सीटू में बायोप्रोसेस में सिंगल-सेल मॉर्फोलॉजी के वास्तविक समय निर्धारण के लिए माइक्रोस्कोपी

Summary

सेल निलंबन में सीधे एकल कोशिकाओं के आकार की निगरानी के लिए सीटू माइक्रोस्कोपी डिवाइस में एक फोटो-ऑप्टिकल विकसित किया गया था। वास्तविक समय माप एक स्वचालित छवि विश्लेषण करने के लिए फोटो ऑप्टिकल बंध्याकरण जांच युग्मन द्वारा आयोजित किया जाता है । विकास राज्य और खेती की स्थिति पर निर्भरता के साथ रूपात्मक परिवर्तन दिखाई देते हैं।

Abstract

माइक्रोबियल बायोप्रोसेस में सीटू निगरानी में ज्यादातर माध्यम के रासायनिक और भौतिक गुणों(जैसेपीएच मूल्य और भंग ऑक्सीजन एकाग्रता) तक सीमित है। फिर भी, कोशिकाओं की आकृति विज्ञान इष्टतम स्थितियों के लिए एक उपयुक्त संकेतक हो सकता है, क्योंकि यह विकास राज्य, उत्पाद संचय और सेल तनाव पर निर्भरता के साथ बदलता है। इसके अलावा, एकल सेल आकार वितरण न केवल खेती की स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करता है, लेकिन यह भी जनसंख्या विषमता के बारे में । ऐसी जानकारी हासिल करने के लिए बायोरिएक्टरों में सेल सस्पेंशन में सीधे सिंगल सेल साइज डिस्ट्रीब्यूशन की मॉनिटरिंग कर के लिए सीटू माइक्रोस्कोपी डिवाइस¹ में फोटो ऑप्टिकल तैयार किया गया था। एक स्वचालित छवि विश्लेषण एक तंत्रिका नेटवर्क मॉडल के आधार पर माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित है, जिसे उपयोगकर्ता-एनोटेटेड छवियों के साथ प्रशिक्षित किया जाता है। कई पैरामीटर, जो माइक्रोस्कोप के कैप्चर से प्राप्त होते हैं, कोशिकाओं की प्रासंगिक विशेषताओं को संसाधित करने के लिए सहसंबद्ध हैं, जैसे कि उनकी मेटाबोलिक गतिविधि। अब तक, सीटू माइक्रोस्कोपी जांच श्रृंखला में प्रस्तुत तंतु कवक निलंबन में गोली के आकार को मापने के लिए लागू किया गया था। इसका उपयोग सूक्ष्मशैवाल खेती में एकल कोशिका आकार को अलग करने और लिपिड संचय से संबंधित करने के लिए किया गया था। सेलुलर कणों का आकार खमीर संस्कृतियों में नवोदित से संबंधित था। माइक्रोस्कोपी विश्लेषण को आम तौर पर तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है: (i) छवि अधिग्रहण, (ii) कण पहचान, और (iii) डेटा विश्लेषण, क्रमशः। सभी चरणों को जीव के अनुकूल बनाना होगा, और इसलिए विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए विशिष्ट एनोटेटेड जानकारी की आवश्यकता होती है। सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता सीधे लाइन में या लाइन पर (एक बाय-पास में) प्रक्रिया विकास के साथ-साथ उत्पादन पैमाने पर निगरानी और नियंत्रण के लिए वास्तविक समय मूल्यों को सक्षम बनाती है। यदि ऑफ लाइन डेटा वास्तविक समय डेटा के साथ संबंधित है, तो सेल आकार पर अज्ञात प्रभावों के साथ वर्तमान थकाऊ ऑफ लाइन माप अनावश्यक हो जाते हैं।

Introduction

कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताएं अक्सर शारीरिक स्थिति से संबंधित होती हैं, कई अनुप्रयोगों के लिए फॉर्म और फ़ंक्शन के बीच एक संबंध मौजूद होता है। एक कोशिका की आकृति विज्ञान विकास की स्थिति, कोशिका की उम्र, ओस्मोटिक और अन्य संभावित कोशिका तनाव या उत्पाद संचय से प्रभावित होती है। कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन अक्सर संस्कृति की विकास जीवन शक्ति का एक उपाय होते हैं। इंट्रासेलर उत्पाद संश्लेषण, शैवाल में लिपिड संचय और बैक्टीरिया में शरीर के गठन को शामिल करना, दूसरों के बीच, कोशिका आकार से भी संबंधित हैं। सेल समूह एक और कारक है कि हाल ही में²संक्षेप के रूप में जांच के लायक है हो सकता है ।

व्यक्तिगत कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर जनसंख्या विषमताओं की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। अध्ययनों से पता चला है कि एक संस्कृति के भीतर विषमता महत्वपूर्ण हो सकता है, उदाहरण के लिए,बड़े पैमाने पर उत्पादन की स्थिति के तहत³ समग्र उपज उपआबादी⁴के कम प्रदर्शन से प्रभावित हो सकता है ।

आमतौर पर, कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं का मूल्यांकन मैनुअल नमूने द्वारा या एक बाय-पास प्रवाह कक्ष के साथ फोटो-ऑप्टिकल डिवाइस के साथ किया जाता है। यह कई प्रतिबंधों की ओर जाता है: अधिग्रहीत डेटा की सीमित मात्रा शायद ही सांख्यिकीय विश्वसनीय माप प्रदान कर सकती है; प्रक्रिया की गतिशीलता की तुलना में नमूने और परिणामों की पहुंच के बीच समय में देरी बहुत लंबी हो सकती है; और सबसे महत्वपूर्ण, नमूना प्रक्रिया (नमूना बंदरगाह का स्थान, माप से पहले नमूने का पूर्व-उपचार, नमूना या बाईपास ट्यूब में प्रतिकूल स्थितियां) एक पक्षपातपूर्ण त्रुटि को ट्रिगर कर सकती है क्योंकि नमूना प्रक्रिया पहले से ही सेल को प्रभावित कर सकती है Morphology. अंत में, वहां हमेशा नमूना या उप पास समाधान में संदूषण का एक उच्च जोखिम मौजूद है, अगर वे जगह में बंध्याकरण नहीं कर रहे हैं ।

