Summary
تم تطوير جهاز مجهري للصور البصرية في الموقع لمراقبه حجم الخلايا المفردة مباشره في تعليق الخلية. يتم اجراء القياس في الوقت الحقيقي عن طريق اقتران المسبار البصري القابل لتعقيم الصور بتحليل تلقائي للصور. تظهر التغيرات المورفولوجية مع الاعتماد علي حاله النمو والظروف الزراعية.
Abstract
ويقتصر الرصد في الموقع في العمليات البيولوجية الميكروبية في الغالب علي الخواص الكيميائية والفيزيائية لهذه الوسيلة (مثلا، قيمه الأس الهيدروجيني وتركيز الأكسجين المذاب). ومع ذلك ، فان المورفولوجية من الخلايا يمكن ان يكون مؤشرا مناسبا للظروف المثلي ، لأنه يتغير مع الاعتماد علي حاله النمو ، وتراكم المنتجات والإجهاد الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان توزيع حجم الخلية الواحدة لا يوفر فقط معلومات عن ظروف الزراعة ، ولكن أيضا عن عدم تجانس السكان. وللحصول علي هذه المعلومات ، تمتطوير جهاز مجهري للصور البصرية في الموقع للتمكين من رصد توزيع حجم الخلية الواحدة مباشره في تعليق الخلية في المفاعلات الحيوية. ويقترن التحليل الألى للصور بالمجهر القائم علي نموذج الشبكة العصبية ، الذي يتم تدريبه باستخدام صور مشروحه من قبل المستخدم. وترتبط العديد من المعلمات ، والتي تكتسب من لقطات من المجهر ، لمعالجه الميزات ذات الصلة من الخلايا ، مثل نشاطهم الأيضي. حتى الآن ، تم تطبيق سلسله التحقيق المجهري المقدمة في الموقع لقياس حجم بيليه في تعليق الفطريات الخيطية. تم استخدامه لتمييز حجم الخلية الواحدة في زراعه الطحالب الدقيقة وربطها بتراكم الدهون. وكان شكل الجزيئات الخلوية المرتبطة في مهدها في ثقافات الخميرة. ويمكن تقسيم تحليل المجهر عموما إلى ثلاث خطوات: ' 1 ' اكتساب الصور ، ' 2 ' تحديد الجسيمات ، و ' 3 ' تحليل البيانات ، علي التوالي. ويتعين تكييف جميع الخطوات مع الكائن الحي ، التالي يلزم تقديم معلومات محدده مشروحه من أجل تحقيق نتائج موثوق بها. وتمكن القدرة علي رصد التغيرات في شكل الخلية مباشره في الخط أو علي الخط (بالمرور المباشر) القيم الانيه للرصد والمراقبة ، وفي تطوير العمليات وكذلك في نطاق الإنتاج. ان ال [أوت لين ] معطيات يرتبط مع ال [رل-تيم] معطيات, الحالية مملة من خط قياسات مع تاثيرات مجهوله علي الخلية حجم يصبح غنيه.
Introduction
وغالبا ما ترتبط الخصائص المورفولوجية للخلايا بالحالة الفسيولوجية ، وهناك اتصال بين الشكل والوظيفة للعديد من التطبيقات. ويتاثر تشكل الخلية الواحدة بحاله النمو ، وعمر الخلية ، والإجهادات الخلوية المحتملة الأخرى أو تراكم المنتجات. وغالبا ما تكون التغيرات المورفولوجية للخلايا مقياسا لحيوية نمو الثقافة. توليف المنتجات داخل الخلايا, تراكم الدهون في الطحالب وإدماج تشكيل الجسم في البكتيريا, من بين أمور أخرى, ترتبط مع حجم الخلية وكذلك. خليه تكتل يستطيع كنت أخرى عامل ان يكون جديرة يتحرى بما ان يلخص مؤخرا2.
يمكن تحديد كميه التغاير السكانية استنادا إلى الخصائص المورفولوجية للخلايا الفردية. وأظهرت الدراسات ان عدم التجانس داخل الثقافة قد يكون كبيرا ، علي سبيل المثال، في ظل ظروف الإنتاج الواسعة النطاق3 وقد يتاثر العائد الإجمالي بانخفاض أداء السكان الفرعيين4.
عاده ، يتم اجراء تقييم الميزات المورفولوجية من الخلايا عن طريق أخذ العينات اليدوية أو مع غرفه تدفق بتمريره إلى جانب جهاز الصور البصرية. وهذا يؤدي إلى عده قيود: فالكمية المحدودة من البيانات المكتسبة لا يمكن ان توفر قياسات موثوقه إحصائيا ؛ التاخير الزمني بين أخذ العينات والوصول إلى النتائج قد يكون طويلا جدا بالمقارنة مع ديناميات العملية ؛ والاهم من ذلك ، فان اجراء أخذ العينات (موقع ميناء أخذ العينات ، والمعالجة المسبقة للعينه قبل القياس ، والظروف غير المواتية في أخذ العينات أو أنبوب التفافيه) يمكن ان تؤدي إلى خطا متحيز كما الاجراء عينه نفسها يمكن ان تؤثر بالفعل علي الخلية مورفولوجيا. وأخيرا ، هناك دائما خطر كبير للتلوث اثناء أخذ العينات أو في حلول المرور ، إذا لم يتم تعقيمها في مكانها.
