Summary
Для мониторинга размеров одиночных клеток непосредственно в клеточной подвеске было разработано фото-оптическое устройство для микроскопии. Измерение в реальном времени проводится путем соединения фотооптического стерилизационного зонда с автоматизированным анализом изображений. Морфологические изменения появляются с зависимостью от состояния роста и условий культивирования.
Abstract
При наблюдении в микробных биопроцессах в основном ограничиваются химическими и физическими свойствами среды(например,значение рН и концентрация растворенного кислорода). Тем не менее, морфология клеток может быть подходящим индикатором для оптимальных условий, так как она меняется с зависимостью от состояния роста, накопления продукта и клеточного стресса. Кроме того, распределение одноклеточных размеров дает не только информацию об условиях культивирования, но и о неоднородности популяции. Для получения такой информации было разработано фото-оптическое устройство микроскопии1 для мониторинга распределения размеров одноклеточных элементов непосредственно в клеточной подвеске в биореакторах. Автоматизированный анализ изображений связан с микроскопией на основе модели нейронной сети, которая обучается с аннотированными пользователями изображениями. Несколько параметров, которые приобретаются из захватов микроскопа, коррелируют с соответствующими особенностями процесса клеток, такими как их метаболическая активность. До сих пор, представленные на месте микроскопии зонд серии был применен для измерения размера гранул в нитевидных грибов суспензии. Он был использован, чтобы различать одноклеточные размеры в микроводорослей культивирования и связать его с липидным накоплением. Форма клеточных частиц была связана с бутонизации в дрожжевых культурах. Анализ микроскопии, как правило, можно разделить на три этапа: i) приобретение изображения, (ii) идентификация частиц и (iii) анализ данных, соответственно. Все шаги должны быть адаптированы к организму, и поэтому для достижения надежных результатов необходима конкретная аннотированная информация. Способность контролировать изменения в морфологии клеток непосредственно в строке или в режиме (в обходном проходе) обеспечивает в режиме реального времени значения для мониторинга и контроля, в разработке процесса, а также в производственном масштабе. Если данные в автономном режиме коррелируют с данными в реальном времени, то текущие утомительные измерения вне очереди с неизвестными влияниями на размер ячейки становятся ненужными.
Introduction
Морфологические особенности клеток часто связаны с физиологическим состоянием, связь между формой и функцией существует для многих применений. На морфологию одной клетки влияет состояние роста, возраст клетки, осмотические и другие потенциальные клеточные стрессы или накопление продукта. Морфологические изменения клеток часто являются мерилом жизнеспособности роста культуры. Синтез внутриклеточного продукта, накопление липидов в водорослях и включение тела в бактериях, среди прочего, связаны с размером клеток, а также. Клеточная агломерация может быть еще одним фактором, который стоит исследовать, как обобщено недавно2.
Неоднородность популяции может быть количественно определена на основе морфологических особенностей отдельных клеток. Исследования показали, что неоднородность в рамках культуры может быть значительным, например,в крупномасштабных производственных условиях3 общая урожайность может быть затронута низкой производительностью субпопуляций4.
Как правило, оценка морфологических особенностей клеток проводится путем ручного отбора проб или с помощью камеры потока в сочетании с фотооптическим устройством. Это приводит к нескольким ограничениям: ограниченное количество полученных данных вряд ли может обеспечить статистически достоверные измерения; задержка между выборкой и доступностью результатов может быть слишком длительной по сравнению с динамикой процесса; и самое главное, процедура отбора проб (расположение порта выборки, предварительная обработка образца до измерения, неблагоприятные условия в выборке или шунтирование) может вызвать предвзятую ошибку, поскольку сама процедура выборки уже может повлиять на клетку Морфология. Наконец, всегда существует высокий риск загрязнения во время отбора проб или в обходных растворах, если они не стерилизованы на месте.
