en befolkning på varje observationspunkt, snarare än ett enda prov över tiden som med traditionella längsgående metoder. Scoring innebär att lägga flytande till brunnarna flera platta, som stimulerar C. elegans att flytta och underlättar kvantifiera förändringar i healthspan. Andra stora fördelar med metoden replikuppsättning inkluderar minskad exponering av agar ytor luftburna föroreningar (t.ex. mögel eller svamp), minimal hantering av djur och robusthet till sporadiska mis scoring (till exempel anropa ett djur som dött när det är fortfarande (Alive). För att korrekt analysera och visualisera data från en replikuppsättning stil experiment, utvecklades också en anpassad programvaruverktyg. Nuvarande funktioner av programvaran omfattar plottning av överlevnadskurvor för replikuppsättningen och traditionella (Kaplan-Meier) experiment, såväl som statistisk analys för replikuppsättningen. De protokoll som anges här beskriver den traditionella experimentella metoden och metoden replikuppsättning, samt en översikt över motsvarande dataanalys.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En av de mest omvälvande tekniska framsteg mot att förstå den genetiska grunden för åldrande var utvecklingen av utfodring-baserade RNAi i C. elegans1. innan experimentell användning av RNAi var många fenotyper av åldrande inte genetiskt fogligt. Utfodring-baserade RNAi uppnås genom produktion av dsRNA inom E. coli som matchar en endogena C. elegans mRNA: IPTG inducerar dubbelriktad transkription över ett skär av antingen C. elegans cDNA eller en del av en öppna läsning ram i en plasmid2. När C. elegans foder vid intakt är E. coli, dsRNA produceras av bakterier transporteras från lumen in intestinala celler via SID-2 transmembrane protein3och sedan distribueras genom resten av djuret via SID-14. Inom varje cell, exogena dsRNA bearbetas av den komplexa Dicer till siRNA, som interagerar med en mogen mRNA via kompletterande bas ihopkoppling att skapa en ny siRNA-mRNA duplex. Denna duplex är erkänt av komplexet RISC och klyvs, därmed förnedrande den endogena mRNA-5. Således, genom att bara ändra plasmid skäret, kan en inaktivera funktionen av nästan alla gen inom C. elegans genomet. Denna upptäckt ledde till skapandet av flera stora utfodring-baserade RNAi bibliotek-samlingar av omvandlas E. coli bestånd som kan kombineras för att uppnå täckning av cirka 86% av kända C. elegans gener6, 7.

Sedan utvecklingen av utfodring-baserade RNAi, har heltäckande skärmar i C. elegans lett till upptäckten av mer än 900 gener som förändrar livslängd när inaktiverat (vilket framgår av RNAi-fenotyp sammanslutningarna curerad i WormBase), som vi kallar att som gerogenes. En roll för flesta gerogenes livslängd kontroll upptäcktes genom utfodring-baserade RNAi i bara några nyskapande rapporter (se figur 1A och kompletterande fil 1 för detaljer). I vissa fall, har dessa gerogenes identifierats baserat på mäta lönsamheten på en enda eller några tidpunkter, som inte ger ett kvantifierbart mått på förändringen i livslängd med RNAi behandling. I andra fall har dessa gener utvärderats kvantitativt för förändringar i livslängd, samt ytterligare ålder-associerade fenotyper. Till exempel identifierat vi tidigare 159 gener som var nödvändiga för både normal och ökad livslängd på djur med minskad insulin/IGF-1 signalering och kvantifieras förändringar i healthspan. Av dessa resultera 103 gen inactivations i en progeric fenotyp, som förlust resulterade i ett eller flera tecken på förtidigt åldrande8.

Medan vissa gerogenes har associerats med 100 eller fler studier (t.ex. daf-16, daf-2, sir-2.1), har över 400 gerogenes 10 eller färre citat (figur 1Boch kompletterande fil 2). Således, medan omfattande utfodring-baserade RNAi skärmar har upptäckt och hastigt kännetecknas hundratals förmodad gerogenes, hur dessa gener fungerar livslängd kontroll, och de genetiska sambanden mellan dessa genprodukter förblir dåligt studerade. Full längsgående analys för ålder-associerade fenotyper är en förutsättning för att identifiera genetiska interaktioner mellan gerogenes (e.g. epistatic interaktioner, asynthetic interaktioner, etc.). Få djupare insikt i de genetiska sambanden mellan gerogenes kräver en hög genomströmning kvantitativ metod, som också utnyttjar fördelarna med utfodring-baserade RNAi.

Den vanligaste surrogat åldrande är livslängd. Den traditionella metoden för att mäta C. elegans dödlighet spår dödsfall av enskilda djur över tiden inom en liten population. Ett relativt litet antal djur följs över tid och regelbundet är försiktigt stack med platina tråd eller ögonfrans, med rörelse som indikator av livskraft (figur 2A). Denna metod har använts, eftersom det ger enkla, direkta mätningar av genomsnittlig och maximal livslängd. Denna traditionella metod är dock tidskrävande och relativt låg genomströmning, vilket begränsar antalet djur och villkor som samtidigt kan mätas på ett kontrollerat sätt. En färsk simuleringsstudie fann att många C. elegans livslängd studier inte assay ett tillräckligt stort antal djur för att kunna tillförlitligt upptäcka små förändringar mellan villkorar9. Dessutom innebär denna traditionella metod upprepade gånger hantering samma kohort av djur över tid, som i sin tur kan medföra förorening, och kan skada eller döda allt bräckligare, äldre djur.

Vi har utvecklat en alternativ ”replikuppsättning” metod för att mäta C. elegans livslängd. Detta är en stor population av ålder-synkroniseras, syngena djur indelade i ett antal små populationer (eller kopior). Tillräckligt replika prover skapas för att täcka varje tidpunkt i planerade experimentet. Vid varje observation tidpunkt, en av replikerna är gjorde för antalet levande, döda och censurerade djur, då djur inom att replikera ignoreras. Således över den förväntade livslängden av befolkningen som helhet, en serie av oberoende subpopulations är regelbundet provtas (figur 2B). I använda replikuppsättningar finns ingen upprepad petade av djur och ingen upprepad exponering för potentiella miljöförorening. Den livskraft som observerats vid enstaka punkt är helt oberoende av alla andra observation, vilket minimerar hanteringen och ökar genomströmningen av minst en storleksordning. Detta har tillåtit oss att kvantifiera förändringar i livslängd för hundratals RNAi kloner samtidigt8,10.

Här presenterar vi detaljerade protokoll för att bedriva C. elegans livslängd via både replikuppsättningen och traditionella metoder för poängsättning C. elegans livslängd. Vi visar att liknande resultat erhålls mellan metoderna. Vi har utvecklat programvara att bistå i den grafiska analysen av livslängd data som genereras via antingen strategi, som vi ger fritt under GPL V3 licens (se tabell material). ”WormLife” är skriven i R11, och innehåller ett grafiskt användargränssnitt (GUI) för Rita data, som har testats i Mac OS och Linux. Slutligen, vi jämför och kontrast begränsningar i varje metod och belysa andra överväganden när du väljer mellan metoder för att mäta kvantitativa förändringar i C. elegans livslängd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. traditionell metod för Scoring C. elegans livslängd