يمكن لتطبيق المجهر في الموقع (ISM) التفاف علي العديد من هذه المشاكل. إذا تم الكشف عن الخلايا تلقائيا ، يمكن مسح التعريف الصحيح لمعالمها المورفولوجية5. وحتى الآن ، كانت القيود الرئيسية لهذه الطريقة هي ' 1 ' وقت تقييم الصور ، الذي كان طويلا جدا بالنسبة للتطبيقات الموقعيه ، و ' 2 ' ضعف استبانه الصور ، ولا سيما في كثافة الخلايا العالية. علي الرغم من ان الحلول الاولي من ISM شملت أخذ العينات الميكانيكية, تخفيف المسبار, أو اقتصرت علي نظام بتمريره6,7, المزيد من النهج تسمح التقاط تعليق الخلية مباشره8.
التطورات الاخيره في ISM تسمح للخط في خط أو علي خط الرصد من الخلايا علي أساس خليه واحده ، والذي يوفر توزيع المعلمات المورفولوجية في الوقت الحقيقي مباشره في تعليق الخلية في تركيزات الخلية عاليه إلى حد كبير. ويمكن التعرف علي الارتباطات مع المعلومات المقدمة من خلال الكشف الألى المقترن بالخلايا والبيانات المتعلقة بالخلية عن طريق تحليلات الخطوط المتفرعة عن المعلمات الرئيسية للخلايا. ثم ، يتم تحقيق تصاميم جديده استشعار لينه ، والتي يتم تقدير المعلمة غير قابله للقياس مع المورفولوجية خليه واحده.
في هذا التقرير ، يتم اجراء ISM عن طريق اقتران مسبار الصور البصرية إلى تحليل الصورة الألى. ISM يتكون من المسبار الاستشعار قضيب واحد التي تمكن من التقاط الصور ضمن نطاق التركيز المعروف في فجوه قياس قابل للتعديل مع كاميرا CCD عاليه الدقة [مم-هو = CCD GT2750 (2750x2200) و MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)]. يتم اجراء الاضاءه ضوء فلاش عن طريق الإرسال. لذلك ، يتكون الضوء من الجانب الآخر من الكاميرا9 ويمكن تعديل شدته. تمر الخلايا بشكل مستمر من خلال هذه الفجوة مع تدفق السائل. ومن ثم ، يتم الحصول علي عينه تمثيليه من السكان. المسبار يستطيع كنت شنت مباشره إلى ال [بيوكتور] [س ثت] هو يصل داخل الخلية تعليق, أو هو يستطيع كنت استعملت في معقمه [ب-تمر]. يتم توصيل قذيفة الاستشعار إلى النظام قبل التعقيم ، والأجزاء البصرية وبعد ذلك شنت في قذيفة.
حتى الآن ، والكائنات المجهرية الصناعية ذات الصلة ، علي سبيل المثال، الفطريات الخيطية (قطر تصل إلى أكثر من 200 μm) ، والطحالب غير المتجانسة crypthecodinium cohnii (متوسط قطر الخلية من 20 μm) ، والخميرة ساكاروميسز سيريفيسياي (متوسط قطر الخلية من 5 μm) ،
الفطريات الخيطية تميل إلى تشكيل الكريات تحت ظروف زراعه معينه. هذه هي من حجم يصل إلى عده مئات من μm. والخلايا الفطرية في الخلية تتطور أطوال مختلفه في الاعتماد علي الإجهاد الهيدروديناميكي في مرحله السوائل. هذا له تاثير علي نشاط الأيض والنمو, امتصاص الركيزة والإفراج عن المنتج. تم تطبيق ISM لتحديد توزيع حجم بيليه وعرض مناطق كثافة الكتلة الحيوية اقل علي حواف الكريات (البيانات غير المنشورة الخاصة).
حجم c. cohnii يغير بين 15 و 26 ميكرومتر عندما تتراكم الخلايا الأحماض الدهنية غير المشبعة docosahexاينويك حمض (DHA) تحت النيتروجين الحد. هذه العملية الحيوية لإنتاج DHA تتكون من جزاين ، مرحله النمو ، حيث تقسم الخلايا وتصبح أصغر ، ومرحله الإنتاج ، التي تتراكم فيها الخلايا المنتج التالي تصبح أكبر. ولذلك ، تم استخدام حجم الخلية لتحديد حاله العملية ، التي اما النمو أو إنتاج DHA كان مواتيه. وأخيرا ، تم العثور علي ارتباط بين حجم الخلية ومحتوي DHA. في هذه الحالة ، ISM يسمح لرصد تراكم DHA داخل الخلايا في الوقت الحقيقي دون شرط أخذ العينات ، وتعطيل الخلية ، وتحليل اللوني الغاز المشتركة10.
