Summary
Un dispositif de microscopie in situ photo-optique a été développé pour surveiller la taille des cellules simples directement dans la suspension cellulaire. La mesure en temps réel est effectuée en couplant la sonde stérilisable photo-optique à une analyse automatisée de l'image. Des changements morphologiques apparaissent avec la dépendance à l'état de croissance et aux conditions de culture.
Abstract
La surveillance in situ des bioprocessus microbiens se limite principalement aux propriétés chimiques et physiques du milieu(p. ex.la valeur du pH et la concentration d'oxygène dissous). Néanmoins, la morphologie des cellules peut être un indicateur approprié pour des conditions optimales, car elle change avec la dépendance à l'état de croissance, l'accumulation de produit et le stress cellulaire. En outre, la distribution de la taille d'une seule cellule fournit non seulement des informations sur les conditions de culture, mais aussi sur l'hétérogénéité de la population. Pour obtenir de telles informations, un dispositif de microscopie in situ photo-optique1 a été développé pour permettre la surveillance de la distribution de taille d'une seule cellule directement dans la suspension cellulaire dans les bioréacteurs. Une analyse automatisée de l'image est couplée à la microscopie basée sur un modèle de réseau neuronal, qui est formé avec des images annotées par l'utilisateur. Plusieurs paramètres, qui sont tirés des captures du microscope, sont corrélés au processus des caractéristiques pertinentes des cellules, comme leur activité métabolique. Jusqu'à présent, la série de sondes de microscopie in situ présentée s'appliquait pour mesurer la taille des granulés dans les suspensions de champignons filamenteuses. Il a été utilisé pour distinguer la taille d'une cellule unique dans la culture des microalgues et de le relier à l'accumulation de lipides. La forme des particules cellulaires était liée au bourgeonnement dans les cultures de levure. L'analyse de la microscopie peut généralement être divisée en trois étapes : (i) l'acquisition d'images, (ii) l'identification des particules et (iii) l'analyse des données, respectivement. Toutes les étapes doivent être adaptées à l'organisme, et donc des informations annotées spécifiques sont nécessaires afin d'obtenir des résultats fiables. La capacité de surveiller les changements dans la morphologie cellulaire directement en ligne ou en ligne (dans un contournement) permet des valeurs en temps réel pour la surveillance et le contrôle, dans le développement des processus ainsi que dans l'échelle de production. Si les données hors ligne sont en corrélation avec les données en temps réel, les mesures hors ligne fastidieuses actuelles avec des influences inconnues sur la taille de la cellule deviennent inutiles.
Introduction
Les caractéristiques morphologiques des cellules sont souvent liées à l'état physiologique, un lien entre la forme et la fonction existe pour de nombreuses applications. La morphologie d'une seule cellule est influencée par l'état de croissance, l'âge de la cellule, les contraintes osmotiques et autres contraintes cellulaires potentielles ou l'accumulation de produits. Les changements morphologiques des cellules sont souvent une mesure de la vitalité de croissance d'une culture. La synthèse intracellulaire des produits, l'accumulation de lipides dans les algues et la formation du corps d'inclusion dans les bactéries, entre autres, sont également liées à la taille des cellules. L'agglomération cellulaire peut être un autre facteur qui vaut la peine d'être étudié tel que résumé récemment2.
Les hétérogénéités de population peuvent être quantifiées en fonction des caractéristiques morphologiques des cellules individuelles. Des études ont montré que l'hétérogénéité au sein d'une culture pouvait être significative, par exemple,dans des conditions de production à grande échelle3 le rendement global pourrait être affecté par une faible performance des sous-populations4.
Habituellement, l'évaluation des caractéristiques morphologiques des cellules est effectuée par échantillonnage manuel ou avec une chambre de contournement couplée à un dispositif photo-optique. Cela conduit à plusieurs restrictions : la quantité limitée de données acquises peut difficilement fournir des mesures statistiquement fiables ; le délai entre l'échantillonnage et l'accessibilité des résultats peut être trop long par rapport à la dynamique du processus; et le plus important, la procédure d'échantillonnage (emplacement du port d'échantillonnage, prétraitement de l'échantillon avant la mesure, conditions défavorables dans le tube d'échantillonnage ou de dérivation) peut déclencher une erreur biaisée car la procédure de l'échantillon elle-même peut déjà affecter les cellules Morphologie. Enfin, il existe toujours un risque élevé de contamination lors de l'échantillonnage ou dans les solutions de contournement, si elles ne sont pas stérilisables en place.