  1. Beredning av reagens
    1. Identifiera gener att inaktiveras via utfodring-baserade RNAi. Köpa transformerad bestånd av HT115 E. coli2 innehållande RNAi klonen av intresse. Alternativt subclone cDNA av genen av intresse ut multicloning platsen för L4440 Plasmiden.
      Obs: HT115 är ett RNase III-brist E. coli stam med IPTG-inducerbara T7 polymeras aktivitet, som används för att förhindra nedbrytning av dsRNA inom bakterierna. För livslängd studier som inte använder utfodring-baserade RNAi, kan antingen HT115 eller OP50 E. coli på standard NGM plåtar vara begagnade.
    2. Förbered 3 – 6 (eller fler) 6 cm RNAi plattor per Testvillkor (kompletterande fil 3 för recept). Lagra RNAi plattor vid 4 ° C före sådd med bakterier för upp till flera månader.
    3. Växa transformerad E. coli över natten (16 – 20 h, 37 ° C skakas inkubator vid 180 – 220 RPM).
      Obs: HT115 E. coli odlas i LB med ampicillin (50 mg/mL). Standard OP50 E. coli är inte antibiotikaresistenta och odlas utan ampicillin. Kultur volym beror på antal plattor, men ligger vanligen mellan 8 och 100 mL LB, beroende på experimentell design.
      1. Koncentrera sig bakterier genom centrifugering vid 3 000 x g i 15-20 min i en bänkmonterade centrifug. Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten 1/10th börjar volym (dvs. 10 x) i LB med ampicillin för HT115 (eller utan ampicillin för standard OP50).
      2. Alikvotens 200 µL koncentrerade 10 x bakterier till varje 6 cm platta. Förbered 3 – 4 replikat per test skick, med 2 extra backup plattor, att användas vid kontaminering. När du förbereder plattor, märka dem så de experimenter scoring analysen är blind för de experimentella förhållandena, med en färgkod eller liknande kodning. Se till att koden registreras.
      3. Att öppna plattorna torka i en ren miljö såsom en laminär bänk tills all vätska absorberats eller tillåta täckt plattorna torka på bänken under natten. Övervaka plattor under torkningen för att säkerställa att ägarn är torr utan uttorkning.
        Obs: Uttorkning pläterar leder till sprickbildning av agar som kommer att orsaka C. elegans att burrow i ägarn. Våt agar ytorna också främja grävande.
    4. Förvara torkade plattor inom en mask box över natten (upp till 24 timmar) vid rumstemperatur för att induktion av dsRNA produktion. Efter 1 dag på RT, lagra plattor vid 4 ° C i upp till 2 veckor i en förseglad zip-lock påse (att förhindra plattorna torka ut). Före användning, återgå plattor till rumstemperatur inom den zip-lock påsen att förhindra kondens från att införa luftburna svamp föroreningar.
  2. Synkronisering av C. elegans med hypoklorit behandling
    Obs: Se kompletterande fil 3 för M9 och hypoklorit lösning recept.
    1. Samla dräktig vuxna djur med M9. Använd en nätansluten glas pipett för att flytta till 2 x 15 mL rör.
    2. Snurra rören för 30 ”på ~ 2 000 rpm. Kontrollera om en pool av nematoder på botten av röret. Aspirera supernatanten. Tvätta två gånger med M9 lösning, upprepande spin och aspiration.
    3. Återsuspendering C. elegans i 4 mL M9. Tillsätt 2 mL av hypokloritlösning. Omedelbart virvel för ~ 3 min, med periodiska kraftig skakning. Efter 3 min, leta ett moln av ägg i dissekera Mikroskop. Vortex ett ytterligare 10 – 20 s om ägg inte har släppts efter 3 min.
      Obs: Timing hypoklorit behandling är viktigt. Ägg inom de dräktiga vuxna är vad överleva behandling. Efter ~ 3 min dräktig vuxna bryta öppna och äggen spiller ut. Dock om äggen är förpackade i hypokloritlösning kommer att alltför länge efter frige de dö. Omvänt, om dräktig vuxna inte finns kvar i hypokloritlösning tillräckligt länge, inga ägg kommer att släppas.
    4. Snabbt tvätta med M9 lösningen två gånger som i steg 2.1.2.
    5. Återsuspendering C. elegans ägg pelleten i 3 mL M9 och överföring till en ny 15 mL tub. Embryon som kläcks under natten i 3 mL M9 lösning med rotation vid 20 ° C.
    6. Beräkna densiteten av L1 djur (eller embryon) per µL genom att släppa 10 µL L1 lösning 3 x 6 cm platta och räkna antalet L1 djur att beräkna Genomsnittligt antal L1s/µL.
      Obs: L1 djur kvittar över tid. L1 lösningar bör därför blandas med jämna mellanrum.
    7. Utsäde 50 L1 djur per platta. Invertera plattorna och förslut med ett gummiband. Lägg plattorna i en plast masken förpackning. Försegla lådan i en stor zip-lock påse. Flytta till en 20 ° C inkubator.
  3. Att förebygga avkomma produktion genom tillsats av 5-Fluoro-2'-deoxiuridin (FUdR)
    1. Växa djur tills L4 scenen vid 20 ° C. Kontrollera att se om synkroniseras djur har utvecklat till L4 cirka 40 h efter sådd (steg 2.1.7).
      Obs:C. elegans utvecklande tid varierar vid olika temperaturer12 och tillväxt andelen muterade djur för vilka priser inte har präglats måste testas empiriskt.
      1. Tillsätt 160 µL av 50 x FUdR till varje 6 cm tallrik med L4 djur.
        Obs: Det är viktigt att lägga till FUdR skede L4. För enkelhetens skull göra 1000 x lager av FUdR genom upplösning 1 g FUdR till 10 mL ultrarena H2O. Filter-sterilisera stock FUdR med ett 0,2 µm filter och en 10 cc spruta. Alikvotens ~ 1 mL lager i sterila 1,5 mL rör. Frysas och förvaras vid-20 ° C.
    2. Inspektera plattor för förekomst av manliga C. elegans. Ta bort alla män.
      Obs: livslängd mäts vanligtvis för hermafroditer och inte män. Hermafroditer som kompis lever kortare än individer djur, även i närvaro av FUdR13. Hanarna är mindre och tunnare sedan hermafroditer och kan lätt identifieras av en distinkt krokiga svans14.
    3. Placera rutan i zip-lås väska. Återgå till 20 ° C inkubator.
  4. Scoring livskraft
    1. Poäng livskraft dagligen genom att försiktigt röra djuret i huvudet med en platina tråd eller ögonfrans. Poäng djur som inte röra sig som döda och ta bort dem från plattan (figur 2A). Registrera antalet observerade döda för varje villkor för varje observationspunkt tid.
      Obs: För att minska risken för scoring bias, försöksledaren måste förbli blind för experimentella förhållanden och på samma sätt måste inte referera till resultaten från tidigare tidpunkter under scoring.
    2. Censor djur som brista, dö från andra uppenbara utveckling defekter, eller krypa upp på sidan av skålen: ta bort dessa djur och registrera antalet vid varje observerat tid pekar mot vederlag i den statistiska analysen. Dessutom om hanar finns, ta bort dem och spela in antalet observerade.
    3. Upprepa från steg 1.4.1 dagligen tills inga djur förbli vid liv.
      Obs: Bör gräsmattan av E. coli minska avsevärt eller svampen börjar växa på plattan, överföra alla återstående djur till en färsk platta med lämpliga RNAi och FUdR.
  5. Data analys - plottning och statistik
    1. Ingång eller öppna inspelade observationsdata i programvara som stöder överlevnadsanalyser med icke-parametriska Kaplan-Meier estimator15 och log-rank test16 (se kompletterande fil 3). Var noga med att inkludera censurerade djur. Inkludera inte hanar som observerades, om någon.
      Obs: dataformat kan variera mellan programvara, men ett gemensamt format är att registrera varje enskilt djur som observerats på en separat rad. Den experimentella tidpunkt vid vilken ett djur observerades som död är ”händelse” gången. Om censurerade, är ”event” tiden den tidpunkt då djuret censurerades. Det finns vanligtvis ett fält eller kryssrutan för att indikera censurerade observationer.
    2. Rita Kaplan-Meier överlevnadskurvor. Välj färre än sex villkor för en enda tomt om många villkor analyserades för att öka läsbarheten.
      1. Kontrollera dataproblem som är visuellt uppenbara - saknas observationer, oväntade kontrollresultat, m.m. — och åtgärda dessa innan statistisk analys.
    3. Använda funktionen log-rank-test i ditt program för att utföra pairwise statistiska jämförelser. Se till att alla tillgängliga alternativ för behandling av censurerade resultat fastställs på ett lämpligt sätt för höger-censurerade data.