الخميرة في مهدها عاده من حجم بين 3 و 8 μm. نسبه الخلايا الموجودة في حاله النضج في وقت ما ، كما هو موضح مع المؤشر الناشئ (BI) ، توفر معلومات حول حيوية النمو11،12، وحتى علاقة مع إفراز البروتين المؤتلف قد ثبت13. مع مساعده من ISM ، في مهدها وغير الناشئة خلايا الخميرة (الخلايا مع وبدون برعم) وتميزت14. ظروف الإجهاد يمكن ان يؤدي أيضا إلى تباين أوسع من حجم الخلية داخل السكان الخميرة, كما هو مبين مؤخرا في زراعات النطاق الأسفل, التي كانت الظروف الواسعة النطاق المغذيات المحدودة التغذية-زراعات دفعه محاكاة3.
ولذلك ، فان ISM لديه القدرة علي رصد حيوية النمو وتكوين المنتجات علي مستوي خليه واحده خلال جميع مراحل العملية الحيوية لتحديد ظروف الزراعة المثلي ، أو لغرض التحكم في العملية. الطرق الموصوفة هنا تتركز علي التطبيقات الميكروبية مع خلايا واحده ، ولكنها تنطبق أيضا علي جزيئات أكبر مثل الخلايا البشرية والحيوانية ، اجلمرتر الخلايا والكريات من الكائنات الحية الخيطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: الخطوات التالية ضرورية لتكييف المعلمات إلى الكائنات المجهرية والظروف الثقافية الخاصة. تعديل إعدادات المسبار يستمر حوالي 20 دقيقه لمستخدم من ذوي الخبرة. ويرد وصف مفصل للأدوات والخطوات في دليل التحقيق المقابل من SOPAT GmbH. بشكل عام ، هناك حاجه إلى الاداات التي يتم تقديمها في البروتوكول التالي: ' 1 ' المسبار المراقب لاجراء التعديلات والحصول علي الصور ؛ ' 2 ' فيجي (ImageJ) للاطلاع علي الشروح المتعلقة بالصور المكتسبة ؛ ' 3 ' دعم سوات للتدريب علي الشبكة العصبية الاصطناعية وإنشاء تدفق العمل ؛ ' 4 ' Batcher لمعالجه مجموعه البيانات باستخدام الصور المكتسبة بالفعل مع سير العمل ؛ ' 5 ' محلل النتائج لتصور النتائج وتقييمها علي الصور المعالجة الدفعي ؛ و (6) رصد للقياس الألى في الوقت الحقيقي والتصور نتيجة.
1. تعيين معلمات الاجهزه
- اعداد ثقافة مع اعلي تركيز الخلية التي يمكن ان تتحقق اثناء التجربة أو الطرد المركزي وأعاده تعليق بيليه من أجل تحقيق هذا التركيز. في هذه الحالة ، تم اختيار 65 g L-1 من تركيز الكتلة الحيوية الجافة ل s. سيريفيسياي زراعات.
- اعداد المخففات المختلفة ، والتي تتراوح من اعلي إلى ادني تركيز بحيث يتم تغطيه النطاق المتوقع بالبالكامل. يوصي بما لا يقل عن 4 تركيزات مختلفه.
- تحديد نطاق حجم الخلية من الكائنات المجهرية مع المجهر التقليدي. تحديد القطر الأقصى المتوقع (دالحد الأقصى) من الخلايا المعنية. يتم تعيين هذه القيمة إلى 8 μm في حاله s. سيريفيسياي.
- اختيار اثنين من الفجوات القياس من 5x و 10x من المتوقع دماكس من الخلايا.
- اختر الحد الأقصى لشده القوه. اختيار شده القوه لكلا الفجوات مع اعلي تركيز الخلية بحيث تكون الخلايا لا تزال مرئية علي الصور مع كثافة الضوء ادني (أحلك الصور).
- اختيار كثافة الحد الأدنى ومصطربه تعامل ، ومن ثم اختيار شده القوه لكلا الفجوات بحيث الخلايا لا تزال مرئية علي الصور مع كثافة الضوء اعلي (ألمع الصور). استخدم اقل تركيز للخلايا ، والذي يظهر علي الأرجح اثناء فتره القياس.
- اختر موضع تركيز واحد ، والذي يعطي الصور الأكثر حده لكل فجوه قياس ، لكل من شده الشدة ولنطاق التركيز الذي يحتاج إلى اختبار (راجع الخطوة 2 للحصول علي تفاصيل حول التركيز). تركيز الخلايا بشكل مناسب بحيث يمكن ان تكون بيانات الصورة المشروحة بعد ذلك (انظر الخطوة 4).
- قياس سلسله التخفيف المعدة مسبقا من تركيز الخلية (انظر الخطوة 2) مع كل من عرض الفجوة وكثافة التعامل معها.
الشكل 1: أداه معايره التركيز. واجهه المستخدم الرسوميه اليسرى: تعيين الدلائل الصورة (الحد الأدنى من 3) مع تركيزات المعروفة ؛ واجهه المستخدم الرسوميه المركزية: اختر الميزات التي سيتم حسابها علي دليل الصور. واجهه المستخدم الرسوميه اليمني: اختر الجذر المرجح خطا مربع (WRMSE) لتحديد الحد الأدنى. WRMSE وأفضل علاقة بين اي ميزه صوره وتركيز الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
- تقييم تجربه سلسله التخفيف.
