Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

Summary

Burada biz yineleme kümesi yöntemi, bir yaklaşım kantitatif ölçmek C. elegans ömrü/hayatta kalma ve healthspan yüksek üretilen iş ve sağlam bir şekilde böylece veri kalite ödün vermeden birçok koşullar tarama izin tanımlamak. Bu iletişim kuralı strateji detayları ve yineleme kümesi veri çözümlemesi için bir yazılım aracı sağlar.

Abstract

Yineleme kümesi yöntemi kantitatif ömrü veya Caenorhabditis elegans nematodlar yaşama böylece ekran üzerinde aynı miktarda daha fazla tedaviler veya koşullar için tek bir dedektif sağlayan bir yüksek-den geçerek şekilde ölçmek için bir yaklaşımdır zaman veri kalite kaybı olmadan. Yöntem ortak ekipman C. elegans ile çalışan çoğu laboratuarlarında bulundu gerektirir ve böylece benimsemeye basittir. Yaklaşım, her bir gözlem noktada bir nüfusun bağımsız örnekleri yerine tek bir örnek zaman içinde geleneksel boyuna yöntemleriyle raporlaması merkezleri. Çok iyi bir tabak wells için sıvı ekleyerek gerektirdiği Puanlama, hangi taşımak için C. elegans uyarır ve sayısal healthspan değişimler kolaylaştırır. Yineleme kümesi yöntemi diğer önemli faydaları azaltılmış teshir edilmesi hava kirleticileri (Örneğin kalıp veya mantar), agar yüzeylere dahil en az hayvan ve sağlamlık sporadik (hala olduğunda bir hayvan ölü arama gibi yanlış Puanlama için işleme hayatta). Uygun şekilde çözümlemek ve bir yineleme kümesi stili deney verileri görselleştirmek için özel yazılım aracı da geliştirilmiştir. Geçerli yazılım yineleme kümesi için her iki yineleme kümesi ve geleneksel (Kaplan-Meier) deneyler yanı sıra için istatistiksel analiz hayatta kalma eğrileri komplo becerisi. Burada sağlanan protokoller karşılık gelen veri analizi genel bakış yanı sıra geleneksel deneysel yaklaşım ve yineleme kümesi yöntemi açıklanmaktadır.

Introduction

Bir yaşlanma genetik temeli anlama doğru en dönüştürücü teknolojik gelişmeler besleme tabanlı RNAi C. elegans¹belirlendi; RNAi deneysel kullanılmadan önce birçok fenotipleri yaşlanma genetik olarak uysal değildi. Besleme tabanlı RNAi dsRNA E. coli eşleşen içinde üretim ile elde bir endojen C. elegans mRNA: IPTG ya C. elegans cDNA bir ekleme veya bir kısmı arasında çift yönlü transkripsiyon indükler bir Açık okuma çerçevesi içinde bir plazmid². C. elegans üzerine sağlam beslerken bakteriler tarafından üretilen E. coli, dsRNA SID-2 transmembran protein³üzerinden bağırsak hücreleri içine lümen taşınan ve hayvan SID-1⁴üzerinden kalan dağıtılmış. Her hücre içinde eksojen dsRNA karmaşık Dicer tarafından siRNA, hangi yeni bir oluşturmak için tamamlayıcı baz eşleşmesi yoluyla bir olgun mRNA ile etkileşim işlenir siRNA-mRNA dubleks. Bu çift yönlü RISC kompleksi tarafından tanınan ve böylece i ciddi endojen mRNA⁵aşağılayıcı. Böylece, sadece plazmid Ekle değiştirilirse tarafından bir C. elegans genom içinde neredeyse herhangi bir gen işlevini devre dışı. Kütüphaneler-koleksiyonları kapsamında yaklaşık %86 ulaşmak için bir araya getirilebilen E. coli stokları dönüştürülmüş birkaç büyük besleme tabanlı RNAi yol açtı bu keşif C. elegans genler^6, bilinen ⁷.

Besleme tabanlı RNAi ilerlemesi beri biz bakın (WormBase içinde küratörlüğünü RNAi fenotip dernekler tarafından kanıtlanan) inaktive zaman ömrü alter 900'den fazla gen keşfi için kapsamlı filtrelerinde de C. elegans açmıştır için gerogenes olarak. Bir rol gerogenes uzun ömürlü denetimindeki çoğunluğu için besleme tabanlı RNAi sadece birkaç seminal raporları ile keşfedilmiştir ( Şekil 1A ve ek dosya 1 Ayrıntılar için bakınız). Bazı durumlarda, bu gerogenes ömrü içinde değişimin ölçülebilir bir ölçü RNAi tedavi ile sağlamak için başarısız canlılığı tek bir veya birkaç zaman puan, ölçme üzerinde dayalı tespit edilmiştir. Diğer durumlarda, bu genlerin kantitatif değişikliklerin ömrü yanı sıra ek yaş ilişkili fenotipleri değerlendirildi. Örneğin, daha önce azalmış insülin/IGF-1 sinyal ile hayvanların normal ve artan ömrü için gerekliydi ve healthspan değişiklikleri sayılabilir 159 genlerin tanımlanmış. Bir veya daha fazla erken yaşlanma⁸ayetlerine neden olarak bu progeric bir fenotip içinde 103 gen inactivations kaynaklanır.

Bazı gerogenes 100 veya daha fazla çalışmaları ile (Örneğin daf-16, daf-2, efendim-2.1) ilişkili olan, 400'den fazla gerogenes 10 veya daha az alıntılar (Şekil 1Bve ek dosya 2) vardır. Kapsamlı besleme tabanlı RNAi ekranların vardır keşfetti ve cursorily sözde gerogenes yüzlerce ile karakterize, böylece, nasıl uzun ömürlü denetimindeki Bu genler işlevi ve bu gen ürünleri arasında genetik karşılıklı ilişkileri kötü kalır okudu. Tam boyuna analiz için yaş ilişkili fenotipleri gerogenes (Örneğin epistatic etkileşimleri, asynthetic etkileşimleri, vb) arasındaki genetik etkileşimler tanımlamak için bir önkoşuldur. Gerogenes arasında genetik karşılıklı ilişkileri daha derin bir anlayış kazanıyor Ayrıca besleme tabanlı RNAi avantajları güçlendirir bir yüksek-den geçerek nicel yöntemi gerektirir.

En yaygın vekil yaşlanma ömrü ölçüsüdür. C. elegans mortalite ölçmek için geleneksel yaklaşım bireysel hayvan ölümleri küçük grup örneğinin içinde zamanla izler. Hayvanlar nispeten az sayıda zaman içinde takip edilmektedir ve düzenli aralıklarla yavaşça bir platin tel veya kirpik, canlılık (Şekil 2A) bir göstergesi olarak hareketi ile prodded. Ortalama ve maksimum ömrü basit, doğrudan ölçümleri sağladığından bu yöntemi yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bu geleneksel hangi hayvanlar ve aynı anda denetimli bir biçimde ölçülebilir koşulları sayısını sınırlar zaman alıcı ve nispeten düşük verimlilik, bir yöntemdir. Son bir simülasyon çalışması birçok C. elegans ömrü çalışmalar hayvanlar güvenilir koşullar⁹arasında küçük değişiklikler tespit edebilmek için yeterince büyük bir dizi tahlil değil bulundu. Ayrıca, bu geleneksel Yöntem art arda hayvanların aynı kohort hangi sırayla kirlenme, tanıtmak ve zarar verebilir veya giderek kırılgan, yaşlı hayvan öldürmek zaman içinde işleme içerir.

C. elegans ömrü ölçmek için bir alternatif "kopya kümesi" yöntem geliştirdik. Bu amaçla, Yaş senkronize, isogenic hayvanların büyük bir nüfus küçük nüfus (veya yinelemeler) bir dizi halinde ayrılır. Yeterli yineleme örnekleri her zaman noktası planlı deneyinde kapsayacak şekilde oluşturulur. Her gözlem zamanda noktada yinelemelerden herhangi birini yaşayan ölü sayısı için attı ve sansürlü hayvanlar, sonra hayvanlar bu çoğaltma içinde atılır. Böylece, beklenen yaşam süresi bir bütün olarak bir dizi bağımsız altgrupları nüfusunun çoğu düzenli olarak bitti (Şekil 2B) örneklenmiş. Çoğaltma kümeleri kullanarak işte hiçbir yinelenen dürtmeye hayvan ve potansiyel çevresel kirlenme yok tekrarlanan maruz kalma. Tek seferlik noktada gözlenen canlılık işleme en aza indirir ve en az bir büyüklük tarafından üretilen iş artırır her diğer gözlem, tamamen bağımsızdır. Bu bize RNAi yüzlerce aynı anda^8,10klonlar için değişiklikleri ömrü içinde quantitate izin verdi.