L'application de la microscopie in situ (ISM) peut contourner plusieurs de ces problèmes. Si les cellules sont détectées automatiquement, une identification correcte de leurs caractéristiques morphologiques peut être étudiée5. Jusqu'à présent, les principales limites de cette méthode étaient (i) le temps d'évaluation des images, qui était trop long pour les applications in situ, et (ii) la mauvaise résolution des images, en particulier à des densités cellulaires élevées. Bien que les premières solutions de l'ISM inclus l'échantillonnage mécanique, la dilution de la sonde, ou ont été limités à un système de contournement6,7, d'autres approches permettent la capture de la suspension cellulaire directement8.
Les progrès récents de l'ISM permettent la surveillance en ligne ou en ligne des cellules sur une base unicellulaire, ce qui permet la distribution de paramètres morphologiques en temps réel directement dans les suspensions cellulaires à des concentrations cellulaires considérablement élevées. Grâce à des analyses hors ligne des paramètres clés des cellules, des corrélations avec les informations fournies par la détection cellulaire automatisée couplée et l'ISM peuvent être identifiées. Ensuite, de nouvelles conceptions de capteurs souples sont réalisées, dans lesquelles un paramètre incommensurable est estimé avec la morphologie unicellulaire.
Dans ce rapport, l'ISM est réalisé en couplant une sonde photo-optique à une analyse d'image automatisée. L'ISM se compose d'une sonde de capteur à une tige qui permet la capture d'images dans une plage de mise au point connue dans un espace de mesure réglable avec une caméra CCD haute résolution [MM-Ho - CCD GT2750 (2750x2200) et MM 2.1 - CMOS G507c (2464x2056)]. L'éclairage de la lumière du flash est effectué par transmission. Par conséquent, la lumière provient du côté opposé de la caméra9 et son intensité peut être ajustée. Les cellules passent continuellement à travers cette lacune avec le flux liquide. Par conséquent, un échantillon représentatif de population est obtenu. La sonde peut être montée directement sur le bioréacteur de sorte qu'elle atteint dans la suspension cellulaire, ou il peut être utilisé dans un by-pass stérilisable. La coque du capteur est connectée au système avant la stérilisation, les pièces optiques sont ensuite montées dans la coquille.
Jusqu'à présent, les micro-organismes industriels pertinents, par exemple,les champignons filamenteux (diamètre de plus de 200 m), les microalgues hétérotrophes Crypthecodinium cohnii (diamètre cellulaire moyen de 20 m), et la levure Saccharomyces cerevisiae (diamètre cellulaire moyen de 5 m), ont été étudiés avec ce dispositif ou similaire, qui est peu décrit.
Les champignons filamenteux ont tendance à former des granulés dans certaines conditions de culture. Celles-ci sont d'une taille allant jusqu'à plusieurs centaines de m. Les hyphes des cellules fongiques développent différentes longueurs dans la dépendance au stress hydrodynamique dans la phase fluide. Cela a une influence sur l'activité métabolique et de croissance, l'apport de substrat et la libération du produit. L'ISM a été appliqué pour identifier la répartition de la taille des granulés et la largeur des zones de faible densité de biomasse aux bords des granulés (données inédites).
La taille de C. cohnii change entre 15 et 26 m lorsque les cellules accumulent l'acide docosahexaénoïque polyinsaturé (DHA) sous limitation d'azote. Ce processus de production biotechnologique de DHA se compose de deux parties, la phase de croissance, dans laquelle les cellules se divisent et deviennent plus petites, et la phase de production, dans laquelle les cellules accumulent le produit et deviennent ainsi plus grandes. Par conséquent, la taille de la cellule a été utilisée pour déterminer l'état du processus, dans lequel la croissance ou la production de DHA était favorable. Enfin, une corrélation entre la taille de la cellule et le contenu DHA a été trouvée. Dans ce cas, ISM permet de surveiller l'accumulation intracellulaire de DHA en temps réel sans l'exigence de l'échantillonnage, la perturbation cellulaire, et l'analyse commune de chromatographie de gaz10.
La levure en herbe est généralement d'une taille comprise entre 3 et 8 m. La proportion de cellules qui sont dans l'état de maturation à la fois, comme décrit avec l'indice en herbe (BI), fournit des informations sur la vitalité de la croissance11,12, et même une relation avec la sécrétion de protéines recombinantes a étéprouvé13. Avec l'aide de l'ISM, les cellules de levure en herbe et non-budding (cellules avec et sans bourgeon) ont été distingués14. Les conditions de stress peuvent également conduire à une plus grande variation de la taille des cellules au sein d'une population de levures, comme l'ont montré récemment les cultures à l'échelle, dans lesquelles les conditions de grandes cultures à teneur en eau à teneur limitée en nutriments ont été imitées3.