Применение микроскопии на месте (ISM) может обойти некоторые из этих проблем. Если клетки обнаружены автоматически, то можно обследовать правильное определение их морфологических особенностей5. До сих пор основными ограничениями этого метода были (i) время оценки изображений, которое было слишком длинным для приложений situ, и ii) плохое разрешение изображений, особенно при высокой плотности клеток. Хотя первые решения ISM включали механическую пробы, разбавление зонда, или были ограничены системой обхода6,7, дальнейшие подходы позволяют захват ячейки подвески непосредственно 8 .
Последние достижения в ISM позволяют в линии или на линии мониторинга клеток на одноклеточной основе, которая обеспечивает распределение морфологических параметров в режиме реального времени непосредственно в клеточных суспензий при значительно высоких концентрациях клеток. Через офлайн-анализ ключевых параметров клеток можно определить корреляции с информацией, предоставляемой совмещенный автоматизированным обнаружением клеток и ISM. Затем достигаются новые конструкции мягких датчиков, в которых неизмеримый параметр оценивается с помощью одноклеточной морфологии.
В этом отчете ISM проводится путем соединения фотооптического зонда с автоматизированным анализом изображений. ISM состоит из однородчатого датчика зонда, который позволяет захват изображения в пределах известного диапазона фокусов в регулируемом зазоре измерения с камерой CCD высокого разрешения «MM-Ho » CCD GT2750 (2750x2200) и MM 2.1 CMOS G507c (2464x2056)». Освещение вспышки света осуществляется путем передачи. Таким образом, свет исходит от противоположной стороны камеры9 и его интенсивность может быть скорректирована. Клетки проходят непрерывно через этот зазор с жидким потоком. Таким образом, получается репрезентативная выборка населения. Зонд может быть установлен непосредственно на биореактор, так что он достигает в ячейки подвески, или он может быть использован в стерилижаемый обходной. Оболочка датчика подключена к системе до стерилизации, оптические части затем устанавливаются в оболочку.
До сих пор, соответствующие промышленные микроорганизмы, например,нитевидные грибы (диаметр до более 200 мкм), гетеротрофные микроводоросли Crypthecodinium cohnii (средний диаметр ячейки 20 мкм), и дрожжи Saccharomyces cerevisiae (средний диаметр ячейки 5 мкм), были исследованы с помощью этого или аналогичных устройств, которые описаны в ближайшее время.
Filamentous грибы, как правило, образуют гранулы при определенных условиях выращивания. Они имеют размер до нескольких сотен мкм. Гифы грибковых клеток развивают различную длину в зависимости от гидродинамического стресса в фазе жидкости. Это влияет на метаболическую и ростовую активность, поглощение субстрата и высвобождение продукта. ISM применялся для определения распределения размеров гранул и ширины зон с более низкой плотностью биомассы по краям гранул (собственные неопубликованные данные).
Размер C. cohnii изменяется между 15 и 26 мкм, когда клетки накапливают полиненасыщенную жирную кислоту докозагексаеновой кислоты (ДГК) под ограничением азота. Этот биотехнологический процесс производства ДГК состоит из двух частей: фазы роста, в которой клетки делятся и становятся меньше, и фазы производства, в которой клетки накапливают продукт и таким образом становятся больше. Таким образом, размер ячейки был использован для определения состояния процесса, в котором либо рост или производство ДГК было благоприятным. Наконец, была обнаружена корреляция между размером ячейки и содержанием ДГК. В этом случае ISM позволяет контролировать внутриклеточное накопление ДГК в режиме реального времени без необходимости отбора проб, нарушения клеток и общего анализа газовой хроматографии10.
Начинающие дрожжи, как правило, размерот 3 до 8 мкм. Доля клеток, которые находятся в состоянии созревания в то время, как описано с начинающим индексом (BI), предоставляет информацию о жизнеспособности роста11,12, и даже связь с рекомбинантной секреции белка было доказано13. С помощью ISM, подающий надежды и не-бутонизации дрожжевых клеток (клетки с и без бутона) были отмечены14. Стресс овечие условия могут также привести к более широкому изменению размера клеток в популяции дрожжей, как недавно показано в масштабе вниз культивирования, в котором условия крупномасштабных питательных ограниченных кормления-пакет культивирования были передразнил3.
