Summary
En foto-optisk in situ mikroskopi enhed blev udviklet til at overvåge størrelsen af enkeltceller direkte i cellen suspension. Real-time målingen udføres ved at koble den fotooptiske steriliserbare sonde til en automatiseret billedanalyse. Morfologiske ændringer vises med afhængighed af vækst tilstand og dyrkningsbetingelser.
Abstract
In situ monitorering i mikrobielle bioprocesser er for det meste begrænset til kemiske og fysiske egenskaber af mediet (f. eks.pH-værdi og koncentrationen af opløst ilt). Ikke desto mindre kan morfologien af celler være en passende indikator for optimale betingelser, da det ændrer sig med afhængighed af vækst tilstand, produkt ophobning og celle stress. Desuden giver en enkelt celle størrelsesfordeling ikke kun oplysninger om dyrkningsforholdene, men også om befolkningens heterogenitet. For at få sådanne oplysninger, en foto-optisk in situ mikroskopi enhed1 blev udviklet for at muliggøre overvågning af enkelt Cellestørrelse fordeling direkte i cellen suspension i bioreaktorer. En automatiseret billedanalyse er koblet til mikroskopi baseret på en neuralt netværksmodel, som er uddannet med bruger kommenterede billeder. Flere parametre, som er opnået fra erobringen af mikroskop, er korreleret til at behandle relevante funktioner i cellerne, ligesom deres metaboliske aktivitet. Indtil nu blev den præsenterede in situ mikroskopi sonde serie anvendt til at måle pellet størrelsen i filamentøse svampe suspensioner. Det blev brugt til at skelne enkelt Cellestørrelse i mikroalger dyrkning og relatere det til lipid ophobning. Formen af cellulære partikler var relateret til spirende i gær kulturer. Mikroskopi analysen kan generelt opdeles i tre trin: (i) image erhvervelse, (II) partikel identifikation, og (III) dataanalyse, hhv. Alle trin skal tilpasses til organismen, og derfor kræves der specifikke kommenterede oplysninger for at opnå pålidelige resultater. Evnen til at overvåge ændringer i cellernes morfologi direkte i line eller on line (i en by-pass) muliggør realtids værdier for overvågning og kontrol, i procesudvikling samt i produktionsskala. Hvis off line data korrelerer med real-time data, de nuværende kedelige off line målinger med ukendte påvirkninger på Cellestørrelse bliver unødvendigt.
Introduction
Morfologiske funktioner i celler er ofte relateret til den fysiologiske tilstand, en forbindelse mellem form og funktion findes for mange applikationer. Morfologien af en enkelt celle påvirkes af vækst tilstanden, cellens alder, osmotiske og andre potentielle celle belastninger eller produkt akkumulering. Morfologiske ændringer af celler er ofte et mål for vækst vitalitet af en kultur. Intracellulære produkt syntese, lipid ophobning i alger og inklusion krop dannelse i bakterier, blandt andre, er relateret med Cellestørrelse samt. Celle agglomerering kan være en anden faktor, der er værd at undersøge som opsummeret for nylig2.
Populations heterogeniteter kan kvantificeres baseret på morfologiske træk ved individuelle celler. Undersøgelser viste, at heterogenitet inden for en kultur kan være signifikant, fxunder store produktionsforhold3 det samlede udbytte kan blive påvirket af en lav præstation af subpopulationer4.
Normalt udføres vurderingen af morfologiske træk af celler ved manuel prøvetagning eller med et by-pass flow kammer koblet til en foto-optisk enhed. Dette fører til flere begrænsninger: den begrænsede mængde af erhvervede data kan næppe give statistisk pålidelige målinger; tidsforsinkelsen mellem prøveudtagningen og tilgængeligheden af resultaterne kan være for lang i forhold til processens dynamik; og vigtigst er det, at prøvetagningsproceduren (placering af prøvetagnings havnen, forbehandling af prøven før målingen, ugunstige forhold i prøveudtagnings-eller bypass-røret) kan udløse en partisk fejl, da selve prøve proceduren allerede kan påvirke celle Morfologi. Endelig findes der altid en høj risiko for kontaminering under prøvetagning eller i ved-pass-løsninger, hvis de ikke er steriliserbare på plads.