सीटू माइक्रोस्कोपी (आईएसएम) में आवेदन इनमें से कई समस्याओं को दरकिनार कर सकता है। यदि कोशिकाओं को स्वचालित रूप से पता लगाया जाता है, तो उनकी रूपात्मक विशेषताओं की सही पहचान⁵का सर्वेक्षण किया जा सकता है। अब तक, इस विधि की मुख्य सीमाएं छवियों का मूल्यांकन समय (i) थीं, जो सीटू अनुप्रयोगों में बहुत लंबा था, और (ii) छवियों का खराब समाधान, विशेष रूप से उच्च सेल घनत्व पर। हालांकि आईएसएम के पहले समाधानों में यांत्रिक नमूना, जांच को कमजोर करना, या एक बाय-पास सिस्टम^6,7तक सीमित था, आगे के दृष्टिकोण सीधे⁸सेल निलंबन को पकड़ने की अनुमति देते हैं।

आईएसएम में हाल की प्रगति एकल-कोशिका आधार पर कोशिकाओं की लाइन में या ऑन लाइन निगरानी के लिए अनुमति देती है, जो वास्तविक समय में रूपात्मक मापदंडों का वितरण सीधे सेल निलंबन में काफी उच्च सेल सांद्रता पर प्रदान करती है। कोशिकाओं के प्रमुख मापदंडों के ऑफ लाइन विश्लेषणों के माध्यम से, युग्मित स्वचालित सेल डिटेक्शन और आईएसएम द्वारा प्रदान की गई जानकारी के साथ सहसंबंधों की पहचान की जा सकती है। फिर, नए नरम सेंसर डिजाइन प्राप्त किए जाते हैं, जिसमें एकल-कोशिका आकृति विज्ञान के साथ एक अथाह पैरामीटर का अनुमान लगाया जाता है।

इस रिपोर्ट में, आईएसएम एक स्वचालित छवि विश्लेषण के लिए एक फोटो ऑप्टिकल जांच युग्मन द्वारा आयोजित किया जाता है । आईएसएम में एक एकल-रॉड सेंसर जांच होती है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीसीडी कैमरा [एमएम-हो = सीसीडी GT2750 (2750x2200) और एमएम 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)) के साथ एक समायोज्य माप अंतर में एक ज्ञात फोकस रेंज के भीतर छवियों को कैप्चर करने में सक्षम बनाता है। फ्लैश लाइट रोशनी ट्रांसमिशन द्वारा आयोजित की जाती है। इसलिए, प्रकाश कैमरा⁹ के विपरीत दिशा से निकलती है और इसकी तीव्रता को समायोजित किया जा सकता है। कोशिकाएं तरल प्रवाह के साथ इस अंतर से लगातार गुजरती हैं। इसलिए, एक प्रतिनिधि नमूना आबादी प्राप्त की जाती है। जांच सीधे बायोरिएक्टर में लगाई जा सकती है ताकि यह सेल निलंबन में पहुंच सके, या फिर इसका उपयोग एक बंध्याकरण ीय पास में किया जा सके। सेंसर शेल नसबंदी से पहले सिस्टम से जुड़ा हुआ है, ऑप्टिकल पार्ट्स बाद में खोल में घुड़सवार हैं ।

अब तक, प्रासंगिक औद्योगिक सूक्ष्मजीवों, जैसे,फिलामेंटलस कवक (200 माइक्रोन से अधिक का व्यास), हेट्रोट्रोफिक माइक्रोएल्गा क्रापथेकोडिनियम कोहनी (20 माइक्रोन का औसत कोशिका व्यास), और खमीर सैचारोमाइसेस सेरेविसी (5 माइक्रोन का औसत कोशिका व्यास), इस या इसी तरह के उपकरणों के साथ जांच की गई थी, जिसे शीघ्र ही वर्णित किया गया है।

फिलामेंतुस कवक कुछ खेती की स्थितियों के तहत छर्रों का निर्माण करते हैं। ये कई सौ μm तक के आकार के होते हैं। कवक कोशिकाओं का हाइफे तरल पदार्थ चरण में हाइड्रोडायनामिक तनाव पर निर्भरता में विभिन्न लंबाई विकसित करता है। यह मेटाबोलिक और विकास गतिविधि, सब्सट्रेट तेज और उत्पाद रिलीज पर प्रभाव डालता है। आईएसएम को पैलेट आकार वितरण और छर्रों के किनारों पर कम बायोमास घनत्व के क्षेत्रों की चौड़ाई (स्वयं के अप्रकाशित डेटा) की पहचान करने के लिए लागू किया गया था।

सी कोहनी का आकार 15 से 26 माइक्रोन के बीच बदल जाता है जब कोशिकाएं नाइट्रोजन सीमा के तहत पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड डोकोसाहेक्सोइक एसिड (डीएचए) जमा करती हैं। इस जैव प्रौद्योगिकीय डीएचए उत्पादन प्रक्रिया में दो भाग होते हैं, विकास चरण, जिसमें कोशिकाएं विभाजित होती हैं और छोटी हो जाती हैं, और उत्पादन चरण, जिसमें कोशिकाएं उत्पाद को जमा करती हैं और इस प्रकार बड़ी हो जाती हैं। इसलिए, कोशिका आकार का उपयोग प्रक्रिया राज्य निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसमें या तो विकास या डीएचए उत्पादन अनुकूल था। अंत में, सेल आकार और डीएचए सामग्री के बीच एक संबंध पाया गया। इस मामले में, आईएसएम नमूने, सेल व्यवधान और सामान्य गैस क्रोमेटोग्राफी विश्लेषण¹⁰की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में इंट्रासेलुलर डीएचए संचय की निगरानी करने की अनुमति देता है।

