Summary
研制了一种光学原位显微镜装置，用于直接监测细胞悬浮液中单个细胞的大小。通过将光光学可消毒探头与自动图像分析相结合，进行实时测量。形态变化表现为依赖生长状态和栽培条件。
Abstract
微生物生物工艺中的原位监测主要限于介质的化学和物理特性（例如，pH值和溶解氧浓度）。然而，细胞的形态可以是最佳条件的合适指标，因为它随着生长状态、产物积累和细胞压力的依赖而变化。此外，单细胞大小分布不仅提供有关种植条件的信息，而且还提供有关种群异质性的信息。为了获得这种信息，研制了一个光学原位显微镜装置1，以便直接监测生物反应器中细胞悬浮液中的单细胞大小分布。基于神经网络模型的自动图像分析与显微镜相结合，该模型使用用户带号的图像进行训练。从显微镜捕获中获得的几个参数与细胞的加工相关特征（如其代谢活性）相关。到目前为止，已采用原位显微镜探针系列测量丝状真菌悬浮液的颗粒大小。用于区分微藻栽培中的单细胞大小，并将其与脂质积累联系起来。细胞颗粒的形状与酵母培养物的萌芽有关。显微镜分析通常可以分为三个步骤：（一） 图像采集，（ii） 粒子识别和 （iii） 数据分析。所有步骤都必须适应生物体，因此需要特定的有分号信息才能获得可靠的结果。能够直接在线或在线（旁路）监控细胞形态的变化，从而在过程开发和生产规模中实现实时值的监测和控制。如果线下数据与实时数据相关，则当前繁琐的线下测量对像元大小的影响变得未知。
Introduction
细胞的形态特征往往与生理状态有关，许多应用存在形态与功能之间的连接。单个细胞的形态受生长状态、细胞年龄、渗透和其他潜在细胞应力或产物积累的影响。细胞的形态变化通常是一种文化生长活力的量度。细胞内产物合成、藻类中脂质积累、细菌内含物形成等都与细胞大小有关。细胞聚集可能是另一个值得研究的因素，最近总结2。
种群异质性可以根据单个细胞的形态特征进行量化。研究表明，一种培养体内的异质性可能很重要，例如，在大规模生产条件下，总产量可能受亚种群低性能4的影响。
通常，细胞的形态特征评估是通过人工采样或与光光学器件耦合的通路流室进行的。这导致几个限制：有限的获取数据很难提供统计上可靠的测量;与过程动态相比，采样与结果可及性之间的时间延迟可能太长;最重要的是，取样过程（取样口的位置、测量前样品的预处理、取样或旁路管中的不利条件）可能会触发有偏差的错误，因为采样过程本身已经会影响细胞形态。最后，在取样过程中或在通过式溶液中，如果它们不能就地消毒，则始终存在很高的污染风险。
原位显微镜（ISM）的应用可以绕过其中的几个问题。如果细胞被自动检测到，可以调查其形态特征的正确识别5。到目前为止，这种方法的主要局限性是：（i） 图像的评估时间，对于原位应用来说太长，以及 （ii） 图像分辨率差，特别是在高单元密度下。虽然ISM的第一个解决方案包括机械取样，稀释探头，或限于一个通过系统6，7，进一步的方法允许捕获细胞悬浮直接8。
ISM的最新进展允许在单细胞基础上对细胞进行在线或在线监测，从而在细胞浓度相当高的细胞悬浮液中直接实时地分布形态参数。通过对细胞关键参数的线下分析，可以识别与耦合自动细胞检测和ISM提供的信息的相关性。然后，实现了新的软传感器设计，其中用单细胞形态估计了不可测量的参数。