Anvendelse af in situ -mikroskopi (ISM) kan omgå flere af disse problemer. Hvis celler registreres automatisk, kan en korrekt identifikation af deres morfologiske funktioner blive undersøgt5. Indtil nu var de vigtigste begrænsninger ved denne metode (i) evaluerings tiden for billeder, som var for lang til in situ -applikationer, og (II) den dårlige opløsning af billeder, især ved høje celle tætheder. Selv om de første løsninger af ISM omfattede mekanisk prøvetagning, fortynding af sonden, eller var begrænset til en by-pass-system6,7, yderligere tilgange tillader opsamling af cellesuspensionen direkte8.
Nylige fremskridt inden for ISM giver mulighed for i linje eller på linje overvågning af celler på en enkelt celle basis, som giver fordelingen af morfologiske parametre i realtid direkte i celle suspensioner ved betydeligt høje celle koncentrationer. Gennem off-line analyser af cellernes nøgleparametre kan korrelationer med oplysninger fra den koblede automatiserede celle detektering og ISM identificeres. Derefter opnås nye bløde sensor designs, hvor en umålelig parameter estimeres med en enkelt celle morfologi.
I denne rapport er ISM gennemført ved at koble en foto-optisk sonde til en automatiseret billedanalyse. ISM består af en enkelt-stang sensor sonde, der gør det muligt at fange billeder inden for et kendt fokusområde i en justerbar måle kløft med et højopløsnings-CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) og MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Blitzen lys belysning udføres ved transmission. Derfor stammer lyset fra den modsatte side af kameraet9 , og dets intensitet kan justeres. Cellerne passerer kontinuerligt gennem dette hul med væskestrømmen. Derfor opnås en repræsentativ stikprøvepopulation. Sonden kan monteres direkte på bioreaktoren, så den når ind i cellesuspensionen, eller den kan bruges i en steriliserbar by-pass. Sensor skallen er sluttet til systemet før sterilisering, de optiske dele er bagefter monteret i skallen.
Indtil nu, relevante industrielle mikroorganismer, f. eks, filamentøse svampe (diameter på op til over 200 μm), heterotrofisk mikroalger Crypthecodinium cohnii (gennemsnitlig celle diameter på 20 μm), og gær Saccharomyces cerevisiae (gennemsnitlig celle diameter på 5 μm), blev undersøgt med denne eller lignende anordninger, som er kort beskrevet.
Filamentøse svampe har tendens til at danne pellets under visse dyrkningsbetingelser. Disse er af en størrelse på op til flere hundrede μm. Hyfer af svampecellerne udvikler forskellige længder i afhængighed af den hydrodynamiske stress i væskefasen. Dette har en indflydelse på den metaboliske og vækst aktivitet, substrat optagelse og produktfrigivelse. ISM blev anvendt til at identificere pellet størrelsesfordelingen og bredden af zoner med lavere biomasse tæthed ved kanterne af pellets (egne ikke-offentliggjorte data).
Størrelsen af C. cohnii ændrer sig mellem 15 og 26 μm, når cellerne akkumulerer den flerumættede fedtsyre docosahexaensyre Acid (DHA) under kvælstof begrænsning. Denne bioteknologiske DHA-produktionsproces består af to dele, vækstfasen, hvor cellerne deler sig og bliver mindre, og produktionsfasen, hvor cellerne akkumulerer produktet og dermed bliver større. Derfor blev cellestørrelsen brugt til at bestemme proces tilstanden, hvor enten vækst-eller DHA-produktionen var gunstig. Endelig blev der fundet en sammenhæng mellem cellestørrelsen og DHA-indholdet. I dette tilfælde, ISM gør det muligt at overvåge intracellulære DHA akkumulering i realtid uden krav om prøvetagning, celle afbrydelse, og den fælles gaskromatografi analyse10.