Таким образом, ISM имеет потенциал для мониторинга жизнеспособности роста и формирования продукта на одноклеточном уровне на всех этапах биопроцесса для определения оптимальных условий культивирования, или для целей контроля процесса. Методы, описанные здесь, сосредоточены на микробных применениях с одиночными клетками, но также применимы к более крупным частицам, таким как клетки человека и животных, клеточные агломераты и гранулы нитевидных организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги необходимы для адаптации параметров к соответствующим условиям микроорганизмов и культуры. Настройка настроек зонда длится около 20 минут для опытного пользователя. Подробное описание инструментов и шагов приведено в соответствующем руководстве по зондированию от SOPAT GmbH. В целом, инструменты, представленные в следующем протоколе, необходимы: i) контроллер зонда для регулировок зонда и приобретения изображения; ii) Фиджи (ImageJ) для аннотации на приобретенных изображениях; iii) поддержка SOPAT для обучения и создания искусственных нейронных сетей (ANN); iv) Batcher для обработки пакетов данных с использованием уже приобретенных изображений с рабочим процессом; v) Анализатор результатов для визуализации результатов и оценки пакетных обработанных изображений; и (vi) монитор для автоматизированного измерения в реальном времени и визуализации результатов.
1. Установка параметров оборудования
- Подготовьте культуру с самой высокой концентрацией клеток, которая может быть достигнута в ходе эксперимента или центрифуги, и повторно приостановите гранулы для достижения этой концентрации. В этом случае для выращивания S. cerevisiae было выбрано 65 г L-1 концентрации сухой биомассы.
- Подготовьте различные разбавления, которые варьируются от самой высокой до самой низкой концентрации, так что ожидаемый диапазон полностью покрыт. Минимум 4 различных концентраций рекомендуется.
- Определите диапазон размеров клеток микроорганизма с помощью обычной микроскопии. Определите ожидаемый максимальный диаметр (dmax)соответствующих ячеек. Это значение установлено до 8 мкм в случае S. cerevisiae.
- Выберите два пробела измерения 5x и 10x ожидаемого dmax из ячеек.
- Выберите максимальную интенсивность стробоскопа. Выберите интенсивность стробоскопа для обоих зазоров с самой высокой концентрацией клеток, чтобы клетки все еще были видны на изображениях с наименьшей интенсивностью света (самые темные изображения).
- Выберите минимальную интенсивность стробоскопа, а затем выберите интенсивность стробоскопа для обоих пробелов, чтобы клетки все еще были видны на изображениях с наивысшей интенсивностью света (самые яркие изображения). Используйте самую низкую концентрацию клеток, которая, вероятно, появляется в период измерения.
- Выберите одну позицию фокусировки, которая дает самые острые изображения для каждого разрыва измерения, как для интенсивности стробоскопа, так и для диапазона концентрации, который необходимо протестировать (см. шаг 2 для получения подробной информации о фокусировке). Фокус ячейки надлежащим образом, так что данные изображения могут быть аннотированы после этого (см. шаг 4).
- Измерьте ранее подготовленную серию разбавления концентрации клеток (см. шаг 2) как с шириной разрыва, так и интенсивностью стробоскопа.
Рисунок 1: Инструмент калибровки концентрации. Левый графический интерфейс: набор каталогов изображений (минимум 3) с известными концентрациями; центральный графический интерфейс: выберите функции, которые будут рассчитаны по каталогу изображений; правый графический интерфейс: выберите взвешенную исходную среднее квадратную ошибку (WRMSE) для определения минимума. WRMSE и лучшая корреляция между любой функцией изображения и концентрацией клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Оцените эксперимент серии разбавления.