Par conséquent, l'ISM a le potentiel de surveiller la vitalité de la croissance et la formation de produits au niveau d'une seule cellule à toutes les étapes d'un bioprocessus pour l'identification de conditions de culture optimales, ou aux fins de contrôle des processus. Les méthodes décrites ici sont axées sur les applications microbiennes avec des cellules individuelles, mais sont également applicables aux particules plus grosses comme les cellules humaines et animales, les agglomérats cellulaires et les granulés d'organismes filamenteux.
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Protocol
REMARQUE : Les étapes suivantes sont nécessaires pour adapter les paramètres aux microorganismes et aux conditions de culture respectifs. L'ajustement des paramètres de la sonde dure environ 20 min pour un utilisateur expérimenté. Une description détaillée des outils et des étapes est donnée dans le manuel de sonde correspondant de SOPAT GmbH. En général, les outils qui sont présentés dans le protocole suivant sont nécessaires : (i) Contrôleur de sonde pour les ajustements de sonde et l'acquisition d'images; (ii) Fidji (ImageJ) pour les annotations sur les images acquises; (iii) SoPAT support for artificial neural network (ANN) training and workflow creation; (iv) Batcher pour le traitement des lots de données à l'aide d'images déjà acquises avec un flux de travail; (v) Analyseur de résultats pour la visualisation et l'évaluation des résultats sur les images traitées par lots; et (vi) Moniteur pour la mesure automatisée en temps réel et la visualisation des résultats.
1. Réglage des paramètres matériels
- Préparer une culture avec la plus forte concentration cellulaire qui pourrait être atteint au cours de l'expérience ou centrifugeuse et resuspendre la pastille afin d'atteindre cette concentration. Dans ce cas, 65 g L-1 de concentration de biomasse sèche ont été choisis pour les cultures de S. cerevisiae.
- Préparer différentes dilutions, qui vont de la concentration la plus élevée à la plus faible de sorte que la plage prévue est entièrement couverte. Un minimum de 4 concentrations différentes sont recommandés.
- Identifier la gamme de taille cellulaire du micro-organisme avec la microscopie conventionnelle. Définir le diamètre maximum prévu (dmax) des cellules respectives. Cette valeur est fixée à 8 m en cas de S. cerevisiae.
- Choisissez deux lacunes de mesure de 5x et 10x dumax prévu des cellules.
- Choisissez l'intensité maximale du stroboscope. Choisissez des intensités stroboscope pour les deux lacunes avec la plus forte concentration cellulaire de sorte que les cellules sont encore visibles sur les images avec la plus faible intensité de lumière (images les plus sombres).
- Choisissez l'intensité minimale du stroboscope, puis choisissez des intensités stroboscope pour les deux lacunes afin que les cellules soient encore visibles sur les images avec la plus forte intensité lumineuse (images les plus brillantes). Utilisez la plus faible concentration cellulaire, qui apparaît probablement au cours de la période de mesure.
- Choisissez une position de mise au point, qui donne les images les plus nettes pour chaque écart de mesure, pour les intensités stroboscope s'ils sont à la fois et pour la plage de concentration qui doit être testée (voir l'étape 2 pour plus de détails sur la mise au point). Les cellules de focalisation de manière appropriée afin que les données d'image puissent être annotées par la suite (voir l'étape 4).
- Mesurez la série de dilution précédemment préparée de la concentration cellulaire (voir l'étape 2) avec des largeurs d'écart et des intensités stroboscope.
Figure 1 : Outil d'étalonnage de la concentration. Gui gauche : définir des répertoires d'images (minimum de 3) avec des concentrations connues ; gui d'interface centrale : choisissez les fonctionnalités à calculer sur le répertoire d'images ; bonne interface graphique : choisissez l'erreur carrée de moyenne de racine pondérée (WRMSE) pour identifier le minimum. WRMSE et la meilleure corrélation entre n'importe quelle caractéristique d'image et la concentration cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Évaluer l'expérience de la série de dilution.
- Utilisez l'outil de calibrage de concentration (CoCa) (voir figure 1) pour identifier la corrélation optimale entre les caractéristiques d'image extraites (brillance ou netteté) et les concentrations précédemment mesurées fournies par l'utilisateur, par exemple,la biomasse sèche ou le nombre de cellules. Suivez les instructions dans le manuel du logiciel pour plus de détails.