C. elegans ömrü yineleme kümesi ve C. elegans uzun ömürlü Puanlama için geleneksel yöntemler üzerinden yürütmek için detaylı protokolleri mevcut burada. Benzer sonuçlar yöntemleri arasında elde edilen göstermektedir. Biz özgürce bir GPL V3 lisansı (bkz: tablo malzemelerin) sağlamak ya da bir yaklaşımla oluşturulan ömrü verilerin grafik çözümlemesini yardımcı olmak üzere geliştirilen yazılım var. "WormLife" R¹¹' de yazılan ve Mac OS ve Linux test verileri çizmek için bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içerir. Son olarak, biz karşılaştırmak ve her yöntemi sınırlamaları kontrast ve C. elegans ömrü içinde nicel değişiklikleri ölçmek için yaklaşımlar arasında seçim yaparken dikkat edilmesi gereken diğer noktalar vurgulayın.

Protocol

1. geleneksel yöntem Puanlama C. elegans uzun ömür için

1. Reaktifler hazırlanması
   1. Genler besleme tabanlı RNAi yolu ile inaktive tanımlayın. RNAi klon ilgi içeren HT115 E. coli² dönüştürülmüş hisse senetleri satın almak. Alternatif olarak, faiz gen cDNA L4440 plazmid multicloning siteye subclone.
      Not: HT115 dsRNA bakteri içinde bozulma önlemek için kullanılan IPTG-indüklenebilir T7 polimeraz aktivite ile bir RNase III-eksik E. coli yük olduğunu. Besleme tabanlı RNAi kullanmayın ömrü çalışmalar için ya HT115 ya da standart NGM plakaları OP50 E. coli -ebilmek var olmak kullanılmış.
   2. 3 – 6 (veya daha fazla) 6 cm RNAi plakaları sınama koşulu (ek dosya 3 tarifi için) başına hazırlayın. Birkaç ay için bakteri ile tohum önce RNAi plakaları 4 ° C'de depolayın.
   3. Dönüştürülmüş E. coli gecede (16 – 20 h, 37 ° C 180-220 devir / dakikada kuluçka sallayarak) büyümek.
      Not: HT115 E. coli ampisilin (50 mg/mL) ile LB içinde büyüdü. Standart OP50 E. coli antibiyotik dirençli değildir ve Obama büyüyor. Kültür birim bağlıdır tabak #'ta, ama genellikle LB, deneysel tasarımına bağlı olarak 8 ve 100 mL arasında.
      1. Bakteriler tarafından Santrifüjü 3000 x g için 15-20 dk benchtop santrifüj, konsantre ol. Süpernatant Aspire edin ve pelet 1'de yeniden askıya alma/10 başlangıç ses (yani 10 x) LB ampisilin HT115 için (veya ampisilin için standart OP50 olmadan) ile içinde.
      2. Aliquot 200 µL 10 x bakteri her 6 cm tabak için konsantre. 3-4 çoğaltır sınama koşulu ile kirlenme durumunda kullanılmak üzere 2 ekstra yedek tabak başı hazırlayın. Tahlil Puanlama deneyci bir renk kodu ya da benzer kodlama düzeni kullanarak deneysel koşullar için kör bu yüzden plakaları hazırlanırken, onları etiket. Kod kaydedildiğinden emin.
      3. Laminar akış tezgah gibi temiz bir ortamda tüm sıvı absorbe olmuştur kadar kuru veya kapalı plakaları bankta gecede kuru izin vermek açık plakaları izin. Tabak aşırı kurutma olmadan agar kuru olduğundan emin olmak için kurutma ederken izlemek.
         Not: tabakları aşırı kurutma agar agar yuva C. elegans neden olur çatlama yol açar. Islak agar yüzeyler de tavşan çukuru tanıtmak.
   4. Kurutulmuş plakaları indüksiyon dsRNA üretim izin vermek için oda sıcaklığında gecede (en fazla 24 s) bir solucan kutusundaki depolar. RT, 1 gün sonra plakaları 4 ° C'de 2 haftaya kadar (tabak kurumasını önlemek için) kapalı zip kilit çanta saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığında yoğunlaşma üzerinden hava mantar kirleticileri tanıtımı önlemek için zip kilit torba içinde plakaları dönün.
2. C. elegans eşitlenmesi hipoklorit tedavi ile
   Not: Ek dosya 3 M9 ve hipoklorit çözüm yemek tarifleri için bkz.
   1. Gravid Yetişkin hayvanlar M9 ile toplamak. Takılı Cam Pipet 2 x 15 mL tüpler için taşımak için kullanın.
   2. Tüpler için 30"~ 2.000 devirde spin. Nematodlar tüpün dibinde, bir havuz olup olmadığını denetleyin. Süpernatant Aspire edin. İki kez spin ve aspirasyon yinelenen M9 çözüm ile yıkayın.
   3. C. elegans 4 mL M9 yeniden askıya alma. 2 mL hipoklorit çözeltisi ekleyin. Girdap periyodik dinç sallayarak ile ~ 3 dakika, hemen. 3 dakika sonra yumurta diseksiyon mikroskop altında bir bulut bakın. Eğer yumurta 3 dk sonra serbest bırakılmamıştır girdap ilave 10-20 s.
      Not: hipoklorit tedavi zamanlama önemlidir. Ne tedavi hayatta gravid yetişkin içinde yumurtalar. ~ 3 dakika sonra gravid yetişkin açık break ve yumurta dışarı dökülme. Ancak, Eğer yumurta hipoklorit çözümde uzun yayımlanmasından sonra onlar ölecek. Gravid yetişkin hipoklorit çözümde yeterince uzun bırakılmış değil, tersine, yumurta yok çıkacak.
   4. Hızlı bir şekilde iki kez olduğu gibi adım 2.1.2 M9 çözüm ile yıkayın.
   5. C. elegans yumurta Pelet 3 mL M9 ve yeni bir 15 mL tüp transferi yeniden askıya alma. Gecede M9 çözüm döndürme 20 ° C'de 3 mL içinde yumurtadan embriyo izin
   6. L1 çözüm 3 10 µL bırakarak µL L1 hayvanlar (veya embriyo) yoğunluğunu hesaplamak x 6 cm tabak ve sayısı L1s/µL ortalama sayısını hesaplamak için L1 hayvan sayısı.
      Not: L1 hayvanlar zamanla razı olacak. Bu nedenle, L1 çözümleri düzenli olarak karışık.
   7. Plaka başına tohum 50 L1 hayvanlar. Tabak ters çevir ve bir lastik bant ile mühür. Plakalar Plastik solucan kutuya koyun. Bir büyük zip kilit çanta kutusunda kapatın. 20 ° C kuluçka taşıyın.
3. Buna ek olarak 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) tarafından Döl üretim önleme
   1. 20 ° C'de L4 sahne kadar hayvan büyümek Hayvanlar için L4 geliştirdik senkronize olup olmadığını görmek için kontrol (adım 2.1.7) tohum sonra yaklaşık 40 h.
      Not:¹² ve büyüme oranları mutant hayvanlar için oranları değil karakterize ampirik olarak test edilmesi gereken farklı sıcaklıklardaC. elegans gelişim süresi değişir.
      1. 50 160 µL eklemek için her 6 cm tabak L4 hayvanlarla x FUdR.
         Not: FUdR L4 aşamada eklemek için önemlidir. Kolaylık sağlamak için FUdR 1000 x stokları 1 g FUdR 10 mL içine çözülerek 0.2 µm filtre ve bir 10 cc şırınga ile ultrasaf H₂O. filtre sterilize etmek stok FUdR olun. Aliquot ~ 1 mL steril 1,5 mL tüpler içine stokunun. Donma ve -20 ° C'de depolayın
   2. Kaplamalar, Erkek varlığı için kontrol C. elegans. Tüm erkekler kaldırın.
      Not: ömrü genellikle ölçülen Hünsa ve değil erkekler için. Dostum Hünsa eşleşmemiş hayvanlar, FUdR¹³varlığında bile daha kısa yaşamak. Erkekler daha küçük ve daha ince sonra Hünsa ve kolayca ayırt edici çengel kuyruk¹⁴tarafından tespit edilebilir.
   3. Kutusu zip kilit torba içine koy. 20 ° C kuluçka için dönmek.
4. Puanlama canlılık
   1. Canlılığı günlük hayvan bir platin tel ya da kirpik ile kafasına hafifçe dokunarak puan. Ölü taşımak ve plaka (Şekil 2A) kaldırmak için başarısız hayvanlar puan. Her koşul için her gözlem süresi noktası için gözlenen kaydedin.
      Not: önyargı Puanlama riskini azaltmak için deneyci için deneysel koşullar kör kalması ve benzer sonuçlar önceki zaman puan Puanlama sırasında başvuru gerekir değil.
   2. Rüptürü, sansür hayvanlar ölmek diğer açık geliştirme kusurları, ya da gezinme kadar yan çanak: Bu hayvanlar ve kayıt numarası her zaman gözlenen işaret dikkate istatistiksel analiz için Kaldır. Ayrıca, erkekler varsa, bunları kaldırmak ve gözlenen kaydedin.
   3. Hiçbir hayvan hayatta kalmak kadar 1.4.1 her gün tekrarlayın.
      Not: E. coli çim önemli ölçüde azaltmak veya mantar plaka büyüdükçe, tüm kalan hayvanların uygun RNAi ve FUdR ile taze bir tabak transfer başlar.
5. Veri Analizi - çizme ve istatistik
   1. Giriş veya parametrik olmayan Kaplan-Meier Tahmincisi¹⁵ ve günlük sırası ile sağkalım Analizi destekleyen yazılımı açık kaydedilen gözlem verileri¹⁶ (bkz: ek dosya 3) sınayın. Sansürlü hayvanlar eklediğinizden emin olun. Gözlendi, erkek varsa eklemeyin.
      Not: veri biçimleri yazılım arasında değişebilir, ama ayrı bir satıra gözlenen her bireysel hayvan kaydetmek için sık kullanılan bir biçimdir. Hangi olarak ölü bir hayvan gözlendi deneysel timepoint "olay" zamanı geldi. Sansür ise "etkinlik" hangi hayvan sansür timepoint. Bir alan veya sansürlü gözlemler belirtmek için onay kutusu genellikle yoktur.
   2. Kaplan-Meier hayatta kalma eğriler çizmek. Okunabilirliği artırmak için çok sayıda koşul denetlesinler Eğer tek bir arsa için altıdan koşullar'ı seçin.
      1. Görsel olarak belirgin - kayıp gözlemler, beklenmeyen kontrol sonuçları, vb veri sorunlarını denetleyin — ve istatistiksel analiz daha önce adres.
   3. İkili yapmak için yazılımınızda günlük-rank testi işlevini kullanın istatistiksel karşılaştırmalar. Sansürlü sonuçları tedavisinde kullanılabilir herhangi bir seçeneği sağ sansür veri için uygun şekilde ayarlandığından emin olun.