- استخدم أداه معايره التركيز (كوكا) (انظر الشكل 1) لتحديد الارتباط الأمثل بين ميزات الصورة المستخرجة (السطوع أو الحده) والتركيزات المقاسه سابقا التي يقدمها المستخدم ، مثلالكتلة الحيوية الجافة أو تعداد الخلايا. اتبع الإرشادات الواردة في دليل البرامج لمزيد من التفاصيل.
- تحديد الارتباط الأمثل بين المعلومات المستخرجة من ميزات الصورة بتركيزات مختلفه مقارنه بأي قياسات خارج الخط . انظر اسطوره الشكل 1.
- اختيار الفجوة القياس الأكثر معقولية وشده الكثافة تحت النظر في منحني ارتباط التركيز مع الميزات التي تؤدي إلى أصغر الجذر الموزون متوسط الخطا مربع (WRMSE).
ملاحظه: يتم إصلاح الفجوة القياس اثناء التجربة ، في حين ان كثافة ومصطربه يمكن تكييفها وفقا لتركيز الخلية.
2.off خط القياس
- ضبط الفجوة القياس المطلوب وفقا للخطوة 1 مع مساعده من قياس سمك.
- فتح واجهه المستخدم الرسوميه التحكم التحقيق في لوحه القيادة sopat.
- قم بتوصيل المسبار المطلوب لمضخم الصوت في إجراءات القسم الفرعي للبرنامج واضغط علي connect.
- اضغط علي زر التشغيل لبدء الدفق (عرض مباشر).
- تنظيف الفجوة القياس عن طريق رش الايثانول في الفجوة ومسح بعناية اي غبار أو الأوساخ مع ورقه البصرية. تحقق من ان زجاج جهاز الاستشعار خاليه من الجزيئات مع عرض لايف في camcontrol.
ملاحظه: الجسيمات والغبار القياسات تخل وتحديد الخلية التلقائي. - ضع ورقه بصريه جافه في فجوه القياس. فتح التحكم المسبار التبويب وضبط كثافة ستروبوساتارد من أجل تصور الورقة. تحويل المسمار ربط حتى يتم النظر بوضوح ألياف واحده من الورق.
- ملء أنبوب مع مرق الثقافة. تراجع المجهر في مرق الثقافة بحيث يتم تغطيه الفجوة بشكل كامل مع تعليق الخلية. فتح التحكم المسبار التبويب وضبط كثافة المطلوب القوه وفقا للقسم 1. التركيز علي الخلايا عن طريق صقل المسمار ربط التركيز. يجب عدم تغيير التركيز بعد الآن اثناء التجربة
ملاحظه: يتم أضافه 5-6 mL من مرق الثقافة إلى 50 mL أنبوب الطرد المركزي المخروطية لتعويم الفجوة قياس بما فيه الكفاية. - تحديد عدد الإطارات لكل نقطه زمنيه [-] في واجهه المستخدم في القائمة التي تسبب في إطارات GUI لكل مشغل. تعيين عدد الإطارات إلى 200 إطارات لكل مشغل.
ملاحظه: يمكن تقليل عدد الإطارات إلى ادني قيمه ، وهو أمر ضروري للحصول علي نتيجة موثوقه احصائيه. ويعتمد ذلك علي حجم العينة المطلوب للحصول علي توزيع تمثيلي لحجم الخلية المورفولوجية (انظر أيضا الخطوة 5). - تحديد معدل الإطار [Hz] في القائمة التي تسبب في معدل اطارواجهه المستخدم الرسوميه. اختر معدل اطار يضمن عدم ظهور الجزيئات المتحركة من اطار سابق في الإطار التالي.
ملاحظه: يمكن ان يثبت هذا مع مشغل اختبار مع إطارات 200. فحص الصور للجسيمات ، والتي يتم التقاطها بشكل متكرر. إذا كانت هذه هي الحالة ، إنقاص معدل الإطار. بالنسبة للقياسات خارج الخط ، يوصي باستخدام هرتز واحد. - تعيين الدليل ، الذي سيتم حفظ الصور المكتسبة ، في القائمة العامة.
- قم باجراء اكتساب صوره عن طريق تنشيط زر الاستحواذ علي مشغل الصورة Start . نقل الأنبوب مع تعليق الثقافة بلطف صعودا وهبوطا للحث علي تدفق من خلال فجوه القياس.
- كرر الخطوة 2.5 بعد كل قياس.
- تحقق من الصور المكتسبة. يجب ان تكون الخلايا حاده بما يكفي للحصول علي تعليق توضيحي. فحص الصور للجسيمات ، والتي يتم التقاطها بشكل متكرر. إذا كانت هذه هي الحالة ، إنقاص معدل الإطار.
- حفظ الإعدادات عن طريق تحديد المسار التالي: C:\progres\sbat Gmbh\morontetonprocers\socicontrol ، واضغط علي حفظ.
3. تحديد الجسيمات
- الحواشي الجسيمات لتدريب الشبكة العصبية الاصطناعية (ANN) (مجموعه التدريب).
- تحميل الصور المكتسبة في أداه التعليق التوضيحي "فيجي, ImageJ" عن طريق سحب وإسقاط الملف في الرئيسية "imagej" نافذه (انظر GUI "فيجي" أداه في الشكل 2)
- افتح أداره عائد الاستثمار عن طريق تحديد: تحليل | الاداات | مدير الاستثمار.