Spirende gær er normalt af en størrelse mellem 3 og 8 μm. Andelen af celler, der er i modning tilstand ad gangen, som beskrevet med spirende indeks (BI), giver oplysninger om vækst vitalitet11,12, og selv en relation med rekombinant protein sekretion er blevet bevist13. Ved hjælp af ISM blev spirende og ikke-spirende gærceller (celler med og uden opløbet) fremtrædende14. Stress betingelser kan også føre til en bredere variation af cellestørrelsen inden for en gær population, som for nylig vist i Scale-down dyrkning, hvor betingelserne for storstilet næringsstof-begrænset fodret-batch dyrkning blev efterlignes3.
Derfor har ISM potentiale til at overvåge vækst vitalitet og produkt dannelse på et enkelt celleniveau i alle stadier af en bioprocess til identifikation af optimale dyrkningsforhold eller med henblik på proceskontrol. De metoder, der er beskrevet her, fokuserer på mikrobielle anvendelser med enkeltceller, men gælder også for større partikler som humane og animalske celler, celle agglomerater og pellets af filamentøse organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: følgende trin er nødvendige for at tilpasse parametrene til de respektive mikroorganismer og dyrkningsbetingelser. Justeringen af sonde indstillingerne varer ca. 20 min. for en erfaren bruger. En detaljeret beskrivelse af værktøjer og trin er angivet i den tilsvarende sonde manual fra SOPAT GmbH. Generelt er de værktøjer, der er præsenteret i følgende protokol er nødvendige: (i) Probe controller til sonde justeringer og image erhvervelse; (II) Fiji (ImageJ) for anmærkninger om erhvervede billeder; (III) Sopat støtte til kunstig neurale netværk (Ann) uddannelse og workflow skabelse; (IV) batcher til data batchbehandling ved hjælp af allerede erhvervede billeder med en arbejdsproces; (v) resultat analysator for resultat visualisering og evaluering af batch forarbejdede billeder; og (vi) Monitor til automatiseret real-time måling og resultat visualisering.
1. indstilling af hardware parametre
- Forbered en kultur med den højeste celle koncentration, der kan opnås under forsøget, eller centrifuge og resuspension af pellet for at opnå denne koncentration. I dette tilfælde blev 65 g L-1 af tør biomasse koncentration valgt for S. cerevisiae -dyrkning.
- Forbered forskellige fortyndinger, der spænder fra den højeste til den laveste koncentration, så det forventede område er fuldt dækket. Der anbefales mindst 4 forskellige koncentrationer.
- Identificer mikroorganismens celle størrelsesområde med konventionel mikroskopi. Definer den forventede maksimale diameter (dMax) for de respektive celler. Denne værdi er indstillet til 8 μm i tilfælde af S. cerevisiae.
- Vælg to måle huller på 5x og 10x af den forventede dMax af cellerne.
- Vælg den maksimale stroboskop intensitet. Vælg stroboskop intensiteter for begge huller med den højeste celle koncentration, så cellerne stadig er synlige på billederne med den laveste lysintensitet (mørkeste billeder).
- Vælg den mindste stroboskop intensitet, og vælg derefter stroboskop intensiteter for begge huller, så cellerne stadig er synlige på billederne med den højeste lysintensitet (lyseste billeder). Brug den laveste celle koncentration, som sandsynligvis vises i måleperioden.
- Vælg en fokus position, som giver de skarpeste billeder for hvert måle tomrum, for både stroboskop intensiteter og for det koncentrationsområde, der skal testes (Se trin 2 for detaljer om fokusering). Fokusér cellerne korrekt, så billeddataene kan kommenteres bagefter (Se trin 4).
- Mål den tidligere forberedte fortyndings serie for celle koncentrationen (Se trin 2) med både spaltebredder og stroboskop intensiteter.
Figur 1: kalibreringsværktøj til koncentration. Venstre GUI: Indstil billedmapper (minimum 3) med kendte koncentrationer; Central GUI: Vælg funktioner, der skal beregnes på billedmappen; højre GUI: Vælg den vægtede gennemsnitlige kvadratiske fejl (WRMSE) for at identificere minimum. WRMSE og den bedste sammenhæng mellem en billedfunktion og celle koncentrationen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Evaluere eksperimentet med fortyndingsserier.
- Brug værktøjet til koncentrations kalibrering (CoCa) (Se figur 1) til at identificere den optimale korrelation mellem de udtrukne billedfunktioner (lysstyrke eller skarphed) og de tidligere målte koncentrationer, som brugeren har givet, fxtør biomasse eller celletal. Følg instruktionerne i softwaremanualen for yderligere oplysninger.