2. kopya Set yöntemi Puanlama C. elegans uzun ömür için

Not: geleneksel Yöntem 3 – 6 plakaları koşul başına gerekirken (1.1.2 bkz. yukarıda), yineleme kümesi yöntemi (bkz. Adım 2.2.2 aşağıda) daha birçok gerektirir. Geleneksel yöntemi bir deney (Şekil 2A) boyunca aynı tabakta hayvanlar izler. Buna ek olarak, yineleme kümesi ile hayvanlar sadece bir kez attı: böylece bir çoğaltma, her zaman bir noktada (deneme sürümü) başına attı birçok aynı çoğaltır deney başında ayarlanır (Şekil 2B).

1. Kitaplık kurulumu.
   Not: RNAi klonlar teslim tarihinde ek ayrıntı burada, aynı anda birçok RNAi klonları, Puanlama için mükellef protokoldür yineleme kümesi olarak ele ve bir anda 100'den fazla klonlar için ölçeklendirilebilir. Koleksiyonları RNAi klonların bir 96-şey biçimi tabak içinde tutulan gliserol hisse senetleri olarak korunur. Yineleme kümesi deneyler 24-şey tabak kullanın. Her şey RNAi klonlar, farklı kimyasal tedaviler, hayvan suşları ve benzeri koleksiyonuna karşılık bir farklı test durumu var.
   1. Öyle ki aşağıdaki koşullarda sublibrary koleksiyonları RNAi klonların yerleşimini montajı:
      1. 96-şey koleksiyon içinde bir boş vektör negatif kontrol iyi A1 olduğundan emin olun.
      2. Rastgele her 24 kuyu içinde bir ek boş vektör denetimi Ekle.
      3. Öyle ki her 24-şey plaka teker rastgele negatif kontrol (Şekil 2C) ekledi 96-şey plaka 24 wells, bloklar halinde bölün.
      4. 24-Wells (Şekil 2C) her gruptaki rasgele pozitif bir denetim ekleyin.
         Not: Pozitif kontrol deneysel soruda bağlıdır. Bu artış ömrü klonlar RNAi topluluğu seyir, örneğin, daf-2(RNAi) sık sık dahil edilir. Diğer taraftan, kısaltılmış ömrü ararken, daf-16(RNAi) sık sık kullanılır.
2. Çoğaltma kümeleri hazırlanması
   Not: gerekli çoğaltır sayısı zaman puan (Şekil 2B) en az sayıya eşittir. Bir sonsal frekans (en az 20 çoğaltma kümesi için hazırlanıyor her diğer gün Puanlama ile 40 gün çalışan bir yineleme kümesi deneme gerektirirÖrneğin Puanlama yanı sıra, deneme başlamadan önce ömrü ölçmek için ne kadar bilmek gerekir her koşul denemenin başında). ~ 5 (2.2.2 ve 2.2.2.3 aşağıya bakınız) ilave yedek ayarlar yapmak için tavsiye edilir.
   1. RNAi sublibrary taze bir damga oluşturmak için bir 96-pin plaka Çoğalıcı tarafından aşağıdaki adımları kullanarak iyi bir 96-iyi biçimde (600 µL plakaları) başına 200 µL LB + Amp aşılamak:
      1. 96 PIN plaka Çoğalıcı sırayla % 50 çamaşır suyu, ultrasaf H₂O ve etanol pimleri çeker tarafından sterilize. En az 30 için dalmış pimleri tutmak çamaşır suyu ve etanol adımlar için s.  Etanol içinde daldırma sonra kısa bir süre belgili tanımlık keyif alev. Tekrar ediyorum.
         Not: tüm çamaşır suyu durulayın emin olun ve iğne çamaşır suyu paslanmaz çelik pim zarar gibi uzun süre bleach maruz bırakmayın.
      2. Dikkatli bir şekilde yapışkanlı folyo kapak donmuş 96-şey gliserol hisse senedi Kütüphane plaka ve yavaşça çıkarın ama sıkıca sterilize plaka Çoğalıcı ipuçları hala donmuş gliserol stokları kuyu eziyet. Aşılamak 200 µL LB + Amp kültürler ve geçirgen bir zar ile inoculated plaka mühür. Kültürler üzerinde benchtop gecede büyümeye izin.
      3. Plaka Çoğalıcı olduğu gibi adım 2.1.1 sterilize, dikkatlice mühür sıvı kültür plaka sonra gece büyüme kaldırmak ve ipuçları Çoğalıcı Pins bırakın. İpuçları bile baskı pimleri yavaşça, yeterli alan bitişik noktalar arasında kalan sağlanması küçük dairesel bir hareket ile plaka üzerinden bir dikdörtgen LB amp + tet agar plaka ve transfer bakteri için geçerlidir. Koloniler gecede 37 ° C'de agar plaka üzerinde büyümeye izin Bkz. ek dosya 3 LB + Amp/Tet hazırlanması için plakalar.
      4. Kullanılmadan önce agar plaka 4 ° c (kapak tarafı aşağı), ters parafin filmde sarılı saklayın.
         Not: kolonileri kapağı yan depolama çapraz-RNAi klonlar kirletmek yoğunlaşma sağlayacak! RNAi klonlar IPTG indüksiyon değişken zaman uzunlukları için sonra dsRNA inducing içinde etkinliğini korumak gibi kolonileri E. coli bağlı olarak belirli RNAi klonlar, 4 ° C'de 2 – 8 hafta boyunca saklanır. İçin küçük topluluklar RNAi klonların, RNAi verimliliği ampirik RT-qPCR tarafından nakavt onaylamak için tespit edilmelidir.
   2. 24-şey plakaları deneme bir deneme için gerekli en az sayıda hesaplamak: (yineleme kümesinin başına # plakaları) x (beklenen # zaman puan). Bir kaç ekstra çoğaltma kümeleri kirlenme (2B rakam) gibi konuların işlenmesinde dahil olduğundan emin olun.
      Not: RNAi klonlar toplam sayısı yinelemeler her zaman noktası (Şekil 2C) için bir dizi yapmak için 24-şey tabak sayısını belirleyin.
      1. 24-şey kaplamalar, 1.1.2 (ek dosya 3 tarifi için) atladıkça hazırlayın. Tabak tahlil Puanlama deneyci bir renk kodu ya da benzer kodlama düzeni kullanarak deneysel koşullar için kör olur, böylece onları hazırlarken etiketleyin.
      2. Bir küme 1,5 mL LB + Amp kültürler (2.2.2 bakınız) her 10 kopyalar için aşılamak. 96 de derin-şey tabak tabak Çoğalıcı (olduğu gibi 2.1.3) ve bakteri kolonileri 2.1.4 (Şekil 2C, sol) üzerinden kullanarak kültürlerde aşılamak. Solunabilir membran ile mühür, 20 h (37 ° C) sallayarak ile büyümek.
      3. 6-şey çok kanallı pipet (Şekil 2C, şu) aralığı ayarlanabilir uç ile kullanarak her plaka için bir gecede kültür 120 µL tohum. Tüm sıvı absorbe olmuştur kadar laminar akış mahallede ortaya çıkardı plakaları kuru. Aşırı kuru değil. Tabak gecede, oda sıcaklığında saklayın.
3. C. elegans hipoklorit tedavi kullanarak eşitleme
   1. Hayvan deney için gerekli en az sayıda hesaplamak: L1s gerekli minimum sayısı = (15-20 hayvanlar/iyi) (24 kuyu/plaka) (tabak/yineleme kümesinin X)(Y replica sets).
      Not: yineleme kümesi yöntemi geleneksel yöntemden daha fazla hayvan gerektirir. Bir 10 cm tabak gravid kurtlardan tam 20.000-50.000 L1 hayvanlar gravid yetişkin yoğunluğuna bağlı olarak sağlar. Benzer şekilde, yirmi 6 cm tabak ~ 30.000 L1 hayvanlar verim. Hayvanlar gerekli en az sayıda iki katına bir yumurta hazırlama hazırlamak planlıyoruz. Nüfus hazırlık hasret Eğer yeniden besleme veya yeni bir tabağa yığın ve gıda proceding^17,18önce en az üç kuşak izin. Geri kalan L1s dondurmak emin olun.
   2. Elde etmek için geleneksel yöntem olduğu gibi 1.2-1.2.6 adımları izlemeniz L1 hayvanlar senkronize. 15-20 L1 hayvanlar her iyi bir 6-şey aralığı ayarlanabilir pipet ve reaktif depo, 1.2.7 için benzer kullanarak içine tohum. Düzenli olarak çözüm önlemek hayvanların yerleşme L1 karıştırın.
4. 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) eklenmesiyle Döl üretim önlenmesi
   1. Adım 1.3.1 izleyin.  Steril 50 x FUdR hisse senedi hazırlamak (bkz. Adım 1.3.1.1).
   2. Hayvanlar ulaşmak L4, 50 25 µL eklediğinizde x FUDR 24-iyi her şey için plaka 6-kanal aralığı ayarlanabilir pipet kullanarak.
5. Skor canlılığı
   1. Çoğalt plakaların bir set kaldırmak ve wells M9 çözüm, şey, başına kayıt toplam hayvanlar ile sel ve sonra yavaşça dokunmatik olmayan hareketli hayvanlar bir solucan çekme (Şekil 2B) ile kafa. Taşımak başarısız hayvanlar ölü attı. Tabak gol atma. Günlük kayıt canlılığı.
      Not: rüptürü, gösteri brüt morfolojik kusurlar, geliştirmek başarısız oldu veya iyi tarafında Gezilen her iki ölü ve toplam değeri çıkararak sansür için hayvanlardır.
      1. Her şey, her zaman bir noktada ayrı olarak diğer değerlerden içinde sansür hayvanlar kaydedin.
      2. Yemek var mı veya kontamine kuyuları puan edinildi değil (Örneğin mantar ya da çamur); Böyle wells sansürlü olarak kabul edilir. Bütün hayvanlar morfolojik veya gelişimsel kusurlar görüntülerseniz, Ayrıca, bir de sansür. Bu RNAi klon/iyi bu noktada zaman için sansür bir olay kaydeder.
      3. Çoğalt bir tabak Puanlama sonra atın. Yeni bir çoğaltma Puanlama bütün wells genelinde tüm hayvan ölene kadar her gün ayarla devam edin. Önyargı Puanlama riskini azaltmak için deneyci için deneysel koşullar kör kalması ve benzer sonuçlar önceki zaman puan Puanlama sırasında başvuru gerekir değil.
      4. Bir kuyu içinde bütün hayvanlar vardı bir belirli zamanda noktada ölü, o zaman o günkü skorlama, incelerseniz bütün hayvanlar ölü için iki ardışık zaman puan için gol olup olmadığını bir şey göz önüne alındığında. Eğer öyleyse, canlılığı Puanlama artık o kadar iyi sonraki zaman puan için gereklidir.
      5. Ek bağımsız deneme denemeler yapmak. Art arda denemeler sonuçlarını Ayrıca bu önceki çalışmalarda belirtildiği deneme sayısı ile izlemek.