- اختر أداه تحديد. ويوصي العصا (تتبع) أداه ، اليدوية ، البيضاوي ، أو بيضاوية التحديدات .
- رسم دائره حول الجسيمات التي يجب ان تكون مشروحه مع أدوات التحديد المذكورة قبل ومن ثم صقله مع أداه فرشاه.
- أضافه التعليق التوضيحي إلى أداره عائد الاستثمار عن طريق الضغط علي أضافه [t].
- وضع علامة علي جميع الكائنات ذات الاهميه (الخلايا التي سيتم تحديدها) علي حوالي 15 صوره.
ملاحظه: من أجل تغطيه جميع المعلومات اللازمة ، اي الاشكال المختلفة ، والاحجام ، وتركيز الخلايا ، والسطوع ، وما إلى ذلك، استخدم خمس صور من البداية ، وخمس صور من بينها ، وخمس صور من نهاية التجربة. - قرر ، إذا كانت الخلايا تحتاج إلى ان تصنف في فئات فرعيه مختلفه بسبب شكلها (عليسبيل المثال، مراحل مختلفه من دوره الخلية) ، أو إذا كانت جميع الخلايا من نفس الفئة.
- تغيير اسم كل الجزيئات المحددة وفقا لذلك. تعيين اسم واحد أو اختصار لكل فئة وعداد لكل الجسيمات من الفئة (عليسبيل المثال، cell_1 ، cell_2 ، الخ). التعليق علي الأقل 50 جزيئات لكل فئة.
- لا الحواشي الكائنات ، والتي لا ينبغي الكشف عنها ، لأنها ليست ذات الصلة للعملية ، مثل فقاعات الغاز أو غيرها من الجزيئات مثل مكونات الوسائط غير الذائبة.
ملاحظه: لن يتم تضمين هذه الاحداث في اجراء التدريب لل ANN وتعتبر خلفيه. - لا الحواشي الخلايا التي هي خارج التركيز.
- أضافه تعليق توضيحي للصور بشكل متناسق قدر الإمكان. إذا كان هناك شكوك ، يمكن تطبيق التسمية تجاهل . فمن المستحسن جدا عدم أساءه استخدامه ، لان ANN سوف تعترف فقط الهياكل التي تسمي.
الشكل 2: واجهه مستخدم أداه فيجي. يتم إنشاء مجموعه التدريب مع الصور المشروحة. يتم تصوير تعليق توضيحي يدوي يتكون من فئتين ، وتظهر قائمه الجزيئات المشروحة في مدير العائد علي الاستثمار. يمكن تعيين أسماء وألوان مختلفه لفئات مختلفه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
- حفظ الكائنات المشروحة والصورة إلى تنسيق ZIP وإرسال الملف إلى شبكه التدريب ، اما عن طريق تحميل إلى النظام الأساسي أو عن طريق إرسال ملف ZIP عبر البريد الكتروني.
ملاحظه: عاده ما يستغرق الأمر عددا من جولات التدريب التكرارية للتعرف علي التنبؤات الكافية للكائنات المصنفة علي الصور. تؤدي كل جولة تدريب إلى سير عمل يتم إرجاعه بواسطة البرنامج. - استخدم سير العمل (* .wf) مع خوارزميه التعرف علي الكائنات المدربة لتحليل صور الاختبار باستخدام مجموعه البيانات التي تتقدم ببرنامج Batcher الذي يمكن بدء تشغيله في لوحه المعلومات.
- تحقق من اكتشاف الكائن علي صور الاختبار من خلال التحديد الكمي للاحداث الايجابيه والسلبية الزائفة.
- قياس الكشف عن الاحداث الايجابيه الزائفة: الجسيمات التي تم اكتشافها خطا كخلايا ، والخلايا غير المصنفة بشكل صحيح ، والخلايا التي لم يتم تحديد الكفاف فيها بشكل جيد.
- قياس الاحداث السلبية الزائفة (الخلايا التي لم يتم التعرف عليها بهذه الصفة).
- تصور النتائج في محلل نتيجة الاداه عن طريق بدء تشغيل البرنامج في لوحه التحكم.
- استيراد ملفات النتائج المطلوبة مع الملف | استيراد ملف أو ملف | استيراد المجلدات.
- تصور النتائج حسب الرسم البياني | إنشاء مخطط علي واجهه المستخدم الرسوميه للمخططات.
- حدد أحد الخيارات التالية: مخطط التوزيع ، مؤامرة الحساسية ، مميزه مع مرور الوقت ، مميزه علي نقاط المسح ، وميزه مقابل الميزة.
ملاحظه: دليل بشان استخدام محلل النتيجة ياتي مع النظام وهو متاح أيضا من الدعم. - إذا كانت النتائج مقبوله ، قم بتشغيل سير العمل في Batcher علي جميع الصور المكتسبة من التجربة. في نفس الوقت ثم يمكن إنشاء برنامج الرصد عن طريق الجمع بين الإعدادات المحفوظة من وحده تحكم المسبار (* .pfg) مع سير العمل (* .wf) ، راجع أيضا الدليل.
ملاحظه: يمكن أيضا استخدام سير العمل لمراقبه التجارب المستقبلية لهذه الوسائط الثقافية. - إذا كانت النتائج غير مقبوله ، تحقق من التعليق التوضيحي علي مجموعه التدريب و/أو المتابعة مع دوره تدريبيه تكراريه أخرى (انظر الخطوة 4.2).