在本报告中，ISM是通过将光光学探头与自动图像分析耦合来进行的。ISM 由单杆传感器探头组成，该探头可通过高分辨率 CCD 摄像机 [MM-Ho + CCD GT2750 （2750x2200） 和 MM 2.1 = CMOS G507c （2464x2056）]在可调节的测量间隙中捕获已知对焦范围内的图像。闪光灯照明通过传输进行。因此，光线来自摄像机9的另一侧，可以调整其强度。细胞通过液体流动连续通过这个间隙。因此，获得了具有代表性的样本总体。探头可直接安装在生物反应器上，使其伸入细胞悬浮液，或可灭菌的通过。传感器外壳在灭菌前连接到系统，光学部件随后安装到外壳中。
到目前为止，相关工业微生物，如丝状真菌（直径高达200μm），异营养微藻Crypthecodiniumcohnii（平均细胞直径为20μm），以及酵母糖霉菌（平均细胞直径为5μm），被研究，这是不久描述的。
在一定的栽培条件下，丝状真菌往往形成颗粒。这些大小高达几百微米。真菌细胞的子宫在流体阶段对流体动力学应力的依赖性不同。这对代谢和生长活性、基质摄入和产品释放有影响。ISM用于识别颗粒大小分布和颗粒边缘低生物量密度区域的宽度（自己的未发布数据）。
当细胞在氮限制下积累多不饱和脂肪酸多糖六烯酸（DHA）时，cohnii的体积在15至26μm之间改变。这种生物技术DHA生产工艺由两部分组成，即细胞分裂和变小的生长阶段，以及细胞积累产品并因此变大的生产阶段。因此，细胞大小用于确定过程状态，其中生长或DHA生产有利。最后，发现细胞大小与DHA含量之间的相关性。在这种情况下，ISM允许实时监测细胞内DHA积累，无需取样、细胞中断和常见的气相色谱分析10。
发芽酵母的大小通常在3至8μm之间。一次处于成熟状态的细胞比例，如萌芽指数（BI）所述，提供了生长活力11、12的信息，甚至与重组蛋白分泌的关系也已被证明为13。在ISM的帮助下，萌芽和非发芽的酵母细胞（有芽和无芽的细胞）被区分为14。压力条件还可能导致酵母群体中细胞大小的更大变化，正如最近在缩小栽培中显示的，其中大规模营养有限喂养批次种植的条件被模仿为3。
因此，ISM有可能在生物过程的所有阶段监测单细胞水平上的生长活力和产品形成，以识别最佳的培养条件，或用于过程控制。本文描述的方法侧重于单细胞的微生物应用，但也适用于较大的颗粒，如人类和动物细胞、细胞聚集物和丝状生物颗粒。
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Protocol
注：以下步骤是使参数适应各自的微生物和培养条件所必需的。对于有经验的用户，探头设置的调整持续约 20 分钟。SOPAT GmbH 的相应探测手册中详细介绍了工具和步骤。通常，需要以下协议中提供的工具：（i） 探头控制器用于探头调整和图像采集;（二） 探头控制器用于探头调整和图像采集;（三） 探头控制器用于探头调整和图像采集;（三）探头控制器用于探头调整和图像采集。（二）斐济（ImageJ）对获取的图像进行注释;（三） 对人工神经网络（ANN）训练和工作流程创建的支持;（iv） 使用已获取的图像进行数据批处理的批处理器，具有工作流;（五）结果分析器，用于对批处理图像进行结果可视化和评估;和 （vi）监控，实现自动实时测量和结果可视化。
1. 设置硬件参数
- 准备在实验或离心机期间可能达到的细胞浓度最高的培养基，并重新悬浮颗粒，以实现这种浓度。在这种情况下，为S.cerevisae栽培选择65 gL-1的干生物质浓度。
- 准备不同的稀释液，从最高浓度到最低浓度不等，以便完全覆盖预期范围。建议至少4种不同的浓度。
- 用传统的显微镜识别微生物的细胞大小范围。定义各细胞的预期最大直径 （d最大） 。此值设置为 8 μm，如果S. cerevisae.