3. grafik verileri

Not: yineleme kümesi ile bir eğri uygun yöntemi ortalama ve maksimum ömrü yaklaşık için uygulanır. C. elegans mortalite değerlendirmek için parametreleri logit eğrisi¹⁹uygun.  Çoğu hayatta kalma araçları logit eğri uydurma desteklemeyen gibi yeni bir program (yineleme kümesi için); logit eğriler çizmek için geliştirilmiştir Kaplan-Meier eğrileri (geleneksel yöntem için) de desteklenir.

1. Yazılım ile başlamak. Güncel sürümü ( Malzeme kısımbakın) için yayın zip dosyasını indirin. ZIP dosyasını bir klasöre ayıklayın. Belgili tanımlık hulâsa ağıl "readme" dosyasında ek yükleme yönergeleri için bkz:.

1. Çizdirme arabirimi başlatın. "Kod" dizininin konumunu bulmak içinde belgili tanımlık ağıl--dan belgili tanımlık fermuar eğe hulâsa (Örneğin  "/ Kullanıcılar/UserName /Desktop/WormLife/kod").
   1. Sadece tespit için klasör yolu yerine R konsolda aşağıdaki komutları girin. Sıkıştırma girmek ya da her satırı girildikten sonra dönmek: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
   2. Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi varsayılan ekran yukarı getiren yeni bir pencerede yüklemek arabirim için bekleyin. Arka planda R izin.
2. Verileri virgülle ayrılmış değerler (CSV) veya sekmeyle ayrılmış değerler (TSV) dosyaları olarak biçimlendirme. Sütunlar ve adları, çözümleme türüne bağımlı belirtin. Ek dosya 4 (yineleme kümesi) ve ek dosya 5 (geleneksel/Kaplan-Meier) önceden biçimlendirilmiş örnek veriler için bkz.
   Not: veri zorlanma/tedavi her zaman noktası deneme başına başına yani bir satır bir "uzun" biçiminde belirtilmesi gerekir. CSV dosyaları platformlar arasında en iyi uyumluluk için tavsiye edilir.
   1. Atlanan veya sansür gözlemler için karşılık gelen satırları kaldırın. Veri alınırken bir hata neden olarak eksik veya sayısal olmayan değerler, olmaması için kontrol edin.
   2. Geleneksel Kaplan-Meier tarzı analiz için bağımsız denemeler-Arsa verilerden havuz değil onları ayrı ayrı. Yineleme kümesi analiz için birden çok deneme verilerden havuz ve daha sonra "TrialView" işlevini kullanarak araştırmak (bkz. 6.3.3.4).
3. Çizdirme arabirimini kullanarak
   1. Bir veri dosyası ("Dosya" menüsünün altındaki "alma") iletişim kutusunu kullanarak. ".Csv" dosyaları açmak için içinde belgili tanımlık damla aşağı ".csv" dosya türünü değiştirme (".txt/.tsv" varsayılandır), veri dosyası ile klasöre gidin. Burada dosya yineleme kümesi örnek veri (ek dosya 4).
      Not: bir veri kümesi zaten açık olduğunda bir dosya alma akım olarak dataset yerini alacak.
   2. Seçili dosya (Şekil S1A yineleme kümesi için) sütunları tanımlayan aracılığıyla yürüyor alma sihirbazını başlatmak için almak için bir dosya seçin. Giriş verileri bir yineleme kümesi deneye karşılık geliyorsa, "Logit" çalışma türünü seçin.
      Not: Alma iş akışı yineleme kümesi (Şekil S1A) ve geleneksel (Kaplan-Meier) (Şekil S1B) arasında farklıdır.
   3. "Verileri çizmek". Veri çizme başlamak için "satır ekle" seçin. (Bir koşullar kümesi için bir satır karşılık gelir. Deneyler ile yardımcı olacak özellikler nerede birçok koşulları test edildi) vardır.
      1. Denetim koşulları-örnek veri N2 (WT) L4440 ile söz konusu olduğunda Arsa (boş vektör) RNAi uygun. "Satır ekle" "Grafik" menüsü altına satır Ekle Sihirbazı'nı başlatmak için seçin: satırını temsil ettiği için koşulu çizim ve Grafik parametreleri seçin.
         1. Eğri bir farklı durum için el ile eklemek 3.3.3.1 adımlarını yineleyin
         2. Rengini değiştirmek veya sembol için bir çizgi çizmek için "grafik menü" altında "Satırı değiştirin" seçin.
         3. Ezelî takas tüm satırları bir satır kaldırmak için "Satır Sil" "grafik menüsünde" altında seçin.
         4. Tüm satırları geçerli komplo temizlemek için "grafik menüsünde" altında "Çizgi işaretini kaldırın" seçin.
         5. Otomatik olarak seçilen en fazla x ekseni (zaman) değeri geçersiz kılmak için "Set X Ölçeği" "grafik menüsündeki" kullanın.
            Not: (hayatta kalan Kesir) y ekseni her zaman artırımlarıyla % %20 0 ' (alt) % 100 (üstte) görüntüler. X ekseni her zaman 5 artışlarla görüntülenir. Eksen etiketlerini Arsa görüntüleri kaydettikten sonra etiketlemede esnekliğe çizilen değil.
      2. Görüntülenmekte olan arsa JPEG formatlı görüntüleri kaydetmek için "Dosya menüsünden"; "Komplo Kaydet" seçeneğini kullanın Sadece geçerli Arsa kaydedilir.
      3. Birçok farklı koşulları için bireysel araziler bir deneyde oluşturmak için yazılım, tanımlama ve bir "dizi" komplo sağlar.
         Not: Serisi konsepti uygulanması ile büyük deneyler çalışırken etkili olmasını sağlar.
         1. Boş arsa çalışma alanı ile başlayarak, tüm araziler (3.3.3.1 bakınız) dizi genelinde tutarlı olacak şekilde denetim koşulları karşılık gelen satırları ekleyin.
         2. "Define serisi" serisiyle grafikler menüde tanımlayın. İlk seride görüntülemek için satır karşılık gelen bir koşul seçin; tek seçilebilir. Grafik parametreleri (çizgi renk ve arsa sembolü) satırında 3.3.3.1 için seçin.
         3. Araziler için farklı test koşulları gözden geçirin. "Serisi çizgi" görüntüsünü ana arsa penceresinin yanı sıra üst menü çubuğu (Şekil 3A-C) iki tarafta bulunan sol/sağ ok düğmelerini kullanarak koşulları arasında geçiş yapın.
            Not: seçilen Serisi hattı bir daha önce eklenmiş denetim/başvuru satır olarak aynı koşul ise, yeni satır yer paylaşımlı görünebilir.
         4. Belirli diğer işlevleri kullanılabilir (kaydetmek serisi çizer ve Trialview-görün 3.3.3.4 için ikinci) yapmak için serisi tanımlayın. Bir dizi tanımladıktan sonra "Dosya" menüsünden "Serisi araziler Kaydet" seçeneği serisi yeni bir klasördeki her arsa için bireysel Arsa görüntü dosyaları kaydetmek için kullanın.
      4. Trialview — bağımsız denemelerin bir yineleme kümesi deney sonuçlarından görselleştirme. Eğer birden fazla denemeler bir veya daha fazla örnek gruplar için çalıştırılan, bireysel çalışmalar verilerden ve tüm denemeler bağımsız denemeler (bkz: 3D şekil) arasında tutarlılığı ayrı ayrı değerlendirmek için havuza alınan verilerden arsa.
         1. Bir serisi 3.3.3.3 içinde açıklandığı gibi ayarlayın. Farklı denemeler farklı bir resimdeki "değişen" örnek gruplarının her biri için belirtilen başvuru/kontrol örnekleri için ilgili denemeler üzerinde çizilir.
         2. TrialView görüntüleri kaydetmek için veri menüsünde "Baskı TrialViews için" git; bir JPEG resmi çıkış serideki her arsa için olacaktır.
            Not: Örnek sonuçları Şekil 3D bir durumda iki deneme ile içindir.
   4. Ortalama ömrü veriler, yineleme kümesi için Özet Tablo. Görsel veri makul uyum sağlamak için eğrileri incelemek, o zaman seçme ''Özet Tablo "ortalama yaşam süresi değerleri (% 50 hayatta kalma logit eğri üzerinde zaman) her örnek türü. için bir tabloyu kaydetmek için veri menüsünden seçeneğini
4. Yineleme kümesi yöntemi ile üretilen verileri istatistiksel değerlendirilmesi
   1. Bir yineleme kümesi deneme iki grup arasında istatistiksel analiz için değiştirin ve yayın zip dosyası içinde sağlanan bir R komut dosyasını çalıştırın (bkz: "WormLife istatistiksel analiz şablon komut. R").
      Not: R yeterlilik komut dosyasını çalıştırmak için gerekli değildir. Ek belgeler dosyasındaki mevcuttur. Komut dosyası örneği yineleme kümesi veri analizi için hazırdır. Kullanıcı tarafından oluşturulan veri uygun biçimde (bkz. ek dosya 4) da analiz edilebilir.
      1. Komut dosyası R (R GUI veya RStudio) açın.
         Not: Bu komut dosyasını çalıştıran olmadan görüntüler.
      2. Bilgisayarınızda konum eşleşmesi için gereken dosyaları konumlarını değiştirin.
         Not: Bu dosya yolları "tam" olması gerekir (yani klasörler dahil olmak üzere tam dosya konumu içermelidir).
         1. "WlDir" (dizininin konumunu), "veri dosyası" (analiz etmek için yineleme kümesi veri dosyası), "compFile" (uygulanabilirse çalışmasına karşılaştırma belirtimi) ve "outputPath" (konum sonuç dosyalarını yazılacağı için (dosya/klasör konumlarını) yollarını değiştirme için).
      3. Analiz edilecek dosyanın içindeki sütun adlarının örnek dosyadan farklı sütun adları "Belirt sütunlar veri dosyasındaki" bölümünde ayarlayın. Her parametre için bir sütun belirtin. Eğer birden fazla suşları bir eğitim var, ama hiçbir RNAi (veya başka bir tedavi) boş girdiler veya aynı veri dosyasıyla (Örneğin "no_treatment", vb) tüm satırlar için bir sütun ekleyin.
      4. "CompFile" parametresini ayarlayın. "CompFile" parametresi NA için ayarlarsanız, tüm olası ikili karşılaştırmalar gruplarının çalıştırılacak.
         Not: Bir grup zorlanma/genotip ve tedavi, hangi birleştirilmiş ve "strain_treatment" görüntülenen kombinasyonu tarafından tanımlanır. Birçok grup ile daha büyük çalışmalar için bir CSV dosyasına karşılaştırmalar belirten sağlanabilir. "Comps_rsm_example.csv" örnek dosyasına bakın.
      5. Monte Carlo yeniden örnekleme için yineleme sayısını ayarla ("k.resamp", varsayılan değer ise 1000).
         Not: P-değeri 0 çok az yineleme gerçekleştirildiğinde iade edilebilir; Bu gibi durumlarda rapor için uygun olan "p < 0,01" (Eğer k.resamp = 100), veya "p < 0,001" (Eğer k.resamp = 1.000), vb
      6. Komut dosyasını çalıştırın: RStudio "kaynak" düğmesini (düzenleme penceresinin sağ üst) veya R GUI "düzen" menüsünden "kaynak belge". (Yürütme biraz zaman alabilir.)
      7. R "meşgul" göstergesi artık görüntülendiğinde, çıkış Açık Dizin-orada-ecek var olmak (medyan sağkalım, p-değerleri, % ortalama ömrü değişim) her karşılaştırma sonuçlarını içeren bir tablo.

Representative Results

Herhangi bir yeni metodoloji geliştirme yeni yöntemi kabul edilen önceki yaklaşımlar sonuçlarından recapitulates ve bir alan içinde standardına uyan zorunludur. Biz yineleme kümesi ve C. elegans ömrü raporlaması için geleneksel yöntemlerle benzer sonuçları²⁰üretmek daha önce ampirik olarak göstermiştir. Genellikle 20 ° C'de tutulan vahşi-türü C. elegans (N2) live biz geleneksel (Şekil 4A, siyah çizgi) ve yineleme kümesi yaklaşım (Şekil 4B, siyah) ile gözlenen 20 ve 25 gün arasında. Böylece, her iki yöntem oldukça vahşi tipi ömrü yaklaşık. Yeni bir yöntem doğru test koşulları ve önemli değişiklikleri algılamak için istatistiksel güç arasındaki değişiklikleri ölçmek için çözünürlük olması zorunludur. Bizim önceki çalışmada, transkripsiyon faktörleri Myc ailesinin belirleyicileri C. elegans uzun ömürlü olduğunu keşfetti. MML-1 ve mxl-2 kodlamak C. elegans homologs memeli Mondo a / karbonhidrat yanıt bağlama öğesi protein (ChREBP) ve Mlx, anılan sıraya göre. Hem C. elegans ve memeliler, transkripsiyonu düzenleyen bu Myc-aile üyeleri heterodimerize. Mml-1 veya mxl-2 kaybı önemli ölçüde ölçülen bir geleneksel ömrü tahlil veya yineleme kümesi (Şekil 4A-B, sarı ve maroon) normal ömrü azalır bulundu. MML-1::MXL-2 karmaşık aksine bulduk mdl-1 (memeli Mad homolog) veya mxl-1 (Max) kaybı önemli ölçüde her iki metodoloji (Şekil 4 tarafından ölçülen C. elegans ömrü artar Mor ve mavi, sırasıyla, her iki kapı aynası).