2. replika Set-metod för Scoring C. elegans livslängd

Obs: medan den traditionella metoden kräver 3 – 6 plattor per tillstånd (se 1.1.2. ovan), den replikuppsättning metoden kräver många fler (se steg 2.2.2 nedan). Den traditionella metoden följer djur på samma platta under ett experiment (figur 2A). Däremot med replikuppsättningen djur är bara gjorde en gång: många identiska replikat ställs in i början av experimentet så att ett replikat görs vid varje tidpunkt (per studie) (figur 2B).

  1. Inställningar för musikbiblioteket.
    Obs: Ytterligare detalj på lämna RNAi kloner täcks här, som replikuppsättningen protokollet är mottagliga för samtidiga poängsättning av många RNAi kloner, och kan skalas till långt över 100 kloner i taget. Samlingar av RNAi kloner bevaras som glycerol lager som hålls i en platta med 96 brunnar format. Replika Set experiment använder 24 brunnar. Alla är väl ett annat test tillstånd, som kan motsvara en samling av RNAi kloner, olika kemiska behandlingar, djura stammar och så vidare.
    1. Montera layouten för sublibrary för samlingar av RNAi kloner, så att följande villkor är uppfyllda:
      1. Säkerställa att en 96 brunnar samling, väl A1 är en tom vektor negativ kontroll.
      2. Infoga en extra tom vector kontroll slumpmässigt inom varje 24 brunnar.
      3. Dela plattan med 96 brunnar i block av 24 brunnar, sådan att varje 24-well platta har en slumpmässigt infogats negativ kontroll (figur 2 c).
      4. Infoga en positiv kontroll slumpmässigt inom varje grupp av 24-wells (figur 2 c).
        Obs: Den positiva kontrollen är beroende av den experimentella frågan. Till exempel när du tittar på en samling av RNAi kloner att öka livslängden, ingår daf-2(RNAi) ofta. Omvänt, när man tittar på förkortad livslängd, daf-16(RNAi) används ofta.
  2. Beredning av replikuppsättningar
    Obs: antalet replikat behövs är lika med det minsta antalet tidpunkter (figur 2B). Man måste veta a posteriori hur länge att mäta livslängd före start av försöket, liksom scoring frekvens (t.ex. en replika set experiment kör 40 dagar med varje annan dag scoring kräver förbereder ett minimum av 20 replikuppsättningar för varje villkor i början av experimentet). Det är lämpligt att göra ~ 5 extra backup set (se 2.2.2 och 2.2.2.3 nedan).
    1. Om du vill skapa en ny stämpel av den RNAi-sublibrary, Inokulera 200 µL LB + Amp per brunn i en 96-väl format (600 µL pläterar) med en 96-pin plattan replicator genom följande steg:
      1. Sterilisera 96 pin plattan replicator i sekventiellt doppa pinnarna i 50% blekmedel, ultrarena H2O och etanol. Hålla stiften nedsänkt i minst 30 s anvisningar om blekmedel och etanol.  Efter nedsänkning i etanol, flame tips kort. Upprepa.
        Obs: se till att skölja bort all lut, och lämna inte stiften utsätts för blekmedel för längre perioder, som blekmedel kan korrodera rostfritt stål stiften.
      2. Ta försiktigt bort självhäftande folie lock från frysta 96 brunnar glycerol lager bibliotek plattan och försiktigt men ordentligt slipa tips av de steriliserade plattan replicator i brunnar av bestånd som fortfarande frysta glycerol. Inokulera 200 µL LB + Amp kulturer och försegla inokulerade plattan med en genomsläpplig membran. Tillåta kulturer att växa över natten på bänkmonterade.
      3. Sterilisera den plattan replicator som i steg 2.1.1, noggrant avlägsna förseglingen från den flytande kultur plattan efter övernattning tillväxt och fördjupa tips replicator stiften. Gälla tips med jämnt tryck en rektangulär LB amp + tet agarplatta och överföra bakterier från stiften på plattan försiktigt med små cirkelrörelser, säkerställa att tillräckligt utrymme finns kvar mellan intilliggande ställen. Tillåta kolonier att växa över natten på agarplattan vid 37 ° C. För beredning av LB + Amp/Tet se kompletterande fil 3 plattor.
      4. Innan användning, förvara agarplatta vid 4 ° C inverterad (locket nedåt), insvept i paraffin filma.
        Obs: Lagra kolonierna locket sida gör att kondens att cross-förorena RNAi kloner! Kolonier av E. coli kan förvaras i 2 – 8 veckor vid 4 ° C, beroende på viss RNAi kloner, som RNAi kloner behålla effekten för att framkalla dsRNA efter IPTG induktion för variabla längder tid. För små samlingar av RNAi kloner, bör RNAi effektivitet empiriskt bestämmas genom RT-qPCR bekräfta knockdown.
    2. Beräkna det minsta antalet 24 brunnar behövs för en studie av experimentet: (# plattor per replikuppsättning) x (beräknade # tidpunkter). Se till att några extra replikuppsättningar ingår för att hantera frågor såsom förorening (figur 2B).
      Obs: Det totala antalet RNAi kloner bestämma antalet 24 brunnar att göra en uppsättning av repliker för varje tidpunkt (figur 2 c).
      1. Förbereda 24 brunnar, som steg 1.1.2 (kompletterande fil 3 för recept). Etikett tallrikar när du förbereder dem så de experimenter scoring analysen kommer att vara blinda för de experimentella förhållandena, med en färgkod eller liknande kodning.
      2. Inokulera en uppsättning 1,5 mL LB + Amp kulturer för varje 10 repliker (se 2.2.2). Inokulera kulturer i 96 väl djupa brunnar med hjälp av plattan replicator (som i 2.1.3) och bakteriekolonier från 2.1.4 (figur 2 c, vänster). Försegla med ventilerande membran, växa 20 h (37 ° C) under skakning.
      3. Utsäde 120 µL av en övernattning kultur till varje tallrik som använder en 6-väl flerkanalspipett med justerbar spets avstånd (figur 2 c, höger). Torka plattorna avslöjat i en LAF tills all vätska absorberats. Torka inte alltför. Förvara tallrikar över natten i rumstemperatur.
  3. Synkronisering av C. elegans med hypoklorit behandling
    1. Beräkna det minsta antalet djur behövs för experimentet: minsta antal L1s behövs = (15-20 djur per brunn) (24 brunnar/platta) (X plattor/replikuppsättning)(Y replica sets).
      Obs: replikuppsättning metoden kräver mer djur än den traditionella metoden. En 10 cm tallrik full av dräktig maskar kan ge 20 000 – 50 000 L1 djur beroende på densiteten hos dräktig vuxna. Likaså ger tjugo 6 cm plattor runt ~ 30.000 L1 djur. Plan för att förbereda en ägg-förberedelse som fördubblar det minsta antalet djur behövs. Om befolkningen i förberedelse har svultit, nytt foder eller bit till en ny platta och tillåta minst tre generationer på mat innan fortsätter17,18. Glöm inte att frysa tillbaka överblivna L1s.
    2. Följ steg 1.2 till 1.2.6 som i den traditionella metoden att få synkroniseras L1 djur. Utsäde 15 – 20 L1 djur till varje brunn med hjälp av en 6-väl justerbar-spacing pipett och reagens reservoir, liknar 1.2.7. Med jämna mellanrum blanda L1 lösning förhindra reglerandet av djur.
  4. Förebyggande av avkomman produktion genom tillsats av 5-Fluoro-2'-deoxiuridin (FUdR)
    1. Följ steg 1.3.1.  Förbereda sterila 50 x FUdR lager (se steg 1.3.1.1).
    2. När djur reach L4, tillsätt 25 µL av 50 x FUDR till varje brunn för en 24-brunn tallrik med 6-kanals justerbar-spacing pipett.
  5. Poäng livskraft
    1. Ta bort en uppsättning replikera plattor och översvämma brunnar med M9 lösningen, rekord totalt djur per brunn, och tryck sedan försiktigt på icke-rörliga djur på huvudet med en mask plocka (figur 2B). Djur som misslyckas med att flytta poängsätts som död. Kassera gjorde plattor. Spela in livskraft dagligen.
      Obs: Djur som bristning, Visa brutto morfologiska defekter, underlåtit att utveckla eller kröp upp på sidan av brunnen är censureras genom att utesluta dem från både döda och totala värdena.
      1. Registrera antalet djur som är censurerade inom varje brunn varje tidpunkt separat från övriga värden.
      2. Inte Poäng brunnar som inte har mat eller är förorenade (t.ex. svampen eller slem); sådana brunnar anses censurerade. Också, censurera en väl om alla djur visar morfologiska eller utvecklingsmässiga defekter. Registrera censurerande händelsen för denna RNAi klon per brunn vid denna tidpunkt.
      3. Efter scoring en replikera tallrik, kassera den. Fortsätt scoring en ny replikera ange varje dag tills alla djur över alla brunnar är döda. För att minska risken för scoring bias, försöksledaren måste förbli blind för experimentella förhållanden och på samma sätt måste inte referera till resultaten från tidigare tidpunkter under scoring.
      4. Om alla djur inom en väl var död vid en given tidpunkt, sedan efter dagens scoring, undersöka om alla djur har varit gjorde som död för två på varandra följande tidpunkter för en tanke väl. Om så är fallet, behövs scoring livskraft inte längre för det brunnen i efterföljande tidpunkter.
      5. Genomföra ytterligare oberoende experiment prövningar. Spåra resultatet av successiva prövningar separat från de i tidigare prövningar, med rättegång nummer noteras.