- 选择两个测量间隙，其尺寸为细胞的预期 d最大值的 5 倍和 10 倍。
- 选择最大频闪镜强度。为细胞浓度最高的两个间隙选择频闪镜强度，以便在光照强度最低的图像（最暗图像）上仍然可以看到细胞。
- 选择最小频闪镜强度，然后为两个间隙选择频闪镜强度，以便在光照强度最高的图像（最亮图像）上仍然可以看到细胞。使用可能出现在测量期间的最小细胞浓度。
- 选择一个对焦位置，该位置可为每个测量间隙生成最清晰的图像，用于频闪镜强度和需要测试的浓度范围（有关对焦的详细信息，请参阅步骤 2）。对焦单元格适当地，以便图像数据可以随后进行点影（请参阅步骤 4）。
- 测量先前制备的细胞浓度稀释系列（参见步骤 2），同时测量间隙宽度和频闪镜强度。
图1：浓度校准工具。左 GUI：设置已知浓度的图像目录（最小 3）;中心 GUI：选择要在图像目录上计算的功能;右 GUI：选择加权根均方误差 （WRMSE） 以识别最小值。WRMSE 和任何图像特征和细胞浓度之间的最佳相关性。请点击此处查看此图的较大版本。
- 评估稀释系列实验。
- 使用浓度校准 （CoCa） 工具（参见图 1）确定提取的图像特征（亮度或锐度）与用户以前测量的浓度（例如干生物质或细胞计数）之间的最佳相关性。有关详细信息，请按照软件手册中的说明操作。
- 与任何线外测量相比，确定从不同浓度的图像特征中提取的信息之间的最佳相关性。参见图 1的图例。
- 在考虑浓度相关性曲线和导致最小加权根均方误差 （WRMSE） 的特征的情况下，选择最合理的测量间隙和频闪镜强度。
注：测量间隙在实验过程中是固定的，而频闪镜强度可根据细胞浓度进行调整。
2.线外测量
- 借助厚度计，根据步骤 1 调整所需的测量间隙。
- 在 SOPAT 仪表板中打开图形用户界面探测器控件。
- 在软件小节操作中将所需的探头连接到放大器，然后按"连接"。
- 按"播放"按钮开始流式传输 （实时视图）。
- 将乙醇喷洒到间隙中，并用光学纸仔细擦拭灰尘或污垢，以清洁测量间隙。检查传感器的玻璃是否不含带凸轮控制中实时视图的颗粒。
注：颗粒和灰尘干扰测量和自动细胞识别。 - 将干光纸放入测量间隙。打开"探头"控制片并调整频闪镜强度，以便将纸张可视化。转动装订螺钉，直到清楚地看到纸张的单个纤维。
- 用培养汤填充管子。将显微镜浸入培养汤中，使间隙完全覆盖细胞悬浮液。打开"探头"控制，并根据第 1 节调整所需的频闪镜强度。通过微调对焦结合螺钉，聚焦电池。实验期间不得再更改焦点
注：将5-6 mL的培养汤添加到50 mL锥形离心管中，以充分浮动测量间隙。 - 在"每个触发器的 GUI帧"中的菜单中定义用户界面中每个时间点 [-] 的帧数。将每个触发器的帧数设置为 200 帧。
注： 帧数可以减少到最低值，这是统计可靠结果所必需的。这取决于获得具有代表性的形态细胞大小分布所需的样本大小（另请参阅步骤 5）。 - 在菜单中定义帧速率 [Hz] 在 GUI帧速率中触发。选择确保从上一帧移动的粒子不会出现在以下帧中的帧速率。
注： 这可以通过具有 200 帧的测试触发器进行验证。检查图像中是否有重复捕获的粒子。如果是这种情况，则降低帧速率。对于线下测量，建议使用 1 Hz。 - 在"常规"菜单中设置将保存获取图像的目录。
- 通过激活"开始"图像触发采集按钮来执行图像采集。将带培养悬浮液的管子轻轻上下移动，以诱导流过测量间隙。
- 每次测量后重复步骤 2.5。
- 检查获取的图像。单元格必须足够锋利才能进行注释。检查图像中是否有重复捕获的粒子。如果是这种情况，则降低帧速率。
- 通过选择以下路径保存设置：C：\程序文件\SOPAT GmbH_监控程序_凸轮控制，然后按"保存"。
3. 粒子识别
- 为人工神经网络 （ANN） （定型集） 的训练对粒子进行批号。
- 通过将文件拖放到主"ImageJ"窗口中，将获取的图像加载到注释工具"斐济，ImageJ"中（参见图2中的GUI"Fiji"工具）
- 通过选择：分析 |工具 |ROI 经理.