- Identifiez la corrélation optimale entre les informations extraites des caractéristiques de l'image à différentes concentrations par rapport à toutes les mesures hors ligne. Voir la légende de la figure 1.
- Choisissez l'écart de mesure et les intensités stroboscope les plus raisonnables à l'étude de la courbe de corrélation de concentration avec les caractéristiques qui entraînent la plus petite erreur de moyenne de racine pondérée (WRMSE).
REMARQUE : L'écart de mesure est fixé pendant l'expérience, alors que l'intensité du stroboscope peut être adaptée en fonction de la concentration cellulaire.
2. Mesure hors ligne
- Ajuster l'écart de mesure souhaité en fonction de l'étape 1 à l'aide d'une jauge d'épaisseur.
- Ouvrez l'interface utilisateur graphique Probe Control dans le tableau de bord SOPAT.
- Connectez la sonde désirée à l'amplificateur dans la sous-section logicielle Actions et appuyez sur Connect.
- Appuyez sur le bouton Play pour commencer à diffuser en continu (Live View).
- Nettoyez l'écart de mesure en pulvérisant de l'éthanol dans l'espace et essuyez soigneusement toute poussière ou saleté avec un papier optique. Vérifiez que le verre du capteur est exempt de particules avec la vue en direct dans le CamControl.
REMARQUE : Les particules et la poussière perturbent les mesures et l'identification automatique des cellules. - Placez un papier optique sec dans l'espace de mesure. Ouvrez le contrôle de la sonde de l'onglet et ajustez l'intensité du stroboscope afin de visualiser le papier. Tourner la vis de liaison jusqu'à ce que les fibres simples du papier sont clairement visibles.
- Remplir un tube de bouillon de culture. Tremper le microscope dans le bouillon de culture afin que l'écart soit entièrement recouvert d'une suspension cellulaire. Ouvrez le contrôle de la sonde de l'onglet et ajustez l'intensité du stroboscope souhaitée en fonction de la section 1. Concentrez-vous sur les cellules en affinant la vis de liaison de mise au point. L'accent ne doit plus être modifié au cours de l'expérience
REMARQUE : 5-6 ml de bouillon de culture sont ajoutés à un tube centrifuge conique de 50 ml pour faire flotter suffisamment l'espace de mesure. - Définir le nombre d'images par point de temps [-] dans l'interface utilisateur dans le menu Déclenchant dans les cadres GUI par déclencheur. Définir le nombre d'images à 200 images par gâchette.
REMARQUE : Le nombre d'images peut être réduit à la valeur la plus basse, ce qui est nécessaire pour un résultat statistiquement fiable. Cela dépend de la taille de l'échantillon nécessaire pour obtenir une distribution représentative de la taille des cellules morphologiques (voir aussi l'étape 5). - Définir le taux d'image [Hz] dans le menu Déclenchant dans le taux de cadreGUI . Choisissez un taux d'image qui garantit que les particules mobiles d'un cadre précédent n'apparaîtront pas dans le cadre suivant.
REMARQUE: Cela peut être prouvé avec un déclencheur de test avec 200 images. Inspectez les images pour les particules, qui sont capturées à plusieurs reprises. Si tel est le cas, diminuez le taux d'image. Pour les mesures hors ligne, 1 Hz est recommandé. - Définir le répertoire, dans lequel les images acquises seront enregistrées, dans le menu général.
- Effectuez une acquisition d'image en activant le bouton d'acquisition de déclenchement d'image Démarrer. Déplacez le tube avec la suspension de culture doucement vers le haut et vers le bas pour induire un flux à travers l'espace de mesure.
- Répétez l'étape 2.5 après chaque mesure.
- Vérifiez les images acquises. Les cellules doivent être assez pointues pour l'annotation. Inspectez les images pour les particules, qui sont capturées à plusieurs reprises. Si tel est le cas, diminuez le taux d'image.
- Enregistrer les paramètres en sélectionnant la voie suivante: C: Fichiers de programme -SOPAT GmbH -monitoringPrograms -camcontrol, et appuyez sur Enregistrer.
3. Identification des particules
- Annoter les particules pour la formation du réseau neuronal artificiel (ANN) (ensemble d'entraînement).