4. حجم العينة الكمية
- تعيين الانحراف المعياري (σ) ، وهو مقبول بين الجزيئات المكتشفة.
ملاحظه: يتغير الانحراف المعياري بالتوازي مع تجانس حجم الخلية. يشير الانحراف المعياري الأقصى إلى العينة باعلي درجه من تغاير الحجم. - تعيين سعة فاصل الثقة أو الدقة المطلوبة فيما يتعلق بالتباين المتوقع في القياسات (ه).
- تعيين خطا اعترف (α) بين 5% (z1-α/2 = 1.96) و 10% (z1-α/2 = 1.64).
- حساب عدد الخلايا التي يتم تعريفها من كل فئة من المعادلة 1.
[المعادلة 1]
ملاحظه: استنادا إلى عدد الخلايا ، يمكن تعريف عدد الصور التي يجب الحصول عليها لكل نقطه بيانات. - اجراء تحليل حساسية علي نقاط زمنيه عشوائية من التجربة للتحقق من ان تحليل جزيئات ن يؤدي إلى تغير في متوسط قطر Feret و Dv90 اقل من 5 ٪. يمكن حسابه تلقائيا في محلل النتائج.
[المعادلة 1]5.on الخط (بواسطة تمريره) أو في خط القياس
- قم باجراء قياس الخط المعطل أولا (راجع الخطوة 2) من أجل تعيين إعدادات الاجهزه والبرامج كداله للكائن الحي والعملية (التركيز أو الوسائط).
- قم بتحميل الإعدادات المحفوظة من القسم السابق عن طريق تحديد تحميل الزر وحدد المسار التالي: C:\progres\sbat Gmbh\onmortingers\sonmes.
- قم بتوصيل المسبار بالخلية الانسيابية أو بالمفاعل الحيوي.
ملاحظه: يمكن اجراء القياسات في الموقع مع شفه قرصه. - اجراء التعقيم.
ملاحظه: يتم تعقيم المادة المسبار المبللة فقط من الصك من خلال التعقيم بالبخار. يمكن ان المسبار طول مبلله تذهب من 6 إلى 222 ملم (الشكل 3).
الشكل 3: رسم تخطيطي لأجهزه ISM. المسبار [م-هو] ([ا]) قابل للتثبيت مباشره في المفاعل حيوي, حيث ان التحقيق [م] 2.1 ([ب]) يستطيع كنت استعملت ك [ب-مرر]. يتم وضع علامة علي الدورة الدموية مرق الثقافة مع السهام في كل صوره. عوامل التحويل هي 0.166 μm pix-1 ل Mm-هو و 0.087 μm pix-1 ل mm 2.1. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
- تحديد معدل الحصول علي الصورة في واجهه المستخدم الرسوميه التي تسبب في الفاصل الزمني لمشغل الحقل [s].
ملاحظه: اعتمادا علي ديناميات العملية ، يمكن تكييف معدل اكتساب الصورة. علي سبيل المثال ، إذا كان من المتوقع ان تكون المرحلة المتاخره من 3 ساعات ، فان معدل الاكتساب يمكن ان يكون اقل ، مما لو كانت عمليه التحويل الأيضي أو تراكم المنتج يجب مراقبتها. عاده ، وهذا يتطلب وقت الاستحواذ أقصر بكثير في المدى دقيقه. علي سبيل المثال ، تسلسل اكتساب صوره بين 5 و 10 دقيقه خلال زراعه الخميرة دفعه يوفر معلومات كافيه للتقاط ديناميات العملية. - تحديد معدل الإطار كما هو موضح في الخطوة 2.10.
ملاحظه: في الخط والقياسات في خط ، يمكن زيادة معدل الإطار ، لان التحريك الميكانيكية يمكن ان تزيد من معدل التدفق من خلال الفجوة. - بدء الحصول علي الصورة عن طريق تفعيل زر بدء تدفق المسبار المحدد.
- إيقاف الاستحواذ عند انتهاء التجربة باستخدام الزر إيقاف دفق المسبار المحدد.
ملاحظه: بالنسبة لتشغيل 1st ، بدء الاستحواذ قبل التلقيح من الثقافة والمضي قدما إلى الخطوة 4. بالنسبة لعمليات التشغيل التالية ، افتح مراقبه البرنامج في لوحه التحكم وحدد سير العمل الذي تم إنشاؤه (راجع الخطوة 4). بدء الرصد فقط قبل التلقيح من الثقافة عن طريق الضغط علي زر التشغيل .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم بنجاح الكشف عن حجم الخلية في ثقافات الخميرة مع ISM والكشف الألى للصور للتمييز بين الخلايا الناشئة وغير الناشئة. كل من كثافة القوه الضاربة واختيار فجوه القياس لديها مجموعه من التسامح ، والتي لا يتاثر تعريف الجسيمات. علي سبيل المثال ، تم قياس الخلايا s. سيريفيسياي مع كثافة القوي المختلفة داخل نطاق التباين من 11 ٪ في تركيز الكتلة الحيوية الجافة من 4 ز L-1. وقد وفرت الصور المناظرة حدودا حاده للخلايا ، ولذلك كان تحديد الجسيمات ممكنا مع وجود اختلاف مقبول في حجم الخلية (1 في المائة) بغض المهم عن شده القوه الضاربة. وفي حاله عدم تعديل كثافة القوه الضاربة بشكل صحيح ، فان الصور تعاني من الإفراط في الاضاءه ولن يكون من الممكن تحديد هويه الخلية المناسبة (الشكل 4).