- Используйте инструмент калибровки концентрации (CoCa) (см. рисунок 1),чтобы определить оптимальную корреляцию между извлеченными объектами изображения (яркость или резкость) и ранее измеренными концентрациями, предоставляемыми пользователем, например,сухой биомассой или количеством клеток. Следуйте инструкциям в руководстве по программному обеспечению для получения дополнительной информации.
- Определите оптимальную корреляцию между извлеченной информацией из объектов изображения в различных концентрациях по сравнению с любыми отлинейными измерениями. Смотрите легенду рисунок 1.
- Выберите наиболее разумный разрыв измерения и интенсивность стробоскопа при рассмотрении кривой корреляции концентрации с функциями, которые приводят к наименьшей взвешенной корневой средней квадратной ошибке (WRMSE).
ПРИМЕЧАНИЕ: Зазор измерения фиксируется во время эксперимента, в то время как интенсивность стробоскопа может быть адаптирована в соответствии с концентрацией клеток.
2. Измерение вне линии
- Отрегулируйте желаемый зазор измерения в соответствии с шагом 1 с помощью датчика толщины.
- Откройте графический пользовательский интерфейс Probe Control на панели мониторинга SOPAT.
- Подключите нужный зонд к усилительу в подразделе программного обеспечения Действия и нажмите Connect.
- Нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать потоковуюпередачу (Live View).
- Очистите зазор измерения путем распылять этанол в зазор и тщательно протрите любую пыль или грязь с оптической бумагой. Убедитесь, что стекло датчика не имеет частиц с Live View в CamControl.
ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы и пыль нарушают измерения и автоматическую идентификацию клеток. - Поместите сухую оптическую бумагу в зазор измерения. Откройте контроль зонда вкладки и отрегулируйте интенсивность стробоскопа, чтобы визуализировать бумагу. Поверните связывающий винт до тех пор, пока не будут четко видны одноволочные волокна бумаги.
- Заполните трубку культивайным бульоном. Опустите микроскоп в культурный бульон так, чтобы зазор полностью покрылся клеточной подвеской. Откройте управление зондом вкладки и отрегулируйте нужную интенсивность стробоскопа в соответствии с разделом 1. Сосредоточьтесь на клетках, тонко настраивая связывающий винт фокусировки. Фокус больше не должен меняться во время эксперимента
ПРИМЕЧАНИЕ: 5-6 мл культового бульона добавляют в коническую центробежную трубку 50 мл, чтобы достаточно поплавкаизировать измерительный зазор. - Определите количество кадров в точке времени в пользовательском интерфейсе в меню Триггерирование в GUI кадры на триггер. Установите количество кадров до 200 кадров на спусковой крючок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кадров может быть уменьшено до самого низкого значения, которое необходимо для получения статистического достоверного результата. Это зависит от размера выборки, необходимого для получения репрезентативного распределения размеров морфологических клеток (см. также шаг 5). - Определите частоту кадров в меню Triggering в частоте GUI Frame. Выберите частоту кадров, которая гарантирует, что движущиеся частицы из предыдущего кадра не будут отображаться в следующем кадре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть доказано с помощью тестового триггера с 200 кадрами. Осмотрите изображения на наличие частиц, которые захватываются неоднократно. Если это так, уменьшите частоту кадров. Для отливных измерений рекомендуется 1 Гц. - Установите каталог, в котором будут сохранены приобретенные изображения, в меню General.
- Выполните приобретение изображения, активировав кнопку приобретения триггера start image. Перемещение трубки с культурой подвески осторожно вверх и вниз, чтобы вызвать поток через измерительный разрыв.
- Повторите шаг 2.5 после каждого измерения.
- Проверьте приобретенные изображения. Клетки должны быть достаточно острыми для аннотации. Осмотрите изображения на наличие частиц, которые захватываются неоднократно. Если это так, уменьшите частоту кадров.
- Сохраните настройки, выбрав следующий путь: C: «Программные файлы»SOPAT GmbH»MonitoringPrograms-camcontrol, и нажмите Сохранить.
3. Идентификация частиц
- Аннотировать частицы для тренировки искусственной нейронной сети (ANN) (учебный набор).