नवोदित खमीर आमतौर पर 3 और 8 माइक्रोन के बीच आकार का होता है। एक समय में परिपक्वता स्थिति में कोशिकाओं का अनुपात, जैसा कि नवोदित सूचकांक (बीआई) के साथ वर्णित है, विकास जीवन शक्ति^11,12के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और यहां तक कि पुनः संयोजन प्रोटीन स्राव के साथ एक संबंध^{भी 13}साबित किया गया है। आईएसएम की मदद से नवोदित और गैर-नवोदित खमीर कोशिकाएं (कली के साथ और बिना कोशिकाएं)¹⁴प्रतिष्ठित थीं। तनाव की स्थिति भी खमीर आबादी के भीतर सेल आकार की एक व्यापक भिन्नता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जैसा कि हाल ही में पैमाने पर खेती में दिखाया गया है, जिसमें बड़े पैमाने पर पोषक तत्वों की स्थिति सीमित फेड बैच की खेती की नकल³थे ।

इसलिए, आईएसएम में इष्टतम खेती की स्थिति की पहचान के लिए जैव प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान या प्रक्रिया नियंत्रण के उद्देश्य के लिए एकल-कोशिका स्तर पर विकास जीवन शक्ति और उत्पाद गठन की निगरानी करने की क्षमता है। यहां वर्णित विधियां एकल कोशिकाओं के साथ माइक्रोबियल अनुप्रयोगों पर केंद्रित हैं, लेकिन मानव और पशु कोशिकाओं, कोशिका समूहऔर तंतु जीवों के छर्रों जैसे बड़े कणों पर भी लागू होती हैं।

Protocol

नोट: संबंधित सूक्ष्मजीव और संस्कृति की स्थिति के लिए मापदंडों को अनुकूलित करने के लिए निम्नलिखित कदम आवश्यक हैं। जांच सेटिंग्स का समायोजन एक अनुभवी उपयोगकर्ता के लिए लगभग 20 मिन तक रहता है। एसओपैट जीएमबीएच से संबंधित जांच मैनुअल में उपकरणों और चरणों का विस्तृत विवरण दिया गया है। सामान्य तौर पर, निम्नलिखित प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किए गए उपकरणों की आवश्यकता होती है: (i) जांच समायोजन और छवि अधिग्रहण के लिए जांच नियंत्रक; (ii) अधिग्रहीत छवियों पर एनोटेशन के लिए फिजी (इमेजजे); (iii) कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क (एनएन) प्रशिक्षण और कार्यप्रवाह निर्माण के लिए SOPAT समर्थन; (iv) वर्कफ़्लो के साथ पहले से अधिग्रहीत छवियों का उपयोग करके डेटा बैच प्रोसेसिंग के लिए बैचर; (v) बैच प्रसंस्कृत छवियों पर परिणाम दृश्य और मूल्यांकन के लिए परिणाम विश्लेषक; और (vi) स्वचालित वास्तविक समय माप और परिणाम दृश्य के लिए मॉनिटर।

1. हार्डवेयर पैरामीटर स्थापित करना

1. प्रयोग या अपकेंद्रित्र के दौरान प्राप्त की जा सकने वाली उच्चतम कोशिका एकाग्रता के साथ एक संस्कृति तैयार करें और इस एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए गोली को फिर से निलंबित करें। इस मामले में, सूखी बायोमास एकाग्रता के 65 ग्राम एल^-1 एस cerevisiae खेती के लिए चुना गया था।
2. अलग-अलग कमजोरियां तैयार करें, जो उच्चतम से सबसे कम एकाग्रता तक है ताकि अपेक्षित सीमा पूरी तरह से कवर हो। न्यूनतम 4 अलग-अलग सांद्रता की सिफारिश की जाती है।
3. पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के साथ सूक्ष्मजीव की कोशिका आकार सीमा की पहचान करें। संबंधित कोशिकाओं के अपेक्षित अधिकतम व्यास (डी_{अधिकतम)}को परिभाषित करें। एस सेरेविसियाके मामले में यह मूल्य 8 माइक्रोन तक सेट है।
4. कोशिकाओं के अपेक्षित डी_{मैक्स} के 5x और 10x के दो माप अंतराल चुनें।
5. अधिकतम स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता चुनें। उच्चतम कोशिका एकाग्रता के साथ दोनों अंतराल के लिए स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता चुनें ताकि कोशिकाएं अभी भी सबसे कम प्रकाश तीव्रता (अंधेरी छवियों) के साथ छवियों पर दिखाई दे सकें।
6. न्यूनतम स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता चुनें, और फिर दोनों अंतरालों के लिए स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता चुनें ताकि कोशिकाएं अभी भी उच्चतम प्रकाश तीव्रता (प्रतिभाशाली छवियों) के साथ छवियों पर दिखाई दे सकें। सबसे कम सेल एकाग्रता का उपयोग करें, जो माप अवधि के दौरान प्रकट होने की संभावना है।
7. एक फोकस स्थिति चुनें, जो प्रत्येक माप अंतर के लिए सबसे तेज छवियों की पैदावार करती है, दोनों स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता के लिए और एकाग्रता सीमा के लिए जिसे परीक्षण करने की आवश्यकता है (ध्यान केंद्रित करने के बारे में विवरण के लिए चरण 2 देखें)। कोशिकाओं को उचित रूप से फोकस करें ताकि छवि डेटा को बाद में एनोटेट किया जा सके (चरण 4 देखें)।
8. दोनों अंतर चौड़ाई और स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता के साथ सेल एकाग्रता (चरण 2 देखें) की पहले से तैयार कमजोर पड़ने की श्रृंखला को मापें।

चित्रा 1: एकाग्रता अंशांकन उपकरण। बाएं जीयूआई: ज्ञात सांद्रता के साथ छवि निर्देशिका (न्यूनतम 3) सेट करें; केंद्रीय जीयूआई: छवि निर्देशिका पर गणना की जाने वाली सुविधाओं का चयन करें; सही जीयूआई: न्यूनतम की पहचान करने के लिए भारित रूट मतलब स्क्वायर त्रुटि (डब्ल्यूआरएमई) चुनें। WRMSE और किसी भी छवि सुविधा और सेल एकाग्रता के बीच सबसे अच्छा संबंध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

9. कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रयोग का मूल्यांकन करें।
   1. निकाले गए छवि सुविधाओं (चमक या तीखापन) और उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान की गई पहले मापी गई सांद्रता, जैसे,शुष्क बायोमास या सेल मायने रखता है के बीच इष्टतम सहसंबंध की पहचान करने के लिए एकाग्रता अंशांकन (CoCa) टूल (देखें चित्रा 1)का उपयोग करें। अधिक जानकारी के लिए सॉफ्टवेयर मैनुअल में निर्देशों का पालन करें।
   2. किसी भी ऑफ लाइन माप की तुलना में विभिन्न सांद्रता पर छवि सुविधाओं से निकाली गई जानकारी के बीच इष्टतम सहसंबंध की पहचान करें। चित्रा 1की कथा देखें ।
   3. सबसे छोटी भारित रूट मतलब स्क्वायर एरर (डब्ल्यूआरएमई) में परिणाम वाली सुविधाओं के साथ एकाग्रता सहसंबंध वक्र के विचाराधीन सबसे उचित माप अंतर और स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता चुनें।
      नोट: प्रयोग के दौरान माप अंतर तय किया जाता है, जबकि स्ट्रोस्कोप तीव्रता को सेल एकाग्रता के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।

2. ऑफ लाइन माप

1. मोटाई गेज की मदद से चरण 1 के अनुसार वांछित माप अंतर को समायोजित करें।
2. एसओपैट डैशबोर्ड में ग्राफिकल यूजर इंटरफेस प्रोब कंट्रोल खोलें।
3. सॉफ्टवेयर उपधारा क्रियाओं और प्रेस कनेक्टमें एम्पलीफायर के लिए वांछित जांच कनेक्ट ।
4. स्ट्रीमिंग शुरू करने के लिए प्ले बटन दबाएं(लाइव व्यू)।
5. गैप में इथेनॉल छिड़ककर माप अंतर को साफ करें और ऑप्टिकल पेपर के साथ किसी भी धूल या गंदगी को सावधानीपूर्वक पोंछें। जांच लें कि सेंसर का गिलास कैमकंट्रोलमें लाइव व्यू के साथ कणों से मुक्त है।
   नोट: कणऔर धूल माप और स्वचालित सेल पहचान परेशान।
6. माप के अंतर में एक सूखा ऑप्टिकल पेपर रखें। टैब प्रोब कंट्रोल खोलें और पेपर की कल्पना करने के लिए स्ट्रोस्कोप तीव्रता को समायोजित करें। बाध्यकारी पेंच बारी जब तक कागज के एकल फाइबर स्पष्ट रूप से देखा जाता है ।
7. संस्कृति शोरबा के साथ एक ट्यूब भरें। संस्कृति शोरबा में माइक्रोस्कोप डुबकी ताकि अंतर पूरी तरह से सेल निलंबन के साथ कवर किया जाता है । टैब प्रोब कंट्रोल खोलें और धारा 1 के अनुसार वांछित स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता को समायोजित करें। फोकस बाध्यकारी पेंच को ठीक-ट्यूनिंग करके कोशिकाओं पर ध्यान दें। प्रयोग के दौरान अब ध्यान नहीं बदला जाना चाहिए
   नोट: संस्कृति शोरबा के 5-6 mL एक ५० mL शंकुअप अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए जोड़ा जाता है मापने के अंतर पर्याप्त नाव ।
8. जीयूआई फ्रेम्समें यूआईएफमें ट्रिगर िंग करने वाले मेन्यू में यूजर इंटरफेस में प्रति टाइम पॉइंट [-] फ्रेम की संख्या को परिभाषित करें। फ्रेम की संख्या प्रति ट्रिगर 200 फ्रेम करने के लिए निर्धारित करें।
   नोट: फ्रेम की संख्या को सबसे कम मूल्य तक कम किया जा सकता है, जो सांख्यिकीय विश्वसनीय परिणाम के लिए आवश्यक है। यह एक प्रतिनिधि रूपात्मक कोशिका आकार वितरण प्राप्त करने के लिए आवश्यक नमूना आकार पर निर्भर करता है (चरण 5 भी देखें)।
9. जीयूआई फ्रेम दर में मेनू ट्रिगरिंग में फ्रेम दर [हर्ट्ज] को परिभाषित करें। एक फ्रेम दर चुनें जो गारंटी देती है कि पिछले फ्रेम से चलती कण निम्नलिखित फ्रेम में दिखाई नहीं देंगे।
   नोट: यह 200 फ्रेम के साथ एक परीक्षण ट्रिगर के साथ साबित किया जा सकता है। कणों के लिए छवियों का निरीक्षण करें, जिन्हें बार-बार कैप्चर किया जाता है। यदि यही स्थिति है, तो फ्रेम दर को कम करें। ऑफ लाइन मापन के लिए, 1 हर्ट्ज की सिफारिश की जाती है।
10. निर्देशिका सेट करें, जिसमें अधिग्रहीत छवियों को मेनू जनरलमें सहेजा जाएगा।
11. स्टार्ट इमेज ट्रिगर अधिग्रहण बटन को सक्रिय करके एक छवि अधिग्रहण करें। संस्कृति निलंबन के साथ ट्यूब धीरे ऊपर और नीचे ले जाने के लिए मापने के अंतर के माध्यम से एक प्रवाह प्रेरित ।
12. प्रत्येक माप के बाद चरण 2.5 दोहराएं।
13. अधिग्रहीत छवियों की जांच करें। कोशिकाओं को एनोटेशन के लिए काफी तेज होना चाहिए। कणों के लिए छवियों का निरीक्षण करें, जिन्हें बार-बार कैप्चर किया जाता है। यदि यही स्थिति है, तो फ्रेम दर को कम करें।
14. निम्नलिखित मार्ग का चयन करके सेटिंग्स को सहेजें: सी:\प्रोग्राम फाइलें \ SOPAT GmbH\ मॉनिटरिंग प्रोग्राम \ कैमकंट्रोल, और प्रेस सेव।