- 选择选择工具。建议使用魔杖（追踪）工具、手绘、椭圆形或椭圆形选择。
- 在粒子周围画一个圆圈，该圆应使用前面提到的选择工具进行加名，然后使用画笔工具对其进行优化。
- 按Add _t"将注释添加到ROI 管理器。
- 在大约 15 个图像上标记所有感兴趣对象（要识别的单元格）。
注：为了涵盖所有必要的信息，即不同的形状、大小、细胞浓度、亮度等，从一开始就使用五个图像，从中间的五个图像，以及从实验结束时的五个图像。 - 决定，如果细胞需要分类在不同的子类，由于其形状（例如，细胞周期的不同阶段），或者如果所有细胞是同一类。
- 相应地更改每个选定粒子的名称。为每个类设置一个名称或缩写，并为类的每个粒子设置一个计数器（例如，cell_1、cell_2等）。每类至少点分50个粒子。
- 不要为不应检测到的对象加分，因为它们与过程无关，例如气泡或其他颗粒（如未溶解的介质组件）。
注：这些活动将不包括在ANN的培训程序中，并被视为背景。 - 不要对焦点外的单元格进行批号。
- 尽可能一致地对图像进行点号。如果有疑问，可以应用"忽略"标签。强烈建议不要滥用其使用，因为 ANN 只会识别标记的结构。
图2：斐济工具用户界面。使用带分号的图像创建训练集。描述了由两个类组成的手动注释，在 ROI 管理器中显示了带注释的粒子列表。可以为不同的类设置不同的名称和颜色。请点击此处查看此图的较大版本。
- 将带过的标号对象和图像保存到 ZIP 格式，并通过上载到平台或通过电子邮件发送ZIP 文件将文件发送到培训网络。
注： 通常，它需要多次迭代训练轮，以确定图像上分类对象的充分预测。每个训练轮导致程序返回的工作流。 - 将工作流 （*.wf） 与经过训练的对象识别算法一起使用可在仪表板中启动的数据批处理程序Batcher分析测试图像。
- 通过定量阳性和阴性事件来检查测试图像上的对象检测。
- 量化误报事件的检测：错误地检测为细胞的粒子、未正确分类的细胞以及轮廓未识别良好的细胞。
- 量化假负事件（无法识别的单元格）。
- 通过在仪表板中启动程序，在工具结果分析器中可视化结果。
- 使用文件导入所需的结果文件|导入文件或文件 |导入文件夹。
- 按图表可视化结果|在图表 GUI 上创建图表。
- 选择以下选项之一：分布图、灵敏度图、随时间显示的特征、测量点的特征以及要素与要素。
注： 系统随附了有关结果分析器利用率的手册，并且支持也提供。 - 如果结果可以接受，则在批处理器中对实验的所有获取图像运行工作流。同时，通过将探测控制器（*.pcfg） 中保存的设置与工作流 （*.wf） 相结合，可以创建监视程序，另请参阅手册。
注： 工作流还可用于监视此培养媒体的未来实验。 - 如果结果不可接受，请检查训练集上的注释和/或继续另一轮迭代训练（请参阅步骤 4.2）。
4. 样品尺寸定量
- 设置检测到的粒子中可接受的标准偏差 （*）。
注： 标准偏差与像元大小均质平行变化。最大标准偏差表示具有最高大小异质性的样本。 - 设置置信区间的振幅或与预期测量方差（e）相关的所需精度。
- 将承认误差 （+） 设置为 5% （z1-+/2 = 1.96） 和 10% （z1-+/2 = 1.64） 之间。
- 计算从公式 1 中每个类标识的单元格数。
[公式 1]
注： 根据单元格数，可以为每个数据点定义需要获取的图像数。 - 对实验的随机时间点执行灵敏度分析，检查 n 粒子的分析是否导致平均 Feret 直径和 Dv90 小于 5% 的变异性。它可以在结果分析器中自动计算。
[公式 1]5.在线（旁路）或在线测量
- 首先执行线下测量过程（参见步骤 2），以便将硬件和软件设置设置为有机体和过程（浓度或介质）的函数。
- 通过选择"加载"按钮上传上一节中保存的设置，然后选择以下路径：C：\程序文件\SOPAT GmbH_监控程序_凸轮控制。
- 将探头连接到流动单元或生物反应器。