- Identificer den optimale korrelation mellem de udtrukne oplysninger fra billedfunktionerne ved forskellige koncentrationer sammenlignet med eventuelle off line -målinger. Se legenden om figur 1.
- Vælg den mest rimelige måle kløft og stroboskop intensiteter under overvejelse af koncentrations korrelations kurven med de funktioner, der resulterer i den mindste vægtede gennemsnitlige kvadratiske fejl (WRMSE).
Bemærk: måle gabet fastsættes under forsøget, hvorimod stroboskop intensiteten kan tilpasses efter celle koncentrationen.
2. off line måling
- Juster det ønskede måle mellemrum i henhold til trin 1 ved hjælp af en tykkelses måler.
- Åbn den grafiske brugergrænseflade sonde kontrol i sopat Dashboard.
- Tilslut den ønskede sonde til forstærkeren i under afsnittet software under afsnit, og tryk på Connect.
- Tryk på Play -knappen for at starte streaming (Live View).
- Rengør måle hullet ved at sprøjte ethanol ind i hullet og tør forsigtigt støv eller snavs af med et optisk papir. Kontrollér, at sensorens glas er fri for partikler med Live View i camcontrol.
Bemærk: partikler og støv forstyrrer målinger og automatisk celle identifikation. - Anbring et tørt optisk papir i måle hullet. Åbn fanen Probe kontrol , og Juster stroboskop intensiteten for at visualisere papiret. Drej bindings skruen, indtil papirets enkeltfibre er tydeligt set.
- Fyld et rør med kultur bouillon. Dyp mikroskopet i kulturen bouillon, så hullet er fuldt dækket med cellesuspension. Åbn fanen Probe kontrol og Juster den ønskede stroboskop intensitet i henhold til punkt 1. Fokuser på cellerne ved at finjustere fokus bindings skruen. Fokus må ikke ændres længere under eksperimentet
Bemærk: 5-6 mL kultur bouillon tilsættes til et 50 mL konisk centrifugal rør for at flyde måle hullet tilstrækkeligt. - Definer antallet af frames pr. tidspunkt [-] i brugergrænsefladen i menuen, som udløser i GUI- rammer pr. udløser. Angiv antallet af rammer til 200 billeder pr. udløser.
Bemærk: antallet af rammer kan reduceres til den laveste værdi, hvilket er nødvendigt for et statistisk pålideligt resultat. Dette afhænger af den stikprøvestørrelse, der kræves for at opnå en repræsentativ fordeling af morfologiske cellestørrelser (Se også trin 5). - Definer frame rate [Hz] i menuen udløser i GUI frame rate. Vælg en billedhastighed, der garanterer, at bevægelige partikler fra en tidligere ramme ikke vises i følgende ramme.
Bemærk: Dette kan bevises med en test udløser med 200 frames. Undersøg billederne for partikler, som er fanget gentagne gange. Hvis det er tilfældet, bør du sænke billedhastigheden. For off line -målinger anbefales 1 Hz. - Indstil mappen, hvor de erhvervede billeder vil blive gemt, i menuen Generelt.
- Foretag en billed erhvervelse ved at aktivere knappen Start billede Trigger . Bevæg røret med kultur suspensionen forsigtigt op og ned for at fremkalde et flow gennem måle hullet.
- Gentag trin 2,5 efter hver måling.
- Tjek de erhvervede billeder. Cellerne skal være skarpe nok til annotering. Undersøg billederne for partikler, som er fanget gentagne gange. Hvis det er tilfældet, bør du sænke billedhastigheden.
- Gem indstillingerne ved at vælge følgende sti: C:\programmer\sopat GmbH\monitoringPrograms\camcontrol, og tryk på Gem.
3. partikel identifikation
- Ansæt partikler til træning af det kunstige neurale netværk (ANN) (Trænings sæt).
- Indlæse de erhvervede billeder i anmærknings værktøjet "Fiji, ImageJ" ved at trække og slippe filen i de vigtigste "ImageJ" vindue (Se GUI "Fiji" værktøj i figur 2)
- Åbn ROI Manager ved at vælge: analysér | Værktøjer | ROI Manager.