3. कण पहचान

1. कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क (एनएन) (प्रशिक्षण सेट) के प्रशिक्षण के लिए एनोटेट कण।
   1. अधिग्रहीत छवियों को मुख्य"इमेजजे"विंडो (चित्र 2में जीआईआई "फिजीटूल देखें) में फ़ाइल को खींचकर और छोड़कर एनोटेशन टूल'फिजी, इमेजजे'में लोड करें
   2. चयन करके आरओआई प्रबंधक खोलें: विश्लेषण करें। उपकरण । आरओआई मैनेजर।
   3. एक चयन उपकरण चुनें। छड़ी (ट्रेसिंग) उपकरण, फ्रीहैंड, अंडाकार, या अंडाकार चयन की सिफारिश की जाती है।
   4. कण के चारों ओर एक चक्र ड्रा करें जिसे पहले उल्लिखित चयन उपकरणों के साथ एनोटेट किया जाएगा और फिर ब्रश उपकरण के साथ इसे परिष्कृत किया जाएगा।
   5. ऐड [टी]दबाकर आरओआई मैनेजर को एनोटेशन डालें।
   6. लगभग 15 छवियों पर ब्याज की सभी वस्तुओं (कोशिकाओं की पहचान की जानी है) को चिह्नित करें।
      नोट: सभी आवश्यक जानकारी को कवर करने के लिए, यानी, विभिन्न आकार, आकार, कोशिकाओं की एकाग्रता, चमक, आदि,शुरू से ही पांच छवियों का उपयोग करें, बीच से पांच छवियां, और प्रयोग के अंत से पांच छवियां।
   7. तय करें, अगर कोशिकाओं को उनके आकार(जैसे,सेल चक्र के विभिन्न चरणों) के कारण विभिन्न उपवर्गों में वर्गीकृत करने की आवश्यकता है, या यदि सभी कोशिकाएं एक ही वर्ग की हैं।
   8. प्रत्येक चयनित कणों का नाम तदनुसार बदलें। प्रत्येक वर्ग के लिए एक नाम या संक्षिप्त नाम और कक्षा के प्रत्येक कण के लिए एक काउंटर निर्धारित करें(उदाहरण के लिए,cell_1, cell_2, आदि)। प्रति वर्ग कम से कम 50 कणों को एनोटेट करें।
   9. वस्तुओं का एनोटेट न करें, जिनका पता नहीं लगाया जाना चाहिए, क्योंकि वे इस प्रक्रिया के लिए प्रासंगिक नहीं हैं, जैसे गैस बुलबुले या अभंग मीडिया घटकों जैसे अन्य कण।
      नोट: उन घटनाओं ANN के लिए प्रशिक्षण प्रक्रिया में शामिल नहीं किया जाएगा और पृष्ठभूमि के रूप में माना जाएगा ।
   10. उन कोशिकाओं को एनोटेट न करें जो ध्यान से बाहर हैं।
   11. छवियों को यथासंभव सुसंगत के रूप में एनोटेट करें। यदि संदेह है, तो लेबल अनदेखा किया जा सकता है। इसके उपयोग का दुरुपयोग न करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, क्योंकि एन केवल उन संरचनाओं को पहचानेगा जो लेबल हैं।

चित्रा 2: फिजी टूल यूजर इंटरफेस। एनोटेटेड छवियों के साथ एक प्रशिक्षण सेट बनाया जाता है। दो वर्गों से मिलकर एक मैनुअल एनोटेशन दर्शाया गया है, एनोटेटेड कणों की सूची आरओआई प्रबंधक में दिखाई गई है। विभिन्न वर्गों के लिए अलग-अलग नाम और रंग सेट किए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. एनोटेटेड ऑब्जेक्ट्स और इमेज को जिप फॉर्मेट में सेव करें और फाइल को ट्रेनिंग नेटवर्क पर भेजें, या तो प्लेटफॉर्म पर अपलोड करके या ई-मेल के जरिए जिप फाइल भेजकर ।
   नोट: आमतौर पर, छवियों पर वर्गीकृत वस्तुओं की पर्याप्त भविष्यवाणियों की पहचान करने के लिए कई पुनरावृत्ति प्रशिक्षण दौर लगते हैं। प्रत्येक प्रशिक्षण दौर एक कार्यप्रवाह की ओर जाता है जो कार्यक्रम द्वारा लौटाया जाता है।
3. डैशबोर्ड में शुरू किए जा सकने वाले डेटा बैच प्रगति कार्यक्रम बैचर के साथ परीक्षण छवियों का विश्लेषण करने के लिए प्रशिक्षित ऑब्जेक्ट रिकग्निशन एल्गोरिदम के साथ कार्यप्रवाह (*.wf) का उपयोग करें।
4. झूठी सकारात्मक और नकारात्मक घटनाओं की मात्रा के माध्यम से परीक्षण छवियों पर वस्तु का पता लगाने की जांच करें।
   1. झूठी सकारात्मक घटनाओं का पता लगाने की मात्रा निर्धारित करें: कणों को गलती से कोशिकाओं के रूप में पता चला, कोशिकाओं है कि सही ढंग से वर्गीकृत नहीं कर रहे हैं, और कोशिकाओं जिनमें से समोच्च अच्छी तरह से पहचान नहीं किया गया है ।
   2. झूठी नकारात्मक घटनाओं (कोशिकाओं है कि इस तरह के रूप में मांयता प्राप्त नहीं कर रहे हैं) की मात्रा ।
5. डैशबोर्ड में कार्यक्रम शुरू करके टूल रिजल्ट एनालाइजर में परिणामों की कल्पना करें।
   1. फ़ाइल के साथ वांछित परिणाम फ़ाइलों का आयात करें। आयात फ़ाइल या फ़ाइल । आयात फ़ोल्डर्स।
   2. चार्ट द्वारा परिणामों की कल्पना करें। चार्ट जीयूआई पर चार्ट बनाएं।
   3. निम्नलिखित विकल्पों में से एक का चयन करें: वितरण चार्ट, संवेदनशीलता साजिश, समय के साथ विशेषता, सर्वेक्षण बिंदुओं पर विशेषता, और सुविधा बनाम सुविधा।
      नोट: रिजल्ट एनालाइजर के उपयोग के बारे में एक मैनुअल सिस्टम के साथ आता है और समर्थन से भी उपलब्ध है।
   4. यदि परिणाम स्वीकार्य हैं, तो प्रयोग की सभी अधिग्रहीत छवियों पर बैचर में कार्यप्रवाह चलाएं। साथ ही निगरानी कार्यक्रम को वर्कफ़्लो (*.डब्ल्यूएफ) के साथ प्रोब कंट्रोलर (*.पीसीएफजी) से सहेजी गई सेटिंग्स के संयोजन से बनाया जा सकता है, मैनुअल भी देखें।
      नोट: इस संस्कृति मीडिया के लिए भविष्य के प्रयोगों की निगरानी के लिए कार्यप्रवाह का भी उपयोग किया जा सकता है।
   5. यदि परिणाम स्वीकार्य नहीं हैं, तो प्रशिक्षण सेट पर एनोटेशन की जांच करें और/या एक और पुनरावृत्ति प्रशिक्षण दौर जारी रखें (चरण ४.२ देखें) ।