注：使用捏合法兰可以进行原位测量。 - 进行灭菌。
注：只有仪器的探头湿材料才能通过蒸汽灭菌进行灭菌。探头润湿长度可为6至222毫米（图3）。
图 3：ISM设备的草图。探针MM-Ho （A） 可直接安装在生物反应器中，而探针MM 2.1 （B） 可用作旁路。文化汤流通在每张图片上都用箭头标记。对于 MM-Ho，转换系数为 0.166 μm pix-1，对于 MM 2.1，转换系数为 0.087 μm pix-1。请点击此处查看此图的较大版本。
- 在"触发间隔 [s]"字段中定义 GUI触发中的图像采集速率。
注：根据过程动态，图像采集速率可以调整。例如，如果预期滞后阶段为 3 小时，则采集率可能低于应监测代谢变化或产品积累。通常，这需要在分钟范围内缩短采集时间。例如，在一批酵母培养期间，5到10分钟之间的图像采集序列提供了足够的信息来捕获过程动态。 - 定义步骤 2.10 中所述的帧速率。
注：在在线和线测量中，帧速率可以增加，因为机械搅拌可以增加通过间隙的流速。 - 通过激活按钮"开始流"选定探测器启动图像采集。
- 当实验完成时，停止采集，按钮停止流选定的探头。
注： 对于第 1次运行，在培养的接种之前开始采集，然后继续执行步骤 4。对于以下运行，请在仪表板中打开程序监视并选择创建的工作流（请参阅步骤 4）。在培养部分接种之前，按下"播放"按钮启动监控。
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Representative Results
利用ISM和自动图像检测成功检测酵母培养物中的细胞大小，以区分萌芽细胞和非发芽细胞。频闪镜强度和测量间隙的选择都有一个公差范围，其中颗粒识别不受影响。例如，在干生物质浓度为4 gL-1的11%的变异范围内，用各种频闪镜强度测量S.cerevisiae细胞。相应的图像提供了清晰的细胞边界，因此，在细胞大小可接受的变化（1%）下，粒子识别是可行的。无论频闪镜强度如何。如果频闪镜强度未正确调整，图像会因过度照明而受到影响，因此无法进行适当的单元识别（图 4）。
图 4：图像采集功能。各种频闪镜强度的示例（SI-%）和测量间隙（MG-μm），用于捕获S.cerevisia细胞（SI和MG的现值在括号中指示）：A（25，50）; B （50， 50）;C （25， 80）;和D （50， 80）。请点击此处查看此图的较大版本。
到目前为止，在原位测量期间无法重新调整测量间隙。因此，稀释系列实验对于保证整个栽培过程中可靠的数据至关重要。主要问题是由于细胞浓度增加而出现无法识别的重叠事件。
可可视化加载数据文件中所有检测到的单元的灵敏度图（特征值的灵敏度分析，例如，相对于粒子数 n 的平均细胞直径）（图 5）。用户必须决定需要哪个过程参数的稳定性。在这种情况下，一个有效数据点所需的最小单元格数。因此，可以分析一个数据点中的或多或少的图像。
图5：平均细胞直径灵敏度图。平均细胞直径的变异性与检测到的粒子数量的依赖性。约 1，000 个细胞可实现平均细胞直径的常值。请点击此处查看此图的较大版本。
注释是实现粒子识别所需的精度的关键点。图 6显示了"用户注释"（A）的示例，该示例用作神经网络的训练集，以及用于评估（B）的测试集图像（神经网络的未知数据）上的粒子标识。两个图像的识别事件率应该相似。
图6：用户注释（训练集）和自动检测（测试集）的比较。训练集：带影和原始图片分别以A和A'中描述。此图片的信息用于训练 ANN。 测试集：训练后创建的工作流 ANN 应用于捕获，这些工作流尚未用于训练：从原始捕获B'中自动识别的单元格（如B所示）。请点击此处查看此图的较大版本。
作为细胞内产物积累对细胞大小分布的影响的实例，在异营养微藻C.cohnii中研究了多不饱和脂肪酸多糖六烯酸（DHA）通过氮限制积累的积累。证明产品积累可以通过ISM10进行定量检测。该方法目前用于研究搅动生物反应器中的剪切力对细胞形态异质性的影响。