- Загрузите приобретенные изображения в инструмент аннотации «Фиджи, ImageJ», перетащив и сбросив файл в окно Main «ImageJ» (см. GUI «Фиджи» инструмент на рисунке 2)
- Откройте менеджера roI, выбрав: Анализ Инструменты Менеджер roI.
- Выберите инструмент выбора. Рекомендуется инструмент wand (отслеживание), от руки, овальный или эллиптический выбор.
- Нарисуйте круг вокруг частицы, которая должна быть аннотирована с инструментами отбора, упомянутыми ранее, а затем уточнить его с помощью инструмента кисти.
- Добавьте аннотацию менеджеру ROI, нажав на добавить .
- Отметьте все объекты, представляющие интерес (клетки, которые будут идентифицированы) примерно на 15 изображениях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы охватить всю необходимую информацию, т.е. различные формы, размеры, концентрацию клеток, яркость и т.д.,используйте пять изображений с самого начала, пять изображений между ними и пять изображений с конца эксперимента. - Решите, нужно ли классифицировать клетки в разных подклассах из-за их формы(например,различных фаз клеточного цикла), или если все клетки одного класса.
- Измените название каждой выбранной частицы соответственно. Установите одно имя или аббревиатив для каждого класса и счетчик для каждой частицы класса(например,cell_1, cell_2 и т.д.). Аннотировать не менее 50 частиц в классе.
- Не анонсировать объекты, которые не должны быть обнаружены, потому что они не имеют отношения к процессу, такие как пузырьки газа или другие частицы, такие как нерастворенные компоненты мультимедиа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти события не будут включены в процедуру обучения для ANN и будут рассматриваться в качестве фона. - Не аннотировать клетки, которые находятся вне фокуса.
- Аннотировать изображения как можно более последовательной. Если есть сомнения, ярлык Игнорировать могут быть применены. Настоятельно рекомендуется не злоупотреблять его использованием, так как ANN будет распознавать только структуры, которые помечены.
Рисунок 2: Интерфейс пользователя инструмента Фиджи. Создается учебный набор с аннотированными изображениями. Изображена ручная аннотация, состоящая из двух классов, список аннотированных частиц показан в ROI Manager. Для разных классов можно установить различные названия и цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Сохраните аннотированные объекты и изображение в формате ЗИП и отправьте файл в сеть обучения либо через загрузку на платформу, либо отправив файл по электронной почте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для определения адекватных прогнозов классифицированных объектов на изображениях требуется ряд итеративных учебных раундов. Каждый учебный раунд приводит к рабочему процессу, который возвращается по программе. - Используйте рабочий процесс (кв.wf) с обученным алгоритмом распознавания объектов для анализа тестовых изображений с помощью программы,прогрессирующей пакет данных Batcher, которая может быть запущена в панели мониторинга.
- Проверьте обнаружение объектов на тестовых изображениях с помощью количественной оценки ложноположительных и отрицательных событий.
- Количественное обнаружение ложноположительных событий: частицы ошибочно обнаружены как клетки, клетки, которые неправильно классифицированы, и клетки которых контур не был хорошо идентифицирован.
- Количественная оценка ложных негативных событий (ячеек, которые не признаются в качестве таковых).
- Визуализируйте результаты в анализаторе результата инструмента, закрутив программу в панели мониторинга.
- Импортируйте файлы желаемых результатов с помощью файла Импортный файл или файл Импортные папки.
- Визуализируйте результаты по диаграмме Создайте диаграмму на графическом интерфейсе диаграмм.
- Выберите один из следующих вариантов: диаграмма распределения, график чувствительности, характеристика с течением времени, характеристика над точками опроса и функция против функции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по использованию анализа тона поставляется с системой, а также доступно из поддержки. - Если результаты приемлемы, запустите рабочий процесс в Batcher на всех приобретенных изображениях эксперимента. В то же время программа мониторинга может быть создана путем объединения сохраненных настроек из контроллера зонда ('.pcfg) с рабочим процессом (к.wf), см. также руководство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс также может быть использован для мониторинга будущих экспериментов для этого мультимедиа культуры. - Если результаты неприемлемы, проверьте аннотацию на учебном наборе и/или продолжайте другой итеративный учебный раунд (см. шаг 4.2).