4. नमूना आकार परिमाणीकरण

1. मानक विचलन (, जो पता चला कणों के बीच स्वीकार्य है सेट करें।
   नोट: मानक विचलन कोशिका आकार एकरूपता के समानांतर में बदलता है। अधिकतम मानक विचलन आकार विषमता के उच्चतम डिग्री के साथ नमूना इंगित करता है।
2. माप (ई)के अपेक्षित विचरण के संबंध में आत्मविश्वास अंतराल या वांछित सटीकता का आयाम निर्धारित करें।
3. 5% (z_1-α/2 = 1.96) और 10% (z_1-α/2 = 1.64) के बीच भर्ती त्रुटि (α) सेट करें।
4. समीकरण 1 से प्रत्येक वर्ग से पहचाने जाने वाले कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
   [समीकरण 1]
   नोट: कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, प्राप्त की जाने वाली छवियों की संख्या को प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए परिभाषित किया जा सकता है।
5. प्रयोग के यादृच्छिक समय बिंदुओं पर एक संवेदनशीलता विश्लेषण करने की जांच करने के लिए कि एन कणों के विश्लेषण मतलब Feret व्यास और 5% से कम के Dv90 की परिवर्तनशीलता की ओर जाता है । इसकी गणना परिणाम एनालाइजरमें स्वचालित रूप से की जा सकती है।

5. ऑन लाइन (बाय-पास) या लाइन माप में

1. जीव और प्रक्रिया (एकाग्रता या मीडिया) के एक समारोह के रूप में हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर सेटिंग्स सेट करने के लिए पहले ऑफ लाइन माप प्रक्रिया (चरण 2 देखें) का प्रदर्शन करें।
2. बटन लोड का चयन करके पिछले अनुभाग से सहेजी गई सेटिंग्स अपलोड करें और निम्नलिखित मार्ग का चयन करें: C:\ कार्यक्रम फ़ाइलें \ SOPAT GmbH\ मॉनिटरिंग प्रोग्राम \ कैमकंट्रोल।
3. जांच को फ्लो सेल या बायोरिएक्टर से कनेक्ट करें।
   नोट: सीटू माप में एक चुटकी फ्लैंज के साथ किया जा सकता है।
4. नसबंदी करें।
   नोट: केवल जांच-यंत्र की weted सामग्री भाप नसबंदी के माध्यम से बंध्याकरण है । जांच गीला लंबाई 6 से २२२ मिमी(चित्रा 3)जा सकते हैं ।

चित्रा 3: आईएसएम उपकरणों का स्केच। जांच एमएम-हो(ए)सीधे बायोरिएक्टर में स्थापित है, जबकि जांच एमएम 2.1(बी)को बाय-पास के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। संस्कृति शोरबा परिसंचरण प्रत्येक चित्र में तीर के साथ चिह्नित है। रूपांतरण कारक एमएम-हो के लिए 0.166 माइक्रोन पिक्स^-1 और एमएम 2.1 के लिए 0.087 माइक्रोन पिक्स^-1 हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

5. क्षेत्र ट्रिगर अंतराल [एस]में जीयूआई ट्रिगरिंग में छवि अधिग्रहण दर को परिभाषित करें।
   नोट: प्रक्रिया गतिशीलता के आधार पर, छवि अधिग्रहण दर को अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि 3 घंटे के अंतराल-चरण की उम्मीद है, तो अधिग्रहण की दर कम हो सकती है, क्योंकि यदि एक चयापचय बदलाव या किसी उत्पाद के संचय की निगरानी की जाएगी। आमतौर पर, इसके लिए मिनट रेंज में बहुत कम अधिग्रहण समय की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, एक बैच खमीर खेती के दौरान 5 और 10 किमी के बीच एक छवि अधिग्रहण अनुक्रम प्रक्रिया गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान करता है ।
6. चरण 2.10 में समझाया के रूप में फ्रेम दर को परिभाषित करें।
   नोट: ऑन लाइन और लाइन माप नक्त में, फ्रेम दर को बढ़ाया जा सकता है, क्योंकि यांत्रिक सरगर्मी अंतर के माध्यम से प्रवाह दर में वृद्धि कर सकती है।
7. चयनित जांच के बटन स्टार्ट स्ट्रीमिंगको सक्रिय करके छवि अधिग्रहण शुरू करें।
8. चयनित जांच के बटन स्टॉप स्ट्रीमिंग केसाथ प्रयोग समाप्त होने पर अधिग्रहण बंद करें।
   नोट: 1^सेंट रन के लिए, संस्कृति के टीका से ठीक पहले अधिग्रहण शुरू करें और चरण 4 पर आगे बढ़ें। निम्नलिखित रन के लिए, डैशबोर्ड में प्रोग्राम मॉनिटरिंग खोलें और बनाए गए वर्कफ़्लो (चरण 4 देखें) का चयन करें। प्ले बटन दबाकर संस्कृति के टीका से ठीक पहले मॉनिटरिंग शुरू करें।