الشكل 4: ميزات الحصول علي الصور. أمثله علي شده الكثافة المختلفة (SI-٪) والفجوات القياس (مغ-μm) للتقاط الخلايا s. سيريفيسياي (القيم الحالية من SI و mg ويشار بين قوسين): A (25 ، 50) ؛ B (50 ، 50) ؛ C (25 ، 80) ؛ و D (50 ، 80). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
وحتى الآن ، لا يمكن أعاده تعديل فجوه القياس اثناء القياس في الموقع . ولذلك ، فان تجربه سلسله التخفيف حاسمه من أجل ضمان البيانات الموثوقه في جميع انحاء الزراعة. والشاغل الرئيسي هو حدوث الاحداث المتداخلة غير القابلة للتحديد بسبب الزيادة في تركيز الخلايا.
ويمكن تصور مؤامرة الحساسية (تحليل حساسية القيم المميزة ، علي سبيل المثال، متوسط قطر الخلية فيما يتعلق بعدد الجسيمات ن) من جميع الخلايا المكتشفة من ملف البيانات المحملة (الشكل 5). يجب ان يقرر المستخدم اي استقرار لمعلمه عمليه معينه مطلوبه. في هذه الحالة الحد الأدنى لعدد الخلايا المطلوبة لنقطه بيانات واحده صالحه. ونتيجة لذلك ، يمكن تحليل صور أكثر أو اقل لنقطه بيانات واحده.
الشكل 5: متوسط الخلية حساسية قطر المؤامرة. تباين متوسط قطر الخلية في الاعتماد علي عدد الجزيئات المكتشفة. يتم تحقيق قيمه ثابته لقطر الخلية المتوسطة مع حوالي 1,000 خلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشرح هو النقطة الرئيسية من أجل تحقيق الدقة المطلوبة لتحديد الجسيمات. ويبين الشكل 6 مثالا علي "تعليق المستخدم" (a) ، الذي يستخدم كمجموعه تدريبيه للشبكة العصبية ، فضلا عن تحديد الجسيمات علي صوره مجموعه الاختبار (بيانات غير معروفه للشبكة العصبية) ، والتي تستخدم لتقييمها (باء). وينبغي ان يكون لكلا الصورتين معدل مماثل من الاحداث المحددة.
الشكل 6: مقارنه التعليق التوضيحي للمستخدم (مجموعه التدريب) والكشف التلقائي (مجموعه الاختبار). مجموعه التدريب: يتم تصوير الصور المشروحة والاصليه في aو a 'علي التوالي. يتم استخدام المعلومات من هذه الصورة لتدريب ANN. مجموعه الاختبار: يتم تطبيق سير العمل الذي تم إنشاؤه بعد التدريب علي اللقطات ، والتي لم يتم استخدامها للتدريب: الخلايا المحددة تلقائيا (المعروضة في b) من التقاط الأصلي ب '. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
كمثال علي تاثير تراكم المنتج داخل الخلايا علي توزيع حجم الخلية ، تم التحقيق في تراكم حمض docosahexاينويك الأحماض الدهنية غير المشبعة (DHA) عن طريق الحد من النيتروجين في الطحالب المجهرية غير المتجانسة c. cohnii. وقد تبين ان تراكم المنتج يمكن الكشف عنه كميا عن طريق ISM10. وتستخدم هذه الطريقة حاليا للتحقيق في تاثير قوي القص في المفاعلات الحيوية التي يحركها علي التغاير المورفولوجية للخلايا.
تم قياس حاله نضوج الخميرة الناشئة s. سيريفيسياي . في حاله المهد ، ونسبه الخلايا التي هي في حاله النضج في وقت (الموصوفة مع BI) ، ويوفر معلومات عن نشاط النمو والتنوع السكاني. وكان التعرف التلقائي علي الخلايا قادرا علي تحديد وتمييز الخلايا الناشئة وغير الناشئة (أو الابنة) بنجاح في تعليق الخلية15. ويرد توزيع حجم الخلية لثلاث عينات في الشكل 7. يشير التحول إلى الخلايا الأصغر إلى الجزء السفلي من الخلايا الناشئة داخل السكان.