Uzun ömürlü ölçmek için geleneksel yaklaşım için ciddi bir sınırlama verim olduğunu. Her iki yöntem itimat bir hayvan yaşıyor olup olmadığını aramak için hareket ya da ölü, değerlendirmek için giderek daha zor hale gelir. Genç hayvanlar uyaranların yokluğunda bir plaka boyunca hareket edecek ve böylece puanı kolaydır. C. elegans giderek haline yaşlanma sedanter ama kafaya hafif bir dokunuş için bir plaka üzerinde bir ters hareket yanıt verir. Ancak, hayvanlar büyük olmak gibi geriye doğru hareket yeteneği azalır ve giderek koordinasyonsuzluk olur. Sonuçta hayvanlar, şiddetle mücadele benzeyen bir fenotip felç ve geleneksel yöntem canlılığı ile Puanlama zaman sadece hayvan aşırı ön ucunda ince seğirme gözlemci tarafından belirlenebilir. Buna ek olarak, canlılığı yineleme kümesi yöntemi yoluyla Puanlama, sıvı healthspan⁸bir okuma sayısal bir dayak yanıt oluşturur bir uyarıcı görevi görür de eklenir. Sıvı hareketi bile büyük hayvanlar için gözlemlemek kolaydır: zayıf düşmüş hayvanlar kronolojik yaş eşlemeli üretmek kuru plakaları ama daha belirgin üzerinde ince baş hareketleri (yavaş da olsa) sıvı vücut viraj. Son olarak, yineleme kümesi Puanlama zaman tüm iyi görüş alanı (~1.1 cm çapında) içinde ve bütün hayvanlar süspansiyon - izin gözlem tüm hayvanların aynı anda vardır. Buna ek olarak, geleneksel yöntemi ile 6 cm tabak Puanlama zaman, bir tüm inceden inceye gözden geçirmek gerekir plaka - bakteriyel çim ve hayvanlar için kenarları boyunca arama. Bu farklılıklar net sonucu en üretimi yineleme kümesi yöntemini kullanırken en az bir büyüklük, aynı anda 100'den fazla ömrü içinde değişiklikleri ölçmek olanak verir geleneksel yaklaşım daha büyük olmasıdır bir araştırmacı ile tek bir deneme koşullarında. Örneğin, biz daha önce doğan artan ömrü için gerekliydi 159 genleri tespit bir genom geniş besleme tabanlı RNAi ekrana gelen azalma daf-2 /insülin benzeri⁸sinyal. Bu analiz, biz ömrü vahşi-türü, bir uzun ömürlü daf-2(e1370) mutant ve genetik deşifre etmek bize izin veren kısa ömürlü daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) Çift Kişilik mutant hayvanlar (Şekil 5A), değişiklikleri sayılabilir insülin benzeri sinyal ve 100'den fazla progeric gen inactivations arasındaki ilişkiler. Ayrıca, biz ne kadar bu progeric gene inactivations healthspan ("activespan" adı verilen zamanda) değiştirilmiş değerlendirildi çoğaltır zamanla (5B rakam) boyunca dayak atma C. elegans düşüş gözlemleyerek.

Şekil 1: beslenme advent RNAi kurşun gen bulma yaşlanma araştırma gelen bir dönemin dayalı, henüz en gerogenes kötü okudu kalır. (A) birçok gerogenes başlangıçta büyük ölçekli fonksiyonel genomik ekranlarından keşfedildi. Bugüne kadar keşfedilen 900'den fazla C. elegans gerogenes pek çok gen bulma fonksiyonel genomik yaklaşımlar değerini vurgulayarak RNAi, besleme tabanlı kullanarak tespit edilmiştir. Grafik, RNAi kullanarak el yazması keşfetti gerogenes sayısını gösterir, fenotip Ontoloji uzun ömrü, şartlar için fenotip üzerinde ek açıklama ( malzemelerin tabloyabakın) yaşam süresi kısaltılmış ve hayat yayılan varyant. Ek dosya 1 gerogenes keşfetti çalışmaları tam listesi için bkz:. (B) en gerogenes kötü okudu kalır. Buna ek olarak için iyi okudu gerogenes daf-16gibi 800'den fazla referansları, gerogenes çoğunluğu olan /FOXO (ok), var 10'dan az başvuruları (Genel başvuru-mutlaka ömrü üzerinde duruldu değil). Güvenilir yüksek üretilen iş yöntemleri gerogenes arasındaki genetik arası ilişkileri daha derin bir anlayış türetmek için gerekli olacak. Grafik PubMed yayınlar RNAi fenotipleri keşfetti C.elegans gerogenes arasındaki eşlemeleri temel alır. Ek dosya 2 gerogenes ve her ile ilgili çalışmalar sayısı tam listesi için bkz:. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Geleneksel ve C.elegans ömrü (A) Puanlama için yineleme ayarla yöntem. C. elegans ömrü Puanlama için geleneksel yöntem. Birkaç küçük eşitlenmiş nüfus koşul başına isogenic hayvanların zamanla takip edilmektedir. Hayvanların aynı nüfus çalışma ders boyunca takip eder. Canlılığı nazik dürtmeye tarafından uyarılmış hareket tarafından değerlendirilir. Taşımak için başarısız hayvanlar ölü attı ve (kaldırılan aspirasyon gösterilen) olan hiçbir canlı hayvan kalıncaya kadar. (B). yineleme ayarla C. elegans ömrü Puanlama yöntemi. Yaş senkronize isogenic hayvanlara büyük nüfusu aynı Çoğalt plakaları bir dizi genelinde dağıtılmaktadır. Her zaman noktası, tek bir çoğaltma attı: hangi hareketi uyarır hafif tamponlu çözüm (M9) eklenir. Sel wells de üzerinden değerlendirilir sonra kendiliğinden taşımak için başarısız hayvanlar uyarıcı dokunmak. Deney için skor süresi başlamadan önce belirlenir. Her hayvan yalnızca bir kez attı ve uzun ömür için daha büyük nüfus birçok bağımsız inceleme--dan türetilmiştir. (C). yineleme kümesi yaklaşım kantitatif C. elegans ömrü ölçmek için bir yüksek aktarım yöntemidir. 100 veya daha fazla bağımsız RNAi klonlar aynı anda izlenebilir. HT115 E. coli dsRNA verilen RNAi klon için ifade etmek gösterilmiştir. Pratik olarak, 96-şey plaka her 24 örnekleri tek bir 24-şey plaka ayrılır. Pozitif kontrol (yeşil iyi) rastgele RNAi klonlar (sarı wells) topluluğu içinde dağıtılmış ve elde edilen her 24-şey plaka bir negatif (yani boş vektör, kırmızı iyi) vardır. Tipik olarak, bir koleksiyon ilk kuyuda (A1) boş bir vektör içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: grafik kullanıcı arabirimi (GUI). (A). varsayılan hoş geldiniz ekranı gösterilen ana arsa pencere arayüzey. Bu ne yazılım açıldığında görüntülenir. Görünümde platformlar arasında farklılıklar bir platformdan bağımsız Pencereleme araç kullanımı nedeniyle en az olmalıdır. (B). ana arsa penceresinden aşağı açılan menüleri için menü seçeneklerine genel bakış. (C). örnek çizim çıktı her iki yineleme kümesi için stil (solda) ve geleneksel Kaplan-Meier stil (sağda) veri. Görüntülenen verileri bağımsız deneylerde toplanmıştır. Dışa aktarılan arsalar böyle etiketleri ekleyerek maksimum esneklik için önceden çizilen eksen etiketlerini içermez. Bu kolaylaştırmak için eksen her zaman artırımlarıyla y ekseni için % 20 ve katları 5 x ekseni ayrılır. Örneğin, bir çok basit ve ortak görüntü düzenleme aracı kullanarak kaydedilmiş araziler, eksen ve satır etiketlerini (zorlanma/tedavi) eklenmiştir. (D). çıktısı örneği yineleme kümesi stili veri kümeleri için bağımsız denemelerin sonuçlarını arasında görsel karşılaştırma için izin "TrialView" işlevi üzerinden. Bu arsa sonuç iki farklı denemeler ve daf-2 