萌芽酵母S.cerevisiae的成熟状态被量化。在萌芽的情况下，一次处于成熟状态的细胞的比例（与BI一起描述），提供生长活动和种群异质性的信息。自动细胞识别能够识别并区分在细胞悬浮15中成功发芽和非发芽（或子细胞）。三个样本的单元大小分布如图7所示。向较小细胞的转变表示群体中萌芽细胞的较低部分。
图7：累积单细胞大小分布。在培养过程中以 3 小时（直线）、7 小时（虚线）和 13 小时（虚线）测量的细胞大小分布。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此处提供的ISM具有相同或非常相似的装置，用于测量真菌、微藻和酵母细胞的形态动力学，从而能够确定生长活性，在藻类的情况下，细胞内产品积累。该传感器没有可移动部件，可直接适用于任何标准搅拌罐生物反应器，无论是通过标准端口还是可灭菌的通过。由于酵母比藻类小得多，因此细胞尺寸的减小需要一些最近的硬件调整，如更高的摄像机分辨率和传输照明，以便获得足够的酵母像素分辨率（有关技术细节，见15）。然而，测量更小的细胞（如细菌）仍有局限性。电流原位光光学仪器表明，在高浓度下重叠粒子信息的限制，以及UV/VIS光谱下结构的干扰效应。到目前为止，除了亮度相关性16外，细菌悬浮物的图像分析算法还没有应用。
其他以前应用的 ISM 工具用于确定细胞浓度，以显示其可靠性。然而，如果细胞在高浓度下相互重叠，这就变得至关重要。因此，本研究的重点不是细胞定量，而是形态特征检测，而亮度强度等图像特征可以与其他设备一样与细胞密度相关，也与其他设备一样。否则，所有这些装置将限于低细胞浓度;使用细胞识别方法时，评估酵母细胞约20 gL-1的最大浓度，而使用聚类大小算法时评估80 gL-1。
为了跟踪细胞的形态特征，需要精确检测其边缘。对于藻类，这是相当简单的，因为大小的变化，但形式保持不变，在整个过程阶段的过渡。相反，酵母细胞由于其形式而提供了更大的挑战，当细胞萌芽时，这种形式不能近似于球体或椭圆。然而，直到现在，在ISM测量18中，细胞是一个完美的球体的假设下计算了细胞大小。尽管在某些情况下，这种近似值与实际情况接近，但无法正确评估更复杂的形式，如萌芽细胞或棒状细胞。然而，在这项研究中，由于通过机器学习算法实现了灵活的边界检测，因此成功地分析了不同的形式。此外，重叠事件仍在调查中，19日是为了进一步达到发展阶段。
目前，活力和活力评估的黄金标准是计算菌群形成单位或用可生存性染料20染色样品，例如亚甲蓝或亚甲紫21;但是，此过程可能会影响结果。每当这些特征与细胞形态22相关时，通过ISM的不断增加的潜力来探索快速评估它们的潜力。此外，关键工艺参数和/或质量属性23可能与形状、聚集和颗粒形成有关，所有参数都可以由 ISM 进行监控。
目前对生物工艺中经常使用的其他主要微生物进行调查。对象识别算法和特征提取用于特征分析的时间主要取决于图像的复杂性和结果的预期准确性。将来，将考虑彩色图像捕获，以进一步扩大信息范围，这些信息可以在单细胞水平上获得，例如，如果颜料被积累或在转基因生物中，其中彩色标记被整合。
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Disclosures
作者没有什么可申报的。
Acknowledgments
作者感谢德国联邦经济和能源部在ZIM-Koop框架内的支持，该项目"智能过程检查"，赠款No.采至 4184201CR5。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor MM 2.1 - MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
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