- Vælg et markeringsværktøj. Værktøjet stav (Tracing), frihånds-, oval-eller elliptiske markeringer anbefales.
- Tegn en cirkel omkring partiklen, der skal kommenteres med markeringsværktøjerne nævnt før og derefter raffinere den med penselværktøjet.
- Føj anmærkningen til ROI Manager ved at trykke på Add [t].
- Marker alle objekter af interesse (celler, der skal identificeres) på omkring 15 billeder.
Bemærk: for at dække alle nødvendige oplysninger, dvs forskellige former, størrelser, koncentration af celler, lysstyrke, etc., bruge fem billeder fra starten, fem billeder fra i mellem, og fem billeder fra slutningen af eksperimentet. - Beslut, hvis cellerne skal klassificeres i forskellige underklasser på grund af deres form (f. eks.forskellige faser af en celle cyklus), eller hvis alle celler er af samme klasse.
- Skift navnet på hvert af de valgte partikler i overensstemmelse hermed. Angiv et navn eller en forkortelse for hver klasse og en tæller for hver partikel klasse (f. eks.cell_1, cell_2 osv.). Annoter mindst 50 partikler pr. klasse.
- Undlad at ankommentere objekter, som ikke bør registreres, fordi de ikke er relevante for processen, såsom gasbobler eller andre partikler som ikke-opløste mediekomponenter.
Bemærk: disse begivenheder vil ikke indgå i uddannelses proceduren for ANN og betragtes som baggrund. - Undlad at ankommentere celler, der ikke er i fokus.
- Annoter billederne så konsistente som muligt. Hvis der er tvivl, kan etiketten ignorere anvendes. Det anbefales stærkt ikke at misbruge sin brug, da ANN kun vil genkende strukturer, der er mærket.
Figur 2: Fiji Tool brugergrænseflade. Der oprettes et Træningssæt med de annoterede billeder. En manuel anmærkning bestående af to klasser er afbildet, listen over annoterede partikler vises i ROI Manager. Forskellige navne og farver kan indstilles for forskellige klasser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Gem de annoterede objekter og billedet i et ZIP-format, og Send filen til Trænings netværket, enten via upload til platformen eller ved at sende zip-filen via e-mail.
Bemærk: normalt tager det en række iterativ Trænings runder for at identificere passende forudsigelser af de klassificerede objekter på billederne. Hver træningsrunde fører til en arbejdsgang, der returneres af programmet. - Brug arbejdsprocessen (*. WF) sammen med den uddannede algoritme til objekt genkendelse til at analysere test billeder med data batch, der udvikler program batcher , som kan startes i dashboardet.
- Kontroller objekt genkendelse på test billederne ved at kvantificere falske positive og negative hændelser.
- Kvantificere påvisning af falske positive hændelser: partikler, der fejlagtigt detekteres som celler, celler, som ikke er korrekt klassificeret, og celler, hvis kontur ikke er blevet godt identificeret.
- Kvantificere de falske negative hændelser (celler, der ikke genkendes som sådanne).
- Visualiser resultaterne i værktøjet resultatanalyse ved at starte programmet i dashboardet.
- Importer de ønskede resultater filer med fil | Importer fil eller fil | Importer mapper.
- Visualiser resultaterne efter diagram | Opret diagram på DIAGRAMMERNE GUI.
- Vælg en af følgende indstillinger: fordelingsdiagram, følsomheds plot, karakteristisk over tid, karakteristisk over undersøgelsespunkter og feature vs. funktion.
Bemærk: en manual vedrørende udnyttelsen af resultat analysatoren leveres med systemet og er også tilgængelig fra support. - Hvis resultaterne er acceptable, skal du køre arbejdsprocessen i batcher på alle erhvervede billeder af eksperimentet. På samme tid kan overvågningsprogrammet oprettes ved at kombinere de gemte indstillinger fra Probe controlleren (*. pcfg) med arbejdsprocessen (*. WF), se også manualen.
Bemærk: arbejdsprocessen kan også bruges til at overvåge fremtidige eksperimenter for dette kultur medie. - Hvis resultaterne ikke er acceptable, kan du kontrollere anmærkningen på Træningssættet og/eller fortsætte med en anden iterativ træningsrunde (Se trin 4,2).