EV(RNAi) (daireler) mavi, kapalı, karşılık gelen havuza alınan sonuçları arasında gösterir N2 EV (RNAi) (siyah, kapalı daireler) ve daf-16 (RNAi) (kırmızı, açık elmas) daf-2 . TrialView hızlı bir şekilde havuza alınan veri kümesi uygun kalitesini etkileyebilir deneme özel veri sorunları için kontrol etmek için izin verir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: geleneksel ve yineleme kümesi yöntemleri üretmek benzer sonuçlar. Her iki bileşeni olan MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) heterodimerdir kaybı ömrü artar. Buna karşılık, her iki bileşeni olan MML-1 kaybı (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) bu rakam başvuru²⁰ üzerinden bir Creative Commons Attribution (CC tarafından) Lisans (bkz: malzemeler) izniyle yeniden basıldı ömrü azalır. (A). Kaplan-Meier geleneksel yöntemi ile sonuçlanır. (B). yineleme kümesi yöntemini kullanarak uygun Logit eğrisi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Yöntemi değişiklikleri ömrü(a)ve healthspan (B) için 100'ün üzerinde değişiklikler dayalı genetik etkileşimler deşifre yineleme kümesi RNAi aynı anda klonlar. Bu rakam⁸ altında Creative Commons Attribution-Non-tecimsel 4.0 Uluslararası Lisansı (NC tarafından CC) (bkz: malzemeler) izni ile yayımlanmaktadır. Progeric gen inactivations azalmış insülin benzeri (ILS) (daf-2, x ekseni) sinyal bağlamında ve daf-16/FoxO (y ekseni), merkezi bir transkripsiyon efektör ILS^{21 yokluğunda (A) genetik ömrü Analizi} . Gene inactivations daf-16 olarak benzer işlevlerle daha fazla ömrü daf-16 (siyah nokta) yokluğunda kısaltmak değil. Gene inactivations daf-16 ' dan tamamen bağımsız işlevlerle kısaltmak genetik her iki arka plan benzer şekilde (gri). Nerede olumsuz etkisi üzerinde ömrü daf - 2 gen inactivations > daf-2; daf-16, paralel (beyaz) işlevinde öneriyor. (B) zaman içinde dayak yapılan değişiklikleri ömrü (y ekseni) içinde değerlendirilmesi sırasında birçok genetik tedirginlikler (x ekseni) için Ortalama healthspan elde edebilirsiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Rakam S1: WormLife iş akışlarında. Bazı adımlardan illüstrasyon iş akışları (bazen "sihirbazlar" denir) destekli. İş akışı, son adımda sonra bu durumların her birinde odak ana arsa penceresine geri döndürülür. (A) stil veri kümeleri (B) veri yineleme kümesi geleneksel Kaplan Meier stili veri kümeleri için iş akışı almak için iş akışı verileri alın. (C) için bir çizim stil veri kümeleri yineleme kümesi için satır eklemek için iş akışı. (D) geleneksel Kaplan Meier stili veri kümeleri için bir arsa için satırları eklemek için iş akışı. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1: gerogenes belirledik çalışmalar. Besleme tabanlı RNAi gelişiyle gen bulma bir devrin ileri Genetik yaşlanma da dahil olmak üzere, uysal değildi fenotipleri için yol açtı. Listelenen, gerogenes keşfetti, numara sırasına göre ömrü olan faaliyet değiştirilmiş genler tanımlanan bağımsız çalışmalar vardır. Not en gerogenes tanımlanan çalışma⁸Çoğalt set yöntemi kullanılmıştır. Nasıl gen değişmiş inactivations ömrü de endikedir doğası: uzun ömür ve progeric genler olanlar artırılması veya azaltılması, sırasıyla inaktive zaman ömrü. "Yaşam süresi varyant" anlamına gelir servis talepleriyle nerede yön değişikliği (yani artırılması veya azaltılması ömrü) belirtilmedi ya da değil küratörlüğünü. Referans¹⁰henüz WormBase RNAi fenotipleri küratörlüğünde koleksiyonunda yer değil, WormBase WS262 (Ocak 2018) (bkz: malzemeler), verileri RNAi-tedavi ömrü ilavesi ile sonuçlanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 2: her gerogene ile ilgili çalışmalar sayısı. En gerogenes kötü incelenmektedir. Daf-16/FoxO gibi bazı genler çok araştırma dikkat konu oldu, 400'den fazla gerogenes 10'dan az ilişkili yayınlar vardır. Henüz WormBase RNAi fenotipleri küratörlüğünde koleksiyonunda bulunmayan¹⁰ WormBase WS262 (Ocak 2018), verileri RNAi-tedavi ömrü ilavesi ile sonuçlanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 3: ortak kimyasalları hazırlanması C. elegans deneyleri. (A). standart NGM ve RNAi plakalar için reçete. (B). tarifi M9 tampon ve hipoklorit çözüm için. (C). hazırlık LB + Amp/Tet levha. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 4: örnek veri yineleme kümesi. Bir yineleme kümesi ömrü deneme bir örnek veri kümesi. Bu veri kümesi zaten alma/analiz için uygun olarak biçimlendirilir. Koşul (zorlanma/genotip ve RNAi birleşimi) başına iki denemeler içerir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 5: geleneksel boyuna örnek veri. Sağ-sansür ile bir geleneksel boyuna ömrü deneme bir örnek veri kümesi hazır alma/Kaplan-Meier hayatta kalma Arsa işlevini kullanarak çözümleme için biçimlendirilmiş. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Her iki geleneksel ve yineleme kümesi yöntemleri kronolojik olarak yaşlı hayvanlar eşitlenmesi gerekir. Biz hayvanlar nerede sadece döllenmiş yumurta gravid yetişkin ile tedavi hayatta hipoklorit tedavi gravid yetişkinlerin kullanarak eşitler bir yöntem içerir. Bu embriyo sıvı süspansiyon yumurtadan ve gelişimsel olarak ilk larva aşamasında (L1) tutukla. L1 hayvanlar yiyecek (Örneğin E. coli ifade dsRNA bir gen ilgi için) üzerine tohum sonra hayvanlar geliştirme devam. L1 hayvanlar tarafından gravid yetişkinlerin hipoklorit tedavi eşitleme artık seribaşı L1 hayvanlar donmuş ve süresiz olarak sıvı azot veya-80 ° C dondurucu içinde saklanan avantajı vardır. Bu şekilde, gelecekteki çalışmaları için değerli bir kaynak oluşturma ve tekrarlanabilirlik iyileştirilmesi her baskı deneysel kurulum esnasında bir örnek korunur. Hipoklorit tedavi gravid yetişkin hayvanların eşitlenmiş hayvanlar yaşlanma araştırma²²için elde etmek için ortak bir yol olsa da, ancak, L1 tutuklama bir açlık yanıttır. Böylece, bazı laboratuar ya damızlık tabaklarda, ortaya veya hipoklorit tedavi tamamen bırakmak ve birkaç gravid yetişkin (yani bir yumurta yatıyordu) birkaç saat için yumurtalarını bırakmak izin vermek izin vermek tercih ederim. İkinci durumda, veliler kaldırılır ve döl ömrü izledi. Bizim bilgi en iyi şekilde ömrü içinde hiçbir bariz farklılıklar M9, tabak ya da Döl gelen bir yumurta yatıyordu yumurtadan senkronize hayvanlar arasında bildirilmiştir. Ancak, verilen bu besin durumu değişiklikleri yakından ömrü içinde değişikliklere bağlı, belirli genetik arka planlar farklı sonuçlar arasında bu eşitleme yaklaşımlar üretmek olabilir önceliği yoktur. Daha dikkatli bir analiz bu teorik endişe çözmek için gereklidir.