- Chargez les images acquises dans l'outil d'annotation "Fidji, ImageJ" en faisant glisser et en laissant tomber le fichier dans la fenêtre Main "ImageJ" (voir GUI "Fidji" outil dans La figure 2)
- Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en sélectionnant : Analyser Outils (fr) Gestionnaire de ROI.
- Choisissez un outil de sélection. L'outil de baguette (traçage), les sélections à main levée, ovales ou elliptiques sont recommandés.
- Dessinez un cercle autour de la particule qui doit être annoté avec les outils de sélection mentionnés précédemment, puis affinez-le avec l'outil de brosse.
- Ajoutez l'annotation au gestionnaire de roi-roi en appuyant sur Add [t].
- Marquez tous les objets d'intérêt (cellules à identifier) sur une quinzaine d'images.
REMARQUE : Afin de couvrir toutes les informations nécessaires, c'est-à-dire différentes formes, tailles, concentration de cellules, luminosité, etc.,utilisez cinq images dès le début, cinq images entre les deux et cinq images de la fin de l'expérience. - Décidez, si les cellules doivent être classées dans différentes sous-classes en raison de leur forme(par exemple,différentes phases d'un cycle cellulaire), ou si toutes les cellules sont de la même classe.
- Modifier le nom de chaque particule sélectionnée en conséquence. Définir un nom ou une abréviation pour chaque classe et un compteur pour chaque particule de la classe(p. ex.,cell_1, cell_2, etc.). Annoter au moins 50 particules par classe.
- N'annoter pas les objets, qui ne doivent pas être détectés, parce qu'ils ne sont pas pertinents pour le processus, tels que les bulles de gaz ou d'autres particules comme les composants non dissous du support.
REMARQUE : Ces événements ne seront pas inclus dans la procédure de formation pour l'ANN et seront considérés comme des antécédents. - N'annoter pas les cellules qui sont floues.
- Annoter les images aussi cohérenteque que possible. En cas de doute, l'étiquette Ignorer peut être appliquée. Il est fortement recommandé de ne pas abuser de son utilisation, puisque l'ANN ne reconnaîtra que les structures qui sont étiquetées.
Figure 2 : Interface utilisateur d'outils Fidji. Un ensemble de formation est créé avec les images annotées. Une annotation manuelle composée de deux classes est représentée, la liste des particules annotées est affichée dans le gestionnaire de retour sur investissement. Différents noms et couleurs peuvent être réglés pour différentes classes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Enregistrez les objets annotés et l'image dans un format ZIP et envoyez le fichier au réseau de formation, soit via le téléchargement sur la plate-forme, soit en envoyant le fichier ZIP par e-mail.
REMARQUE : Habituellement, il faut un certain nombre de rondes d'entraînement itératif pour identifier les prédictions adéquates des objets classifiés sur les images. Chaque cycle de formation mène à un flux de travail qui est retourné par le programme. - Utilisez le flux de travail (.wf) avec l'algorithme de reconnaissance d'objets formé pour analyser les images de test avec le programme de progression du lot de données Batcher qui peut être démarré dans le tableau de bord.
- Vérifiez la détection d'objets sur les images de test grâce à la quantification d'événements faux positifs et négatifs.
- Quantifier la détection de faux événements positifs : particules détectées par erreur sous forme de cellules, cellules qui ne sont pas correctement classées et cellules dont le contour n'a pas été bien identifié.
- Quantifier les faux événements négatifs (cellules qui ne sont pas reconnues comme telles).
- Visualisez les résultats dans l'analyseur de résultats de l'outil en commençant le programme dans le tableau de bord.
- Importer les fichiers de résultats souhaités avec Le Fichier Fichier d'importation ou fichier Importer des dossiers.
- Visualiser les résultats par graphique (fr) Créez un graphique sur l'interface graphique.
- Sélectionnez l'une des options suivantes : Graphique de distribution, diagramme de sensibilité, Caractéristique au fil du temps, Caractéristique sur les points d'enquête et Fonctionnalité vs fonctionnalité.
REMARQUE: Un manuel concernant l'utilisation de l'analyseur de résultats est livré avec le système et est également disponible à partir de la prise en charge. - Si les résultats sont acceptables, exécutez le flux de travail dans le Batcher sur toutes les images acquises de l'expérience. Dans le même temps, le programme de surveillance peut être créé en combinant les paramètres enregistrés à partir du contrôleur de sonde (.pcfg) avec le flux de travail (.wf), voir aussi le manuel.