4. Количественная оценка размера выборки
- Установите стандартное отклонение, которое приемлемо среди обнаруженных частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное отклонение изменяется параллельно однородности размера ячейки. Максимальное стандартное отклонение указывает на образец с наивысшей степенью неоднородности размера. - Установите амплитуда доверительного интервала или желаемую точность по отношению к ожидаемой дисперсии измерений (e).
- Установите допущенную погрешность (я) между 5% (z1-з/2 и 1,96) и 10% (z1-з/2 и 1,64).
- Рассчитайте количество клеток, которые будут идентифицированы из каждого класса из уравнения 1.
(Уравнение 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества ячеек, количество изображений, которые должны быть приобретены могут быть определены для каждой точки данных. - Выполните анализ чувствительности на случайных точках времени эксперимента, чтобы проверить, что анализ n частиц приводит к изменчивости среднего диаметра Feret и Dv90 менее 5%. Он может быть вычисляться автоматически в анализаторе результата.
(Уравнение 1)5. На линии (By-Pass) или В линии измерения
- Выполните процедуру измерения вне строки сначала (см. шаг 2) для того, чтобы установить аппаратные и программные настройки в качестве функции организма и процесса (концентрация или средства массовой информации).
- Загрузите сохраненные настройки из предыдущего раздела, выбрав кнопку Нагрузка и выберите следующий путь: C: »Программные файлы»SOPAT GmbH'monitoringPrograms.camcontrol.
- Подключите зонд к ячейке потока или к биореактору.
ПРИМЕЧАНИЕ: На месте измерения могут быть выполнены с щепоткой фланга. - Выполните стерилизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только увлажненный зондом материал инструмента стерилизован через паровую стерилизацию. Длина зонда смачиваемым может составить от 6 до 222 мм(рисунок 3).
Рисунок 3: Эскиз устройств ISM. Зонд MM-Ho(A) устанавливается непосредственно в биореакторе, в то время как зонд MM 2.1 (B) может быть использован в качестве объездного прохода. Циркули культового бульона отмечены стрелками на каждой картине. Коэффициенты конверсии 0,166 мкм пикс-1 для MM-Ho и 0,087 мкм пикс-1 для ММ 2.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Определите скорость приобретения изображения в GUI Triggering в интервале триггерав поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от динамики процесса, скорость приобретения изображения может быть адаптирована. Например, если ожидается период отставания в 3 часа, скорость приобретения может быть ниже, чем при смене метаболизма или накоплении продукта. Как правило, это требует гораздо меньше времени приобретения в минутном диапазоне. Например, последовательность приобретения изображения между 5 и 10 минутами во время выращивания пакетных дрожжей обеспечивает достаточную информацию для захвата динамики процесса. - Определите частоту кадров, как это объясняется в шаге 2.10.
ПРИМЕЧАНИЕ: В он-лайн и в линии измерений, частота кадров может быть увеличена, так как механическое перемешивание может увеличить скорость потока через зазор. - Начало приобретения изображения путем активации кнопки Начало потоковой передачи выбранного зонда.
- Остановить приобретение, когда эксперимент закончен с кнопкой Остановить потоковое выбранного зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для1-й перспективе, начать приобретение непосредственно перед прививкой культуры и приступить к шагу 4. Для следующих запусков откройте мониторинг программы в панели мониторинга и выберите созданный рабочий процесс (см. шаг 4). Начните мониторинг непосредственно перед прививкой культуры, нажав кнопку Play.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обнаружение размера клеток в дрожжевых культурах с ISM и автоматизированным обнаружением изображений для разграничения между бутонизации и не-бутонизации клеток была успешно проведена. И интенсивность stroboscope и выбор зазоризмерения имеют ряд допускаемости, в котором идентификация частицы не повлияна на. Например, S. cerevisiae клетки были измерены с различными интенсивностью стробоскопа в пределах вариации диапазона 11% при сухой концентрации биомассы 4 г L-1. Соответствующие изображения обеспечивают острые границы клеток, поэтому идентификация частиц была осуществима с приемлемым изменением размера ячейки (1%) независимо от интенсивности стробоскопа. В случае, если интенсивность стробоскопа не регулируется должным образом, изображения страдают от чрезмерного освещения и надлежащей идентификации клеток не будет возможно(рисунок 4).