4. kvantificering af stikprøvestørrelse
- Indstil standardafvigelsen (σ), som er acceptabel blandt de fundne partikler.
Bemærk: standardafvigelsen ændres parallelt med cellestørrelsen homogenitet. Den maksimale standardafvigelse angiver den prøve, som har den højeste grad af heterogenitet i størrelse. - Indstil amplituden af konfidensintervallet eller den ønskede nøjagtighed i forhold til den forventede varians af målinger (e).
- Angiv den indrømmede fejl (α) mellem 5% (z1-α/2 = 1,96) og 10% (z1-α/2 = 1,64).
- Beregn antallet af celler, der skal identificeres fra hver klasse fra ligning 1.
[Ligning 1]
Bemærk: baseret på antallet af celler, kan antallet af billeder, der skal erhverves, defineres for hvert datapunkt. - Foretag en følsomhedsanalyse af eksperimentets tilfældige tidspunkter for at kontrollere, at analysen af n-partikler fører til en variation af den gennemsnitlige Feret-diameter og Dv90 på mindre end 5%. Den kan beregnes automatisk i resultat analysatoren.
[Ligning 1]5. on line (by-pass) eller i linje måling
- Udfør den off line måling procedure først (Se trin 2) for at indstille hardware og software indstillinger som en funktion af organismen og processen (koncentration eller medier).
- Overfør de gemte indstillinger fra det forrige afsnit ved at vælge knappen Indlæs, og Vælg følgende sti: C:\programmer\sopat GmbH\monitoringPrograms\camcontrol.
- Tilslut sonden til flowcellen eller til bioreaktoren.
Bemærk: in situ -målinger kan udføres med en knivspids flange. - Udfør sterilisering.
Bemærk: kun det sonde befulede materiale på instrumentet er steriliserbart gennem dampsterilisering. Den befugtede sonde længde kan gå fra 6 til 222 mm (figur 3).
Figur 3: skitse af ISM-enhederne. Sonden MM-Ho (A) er installerbar direkte i bioreaktoren, mens sonden mm 2,1 (B) kan bruges som en by-pass. Kulturen bouillon cirkulation er markeret med pile i hvert billede. Omregningsfaktorerne er 0,166 μm pix-1 for mm-Ho og 0,087 μm pix-1 for mm 2,1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Definer billed anskaffelsesprocenten i GUI- udløsning i felt udløser intervallet [s].
Bemærk: afhængigt af proces dynamikken kan billed erhvervelses raten tilpasses. For eksempel, hvis en lag-fase på 3 timer forventes, kan satsen for erhvervelse være lavere, end hvis en metabolisme Skift eller ophobning af et produkt skal overvåges. Normalt kræver dette en meget kortere anskaffelsestidspunkt i minut intervallet. For eksempel, en billed erhvervelse sekvens mellem 5 og 10 min under en batch gær dyrkning giver tilstrækkelige oplysninger til at fange proces dynamik. - Definer billedhastigheden som forklaret i trin 2,10.
Bemærk: i on line og i linje målinger kan billedhastigheden øges, da den mekaniske omrøring kan øge strømningshastigheden gennem hullet. - Start billed anskaffelse ved at aktivere knappen Start streaming af den valgte sonde.
- Stop anskaffelse, når eksperimentet er færdigt med knappen stop streaming af den valgte sonde.
Bemærk: for den 1St Run, starte erhvervelsen lige før inokulation af kulturen og gå videre til trin 4. For følgende kørsler skal du åbne program overvågningen i dashboardet og vælge den oprettede arbejdsproces (Se trin 4). Start overvågningen lige før inokulering af kulturen ved at trykke på afspilnings knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellestørrelsen detektion i gær kulturer med ISM og automatiseret billed detektering til at skelne mellem spirende og ikke-vordende celler blev gennemført med succes. Både stroboskop intensiteten og valget af måle gabet har en række tolerance, hvor partikel identifikationen ikke påvirkes. F. eks. blev S. cerevisiae -celler målt med forskellige stroboskop intensiteter inden for et Variations interval på 11% ved en tør biomasse koncentration på 4 g L-1. De tilsvarende billeder gav skarpe cellegrænser, og derfor var partikel identifikationen mulig med en acceptabel variation af cellestørrelsen (1%) Uanset stroboskop intensiteten. Hvis stroboskop intensiteten ikke justeres korrekt, lider billederne af over belysning, og en korrekt celle identifikation vil ikke være mulig (figur 4).