REMARQUE : Le flux de travail peut également être utilisé pour surveiller les expériences futures pour ce média culturel. - Si les résultats ne sont pas acceptables, vérifiez l'annotation sur l'ensemble de formation et/ou continuez avec un autre cycle d'entraînement itératif (voir l'étape 4.2).
4. Quantification de la taille de l'échantillon
- Définir l'écart type ( ' ), ce qui est acceptable parmi les particules détectées.
REMARQUE : L'écart standard change parallèlement à l'homogénéité de la taille de la cellule. L'écart standard maximal indique l'échantillon avec le degré le plus élevé d'hétérogénéité de taille. - Définir l'amplitude de l'intervalle de confiance ou la précision souhaitée par rapport à la variance attendue des mesures (e).
- Définir l'erreur admise entre 5 % (z1-2 et 1,96) et 10 % (z1-2 et 1,64).
- Calculer le nombre de cellules à identifier à partir de chaque classe à partir de l'équation 1.
[Équation 1]
REMARQUE : En fonction du nombre de cellules, le nombre d'images à acquérir peut être défini pour chaque point de données. - Effectuer une analyse de sensibilité sur les points de temps aléatoires de l'expérience pour vérifier que l'analyse des particules n conduit à une variabilité du diamètre moyen de Feret et le Dv90 de moins de 5%. Il peut être calculé automatiquement dans l'analyseurde résultats .
[Équation 1]5. En ligne (by-pass) ou en ligne de mesure
- Effectuer d'abord la procédure de mesure hors ligne (voir l'étape 2) afin de définir les paramètres matériels et logiciels en fonction de l'organisme et du processus (concentration ou média).
- Téléchargez les paramètres enregistrés de la section précédente en sélectionnant le bouton Charge et sélectionnez la voie suivante : C:Program Files-SOPAT GmbH-monitoringPrograms-camcontrol.
- Connectez la sonde à la cellule d'écoulement ou au bioréacteur.
REMARQUE : Les mesures in situ peuvent être exécutées avec une pincement. - Effectuer la stérilisation.
REMARQUE : Seul le matériau mouillé par la sonde de l'instrument est stérilisable par stérilisation à la vapeur. La longueur mouillée de la sonde peut aller de 6 à 222 mm (figure 3).
Figure 3 : Croquis des dispositifs ISM. La sonde MM-Ho (A) est installable directement dans le bioréacteur, tandis que la sonde MM 2.1 (B) peut être utilisée comme un contournement. La circulation du bouillon de culture est marquée de flèches dans chaque image. Les facteurs de conversion sont de 0,166 m pix-1 pour MM-Ho et de 0,087 m pix-1 pour MM 2.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Définir le taux d'acquisition d'image dans l'interface graphique Déclenchant dans l'intervalle de déclenchement de champ [s].
REMARQUE : Selon la dynamique du processus, le taux d'acquisition d'image peut être adapté. Par exemple, si une phase de décalage de 3 heures est prévue, le taux d'acquisition peut être plus faible que si un changement de métabolisme ou l'accumulation d'un produit doit être surveillé. Habituellement, cela nécessite un temps d'acquisition beaucoup plus court dans la plage minute. Par exemple, une séquence d'acquisition d'image entre 5 et 10 min au cours d'une culture de levure par lots fournit suffisamment d'informations pour capturer la dynamique des processus. - Définissez le taux d'image tel qu'il est expliqué à l'étape 2.10.
REMARQUE : En ligne et en ligne, le taux d'armature peut être augmenté, puisque l'agitation mécanique peut augmenter le débit à travers l'espace. - Démarrer l'acquisition d'image en activant le bouton Démarrer le streaming de sonde sélectionnée.
- Arrêtez l'acquisition lorsque l'expérience est terminée avec le bouton Arrêtez le streaming de la sonde sélectionnée.
REMARQUE: Pour la course 1st, commencer l'acquisition juste avant l'inoculation de la culture et procéder à l'étape 4. Pour les exécutions suivantes, ouvrez le programme Surveillance dans le tableau de bord et sélectionnez le flux de travail créé (voir l'étape 4). Démarrez la surveillance juste avant l'inoculation de la culture en appuyant sur le bouton Play.