Рисунок 4: Особенности приобретения изображений. Примеры различных интенсивностей стробоскопа (SI-%) и пробелы в измерении (MG-m) для захвата клеток S. cerevisiae (нынешние значения СИ и МГ указаны в скобках): A (25, 50); B (50, 50); С (25, 80); и D (50, 80). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
До сих пор измерительный разрыв не может быть скорректирован во время измерения in situ. Таким образом, эксперимент серии разбавления имеет решающее значение для того, чтобы гарантировать надежные данные во всем культивировании. Основной проблемой является возникновение неопределимых перекрывающихся событий из-за приращения концентрации клеток.
График чувствительности (анализ чувствительности характерных значений, например,средний диаметр ячейки по отношению к числу частиц n) всех обнаруженных ячеек из загруженного файла данных может быть визуализирован(рисунок 5). Пользователь должен решить, какая стабильность определенного параметра процесса необходима. В этом случае минимальное количество ячеек, необходимое для одной действительной точки данных. В результате, более или менее изображения могут быть проанализированы для одной точки данных.
Рисунок 5: Участок чувствительности диаметра ячейки. Вариативность среднего диаметра клеток в зависимости от количества обнаруженных частиц. Постоянное значение среднего диаметра ячейки достигается примерно с 1000 ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Аннотация является ключевым моментом для достижения желаемой точности идентификации частиц. На рисунке 6 показан пример «аннотации пользователя» (A), которая используется в качестве учебного набора для нейронной сети, а также идентификации частиц на изображении тестового набора (неизвестные данные для нейронной сети), который используется для его оценки (B). Оба изображения должны иметь одинаковую скорость идентифицированных событий.
Рисунок 6: Сравнение аннотации пользователя (учебный набор) и автоматического обнаружения (набор тестов). Учебный набор: аннотированные и оригинальные картины изображены в A,и A', соответственно. Информация этой картинки используется для обучения ANN. Тестовый набор: рабочий процесс, созданный после обучения ANN, применяется к захватам, которые не были использованы для обучения: автоматически идентифицированные ячейки (показано в B) из исходного захвата B'. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
В качестве примера влияния внутриклеточного накопления продукта на распределение размеров клеток, накопление полиненасыщенных жирных кислот докозагексаеновой кислоты (ДГК) по ограничению азота было исследовано в гетеротрофных микроводорослях C. cohnii. Было продемонстрировано, что накопление продукта может быть количественно обнаружено с помощью ISM10. Метод в настоящее время используется для исследования влияния сил сдвига в перемешивают биореакторы на морфологическую неоднородность клеток.
Состояние созревания подающих надежды дрожжей S. cerevisiae было количественно. В случае бутонизации, доля клеток, которые находятся в состоянии созревания в то время (описано с BI), предоставляет информацию о росте активности и неоднородности населения. Автоматическое распознавание клеток удалось определить и отличить подающий надежды и не-подающий надежды (или дочь) клетки успешно в клеточной суспензии15. Распределение размера ячейки трех образцов показано на рисунке 7. Переход к более мелким клеткам указывает на более низкую часть подающих надежды клеток в популяции.