Başlangıç nüfus eşitlemek için kullanılan yöntem bakılmaksızın, ya Döl üretim engellemek veya gelecekteki Döl eşitlenmiş başlangıç popülasyondan ayırmak için adımların atılması gerekir. Bizim iletişim kuralında, Döl üretim, önlemek için FUdR kullanmayı anahat hayvanlar ayıran olarak uygun bir seçenek çoğaltma yöntemini ayarlamak için değildir. Döl genetik olarak Dişileştirilmiş genetik arka plan (sıcaklık bağımlı steril zorlanma²³olanÖrneğin fer-15(b26);fem-1(hc17), ) kullanarak önlemek mümkündür. Ancak, ikisi de eksiklikleri değil: genetik arka planlar kullanımı daha sonraki analiz karmaşık hale getirebilir ve bazı genetik kökenden uzun ömürlü^24,25,26FUdR değiştirebilir.

Döl önlenmesi için alternatif olarak kimyasal ve genetik üretim anlamına gelir, Yetişkin hayvanlar düzenli olarak taze RNAi tabakaları bana onları--dan onların Döl yalıtmak için hareket edebilir. Bu arka plan konuları üretilen iş pahasına kolaylaştırır. Düzenli olarak taze yiyecek için hayvanların hareket mümkün açlık önlenmesi ve dsRNA maruz yenileyerek ek avantajları vardır. Ancak, ömrünü etkileyen bazı genetik etkileşimler sadece otelde Döl üretim inhibe keşfedildi: erken analizi için bir ömrü fenotip TGFβ yolu yanlışlıkla sonucuna azalan TGFβ sinyal C. elegans etkiledi dauer oluşumu^27,28yaşlanma değil ama. Ancak, FUdR kullanılan çalışma bir takip bu²⁹sinyal insülin ile artan uzun ömürlü sinyal TGFβ azalma ortaya koydu. Neden daha önceki çalışmalar TGFβ mutasyona uğramış hayvanlarda artan ömrü görmek başarısız oldu? TGFβ yolu mutasyonlar kusur (egl) döşeme hafif bir yumurta üretmek ve daha sonra üst öldürür hayatında Döl iç tarama neden üreme uzun ömürlü, genişletmek. Uzun ömürlü TGFβ mutasyona uğramış hayvanlar egl fenotip nedeniyle normal bir ömrü var için ne zaman vahşi-türü hayvanlar normalde öldü zaman etrafında hayvan öldürdü çıktı olasıdır. Aç yabani türü hayvanlar da bir egl fenotip, belki de Döl düşük gıda şartları altında bir adaptif hayatta kalma avantaj olarak tezahür bu DR için bağlantılı diğer genetik yolları ile ilgili olabilir. Bu adaptif yanıt ömrü deneyleri tasarlarken altında stres koşulları ve dikkatli analiz ve dikkate gerek hayvanlar geçmesi altta yatan karmaşıklığı vurgular.

Tasarlanması ve ömrü deneyler her iki yöntemle önyargı önlemek için önemlidir. Deneyler bir çift-kör şekilde yaptı: nasıl örnekleri daha önce önceki zaman noktalarda attı ve bir sınama koşulu kimliğini deneyci için bilinmeyen olması gerekir. Ayrıca, hem olumlu hem de olumsuz denetimleri eklemek her zaman gereklidir; yineleme kümesi yöntemi söz konusu olduğunda, Bunlar rastgele bir 24-şey tabak eklenir. Bir ekleme sırası ile içermeyen bir plazmid ifade E. coli için C. elegans karşılık gelen genom boş vektör negatif (yani "L4440"-bkz: belgeleri) denetimidir. Pozitif denetimleri belirli bir deney niteliğine bağlıdır. Örneğin, daf-2 C. elegans insülin/IGF-1 reseptör kodlar ve daf-2 inactivation besleme tabanlı RNAi üzerinden sağlam ömrü vahşi-türü hayvanlar²⁷' en az iki kat artırır. Böylece daf-2(RNAi) olumlu bir denetim olarak ömrünü artırmak için gen inactivations ararken hizmet olabilir. Diğer taraftan, daf-16 FOXO transkripsiyon faktörü orthologue³⁰kodlar. DAF-16 birçok uzun ömürlü paradigmalar, temel bir bileşenidir ve vahşi-türü hayvanlar (N2) daf-16(RNAi) ile tedavi kısa ömürlü ve yaşlılık hastalığı³¹belirtileri gösteriyor.