3. diagramdata

Obs: Med replikuppsättningen metoden en kurva passa används för att approximera medelvärde och maximal livslängd. Parametrar för att bedöma C. elegans dödlighet passar en logit kurva19.  Som de flesta överlevnad verktyg inte stöder logit kurva montering, utvecklades ett nytt program för plottning logit kurvor (för replikuppsättningen); Kaplan-Meier-kurvor (för den traditionella metoden) stöds också.

  1. Kom igång med programvaran. Ladda ner release zip-filen för den aktuella versionen (se Avsnittet material). Extrahera zip-filen till en mapp. Finns i ”readme” filen i den extraherade mappen ytterligare installationsanvisningar.
  1. Börja rita gränssnittet. Hitta platsen för katalogen ”kod” i mappen extraherade från zip-filen (t.ex.  ”/ Användare/användarnamn desktopen/WormLife/kod”).
    1. Ange följande kommandon i konsolen R ersätter mappsökvägen bara identifieras. Tryck på Ange eller returnera efter varje rad: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), (2) source("plotGUI.R"), (3) openMain().
    2. Ge tid för gränssnittet att ladda i ett nytt fönster, uppfostra standardskärmen som visas i figur 3A. Låt R som körs i bakgrunden.
  2. Formatera data som kommaavgränsade värden (CSV) eller tabbavgränsade värde (TSV) filer. Ange namn, beroende på typen av analys och kolumner. Se kompletterande fil 4 (replikuppsättning) och kompletterande fil 5 (traditionella/Kaplan-Meier) för förformaterade exempeldata.
    Obs: Data måste anges i en ”lång” format, dvs en rad per stam/behandling per per studie pekar på samtidigt. CSV-filer rekommenderas för bästa kompatibilitet mellan plattformar.
    1. Ta bort rader som motsvarar observationer som hoppas över eller censurerade. Kontrollera frånvaron av saknade eller icke-numeriska värden, eftersom det kan resultera i ett fel när data importeras.
    2. För traditionell Kaplan-Meier-stilanalys inte pool data från oberoende prövningar-plot dem separat. För replikuppsättningen analys, pool data från flera studier och sedan undersöka med hjälp av funktionen ”TrialView” (se 6.3.3.4).
  3. I plotting gränssnittet
    1. Läsa in en datafil (”importera” under menyn ”Arkiv”) med hjälp av dialogrutan. För att öppna ”CSV” filer, ändra filtypen i droppa ned till ”CSV” (Standardvärdet är ”.txt/.tsv”), navigera till mappen med filen. Här är filen replikuppsättning exempeldata (kompletterande fil 4).
      Obs: Importera en fil när en datamängd är redan öppen kommer att ersätta nuvarande datamängden.
    2. Välj en fil att importera om du vill starta guiden Importera, som går genom att identifiera kolumnerna i den markerade filen (Figur S1A för replikuppsättningen). Om indata motsvarar en replikuppsättning experiment, välja ”Logit” för studien.
      Obs: Importera arbetsflödet är olika mellan replikuppsättning (Figur S1A) och traditionella (Kaplan-Meier) (Figur S1B).
    3. ”Rita data”. Välj ”Lägg till rad” att börja rita data. (En linje motsvarar en uppsättning villkor. Det finns funktioner för att hjälpa med experiment där många villkor testades).
      1. Rita den kontroll villkor-när det gäller till exempeldata N2 (WT) med L4440 (tom vektor) RNAi är lämpliga. Välj ”Lägg till rad” under menyn ”diagram” att starta guiden Lägg till raden: Välj villkoret att handlingen och de grafiska parametrarna för att representera linjen.
        1. För att lägga till en kurva för ett annat tillstånd manuellt, upprepa stegen i 3.3.3.1
        2. För att ändra färg eller rita symbol för en linje, markerar du ”ändra raden” under menyn ”diagram”.
        3. Ta bort en linje utan att rensa alla rader, Välj ”Radera rad” under menyn ”diagram”.
        4. Avmarkera alla rader i den aktuella tomten, Välj ”Rensa Line” under menyn ”diagram”.
        5. Om du vill åsidosätta värdet automatiskt valda högsta x-axeln (tid), använda ”Set X scale” under menyn ”diagram”.
          Obs: y-axeln (överlevande fraktion) visar alltid 100% (överst) till 0% (botten) i steg om 20%. X-axeln visas alltid i steg om 5. Axeletiketterna ritas inte att möjliggöra flexibilitet i märkning efter tomt bilder sparas.
      2. Av de för tillfället visas tomten bilder i JPEG-format genom att använda alternativet ”Spara Plot” under ”Arkiv”; endast nuvarande tomten sparas.
      3. För att skapa enskilda tomter för många olika förhållanden i ett experiment, kan programvaran definiera och rita en ”serie”.
        Obs: Genomförandet av konceptet serien förbättrar effektiviteten när du arbetar med stora experiment.
        1. Om du börjar med en tom tomt arbetsyta, lägga till rader som motsvarar de villkor som ska vara konsekvent över alla tomter i serien (se 3.3.3.1) kontroll.
        2. Definiera serien med ”definiera serien” i menyn diagram. Välj ett villkor som motsvarar raden ska visas först i serien; bara en kan väljas. Välj grafiska parametrar (linjesymbol färg och tomt) för raden, liksom 3.3.3.1.
        3. Granska tomterna för de olika förhållandena. Växla visning av raden ”serien” mellan förhållanden med hjälp av pil vänster/höger knapparna på sidorna av fönstret viktigaste tomt samt i övre menyraden (figur 3A-C).
          Obs: Om raden markerade serien är samma skick som en av tidigare extra kontroll/referens linjer, den nya linjen kan visas.
        4. Definiera serien för att göra vissa andra funktioner tillgängliga (Spara serien tomter och Trialview-se 3.3.3.4 för de sistnämnda). Efter definiera en serie, använda alternativet ”Spara serien tomter” från menyn ”Arkiv” för att spara individuella tomt image-filer för varje tomt i serien i en ny mapp.
      4. Trialview – visualisera resultaten från oberoende studier av en replikuppsättning experiment. Om flera prövningar kördes för en eller flera av grupperna prov, rita data från individuella prövningar och poolade data från alla prövningar separat för att utvärdera överensstämmelsen mellan oberoende studier (se figur 3D).
        1. Ställa in en serie som beskrivs i 3.3.3.3. De olika prövningarna ritas för varje ”varierande” prov grupp i en annan bild över respektive prövningar för angivna referens/kontrollprover.
        2. För att spara TrialView bilder, gå till ”Print TrialViews” i menyn Data; en JPEG-bild matas ut för varje tomt i serien.
          Anmärkning: Exempel resultaten i figur 3D är för ett fall med två prövningar.
    4. Median livslängd sammanfattande tabell för replikuppsättningen data. Visuellt inspektera kurvor för att säkerställa rimlig passform av data, och välj sedan den ''sammanfattande tabell ”alternativet i menyn Data att spara en tabell med median livslängd värden (tid på 50% överlevnad på logit kurva) för varje Provtyp.
  4. Statistisk utvärdering av data som genereras via metoden replikuppsättningen
    1. För statistisk analys mellan två grupper från en replikuppsättning experiment, ändra och köra en R skript, som finns i release zip-filen (se ”WormLife statistisk analys template script. R ”).
      Obs: Kunskaper i R krävs inte att köra skriptet. Ytterligare dokumentation finns i kommentarerna i filen. Skriptet är redo för analys av exemplet replikuppsättning data. Användargenererade data i lämpligt format kan (se kompletterande fil 4) också analyseras.
      1. Öppna skriptfilen i R (R GUI eller RStudio).
        Anmärkning: Detta visar skriptet utan att köra den.
      2. Ändra placeringen av nödvändiga filer för att matcha platsen på datorn.
        Obs: Dessa sökvägar måste vara ”fullständigt kvalificerade” (dvs bör inkludera komplett filplatsen, inklusive mappar).
        1. Ändra sökvägarna (fil/mapp platser) för ”wlDir” (platsen för katalogen), ”dataFile” (replikuppsättning datafilen att analysera), ”compFile” (specifikation av jämförelser att köra, om tillämpligt) och ”outputPath” (plats där resultatet filer kommer att skrivas till).
      3. Ange kolumnnamn i avsnittet ”Ange kolumner i datafilen” om kolumnnamn i filen som ska analyseras är olika från exempelfilen. Ange en kolumn för varje parameter. Om en studie har flera stammar, men ingen RNAi (eller annan behandling) inkludera en kolumn i datafilen med tomma poster eller samma för alla rader (e.g. ”no_treatment”, etc.).
      4. Ställa in parametern ”compFile”. Om parametern ”compFile” är inställd till NA, ska då alla möjliga parvisa jämförelser av grupper köras.
        Obs: En grupp definieras genom en kombination av stam/genotyp och behandling, vilket är sammanlänkade och visas som ”strain_treatment”. För större studier med många grupper, kan en CSV-fil anger jämförelser tillhandahållas. Se exempelfilen ”comps_rsm_example.csv”.
      5. Ange antal upprepningar för Monte Carlo omsampling (”k.resamp”, standardvärdet är 1 000).
        Obs: P-värden 0 kan returneras när för få iterationer utförs; i sådana fall är det lämpligt att rapporten ”p < 0,01” (om k.resamp = 100), eller ”p < 0,001” (om k.resamp = 1 000), m.m.
      6. Kör skriptet: ”source”-knappen i RStudio (överst till höger i redigeringsfönstret) eller ”källa dokument” i menyn ”Redigera” i R GUI. (Utförande kan ta lite tid.)
      7. När indikatorn R ”upptagen” inte längre visas, öppna utdata katalog-där blir en tabell med resultaten av varje jämförelse (median överlevnad, p-värden, % median livslängd förändring).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I utvecklingen av någon ny metod är det nödvändigt att den nya metoden recapitulates godkända resultat från tidigare metoder och uppfyller standarden inom ett fält. Vi har tidigare visat empiriskt att den replikuppsättning och traditionella metoder för testmetoder C. elegans livslängd producerar liknande resultat20. Vildtyp C. elegans (N2) upprätthålls vid 20 ° C normalt lever mellan 20 och 25 dagar, som vi observerade med både traditionella (figur 4A, svarta linjen) och replikuppsättning tillvägagångssätt (figur 4B, svart). Båda metoderna ungefärlig således rimligen vildtyp livslängd. Det är också viktigt att en ny metod har upplösningen att exakt kvantifiera förändringar mellan provningsförhållanden och statistiska kraft upptäcka betydande förändringar. I vår tidigare studie upptäckte vi att familjen Myc transkriptionsfaktorer är bestämningsfaktorer av C. elegans livslängd. MML-1 och mxl-2 koda de C. elegans homologs av däggdjur Mondo A / kolhydrat svar element bindande protein (ChREBP) och Mlx, respektive. I både C. elegans och däggdjur, dessa Myc-familjens medlemmar heterodimerize att reglera transkription. Vi hittade att förlust av antingen mml-1 eller mxl-2 avsevärt minskar normala livslängd, mätt genom antingen en traditionell livslängd assay eller replikuppsättning (figur 4A-B, gul och maroon). I motsats till MML-1::MXL-2 komplex hittade vi att förlust av antingen mdl-1 (homolog till däggdjur Mad) eller mxl-1 (Max) ökat betydligt C. elegans livslängd mätt som antingen metod (figur 4 lila och blå, respektive i båda paneler).