الشكل 7: التوزيع التراكمي لحجم الخلية الواحدة. يتم قياس توزيعات حجم الخلية اثناء الدورة الزمنيه للزراعة عند 3 ساعات (خط مستقيم) و 7 ساعات (خط منقط) و 13 ساعة (خط متقطع). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت ISM كما قدمت هنا مع نفس أو أجهزه مشابهه جدا لقياس ديناميات مورفولوجيك من الفطريات والطحالب المجهرية ، وخلايا الخميرة ، والتي مكنت تحديد نشاط النمو ، وفي حاله الطحالب ، تراكم المنتج داخل الخلايا. جهاز الاستشعار ليس لديه أجزاء المنقولة وقابله للتطبيق مباشره في اي معيار دبابة يحركها المفاعل الحيوي ، اما من خلال منفذ القياسية أو في التعقيم عن طريق تمرير. منذ الخميرة هو أصغر بكثير من الطحالب ، والحد من حجم الخلية المطلوبة بعض التكيفات الاجهزه الاخيره مثل دقه الكاميرا اعلي والاضاءه عن طريق الإرسال من أجل الحصول علي دقه بكسل كافيه من الخميرة (للحصول علي التفاصيل الفنية ، انظر15). ومع ذلك ، لا يزال هناك قيد لقياس الخلايا الصغيرة حتى مثل البكتيريا. وتشير الاجهزه البصرية الحالية الموجودة في الموقع إلى القيود المتعلقة بتداخل معلومات الجسيمات في التركيز العالي وتاثيرات التداخل مع الهياكل الموجودة تحت طيف الاشعه فوق البنفسجية/VIS. حتى الآن ، لم يتم تطبيق خوارزميات تحليل الصور للتعليقات البكتيرية ، باستثناء الارتباطات السطوع16.
واستخدمت أدوات ISM الأخرى المطبقة سابقا لتحديد تركيز الخلية من أجل إظهار موثوقيتها. ومع ذلك ، أصبح هذا الأمر حاسما إذا تداخلت الخلايا مع بعضها البعض بتركيزات مرتفعه. ولذلك ، فان تركيز هذه الدراسة لم يكن الكمية الخلية ، ولكن الكشف عن ميزه المورفولوجية ، في حين ملامح الصورة مثل كثافة السطوع يمكن ان تكون مرتبطة كثافة الخلية كما أجريت مع الاجهزه الأخرى ، أيضا17. والا ستقتصر جميع هذه الاجهزه علي تركيزات الخلايا المنخفضة ؛ تركيز اقصي من ca. 20 ز L-1 من خلايا الخميرة تم تقييمها عند استخدام نهج التعرف علي الخلايا مقابل 80 g l-1 عند استخدام خوارزميه حجم الكتلة.
من أجل تتبع الخصائص المورفولوجية للخلية ، يجب الكشف عن حوافها بدقه. في حاله الطحالب ، وهذا هو بسيط نوعا ما يتغير حجم ، ولكن الشكل لا يزال ثابتا خلال الانتقال من مراحل العملية. في المقابل ، توفر خلايا الخميرة تحديا أكبر بسبب شكلها ، والذي لا يمكن تقريبه إلى الكره أو القطع الناقص عندما تكون الخلايا في مهدها. ومع ذلك ، حتى الآن تم حساب حجم الخلية تحت افتراض ان خليه هي المجال المثالي في قياسات ISM18. وعلي الرغم من ان هذا التقريب قريب من الواقع في بعض الحالات ، الا انه لا يمكن تقييم الاشكال الأكثر تعقيدا مثل الخلايا الناشئة أو الخلايا التي تتشكل علي شكل قضيب بشكل صحيح. في هذه الدراسة ، ومع ذلك ، تم تحليل اشكال مختلفه بنجاح بسبب الكشف عن الحدود المرنة التي تم تمكينها من خلال خوارزميات التعلم الألى. وعلاوة علي ذلك ، لا تزال الاحداث المتداخلة قيد التحقيق19 لتحقيق مرحله تطوير أخرى.
حاليا ، فان معيار الذهب لتقييم الحيوية والقدرة علي البقاء هو العد مستعمره تشكيل وحدات أو وصمه عار عينه مع صبغ القدرة علي البقاء20، علي سبيل المثال، الميثيلين الأزرق أو الميثيلين البنفسج21؛ ومع ذلك ، يمكن ان يؤثر هذا الاجراء علي النتائج. وكلما كانت هذه السمات مرتبطة بشكل الخلية22، ينبغي استكشاف إمكانيات التقييم السريع لها من خلال الإمكانات المتزايدة لISM. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان تكون مرتبطة معلمات العملية الحرجة و/أو سمات الجودة23 للشكل ، وتشكيل التكتل وبيليه ، والتي يمكن رصدها جميعا من قبل ISM.
وتجري حاليا تحقيقات مع الكائنات المجهرية الرئيسية الأخرى التي يكثر استخدامها في العملية البيولوجية. يعتمد الوقت المناسب للتكيف مع خوارزميات التعرف علي الوجوه واستخراج الميزات لتحليل المعالم بشكل رئيسي علي تعقيد الصور والدقة المتوقعة للنتائج. وفي المستقبل ، سينظر في التقاط الصور الملونة من أجل زيادة توسيع نطاق المعلومات ، التي يمكن الحصول عليها علي مستوي خليه واحده ، علي سبيل المثال، إذا تراكمت الاصباغ أو في الكائنات المحورة وراثيا ، التي أدمجت فيها علامات ملونه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي أصحاب البلاغ ما يعلنونه.
Acknowledgments
المؤلفات شاكره للدعم من الوزارة المانيه فيديرالية علم اقتصاد وطاقة ضمن الإطار [زيم-كووب], مشروع "ذكية عمليه تفتيش", هبه لا. ZF 4184201CR5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor MM 2.1 - MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
References
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