Representative Results

नवोदित और गैर नवोदित कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए आईएसएम और स्वचालित छवि का पता लगाने के साथ खमीर संस्कृतियों में सेल आकार का पता लगाने का सफलतापूर्वक आयोजन किया गया था। स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता और माप अंतर के चयन दोनों में सहिष्णुता की एक श्रृंखला है, जिसमें कण पहचान प्रभावित नहीं होती है। उदाहरण के लिए, एस सेरेविस कोशिकाओं को 4 ग्राम^एल-1की सूखी बायोमास एकाग्रता पर 11% की भिन्नता सीमा के भीतर विभिन्न स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता के साथ मापा गया था। इसी छवियों ने तेज कोशिका सीमाएं प्रदान कीं, इसलिए कण पहचान कोशिका आकार (1%) की स्वीकार्य भिन्नता के साथ संभव थी स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता की परवाह किए बिना। यदि स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता को ठीक से समायोजित नहीं किया जाता है, तो छवियां अधिक प्रकाश व्यवस्था से पीड़ित होती हैं और एक उचित सेल पहचान संभव नहीं होगी(चित्र4)।

चित्रा 4: छवि अधिग्रहण सुविधाएं। विभिन्न स्ट्रोबोस्कोप तीव्रता (एसआई-%) के उदाहरण और एस cerevisiae कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए माप अंतराल (एमजी-μm) (एसआई और एमजी के वर्तमान मूल्यों कोष्ठक में संकेत दिए जाते हैं): ए (25, 50); बी (50, 50); सी (25, 80); और डी (50, 80) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अब तक, मापने के अंतर को सीटू माप में एक के दौरान फिर से समायोजित नहीं किया जा सकता है । इसलिए, खेती के दौरान विश्वसनीय डेटा की गारंटी देने के लिए कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला प्रयोग महत्वपूर्ण है। मुख्य चिंता सेल एकाग्रता में वृद्धि के कारण अज्ञात ओवरलैपिंग घटनाओं की घटना है।

लोडेड डेटा फ़ाइल से सभी पता लगाए गए कोशिकाओं की एक संवेदनशीलता साजिश (विशिष्ट मूल्यों का संवेदनशीलता विश्लेषण, उदाहरण के लिए,कण संख्या एन के संबंध में मतलब सेल व्यास) की कल्पना की जा सकती है(चित्रा 5)। उपयोगकर्ता को यह तय करना होगा कि एक निश्चित प्रक्रिया पैरामीटर की स्थिरता की आवश्यकता है। इस मामले में एक वैध डेटा बिंदु के लिए आवश्यक कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या। परिणामस्वरूप, कम या ज्यादा छवियों का विश्लेषण एक डेटा बिंदु के लिए किया जा सकता है।

चित्रा 5: मतलब सेल व्यास संवेदनशीलता साजिश । पता चला कणों की संख्या की निर्भरता में मतलब सेल व्यास की परिवर्तनशीलता। मतलब सेल व्यास का एक निरंतर मूल्य लगभग 1,000 कोशिकाओं के साथ प्राप्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कण पहचान की वांछित सटीकता प्राप्त करने के लिए एनोटेशन महत्वपूर्ण बिंदु है। चित्रा 6 एक "उपयोगकर्ता एनोटेशन" (ए) का एक उदाहरण दिखाता है, जिसका उपयोग तंत्रिका नेटवर्क के लिए निर्धारित प्रशिक्षण के रूप में किया जाता है, साथ ही परीक्षण सेट (तंत्रिका नेटवर्क के लिए अज्ञात डेटा) की छवि पर कण पहचान, जिसका उपयोग इसके मूल्यांकन (बी) के लिए किया जाता है। दोनों छवियों की पहचान की घटनाओं की एक समान दर होनी चाहिए ।

चित्रा 6: उपयोगकर्ता एनोटेशन (प्रशिक्षण सेट) और स्वचालित पहचान (परीक्षण सेट) की तुलना। प्रशिक्षण सेट: एनोटेटेड और मूल चित्रों को क्रमशः एऔर एमें चित्रित किया गया है। इस तस्वीर की जानकारी ANN को प्रशिक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । टेस्ट सेट: एन प्रशिक्षण के बाद बनाया गया कार्यप्रवाह कैप्चर पर लागू होता है, जिसका उपयोग प्रशिक्षण के लिए नहीं किया गया है: मूल कैप्चर बी से स्वचालित रूप से पहचानी गई कोशिकाएं (बीमें दिखाया गया) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कोशिका आकार वितरण पर इंट्रासेलर उत्पाद संचय के प्रभाव के उदाहरण के रूप में, नाइट्रोजन सीमा द्वारा पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड डोकोसाहेक्सोइक एसिड (डीएचए) के संचय की जांच हेट्रोट्रोफिक माइक्रोएल्गा सी कोहनीमें की गई थी। यह दर्शाया गया कि उत्पाद के संचय का पता मात्रात्मक रूप से आईएसएम¹⁰के माध्यम से लगाया जा सकता है । विधि वर्तमान में कोशिकाओं की रूपात्मक विषमता पर उभारा बायोरिएक्टरों में कतरनी बलों के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

नवोदित खमीर एस cerevisiae की परिपक्वता स्थिति की मात्रा निर्धारित किया गया था । नवोदित के मामले में, कोशिकाओं का अनुपात जो एक समय में परिपक्वता स्थिति में हैं (बीआई के साथ वर्णित), विकास गतिविधि और जनसंख्या विषमता की जानकारी प्रदान करता है। स्वचालित सेल मान्यता सेल निलंबन¹⁵में सफलतापूर्वक नवोदित और गैर-नवोदित (या बेटी) कोशिकाओं की पहचान करने और भेद करने में सक्षम थी। तीन नमूनों का सेल साइज डिस्ट्रीब्यूशन फिगर 7में दिखाया गया है । छोटी कोशिकाओं में बदलाव जनसंख्या के भीतर नवोदित कोशिकाओं के निचले हिस्से को इंगित करता है।

चित्रा 7: संचयी एकल सेल आकार वितरण। 3 घंटे (सीधी रेखा), 7 एच (बिंदीदार रेखा), और 13 एच (धराशायी रेखा) पर खेती के समय के दौरान मापा गया सेल आकार वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