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Representative Results
La détection de la taille des cellules dans les cultures de levure avec l'ISM et la détection automatisée d'image pour distinguer entre les cellules en herbe et non-budding a été menée avec succès. L'intensité du stroboscope et le choix de l'écart de mesure ont une gamme de tolérance, dans laquelle l'identification des particules n'est pas affectée. Par exemple, les cellules de S. cerevisiae ont été mesurées avec diverses intensités de stroboscope dans une gamme de variation de 11% à une concentration sèche de biomasse de 4 g L-1. Les images correspondantes ont fourni des limites nettes de cellules, donc l'identification de particule était faisable avec une variation acceptable de la taille de cellules (1%) quelle que soit l'intensité du stroboscope. Dans le cas où l'intensité du stroboscope n'est pas correctement ajustée, les images souffrent d'un éclairage trop clair et une identification cellulaire appropriée ne sera pas possible (figure 4).
Figure 4 : Caractéristiques d'acquisition d'images. Exemples de diverses intensités stroboscope (SI-%) et les lacunes de mesure (MG-m) pour la capture des cellules S. cerevisiae (les valeurs actuelles de SI et de MG sont indiquées entre parenthèses) : A (25, 50); B (50, 50); C (25, 80); et D (50, 80). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Jusqu'à présent, l'écart de mesure ne peut pas être réajusté lors d'une mesure in situ. Par conséquent, l'expérience de la série de dilution est cruciale afin de garantir des données fiables tout au long d'une culture. La principale préoccupation est l'apparition d'événements non identifiables qui se chevauchent en raison de l'augmentation de la concentration cellulaire.
Une parcelle de sensibilité (analyse de sensibilité des valeurs caractéristiques, par exemple,diamètre moyen des cellules par rapport au nombre de particules n) de toutes les cellules détectées à partir du fichier de données chargé peut être visualisée (Figure 5). L'utilisateur doit décider quelle stabilité d'un certain paramètre de processus est nécessaire. Dans ce cas, le nombre minimum de cellules nécessaires pour un point de données valide. En conséquence, plus ou moins d'images peuvent être analysées pour un point de données.
Figure 5 : Parcelle moyenne de sensibilité au diamètre des cellules. Variabilité du diamètre moyen des cellules dans la dépendance du nombre de particules détectées. Une valeur constante du diamètre moyen des cellules est atteinte avec environ 1000 cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
L'annotation est le point clé afin d'atteindre la précision souhaitée de l'identification des particules. La figure 6 montre un exemple d'une « annotation utilisateur » (A), qui est utilisée comme ensemble de formation pour le réseau neuronal, ainsi que l'identification des particules sur une image de l'ensemble de test (données inconnues pour le réseau neuronal), qui est utilisé pour son évaluation (B). Les deux images doivent avoir un taux similaire d'événements identifiés.
Figure 6 : Comparaison de l'annotation utilisateur (ensemble de formation) et de la détection automatique (ensemble de tests). Ensemble de formation : des images annotées et originales sont représentées en A, et A', respectivement. Les informations de cette image sont utilisées pour former l'ensemble de test ANN. : le flux de travail créé après la formation de l'ANN est appliqué aux captures, qui n'ont pas été utilisées pour la formation : cellules automatiquement identifiées (indiquées en B) à partir de la capture originale B'. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Comme exemple de l'effet de l'accumulation intracellulaire de produit sur la distribution de taille de cellules, l'accumulation de l'acide docosahexaénoïque polyinsaturé d'acide d'acide (DHA) par la limitation d'azote a été étudiée dans les microalgues hétérotrophiques C. cohnii. Il a été démontré que l'accumulation du produit peut être détectée quantitativement au moyen de l'ISM10. La méthode est actuellement utilisée pour étudier l'impact des forces de cisaillement dans les bioréacteurs agités sur l'hétérogénéité morphologique des cellules.
L'état de maturation de la levure en herbe S. cerevisiae a été quantifié. Dans le cas du bourgeonnement, la proportion de cellules qui sont dans l'état de maturation à la fois (décrit avec le BI), fournit des informations sur l'activité de croissance et l'hétérogénéité de la population. La reconnaissance cellulaire automatique a été en mesure d'identifier et de distinguer les cellules en herbe et non-budding (ou fille) avec succès dans la suspension cellulaire15. La distribution de la taille de la cellule de trois échantillons est indiquéeà la figure 7 . Un passage à de plus petites cellules indique une partie inférieure des cellules en herbe dans la population.