Geleneksel boyuna ömrü yaklaşım birincil avantajları çok iyi kurulmuş ve deneyler kurmak kolay vardır. Nispeten daha az sayıda hayvan her test durumu için bir kaç tabaklarda ihtiyaç vardır. Böylece, kötü büyüyen veya yaymak için dengeleyici gerektiren suşları kolayca test edilebilir. Geleneksel yaklaşım son derece uyarlanabilir ve herhangi bir kullanılabilir yaklaşımlar ile Döl üretim işleme, FUdR ile tedavi de dahil olmak üzere, Dişileştirilmiş genetik arka plana geçiş veya düzenli olarak yetişkin hayvanlar için yeni plaka taşıma için kullanılabilir yumurta atarken döneminde. Hayvanlar büyük ölçüde hareket çıkışını azaltır, mutasyona uğramış bir arka plan ile çalışma hiç ideal iken ve ne kadar FUdR vahşi tipi ömrü^32,33,34değiştirmez, ömrü etkiler ve ilgili fenotipleri yaş Bazı genetik arka planlar^35,25,26. Unutmayın erkekler, varlığı bile FUdR, kullanımı ile önemli ölçüde hermafrodit ömrü¹³kısaltacaktır, böylece Hünsa L4 ulaştı sonra erkekler içeren bir tabak kullanılamaz durumda. Aynı şekilde, Analizi Kaplan-Meier Tahmincisi ve ilişkili eğrileri ve günlük-rank testi ile mortalite verileri için iyi kurulmuş. Ancak, geleneksel ömrü analiz için birkaç dezavantajları vardır. İşleme plakaların tekrar (yani hava için plakalar maruz) hava mantar kirlenme giriş kolaylaştırır. Ayrıca, alay zarar verebilir veya hayvanlar, özellikle öldürmek tekrarlanan nüfus gelişmeler çağda ve kırılgan hale gibi. E. coli (lümen kolonize ve yutak ambalaj) fırsatçı patojen³⁶olur iken büyük hayvanlar büyük ölçüde felçli ve E. coli, içinde mired haline. Çok eski yaşayan hayvanlar sadece ince baş hareketleri tarafından tespit edilebilir. Böylece, bir ayağı çukurda canlı hayvan ölü sınıflandırmak kolaydır. Son olarak, geleneksel yaklaşım tarafından üretilen iş sınırlıdır.

Yineleme kümesi yüksek aktarım yöntemidir ve nicel. Ancak, bu yöntemin dezavantajı zaman ve kaynak kurmak ilk yılında büyük bir yatırımdır. 20'den fazla zaman puan gerektirir (nerede yaklaşık 15 hayvan RNAi klon her zaman noktası başına incelenir) 30.000 L1 hayvanlar hangi çoğu suşları için kolay iken bazı durumlarda sorunlu olabilir 100 RNAi klonlar incelemek için orta derecede büyük bir deney. Örneğin, dengeleyici veya transgenik çizgiler taşıyan sürdürülmesi gereken bir büyük parçacık sıralayıcısı ("solucan sıralayıcısı") suşları olmadan kötü iletilen bir ekstra kromozom dizi kolayca bu yöntemle incelenmesi olamaz. Döl üretim, FUdR veya Dişileştirilmiş genetik arka plan kullanımını gerektiren inhibe olabilir gerekir ki bir ikinci dezavantajdır. Bir yineleme kümesinin her zaman denemenin noktası için başında hazırlamak gerekir gibi son olarak, bir tahlil çalışır, süreyi bilmek gerekir. Ancak, bu yöntemin avantajları, çoktur. Her şeyden önce canlılığı Puanlama çok daha hızlı ve bir kolayca takip edebilirsiniz hayvanlar 100 test koşulları üzerinde aynı anda (yani RNAi klonlar). Yineleme kümesinin bu yana sadece bir kez attı sonra atılır, tekrarlanan hiçbir işleme plakaların olduğunu ya da hayvanların hangi mantar bulaşma olasılığını en aza indirir ve bir solucan ile zaman zaman kaba dürtmeye tarafından neden olduğu ölüm ortadan kaldırır alay seçin. Ayrıca, sıvı de eklenmesi Puanlama büyük ölçüde kolaylaştırır. Eski plaka hayvanlardan boşaltma ve bakteri çevreleyen ince baş hareketleri izin daha kolay gol için asist. Ayrıca sıvı da dayak oranları fitness (Örneğin healthspan^8,37) bir ölçüsü olarak ölçmek için fırsat sağlar.

Yaşlanma sistemleri biyolojik yaklaşımlar çözülmeye kullanımını gerektiren birden çok nedensel mekanizmalarını içeren karmaşık bir olgudur. Bu yaklaşımlar genellikle çok sayıda genomik/transcriptomic veri, kullanarak modelleme, veri temelli birleştirmek ve ömrü ve healthspan ölçmek için tamamlayıcı sağlam ve yüksek işlem hacmi yöntemleri gerektirir. Yineleme kümesi yüksek üretilen iş yöntemi pek çok RNAi klon karşılaştırılması boyuna, toplu iş etkileri ve böylece nedensel yollar arasındaki etkileşimler algılayın dinamik modeller gelişimi kolaylaştırmak teknik hatalar en aza indirerek izin verir nicel bir şekilde. Ayrıca, büyük bir nüfus yaş senkronize hayvanların küçük nüfus bir dizi halinde ayrılmıştır çünkü birkaç genom çapında genomik yaklaşımlar yineleme kümesi yöntemi ile entegrasyonunu mümkün olabilir.

Diğer yöntemler daha önce C. elegans ömrü deneyleri, genellikle geleneksel boyuna yaklaşım adapte üzerinde odaklanarak daha fazla işlem hacmi artırmak için geliştirilmiştir (yani hayvanlar aynı kümesini zamanla takip) için otomatik gözlem ve ortak flatbed tarayıcılar^38,39veya mikrosıvısal plakaları⁴⁰gibi daha özel ekipman kullanarak kaydı. Tarayıcı tabanlı yaklaşımlar bir uyarıcı ışık kullanımı ve aynı anda birden çok plakaları için hareket dayalı canlı/ölü durumunu belirlemek için ardışık olarak çekilen karşılaştırın; Bu tür yaklaşımlar özel bilimsel donanım gerektirmez, zaman kadar iş akışları oluşturduktan yer bağlı olarak istenilen ölçek önemli olabilir. Alternatif olarak, tek hayvan derinlemesine fenotipik karakterizasyonu-zaman içinde ve döl önlemek için ama fabrikasyon mikrosıvısal tabak ve satın alma gerekli tedavi olmadan için özel mikrosıvısal aygıtları ömrü deneyleri izin ilişkili mikrosıvısal pompalar ve görüntüleme ekipman. Buna ek olarak, yineleme kümesi yöntemi burada, ayrıntılı yazılım ile birlikte zaten C. elegansile çalışma laboratuarlarında ortak olan araçları kullanarak büyük ölçüde geliştirilmiş üretilen iş sağlar.

WormLife bilgisayar yazılımı içinde belgili tanımlık gelecek istatistiksel karşılaştırma ve ek platformlarıyla uyumluluk daha kolay erişim sunmak için geliştirilmiş olacak. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için en güncel belgeler üzerinde yazılım test platformları için yükleme yönergeleri dahil olmak üzere GitHub sayfasindan bulunabilir. Herhangi bir yazılım yüklemeye gerek kalmadan uygun erişimi etkinleştirmek için web tabanlı bir sürümü de geliştirilecektir.

Özet olarak, yineleme kümesi yöntemi ve burada ayrıntılı serbestçe kullanılabilir yazılım birleşimi performans ve sağlamlık ömrü deneyleri ve hayatta kalma tabanlı deneyleri (Örneğin geniş bir artırmak için güçlü bir platform sağlar stres toleransı, toksikoloji çalışmalar, healthspan, vb). Özellikle fonksiyonel genomik ile birleştirildiğinde, bu yaklaşım yaşlanma. ilerleme katkıda genetik etkileşimler sayısız deşifre için metazoan modeli sistemi C. elegans pek çok faydaları güçlendirir

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)	Gold Bio	12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm	Thermo-Fisher	242811
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
Air-permeable plate seal	VWR	60941-086
96-pin plate replicator	Nunc	250520
bacto-peptone	VWR	90000-368
bacteriological agar	Affymetrix/USB	10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis	Samuelson Lab	N/A	https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/
Wormbase			http://www.wormbase.org/
OASIS			https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/
Graphpad Prism			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/