आईएसएम का उपयोग कवक, सूक्ष्मशैवाल और खमीर कोशिकाओं की रूपात्मक गतिशीलता को मापने के लिए किया गया था, जिसने विकास गतिविधि के निर्धारण को सक्षम किया, और शैवाल, इंट्रासेलर उत्पाद संचय के मामले में। सेंसर कोई चल भागों है और सीधे किसी भी मानक उभारा टैंक बायोरिएक्टर में लागू होता है, या तो एक मानक बंदरगाह के माध्यम से या एक बंध्याकरण उप पास में । चूंकि खमीर शैवाल की तुलना में बहुत छोटा है, सेल आकार में कमी के लिए खमीर के पर्याप्त पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन (तकनीकी विवरण के लिए,¹⁵देखें) के लिए ट्रांसमिशन द्वारा उच्च कैमरा रिज़ॉल्यूशन और रोशनी जैसे कुछ हालिया हार्डवेयर अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हालांकि, बैक्टीरिया जैसी छोटी कोशिकाओं को मापने के लिए अभी भी एक सीमा मौजूद है। सीटू फोटो-ऑप्टिकल इंस्ट्रूमेंटेशन में वर्तमान उच्च एकाग्रता में अतिव्यापी कण जानकारी और यूवी/विस स्पेक्ट्रम के नीचे संरचनाओं के साथ हस्तक्षेप प्रभाव के बारे में सीमाओं को इंगित करता है । आज तक, बैक्टीरियल निलंबन के लिए छवि विश्लेषण एल्गोरिदम लागू नहीं किया गया है, चमक सहसंबंध¹⁶के अलावा ।

उनकी विश्वसनीयता दिखाने के लिए सेल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पहले लागू किए गए अन्य आईएसएम टूल का उपयोग किया गया था। हालांकि, यह महत्वपूर्ण हो गया अगर कोशिकाओं को ऊंचा सांद्रता पर एक दूसरे को छा । इसलिए, इस अध्ययन का ध्यान सेल क्वांटिफिकेशन नहीं था, बल्कि रूपात्मक सुविधा का पता लगाया गया था, जबकि चमक तीव्रता जैसी छवि सुविधाओं को सेल घनत्व से सहसंबद्ध किया जा सकता है जैसा कि अन्य उपकरणों के साथ किया जाता है, बहुत^17। अन्यथा ये सभी उपकरण कम सेल सांद्रता तक सीमित होंगे; क्लस्टर साइज एल्गोरिदम का उपयोग करते समय सेल रिकग्निशन अप्रोच बनाम सीए 80 ग्राम^एल-1 का उपयोग करते समय खमीर कोशिकाओं के सीए 20 ग्राम^एल-1 की अधिकतम एकाग्रता का मूल्यांकन किया गया था।

एक सेल की रूपात्मक विशेषताओं को ट्रैक करने के लिए, इसके किनारों का सही पता लगाने की आवश्यकता है। शैवाल के मामले में, यह आकार में परिवर्तन के रूप में सरल है, लेकिन प्रक्रिया चरणों के संक्रमण के दौरान फॉर्म स्थिर रहता है। इसके विपरीत, खमीर कोशिकाएं अपने रूप के कारण एक बड़ी चुनौती प्रदान करती हैं, जिसे कोशिकाओं के नवोदित होने पर किसी क्षेत्र या अंडाकार के लिए अनुमानित नहीं किया जा सकता है। फिर भी, अब तक सेल आकार की गणना इस धारणा के तहत की गई थी कि एक कोशिका आईएसएम माप¹⁸में एक आदर्श क्षेत्र है। यद्यपि यह सन्निकटन कुछ मामलों के लिए वास्तविकता के करीब है, लेकिन नवोदित कोशिकाओं या रॉड के आकार की कोशिकाओं जैसे अधिक जटिल रूपों का उचित मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हालांकि, मशीन लर्निंग एल्गोरिदम के माध्यम से सक्षम लचीली सीमा का पता लगाने के कारण विभिन्न रूपों का सफलतापूर्वक विश्लेषण किया गया। इसके अलावा, ओवरलैपिंग घटनाओं की जांच¹⁹ अभी भी एक और विकास के स्तर को प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं ।

वर्तमान में, जीवन शक्ति और व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए सोने का मानक कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गिनती करना है या एक व्यवहार्यता^{रंगे 20}के साथ एक नमूना दाग देना है, उदाहरण के लिए,मिथिलीन ब्लू या मेथिलीन वायलेट^21; हालांकि, यह प्रक्रिया परिणामों को प्रभावित कर सकती है। जब भी इस तरह की विशेषताएं सेल आकृति विज्ञान²²से संबंधित हैं, तेजी से उनका आकलन करने की क्षमता आईएसएम की बढ़ती क्षमता से पता लगाया जाना चाहिए । इसके अलावा, महत्वपूर्ण प्रक्रिया मापदंडों और/या गुणवत्ता गुण²³ आकार, समूह और गोली गठन से संबंधित हो सकता है, जो सभी आईएसएम द्वारा निगरानी की जा सकती है ।

जैव प्रक्रिया में अक्सर उपयोग किए जाने वाले अन्य प्रमुख सूक्ष्मजीवों के साथ जांच वर्तमान में की जाती है। ऑब्जेक्ट रिकग्निशन एल्गोरिदम के अनुकूलन और सुविधा विश्लेषण के लिए सुविधा निष्कर्षण के लिए समय मुख्य रूप से छवियों की जटिलता और परिणामों की अपेक्षित सटीकता पर निर्भर करता है। भविष्य में, जानकारी की सीमा को और व्यापक बनाने के लिए रंगीन छवि कैप्चर पर विचार किया जाएगा, जिसे एकल-कोशिका स्तर पर प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए,यदि पिगमेंट जमा होते हैं या आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों में, जिसमें रंगीन मार्कर एकीकृत किए गए थे।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor MM 2.1 - MFC	SOPAT GmbH, Germany	n.a.	Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germany	n.a.
Thickness gauge	n.n.		It can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%	n.n.		It can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5	SOPAT GmbH, Germany
Optical lense paper	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	open source
50 mL conical centrifuge tubes			It can be any supplier