En allvarlig begränsning att den traditionella metoden för att mäta livslängd är genomströmning. Båda metoderna är beroende av rörelse att ringa om ett djur är levande eller döda, som blir allt svårare att bedöma. Unga djur kommer att flytta under en platta i avsaknad av stimuli och är därmed lätt att poäng. Åldrande C. elegans blivit alltmer stillasittande men att svara på en lätt beröring på huvudet av en återföring rörelse på en tallrik. Men när djur blir äldre möjligheten att flytta bakåt minskar och blir allt mer okoordinerade. Slutändan djur blivit förlamad, en fenotyp som starkt liknar sarcopeni och när scoring via traditionella metoden livskraft kan endast fastställas genom att observera subtila twitch vid extrema främre spetsen av djuret. När scoring lönsamhet via metoden replikuppsättning, läggs däremot vätskan till brunnen, som fungerar som en stimulans som genererar ett kok stryk-svar som kan kvantifieras som en avläsning av healthspan8. Rörelse i vätskan är lättare att observera för ännu äldre djur: kronologiskt åldersmatchade orkeslös djur producerar subtila huvudrörelser på torra plåtar men en mer uttalad (om än långsam) kroppen böja i vätska. Slutligen, när scoring replikuppsättning, hela brunnen ligger inom synfältet (~1.1 cm i diameter) och alla djur är i suspension - möjliggör observation av alla djur samtidigt. Däremot när scoring en 6 cm tallrik via den traditionella metoden, måste en skanna över hela plattan - söka genom bakteriella gräsmattan och längs kanterna för djur. Netto följden av dessa skillnader är att genomströmningen när du använder metoden replikuppsättningen är minst en storleksordning större än den traditionella metoden, som gör det möjligt att samtidigt kvantifiera förändringar i livslängd över mer än 100 villkor i ett enda experiment med en utredare. Till exempel från en genome-wide utfodring-baserade RNAi skärm vi identifierat tidigare 159 gener som var nödvändiga för den öka livslängden som är knutna till minskade daf-2 /insulin-liknande signalering8. I den analys vi kvantifieras förändringarna i livslängd i vildtyp, en långlivad daf-2(e1370) mutant och kortlivade daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) dubbel muterade djur (figur 5A), som tillät oss att dechiffrera den genetiska relationer mellan insulin-liknande signalering och över 100 progeric gen inactivations. Vidare bedömde vi hur dessa progeric gen inactivations förändrat healthspan (vid den tid som kallas ”activespan”) genom att observera nedgången i C. elegans stryk över replikat över tiden (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: tillkomsten av utfodring baserat RNAi leda till en era av gen upptäckt i åldrande forskning, men de flesta gerogenes förblir dåligt studerade. (A) många gerogenes upptäcktes ursprungligen från storskalig funktionell genomisk skärmar. Av de drygt 900 C. elegans gerogenes upptäckt hittills, identifierades många med hjälp av utfodring-baserade RNAi, belysa värdet av funktionella Tillämpningsinriktad inställning i gen upptäckt. Diagrammet visar antalet gerogenes som upptäckte per manuskript med hjälp av RNAi, baserat på fenotypen annotation (se tabell material) för fenotyp ontologi villkor utökad livslängd, förkortat livslängd och life span variant. Se kompletterande fil 1 för en fullständig förteckning över studier som upptäckte gerogenes. (B) de flesta gerogenes fortfarande dåligt studerade. I motsats till väl studerat gerogenes som daf-16/FOXO (pil), som har mer än 800 referenser, majoriteten av gerogenes har färre än 10 referenser (allmän referens-inte nödvändigtvis fokuserade på livslängd). Tillförlitliga metoder för hög genomströmning kommer att vara viktigt att härleda djupare insikt i de genetiska inbördes relationerna mellan gerogenes. Diagrammet är baserat på mappningar mellan publikationer i PubMed och den C.elegans gerogenes upptäckte från RNAi fenotyper. Se kompletterande fil 2 för fullständig förteckning över gerogenes och antal studier som är associerade med varje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Traditionella och replika ange metoden för scoring C.elegans livslängd (A). Den traditionella metoden för poängsättning C. elegans livslängd. Flera små synkroniserade populationer av syngena djur per tillstånd följs över tiden. Samma population av djur följs under hela studien. Lönsamhet bedöms av rörelse, som kan stimuleras av mild prodding. Djur som misslyckas med att flytta poängsätts som död och är borttagna (aspiration visas) tills inga livskraftiga djur återstår. (B). The replika ange metod för poängsättning C. elegans livslängd. En stor population av ålder-synkroniserad syngena djur fördelas över ett antal identiska replikera plåtar. Vid varje tidpunkt, en enda replikera poängsätts: mild buffertlösning (M9) läggs, som stimulerar till rörelse. Djur som misslyckas med att flytta spontant efter översvämningar brunnar bedöms också touch stimulans. Scoring varaktighet för experimentet bestäms före start. Varje djur görs endast en gång och lång livslängd för den största befolkningen härstammar från många oberoende observationer. (C). The replikuppsättning strategi är en hög genomströmning metod att kvantitativt mäta C. elegans livslängd. 100 eller fler oberoende RNAi kloner kan spåras samtidigt. HT115 E. coli uttrycker dsRNA för en given RNAi-klon visas. Praktiskt, är varje 24 prov från plattan med 96 brunnar uppdelade i en enda 24-väl plåt. Varje resulterande 24-well platta har en negativ (dvs tom vektor, red väl) och positiv kontroll (grön väl) fördelas slumpmässigt inom en samling av RNAi kloner (gula brunnarna). Den första brunnen (A1) i en samling innehåller normalt en tom vektor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: det grafiska användargränssnittet (GUI). (A). viktigaste tomt fönster gränssnittet visar standard välkomstskärmen. Detta är vad som visas när du öppnar programvaran. Skillnader i utseendet mellan plattformar bör vara minimal på grund av användning av en plattformsoberoende windowing toolkit. (B). översikt över menyalternativ, för nedrullningsbara menyerna tillgänglig från fönstret viktigaste tomt. (C). exempel tomt utdata för båda replikuppsättning stil (vänster) och traditionell Kaplan-Meier stil (höger) data. Data som visas samlades i oberoende experiment. Exporterade tomter ingår inte pre plottade axeletiketter, för maximal flexibilitet i att lägga sådana etiketter. För att underlätta detta, är axlarna alltid indelade i steg om 20% för y-axeln, och steg 5 för x-axeln. I det här exemplet har axis och linje etiketter (stam/behandling) lagts till de sparade tomter, med en mycket enkel och gemensamma bildredigeringsverktyg. (D). ett exempel på utdata från funktionen ”TrialView”, vilket möjliggör den visuella jämförelsen mellan resultaten av oberoende studier för replikuppsättningen stil datamängder. Denna handling visar resultatet mellan två olika prövningar och motsvarande poolade resultat för daf-2 EV(RNAi) (blå, slutna cirklar), N2 EV (RNAi) (svart, slutna cirklar) och daf-2 med daf-16 (RNAi) (röd, öppna diamanter). TrialView tillåter för att snabbt kontrollera för rättegång-specifika dataproblem som kan påverka kvaliteten på den sammanslagna datan passform. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: den traditionella och replikuppsättning metoder ge liknande resultat. Förlust av någon komponent av den MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) heterodimer ökar livslängden. I kontrast, förlust av någon komponent av MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) minskar livslängden denna siffra är omtryckt från referens20 med tillstånd via en Creative Commons Erkännande (CC BY) licens (se material). (A). Kaplan-Meier resultat med den traditionella metoden. (B). Logit kurvanpassning med metoden replikuppsättning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Replikuppsättningen metod kan dechiffrera genetisk interaktion utifrån förändringar i livslängd (A) och förändringar i healthspan (B) för över 100 RNAi kloner samtidigt. Denna siffra är omtryckt från8 med tillstånd enligt licensen Creative Commons Erkännande-Icke-kommersiell 4.0 International (CC-av-NC) (se material). (A) genetiska livslängd analys av progeric gen inactivations i samband med minskad insulin-liknande signalering (ILS) (daf-2, x-axeln) och i avsaknad av daf-16/FoxO (y-axeln), en central transkriptionell effektor ILS21 . Gen inactivations med liknande funktioner som daf-16 inte ytterligare förkorta livslängden i avsaknad av daf-16 (svarta prickar). Gen inactivations med funktioner som är helt oberoende från daf-16 förkorta både genetiska bakgrunder likaså (grå). Gen inactivations där negationen effekt på livslängden i daf-2 > daf-2; daf-16, föreslår funktion parallellt (vit). (B) stryk-förändringar över tid kan härleda de genomsnittliga healthspan för många genetiska störningar (x-axeln) medan bedömningen av förändringar i livslängd (y-axeln). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur S1: arbetsflöden i WormLife. Illustration av stegen i några guidade arbetsflöden (som ibland kallas ”guider”). I varje enskilt fall, efter det sista steget i arbetsflödet, returneras fokus tillbaka till fönstret viktigaste tomt. (A) data importera arbetsflödet för replikuppsättningen stil datamängder (B) data importera arbetsflödet för traditionell Kaplan Meier stil datamängder. (C) arbetsflödet för att lägga till rader till en tomt för replikuppsättningen stil datamängder. (D) arbetsflödet för att lägga till rader till en tomt för traditionell Kaplan Meier stil datamängder. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 1: studier har identifierat gerogenes. Tillkomsten av utfodring-baserade RNAi ledde till en era av gen upptäckt för fenotyper som inte var eftertraktansvärda av framåt genetik, inklusive åldrande. Anges, är i storleksordningen numret av gerogenes upptäckte, oberoende studier som identifierat gener vars verksamhet ändras livslängd. Observera att den studie som identifierats mest gerogenes utnyttjas den replikera set metod8. Arten av hur genen inactivations ändras livslängd är också indicerat: livslängd och progeric gener är de som ökad eller minskad livslängd när inaktiverat, respektive. ”Livslängd variant” hänvisar till fall där riktningen på förändring (dvs ökas eller minskas livslängden) angavs inte eller har inte varit curator. Data från WormBase WS262 (januari 2018) (se material), med tillägg av RNAi-behandling livslängd resultat från referens10, som inte ännu ingår i samlingen curerad av WormBase RNAi fenotyper. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 2: antalet studier är associerad med varje gerogene. De flesta gerogenes är dåligt studerat. Medan vissa gener, som daf-16/FoxO, har varit föremål för mycket forskning uppmärksamhet, har mer än 400 gerogenes färre än 10 associerade publikationer. Data från WormBase WS262 (januari 2018), med tillägg av RNAi-behandling livslängd resultat från10 som inte ännu ingår i samlingen curerad av WormBase RNAi fenotyper. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 3: utarbetande av gemensamma reagenser för C. elegans experiment. (A). recept för standard NGM och RNAi plattor. (B). recept på M9 buffert och hypoklorit lösning. (C). förberedelse av LB + Amp/Tet plattor. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 4: replikuppsättning exempeldata. En exempel datamängd från en replikuppsättning livslängd experiment. Den här datamängden är redan formaterad för att vara lämplig för import/analys. Innehåller två prövningar per tillstånd (kombination av stam/genotyp och RNAi). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 5: traditionella längsgående exempeldata. En exempel datamängd från en traditionell längsgående livslängd experiment, med rätt-censurera, formaterad för redo import/analys med Kaplan-Meier överlevnad tomt funktionalitet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Både traditionella och replika set metoder kräver synkronisering av kronologiskt äldre djur. Vi har en metod som synkroniserar djur med hypoklorit behandling av dräktig vuxna, där endast befruktade ägg med den dräktiga vuxen överleva behandling. Dessa embryon kläcks i flytande suspension och utvecklingsmässigt arrestera på den första larvstadium (L1). Efter sådd L1 djur till mat (t.ex. E. coli uttrycker dsRNA till en gen av intresse), återuppta djur utveckling. Synkronisera L1 djur av hypoklorit behandling av dräktig vuxna har fördelen att överblivna unseeded L1 djuren kan frysas och sparas på obestämd tid i flytande kväve eller en-80 ° C frys. På detta sätt bevaras ett prov av varje stam vid tidpunkten för den experimentella setup, att skapa en värdefull resurs för framtida studier och förbättra reproducerbarhet. Men medan hypoklorit behandling av dräktig vuxna djur är ett vanligt sätt att få synkroniserade djur för åldrande forskning22, är L1 gripandet svält svar. Alltså, vissa laboratorier föredrar antingen att tillåta kläckning att uppstå på tallrikar, eller att avstå från hypoklorit behandling alldeles och tillåta några dräktig vuxna att lägga ägg i flera timmar (dvs. ett ägg låg). I det senare fallet, föräldrarna tas bort och avkomman livslängden följs. Till bäst av vår kunskap, har inga uppenbara skillnader i livslängd rapporterats mellan djur som synkroniserades i M9, kläckts på tallrikar eller avkomman från ett ägg lay. Med tanke på att förändringar i näringsämnen tillgängligheten är nära kopplade till förändringar i livslängd, finns det dock företräde att specifika genetiska bakgrunder kan producera olika utfall mellan dessa synkronisering synsätt. En mer noggrann analys krävs för att lösa denna teoretiska oro.