Figure 7 : Distribution cumulative de la taille d'une seule cellule. Répartition de la taille des cellules mesurée au cours d'une culture à 3 h (ligne droite), 7 h (ligne pointillée) et 13 h (ligne en pointillés). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'ISM tel qu'il est présenté ici avec les mêmes dispositifs ou très similaires a été utilisé pour mesurer la dynamique morphologique des champignons, des microalgues et des cellules de levure, ce qui a permis de déterminer l'activité de croissance, et en cas d'algues, l'accumulation intracellulaire des produits. Le capteur n'a pas de pièces mobiles et est directement applicable dans n'importe quel bioréacteur de réservoir remué standard, soit par un port standard ou dans un contournement stérilisable. Puisque la levure est beaucoup plus petite que les algues, la réduction de la taille des cellules a nécessité quelques adaptations matérielles récentes comme une résolution de caméra plus élevée et l'éclairage par transmission afin d'obtenir une résolution de pixel suffisante de la levure (pour des détails techniques, voir15). Cependant, il existe encore une limitation pour mesurer des cellules encore plus petites comme les bactéries. L'instrumentation photo-optique in situ actuelle indique des limites en ce qui concerne le chevauchement de l'information sur les particules dans les effets de concentration et de brouillage élevés avec des structures inférieures au spectre UV/VIS. À ce jour, les algorithmes d'analyse d'image pour les suspensions bactériennes n'ont pas été appliqués, à l'exception des corrélations de luminosité16.
D'autres outils ISM précédemment appliqués ont été utilisés pour déterminer la concentration cellulaire afin de montrer leur fiabilité. Ceci, cependant, est devenu crucial si les cellules se chevauchaient à des concentrations élevées. Par conséquent, l'objectif de cette étude n'était pas la quantification cellulaire, mais la détection des caractéristiques morphologiques, tandis que les caractéristiques de l'image comme l'intensité de luminosité peuvent être corrélées à la densité cellulaire telle qu'elle est effectuée avec d'autres appareils, trop17. Sinon, tous ces dispositifs seraient limités à de faibles concentrations cellulaires; une concentration maximale de environ 20 g L-1 de cellules de levure a été évaluée lors de l'utilisation d'une approche de reconnaissance cellulaire par rapport à environ 80 g L-1 lors de l'utilisation d'un algorithme de taille de cluster.
Afin de suivre les caractéristiques morphologiques d'une cellule, ses bords doivent être détectés avec précision. Dans le cas des algues, c'est assez simple car la taille change, mais la forme reste constante tout au long de la transition des étapes de processus. En revanche, les cellules de levure fournissent un plus grand défi en raison de leur forme, qui ne peut pas être approximative à une sphère ou une ellipse lorsque les cellules sont en herbe. Néanmoins, jusqu'à présent, la taille de la cellule a été calculée en supposant qu'une cellule est une sphère parfaite dans les mesures ISM18. Bien que cette approximation soit proche de la réalité pour certains cas, des formes plus compliquées telles que les cellules en herbe ou les cellules en forme de tige ne peuvent pas être correctement évaluées. Dans cette étude, cependant, différentes formes ont été analysées avec succès en raison de la détection flexible des limites activée par des algorithmes d'apprentissage automatique. En outre, les événements qui se chevauchent font toujours l'objet d'une enquête19 pour atteindre une nouvelle étape de développement.
Actuellement, l'étalon-or pour l'évaluation de la vitalité et de la viabilité est de compter les unités de formation de colonies ou de tacher un échantillon avec un colorant de viabilité20, par exemple,bleu méthylène ou violet méthylène21; cependant, cette procédure peut influencer les résultats. Chaque fois que de telles caractéristiques sont liées à la morphologie cellulaire22, le potentiel de les évaluer rapidement devrait être exploré par le potentiel croissant de l'ISM. En outre, les paramètres critiques du processus et/ou les attributs de qualité23 peuvent être liés à la forme, à l'agglomération et à la formation de granulés, qui peuvent tous être surveillés par l'ISM.
Des investigations avec d'autres micro-organismes clés fréquemment utilisés dans le bioprocessus sont actuellement effectuées. Le temps d'adaptation des algorithmes de reconnaissance d'objets et d'extraction des fonctionnalités pour l'analyse des fonctionnalités dépend principalement de la complexité des images et de l'exactitude attendue des résultats. À l'avenir, la capture d'images colorées sera envisagée afin d'élargir davantage la gamme d'informations, qui pourraient être obtenues au niveau d'une seule cellule, par exemple,si des pigments sont accumulés ou dans des organismes génétiquement modifiés, dans lesquels des marqueurs colorés ont été intégrés.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien du ministère fédéral allemand de l'économie et de l'énergie dans le cadre ZIM-Koop, projet "Inspection intelligente des processus", subvention non. ZF 4184201CR5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor MM 2.1 - MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
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