Figur 4: billede erhvervelse funktioner. Eksempler på forskellige stroboskop intensiteter (SI-%) og måle huller (MG-μm) til opsamling af S. cerevisiae -celler (nuværende værdier af si og mg er angivet i parentes): A (25, 50); B (50, 50); C (25 af 80); og D (50, 80). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Indtil videre kan måle gabet ikke justeres igen under en in situ -måling. Derfor er forsøget i fortyndings serien afgørende for at sikre pålidelige data i hele dyrkningen. Den største bekymring er forekomsten af uidentificerbare overlappende hændelser på grund af forøgelsen i celle koncentrationen.
Et følsomheds plot (følsomhedsanalyse af karakteristiske værdier, f. eks.den gennemsnitlige celle diameter med hensyn til partikel nummer n) for alle fundne celler fra den indlæste datafil kan visualiseres (figur 5). Brugeren skal afgøre, hvilken stabilitet af en bestemt proces parameter der er nødvendig. I dette tilfælde det mindste antal celler, der kræves for et gyldigt datapunkt. Som følge heraf kan flere eller færre billeder analyseres for ét datapunkt.
Figur 5: gennemsnitlig følsomhed for celle diameter. Variabilitet i den gennemsnitlige celle diameter afhængig af antallet af fundne partikler. En konstant værdi af den gennemsnitlige celle diameter opnås med omkring 1.000 celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Anmærkningen er det vigtigste punkt for at opnå den ønskede nøjagtighed af partikel identifikationen. Figur 6 viser et eksempel på en "bruger anmærkning" (a), der anvendes som en uddannelse for det neurale netværk, samt partikel identifikationen på et billede af test sættet (ukendte data for det neurale netværk), som anvendes til evaluering (B). Begge billeder skal have en tilsvarende hastighed af identificerede hændelser.
Figur 6: sammenligning af bruger anmærkning (Træningssæt) og automatisk detektering (testsæt). Træningssæt: kommenterede og originale billeder afbildes i henholdsvis aog a. Oplysningerne i dette billede bruges til at træne ANN. testsæt: den arbejdsproces, der er oprettet efter træningen af ANN anvendes på fanger, som ikke er blevet brugt til træningen: automatisk identificerede celler (vist i b) fra den oprindelige Capture b '. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som et eksempel på virkningen af intracellulær produkt akkumulering på celle størrelsesfordelingen blev akkumuleringen af den flerumættede fedtsyre docosahexaensyre (DHA) ved kvælstof begrænsning undersøgt i de heterotrofiske mikroalger C. cohnii. Det blev påvist, at akkumuleringen af produktet kan påvises kvantitativt ved hjælp af ISM10. Metoden anvendes i øjeblikket til at undersøge virkningen af forskydningskræfter i omrørende bioreaktorer på cellernes morfologiske heterogenitet.
Modning tilstand af spirende gær S. cerevisiae blev kvantificeret. I tilfælde af spirende, den andel af celler, der er i modnings tilstand på et tidspunkt (beskrevet med BI), giver oplysninger om vækst aktivitet og befolkningens heterogenitet. Den automatiske celle genkendelse var i stand til at identificere og skelne spirende og ikke-spirende (eller datter) celler med succes i cellesuspension15. Celle størrelsesfordelingen af tre prøver er vist i figur 7. Et skift til mindre celler indikerer en lavere del af spirende celler i populationen.