Oavsett vilken metod som används för att synkronisera start befolkningen, måste åtgärder vidtas för att antingen hindra avkomma produktion eller att separera synkroniserad start befolkningen från framtida avkomma. I våra protokoll, vi redogöra för hur du använder FUdR för att förhindra avkomma produktion, som separera djur är inte ett hållbart alternativ för den replikuppsättning metod. Det är också möjligt att förhindra avkomma produktion genetiskt med hjälp av en feminiserade genetisk bakgrund (t.ex. fer-15(b26);fem-1(hc17), som är en temperatur-anhörigen sterila stam23). Men varken är utan brister: användning av genetiska bakgrunder kan komplicera efterföljande analys, och i vissa genetiska bakgrunder FUdR kan ändra livslängd24,25,26.

Som ett alternativ till att förhindra avkomma innebär produktion genom kemiska eller genetiska, vuxna djur kan flyttas regelbundet till färska RNAi plattor att isolera dem från deras avkomma. Detta förenklar bakgrund överväganden på bekostnad av genomströmning. Periodvis flytta djuren till färska livsmedel har ytterligare fördelar för att förebygga möjliga svält och förnya exponering för dsRNA. Vissa genetiska interaktioner som påverkar livslängden upptäcktes dock endast när avkomman produktionen hämmades: tidig analys av TGFβ väg för en livslängd fenotyp felaktigt slutsatsen att minskad TGFβ signalering påverkat C. elegans dauer bildandet men inte åldrande27,28. En uppföljning studie som använde FUdR visade emellertid minskade TGFβ signalering ökad livslängd genom insulin signalering29. Varför misslyckades tidigare studier att se ökad livslängd i TGFβ muterade djur? TGFβ väg mutationer producerar en svag äggläggning defekt (egl) och förlänga reproduktiv livslängd, vilket orsakar inre kläckning av avkomma senare i livet som dödar föräldern. Det är troligt att de långlivade TGFβ muterade djur verkade ha en normal livslängd på grund av egl fenotypen dödade djuren runt den tid när vilda djur normalt dör. Detta kan vara relevant för andra genetiska vägar kopplade till DR, som utsvultna vildtyp djur också manifestera en egl fenotyp, kanske som en adaptiv överlevnadsfördel till avkomma under förhållanden av låg mat. Detta belyser de underliggande komplexiteten i adaptiv Svaren djur genomgå under stress förhållanden, och behovet av noggrann analys och behandling när man utformar livslängd experiment.

Utforma och genomföra livslängd experiment av endera metoden är det viktigt att undvika partiskhet. Experiment måste genomföras på en dubbel-blind sätt: hur prover var tidigare gjorde vid tidigare tidpunkter och en Testvillkor identitet måste vara okänd för experimenter. Dessutom är det alltid nödvändigt att inkludera både positiva och negativa kontroller. När det gäller metoden set för replika infogas dessa slumpmässigt i en 24-bra platta. E. coli uttrycker en plasmid som inte innehåller ett skär med sekvensen är motsvarar den C. elegans genomet den tom vektor negativa kontrollen (dvs ”L4440”-se material). Positiva kontroller är beroende av den särskilda karaktären hos ett experiment. Exempelvis daf-2 kodar C. elegans insulin/IGF-1 receptorn och daf-2 inaktivering via utfodring-baserade RNAi ökar kraftfullt livslängd minst två gånger i vilda djur27. Således kan daf-2(RNAi) tjäna som en positiv kontroll när du letar genen inactivations som ökar livslängden. Omvänt, daf-16 kodar FOXO transkription faktorn orthologue30. DAF-16 är en viktig komponent i många livslängd paradigm och vilda djur (N2) som behandlats med daf-16(RNAi) är kortlivade och visar tecken på progeri31.