Рисунок 7: Совокупное распределение размеров одноялты. Распределение размеров клеток измеряется в течение времени культивирования на 3 ч (прямая линия), 7 ч (пунктирная линия) и 13 ч (разбитая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ISM, представленный здесь с теми же или очень похожими устройствами, использовался для измерения морфологической динамики грибов, микроводорослей и дрожжевых клеток, что позволило определить активность роста, а в случае водорослей, внутриклеточного накопления продукта. Датчик не имеет подвижных частей и непосредственно применим в любом стандартном перемешивают биореактор бака, либо через стандартный порт или в стерилизатори. Так как дрожжи гораздо меньше, чем водоросли, сокращение размера ячейки требует сяропричебных адаптаций, таких как более высокое разрешение камеры и освещение путем передачи, чтобы получить достаточное разрешение пикселей дрожжей (для технических деталей, см.15). Тем не менее, существует еще ограничение для измерения еще меньше клеток, как бактерии. Ток на месте фотооптического прибора указывает на ограничения в отношении перекрывающихся частиц информации в высокой концентрации и помех с структурами ниже спектра УФ/VIS. На сегодняшний день алгоритмы анализа изображений для бактериальных суспензий не применялись, кроме корреляций яркости16.
Другие ранее применяемые инструменты ISM использовались для определения концентрации клеток, чтобы показать их надежность. Это, однако, стало решающим, если клетки перекрывались друг с другом при повышенных концентрациях. Таким образом, в центре внимания этого исследования была не количественная оценка клеток, а обнаружение морфологических объектов, в то время как изображения, такие как интенсивность яркости, могут быть соотнесены с плотностью клеток в том, что выполняется с другими устройствами, слишком17. В противном случае все эти устройства были бы ограничены низкой концентрацией клеток; при использовании подхода к распознаванию клеток при использовании подхода к распознаванию клеток при использовании алгоритма размера кластера была оценена максимальная концентрация около 20 г L-1.
Для того, чтобы отслеживать морфологические особенности клетки, ее края должны быть точно обнаружены. В случае водорослей, это довольно просто, как размер меняется, но форма остается постоянной на протяжении всего перехода стадии процесса. В отличие от этого, дрожжевые клетки обеспечивают большую проблему из-за их формы, которая не может быть приближена к сфере или эллипс, когда клетки бутонизации. Тем не менее, до сих пор размер ячейки рассчитывался исходя из предположения, что ячейка является идеальной сферой в измерениях ISM18. Хотя это приближение близко к реальности для некоторых случаев, более сложные формы, такие как подающие надежды клетки или стержня формы клетки не могут быть должным образом оценены. В этом исследовании, однако, различные формы были успешно проанализированы из-за гибкого обнаружения границ, включенного с помощью алгоритмов машинного обучения. Кроме того, в целях достижения дальнейшего этапа развития по-прежнему расследуются дублирующие друг друга события19.
В настоящее время, золотой стандарт для жизнеспособности и оценки жизнеспособности является подсчет колонии формирования единиц или пятно образца с жизнеспособностью красителя20, например,метиленовый синий или метиленовый фиолетовый21; однако, эта процедура может повлиять на результаты. Всякий раз, когда такие функции связаны с морфологией клеток22, потенциал быстрой оценки их должны быть изучены с увеличением потенциала ISM. Кроме того, критические параметры процесса и/или атрибуты качества23 могут быть связаны с формой, агломерцией и образованием гранул, которые все могут контролироваться ISM.
В настоящее время проводятся исследования с другими ключевыми микроорганизмами, часто используемыми в биопроцессе. Время адаптации алгоритмов распознавания объектов и извлечения функций для анализа объектов зависит главным образом от сложности изображений и ожидаемой точности результатов. В будущем будет рассматриваться возможность захвата цветных изображений в целях дальнейшего расширения круга информации, которая может быть получена на одноклеточном уровне, например,при накоплении пигментов или в генетически модифицированных организмах, в которые были интегрированы цветные маркеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего декларировать.
Acknowledgments
Авторы благодарны за поддержку Федерального министерства экономики и энергетики Германии в рамках проекта «Умный процесс инспекции», гранта нет. NoФ 4184201CR5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor MM 2.1 - MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
References
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