Figur 7: kumulativ fordeling af enkelt Cellestørrelse. Celle størrelsesfordelinger målt i løbet af en dyrkningsperiode på 3 timer (lige linje), 7 timer (punkteret linje) og 13 timer (stiplede linje). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ISM som præsenteret her med samme eller meget lignende enheder blev brugt til at måle morfologiske dynamik af svampe, mikroalger, og gærceller, som gjorde det muligt at fastsætte vækst aktivitet, og i tilfælde af alger, intracellulære produkt ophobning. Sensoren har ingen bevægelige dele og er direkte anvendelig i enhver standard rørbeholder bioreaktor, enten gennem en standard port eller i en steriliserbar by-pass. Da gær er meget mindre end alger, krævede reduktionen i Cellestørrelse nogle nylige hardware tilpasninger som en højere kamera opløsning og belysning ved transmission for at få en tilstrækkelig pixel opløsning af gæren (for tekniske detaljer, se15). Men der findes stadig en begrænsning for at måle selv mindre celler som bakterier. Den nuværende in situ -fotooptiske instrumentering angiver begrænsninger med hensyn til overlappende partikel information i høj koncentration og interferens effekter med strukturer under UV/Vis-spektret. Up to date, billedanalyse algoritmer til bakterielle suspensioner er ikke blevet anvendt, bortset fra lysstyrke korrelationer16.
Andre tidligere anvendte ISM-værktøjer blev anvendt til at bestemme celle koncentrationen for at vise deres pålidelighed. Dette blev dog afgørende, hvis cellerne overlappede hinanden ved forhøjede koncentrationer. Derfor var fokus for denne undersøgelse ikke celle kvantificering, men morfologiske funktion afsløring, mens billedfunktioner som lysstyrkeintensitet kan korreleres til celletætheden som udføres med andre enheder, for17. Ellers vil alle disse anordninger være begrænset til lave celle koncentrationer; en maksimal koncentration på ca. 20 g L-1 af gærceller blev evalueret ved brug af en celle genkendelses metode vs. ca. 80 g l-1 ved brug af en klynge størrelses algoritme.
For at spore de morfologiske funktioner i en celle, skal dens kanter detekteres nøjagtigt. I tilfælde af alger er dette ret simpelt, da størrelsen ændres, men formen forbliver konstant under hele overgangen af proces stadier. I modsætning hertil giver gærceller en større udfordring på grund af deres form, som ikke kan tilnæres til en sfære eller ellipse, når cellerne er spirende. Ikke desto mindre, indtil nu cellestørrelsen blev beregnet under den antagelse, at en celle er en perfekt sfære i ISM-målinger18. Selv om denne tilnærmelse er tæt på virkeligheden i nogle tilfælde, kan mere komplicerede former såsom spirende celler eller stang formede celler ikke vurderes ordentligt. I denne undersøgelse blev forskellige former imidlertid analyseret med succes på grund af den fleksible grænse registrering, der blev aktiveret via algoritmer til maskinel indlæring. Desuden er overlappende begivenheder stadig under undersøgelse19 for at opnå en yderligere udviklingsfase.
I øjeblikket er guldstandarden for vitalitet og levedygtighed vurdering at tælle kolonidannende enheder eller at plette en prøve med en levedygtighed farvestof20, f. eks, methylenblåt eller methylenviolet21; men denne procedure kan påvirke resultaterne. Når sådanne funktioner er relateret til cellen morfologi22, potentialet for hurtigt at vurdere dem bør undersøges af det stigende potentiale i ISM. Desuden kan kritiske procesparametre og/eller kvalitets attributter23 relateres til form, agglomerering og pellet dannelse, som alle kan overvåges af ISM.
Undersøgelser med andre vigtige mikroorganismer, der hyppigt anvendes i bioprocess, udføres i øjeblikket. Tidspunktet for tilpasningen af objekt genkendelses algoritmerne og funktionen udtræk til Funktionsanalyse afhænger hovedsageligt af kompleksiteten af billederne og den forventede nøjagtighed af resultaterne. I fremtiden vil farvet billedoptagelse blive overvejet med henblik på yderligere at udvide den vifte af oplysninger, som kunne opnås på et enkelt celleniveau, fxhvis pigmenter akkumuleres eller i genetisk modificerede organismer, hvor farvede markører blev integreret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for støtte fra det tyske Forbundsministerium for økonomi og energi inden for rammerne ZIM-Koop, projekt "Smart proces inspektion", Grant nej. ZF 4184201CR5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor MM 2.1 - MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
References
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