De främsta fördelarna med metoden traditionella längsgående livslängd är att det är mycket väl etablerad, och experiment är lätt att ställa in. Relativt få djur behövs på bara några plattor för varje Testvillkor. Således, stammar som växer dåligt eller kräver Balanserare sprids kan enkelt testas. Den traditionella metoden är mycket anpassningsbar och kan användas med någon av de tillgängliga metoderna för hantering av avkomman produktion, inklusive behandling med FUdR, passerar in en feminiserade genetiska bakgrunden eller periodvis flyttar vuxna djur till nya plattor under perioden äggläggningen. Flytta djur kraftigt minskar genomströmningen, arbeta med en mutant bakgrund är aldrig perfekt, och även om FUdR inte förändrar vildtyp livslängd32,33,34, det kan påverka livslängden och ålder relaterade fenotyper i vissa genetiska bakgrunder35,25,26. Observera att förekomsten av män, även med användning av FUdR, kommer att avsevärt förkorta hermafrodit livslängd13, således en platta som innehöll hanar efter hermafroditer nått L4 är oanvändbar. Likaså är analys genom Kaplan-Meier estimator och associerade kurvor och de log-rank-testet, väl etablerad för data om dödligheten. Dock finns det flera nackdelar till traditionella livslängd analysen. Upprepad hantering av plåtar (dvs utsätta plattorna till luft) underlättar införandet av luftburna svamp kontaminering. Dessutom upprepade peta kan skada eller döda djur, särskilt som befolkningen förskott i ålder och blir sköra. Äldre djur blivit i hög grad förlamade och sitter fast i E. coli, medan E. coli blir en opportunistisk patogen (kolonisera lumen och packning svalget)36. Mycket gamla levande djur kan endast identifieras genom subtila huvudrörelser. Det är således lätt att klassificera ett orkeslöst levande djur som döda. Slutligen, den traditionella metoden begränsas av genomströmning.

Metoden replikuppsättningen är hög genomströmning och kvantitativa. Nackdelen med denna metod är dock en större investering av tid och resurser i den ursprungliga uppsättningen upp. Ett måttligt stora experiment för att undersöka 100 RNAi kloner över 20 punkter kräver 30.000 L1 djur (där cirka 15 djur undersöks per RNAi klon per tidpunkt), som visserligen lätt för de flesta stammar, kan vara problematiska i vissa fall. Till exempel utan en stor-partikel sorterare (”mask sorterare”) stammar som måste upprätthållas med Balanserare eller transgena linjerna bär kan inte en dåligt överförda extra kromosomala matris enkelt granskas av denna metod. Andra nackdelen är att avkomman produktion måste hämmas, vilket kräver användning av FUdR eller en feminiserade genetiska bakgrund. Slutligen måste man veta hur lång tid analysen kommer att köras, som man måste förbereda en replikuppsättningen för varje tidpunkt i början av experimentet. Fördelarna med denna metod är dock många. Främst, scoring livskraft är mycket snabbare och man kan enkelt följa djur över 100 provningsvillkor samtidigt (dvs RNAi kloner). Eftersom en replikuppsättning är endast gjorde en gång och sedan kasseras, det finns ingen upprepad hantering av plattor eller peta av djur, vilket minimerar risken för svamp kontaminering och eliminerar dödligheten orsakas av en tillfällig grov petade med en mask plocka. Dessutom underlättar tillägg av vätska till brunnen avsevärt scoring. Att frigöra gamla djur från plattan och omgivande bakterier hjälper att låta subtila huvudrörelser som lättare skall poängsättas. Tillsats av vätska ger också möjlighet att mäta thrashing priser som ett mått på fitness (t.ex. healthspan8,37).

Åldrande är ett komplext fenomen som involverar flera kausala mekanismer som kräver användning av system biologiska metoder att nysta upp. Dessa metoder ofta införliva datadriven modellering, med hjälp av stora datavolymer genomisk/transcriptomic, och kräver kompletterande robust och hög genomströmning metoder att mäta livslängd och healthspan. Metoden replikuppsättning hög genomströmning kommer att möjliggöra jämförelse av många RNAi kloner längdriktningen, samtidigt minimera batch effekter och tekniska fel, vilket underlättar utvecklingen av dynamiska modeller som kan härleda interaktioner mellan kausala vägar i ett kvantitativt sätt. Dessutom, är integration av flera genome-wide genomik metoder med metoden replikuppsättningen genomförbart eftersom en stor population av ålder-synkroniserad djur är uppdelad i ett antal små populationer.

Andra metoder har utvecklats tidigare för att förbättra genomströmning av C. elegans livslängd experiment, ofta med fokus på anpassning av den traditionella längsgående metoden (dvs. efter samma uppsättning djur över tiden) automatiserat observation och inspelning med vanliga flatbädd skannrar38,39eller mer specialiserad utrustning såsom mikroflödessystem plattor40. Scanner-baserade metoder använda ljus som stimulans och jämföra sekventiellt tagna bilder för att avgöra alive/dead status baserat på rörelse för flera plattor på en gång; medan sådana tillvägagångssätt inte kräver proprietär vetenskaplig hårdvara, kan tiden involverade i ställa in arbetsflöden vara betydande beroende på önskad skalning. Alternativt, livslängd experiment i anpassade mikroflödessystem enheter möjliggör djupgående fenotypisk karakterisering av enskilda djur över tid, och utan behandling för att förhindra avkomma, men kräver tillverkning av mikrofabricerade tallrikar och förvärv associerade mikroflödessystem pumpar och bildbehandlingsutrustning. Däremot kan den replikuppsättning metoden, i kombination med programvaran som beskrivs här, kraftigt förbättrad genomströmning med de verktyg som redan är vanligt i laboratorier som arbetar med C. elegans.

WormLife programvaran kommer att förbättras i framtiden för att erbjuda enklare tillgång till statistiska jämförelser och kompatibilitet med ytterligare plattformar. Den senaste dokumentationen för programvaran kan hittas på GitHub sidan, inklusive Installationsinstruktioner för plattformar som programvaran har testats. En webbaserad version kommer också att utvecklas för att möjliggöra bekväm åtkomst utan att behöva installera någon programvara.

Sammanfattningsvis ger kombinationen av metoden replikuppsättningen och fritt tillgänglig programvara beskrivs här en kraftfull plattform för att förbättra genomströmning och robusthet av livslängd experiment och ett brett spektrum av överlevnad-baserade analyser (t.ex. betona tolerans, toxikologiska studier, healthspan, etc.). Synnerhet i kombination med funktionell genomik, utnyttjar denna metod de många fördelarna med metazoan modell systemet C. elegans för att dechiffrera myriaden av genetiska interaktioner som bidrar till utvecklingen av åldrande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Medel för detta arbete som beskrivs i detta manuskript kom från: University of Rochester kontoret av The Provost och av skolamedicinen och tandvård Utbildningskansliet via Health Sciences Center för Computational Innovation (HSCCI); Ellison medicinska stiftelsen nya lärda i åldrande Fellowship (AG-NS-0681-10) finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395, (6705), 854 (1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2, (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579, (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14, (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21, (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8, (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51, (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343, (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103, (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910, (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50, (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14, (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A, (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10, (4), e1004278 (2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389, (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1, (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132, (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9, (1), e85964 (2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131, (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17, (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41, (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278, (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12, (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13, (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34, (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46, (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10, (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12, (3), 398-409 (2013).
Den replika Set-metoden: En hög genomströmning strategi att kvantitativt mäta <em>Caenorhabditis elegans</em> livslängd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter