Summary
En foto-optisk in situ mikroskopi enheten ble utviklet for å overvåke størrelsen på enkeltceller direkte i cellen suspensjonen. Sann tids målingen utføres ved å kobling Foto-optiske vanndampsteriliseres sonde til en automatisert bildeanalyse. Morfologiske endringer vises med avhengighet av vekst tilstand og dyrking forhold.
Abstract
In situ overvåking i mikrobiell bioprocesses er hovedsakelig begrenset til kjemiske og fysiske egenskaper av mediet (f. ekspH-verdi og oppløst oksygen konsentrasjon). Likevel kan morfologi av celler være en passende indikator for optimale forhold, siden det endres med avhengighet av vekst staten, produkt akkumulering og celle stress. Videre gir enkelt Cellestørrelse fordelingen ikke bare informasjon om dyrking forhold, men også om befolkningen heterogenitet. For å få slik informasjon, ble en foto-optisk in situ mikroskopi enhet1 utviklet for å muliggjøre overvåking av enkelt Cellestørrelse fordeling direkte i celle suspensjonen i bioreaktorer. En automatisert bildeanalyse er koplet til mikroskopi basert på et nettverk modell, som er trent med bruker-kommenterte bilder. Flere parametre, som er oppnådd fra fanger av mikroskopet, er korrelert å behandle relevante funksjoner i cellene, som deres metabolske aktivitet. Inntil nå, den presenterte in situ mikroskopi sonde serien ble brukt for å måle pellet størrelse i trådformede sopp suspensjoner. Den ble brukt til å skille enkelt Cellestørrelse i mikroalger dyrking og forholde det til lipid akkumulering. Formen på cellulære partikler var relatert til spirende i gjær kulturer. Den mikroskopi analysen kan vanligvis deles inn i tre trinn: (i) bildeoppkjøp, (II) partikkel identifisering, og (III) dataanalyse, henholdsvis. Alle tiltak må tilpasses organismen, og derfor er spesifikk kommentert informasjon kreves for å oppnå pålitelige resultater. Muligheten til å overvåke endringer i celle morfologi direkte i linje eller på linje (i et by-pass) muliggjør sann tidsverdier for overvåking og kontroll, i Prosessutvikling og i produksjonsskala. Hvis av linje dataene samsvarer med sanntidsdataene, blir gjeldende kjedelige av- linje målinger med ukjente påvirkninger på cellestørrelsen unødvendig.
Introduction
Morfologiske funksjoner av celler er ofte knyttet til den fysiologiske tilstand, en forbindelse mellom form og funksjon finnes for mange programmer. Morfologi av en enkelt celle er påvirket av tilstanden til vekst, cellens alder, osmotisk og andre potensielle celle påkjenninger eller produkt akkumulering. Morfologiske endringer av celler er ofte et mål på vekst vitalitet i en kultur. Intracellulære produkt syntese, lipid akkumulering i alger og inkludering kroppens dannelse i bakterier, blant andre, er i slekt med cellestørrelsen også. Cell agglomerering kan være en annen faktor som er verdt å undersøke som oppsummert nylig2.
Befolknings heterogeniteter kan være kvantifisert basert på morfologiske trekk ved individuelle celler. Studier viste at heterogenitet innenfor en kultur kan være betydelig, for eksempelunder store produksjonsforhold3 den totale avkastningen kan påvirkes av en lav ytelse av subpopulasjoner4.
Vanligvis er vurderingen av morfologiske funksjoner av celler utført av manuell prøvetaking eller med en by-pass Flow kammer koplet til en foto-optisk enhet. Dette fører til flere restriksjoner: den begrensede mengden ervervet data kan neppe gi statistisk pålitelige målinger; tidsforsinkelsen mellom prøvetaking og tilgjengeligheten av resultatene kan være for lang i forhold til dynamikken i prosessen; og viktigst, prøvetaking prosedyren (plassering av prøvetaking porten, pre-behandling av prøven før målingen, ugunstige forhold i prøvetaking eller bypass tube) kan utløse en partisk feil som prøven prosedyren i seg selv kan allerede påvirke celle Morfologi. Til slutt, det finnes alltid en høy risiko for forurensning under prøvetaking eller i by-pass løsninger, hvis de ikke er vanndampsteriliseres på plass.
Anvendelsen av in situ MIKROSKOPI (ISM) kan omgå flere av disse problemene. Hvis celler oppdages automatisk, kan en korrekt identifisering av deres morfologiske funksjoner bli kartlagt5. Hittil var de viktigste begrensningene ved denne metoden (i) evaluerings tidspunktet for bilder, som var for lang for in situ -applikasjoner, og (II) den dårlige oppløsningen av bilder, spesielt ved høy celle tetthet. Selv om første løsninger av ISM inkluderte mekanisk prøvetaking, fortynning av sonden, eller var begrenset til et by-pass system6,7, ytterligere tilnærminger tillate fangst av cellen suspensjon direkte8.
Nylige fremskritt i ISM gir mulighet for in line eller on line overvåking av celler på en enkelt celle basis, som gir fordelingen av morfologiske parametre i sanntid direkte i celle suspensjoner ved betydelig høye celle konsentrasjoner. Gjennom off linje analyser av cellenes nøkkelparametre, sammenhenger med informasjon gitt av sammenkoblede automatiserte celle deteksjon og ISM kan identifiseres. Deretter oppnås nye Soft sensor design, der en unmeasurable parameter er anslått med enkelt celle morfologi.
I denne rapporten utføres ISM ved å kopling en foto-optisk sonde til en automatisert bildeanalyse. ISM består av en enkelt stang sensor sonde som gjør det mulig å fange opp bilder innenfor et kjent fokusområde i et justerbart mål gap med et høyoppløselig CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) og MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Blits lys belysningen utføres ved overføring. Derfor kommer lyset fra motsatt side av kameraet9 og dens intensitet kan justeres. Celler passerer kontinuerlig gjennom dette gapet med væsken flyt. Derfor oppnås en representativ utvalgs populasjon. Sonden kan monteres direkte på bioreactor slik at den når inn i celle fjæringen, eller den kan brukes i en vanndampsteriliseres by-pass. Sensor skallet er koblet til systemet før sterilisering, de optiske delene er etterpå montert inn i skallet.
Inntil nå, relevante industrielle mikroorganismer, f. eks, trådformede sopp (diameter på opptil over 200 μm), heterotrofe mikroalger Crypthecodinium cohnii (gjennomsnittlig celle diameter på 20 μm), og gjær Saccharomyces cerevisiae (gjennomsnittlig celle diameter på 5 μm), ble undersøkt med denne eller lignende enheter, som er kort beskrevet.
Trådformede sopp tendens til å danne pellets under visse dyrking forhold. Disse er av en størrelse på opp til flere hundre μm. Hyfer av sopp cellene utvikle ulike lengder i avhengighet til hydrodynamisk stress i væskefasen. Dette har en innflytelse på metabolsk og vekst aktivitet, substrat opptak og produkt utgivelse. ISM ble brukt til å identifisere pellet størrelsesfordelingen og bredden av soner av lavere biomasse tetthet på kantene av pellets (egne upubliserte data).
Størrelsen på C. cohnii endrer mellom 15 og 26 μm når cellene akkumuleres flerumettede fatty acid dokosaheksaensyre acid (DHA) under nitrogen begrensning. Denne bioteknologisk DHA produksjonsprosessen består av to deler, vekstfasen, der cellene deler seg og blir mindre, og produksjonsfasen, der cellene akkumulerer produktet og dermed blir større. Derfor ble cellestørrelsen brukt til å bestemme prosess tilstanden, der enten vekst eller DHA-produksjon var gunstig. Til slutt ble det funnet en korrelasjon mellom cellestørrelsen og DHA-innholdet. I dette tilfellet gjør ISM det mulig å overvåke den intracellulære DHA-akkumulering i sanntid uten kravet om prøvetaking, celle avbrudd og felles gass kromatografi analyse10.
Spirende gjær er vanligvis av en størrelse mellom 3 og 8 μm. Andelen celler som er i modnings tilstand om gangen, som beskrevet med den spirende index (BI), gir informasjon om vekst vitalitet11,12, og selv en forbindelse med rekombinant protein sekresjon er påvist13. Med hjelp av ISM var spirende og ikke-spirende gjærceller (celler med og uten en knopp) fremtredende14. Stress forhold kan også føre til en bredere variant av cellestørrelsen i en gjær befolkning, som nylig vist i skala ned dyrket, der forholdene i storstilt nærings-begrenset matet-batch dyrket var etterlignet3.
Derfor har ISM potensial til å overvåke vekst vitalitet og produkt dannelse på et enkelt cellenivå under alle stadier av en bioprosessen for identifisering av optimale dyrking forhold, eller for det formål å behandle kontroll. Metodene som er beskrevet her er fokusert på mikrobielle applikasjoner med enkeltceller, men er også gjeldende for større partikler som menneske-og dyreceller, celle agglomerater og pellets av trådformede organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: følgende trinn er nødvendige for å tilpasse parametrene til de respektive mikroorganismen og kultur forhold. Justeringen av sonde innstillingene varer ca 20 min for en erfaren bruker. En detaljert beskrivelse av verktøy og trinn er gitt i den korresponderende sonde manualen fra SOPAT GmbH. Generelt er verktøyene som presenteres i følgende protokoll nødvendig: (i) probe Controller for sonde justeringer og bildeoppkjøp; (II) Fiji (ImageJ) for kommentarer på ervervet bilder; (III) SOPAT støtte for kunstig nevrale nettverk (Ann) opplæring og arbeidsflyt opprettelse; (IV) batcher for data satsvis behandling ved hjelp av allerede anskaffet bilder med en arbeidsflyt; (v) resultat Analyzer for resultat visualisering og evaluering på batch behandlet bilder; og (vi) overvåke for automatisert sann tidsmåling og resultat visualisering.
1. innstilling av maskinvareparametere
- Forbered en kultur med høyest celle konsentrasjon som kan oppnås under eksperimentet eller sentrifuger og resuspend pellet for å oppnå denne konsentrasjonen. I dette tilfellet, 65 g L-1 av tørr biomasse konsentrasjon ble valgt for S. cerevisiae dyrket.
- Forbered ulike fortynninger, som spenner fra den høyeste til den laveste konsentrasjonen, slik at den forventede rekkevidden er fullt dekket. Det anbefales minst 4 forskjellige konsentrasjoner.
- Identifiser celle størrelsesområdet til mikroorganismen med konvensjonell mikroskopi. Definer forventet maksimal diameter (dMaks.) for de respektive cellene. Denne verdien er satt til 8 μm i tilfelle S. cerevisiae.
- Velg to måle hull av 5x og 10x av de forventede dMax av cellene.
- Velg maksimal stroboscope intensitet. Velg stroboscope intensitet for begge hullene med den høyeste celle konsentrasjonen, slik at cellene fortsatt er synlige på bildene med lavest lysstyrke (mørkeste bilder).
- Velg minimum stroboscope intensitet, og velg deretter stroboscope intensitet for begge hullene, slik at cellene fortsatt er synlige på bildene med høyest lys intensitet (lyseste bilder). Bruk den laveste celle konsentrasjonen, som sannsynligvis vises i løpet av målings perioden.
- Velg en fokus posisjon, som gir de skarpeste bildene for hvert målings gap, både for stroboscope intensitet og for konsentrasjons området som må testes (se trinn 2 for detaljer om fokusering). Fokuser celler på riktig måte, slik at bildedataene kan merkes etterpå (se trinn 4).
- Mål den tidligere forberedte fortynnings serien av celle konsentrasjonen (se trinn 2) med både gap bredder og stroboscope intensitet.
Figur 1: verktøy for konsentrasjon kalibrering. Venstre GUI: sett bilde kataloger (minimum 3) med kjente konsentrasjoner; sentrale GUI: Velg funksjoner som skal beregnes på bildekatalogen; høyre GUI: Velg vektet roten bety kvadrat feil (WRMSE) for å identifisere minimum. WRMSE og den beste sammenhengen mellom en bilde funksjon og celle konsentrasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Evaluere fortynning serien eksperimentet.
- Bruk verktøyet for konsentrasjon kalibrering (CoCa) (se figur 1) for å identifisere den optimale sammenhengen mellom de utpakkede bilde funksjonene (lysstyrke eller skarphet) og tidligere målte konsentrasjoner gitt av brukeren, for eksempeltørr biomasse eller celle tellinger. Følg instruksjonene i programvarehåndboken for mer informasjon.
- Identifiser den optimale sammenhengen mellom den utpakkede informasjonen fra bilde funksjonene i ulike konsentrasjoner sammenlignet med en av linje målingene. Se legenden om figur 1.
- Velg det mest fornuftige målings gapet og stroboscope intensitet som er under behandling av konsentrasjonen korrelasjons kurven med funksjoner som resulterer i den minste vektet roten bety kvadrat feil (WRMSE).
Merk: måle gapet er fast under eksperimentet, mens stroboscope intensitet kan tilpasses i henhold til celle konsentrasjonen.
2. off linje måling
- Juster ønsket måle gap i henhold til trinn 1 ved hjelp av en tykkelse måler.
- Åpne det grafiske brukergrensesnittet sonde kontroll i SOPAT-dashbordet.
- Koble den ønskede sonden til forsterkeren i programvaren ledd handlinger og trykk Connect.
- Trykk på avspillings knappen for å starte strømming (Live View).
- Rengjør måle gapet ved å sprøyte etanol inn i gapet og forsiktig tørke støv eller skitt med en optisk papir. Kontroller at glasset på sensoren er fri for partikler med Live View i CamControl.
Merk: partikler og støv forstyrrer målinger og den automatiske celle identifikasjonen. - Plasser et tørt, optisk papir i måle gapet. Åpne kategorien sonde og Juster stroboscope intensitet for å visualisere papiret. Drei på bindings skruen til enkelt fibrene i papiret er tydelig synlig.
- Fyll en tube med kultur buljong. Dypp mikroskopet i kulturen buljong slik at gapet er fullt dekket med celle suspensjon. Åpne kategori sonde kontrollen og Juster ønsket stroboscope intensitet i henhold til avsnitt 1. Fokuser på cellene ved å finjustere skruen for fokus binding. Fokuset må ikke endres lenger under eksperimentet.
Merk: 5-6 mL kultur buljong tilsettes til et 50 mL konisk sentrifugal rør for å flyte måle gapet tilstrekkelig. - Definer antall bilder per tids punkt [-] i brukergrensesnittet i menyen som utløser i GUI- rammene per utløser. Angi antall rammer til 200 bilder per utløser.
Merk: antall bilder kan reduseres til den laveste verdien, noe som er nødvendig for et statistisk pålitelig resultat. Dette avhenger av utvalgsstørrelsen som kreves for å oppnå en representativ morfologiske celle størrelsesfordeling (se også trinn 5). - Definere bildefrekvens [Hz] i menyen utløser i GUI Frame Rate. Velg en bildefrekvens som garanterer at bevegelige partikler fra en tidligere ramme ikke vises i følgende ramme.
Merk: Dette kan bevises med en test utløser med 200 rammer. Inspiser bildene for partikler, som er fanget gjentatte ganger. Hvis dette er tilfellet, reduserer du bildefrekvensen. For off-line målinger anbefales 1 Hz. - Angi katalogen, der de kjøpte bildene vil bli lagret, i menyen Generelt.
- Utfør et bildeoppkjøp ved å aktivere knappen Start bilde utløser oppkjøpet . Beveg røret med kultur oppheng forsiktig opp og ned for å indusere en flyt gjennom måle gapet.
- Gjenta trinn 2,5 etter hver måling.
- Sjekk de kjøpte bildene. Celler må være skarpe nok for merknad. Inspiser bildene for partikler, som er fanget gjentatte ganger. Hvis dette er tilfellet, reduserer du bildefrekvensen.
- Lagre innstillingene ved å velge følgende vei: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol, og trykk Lagre.
3. partikkel-identifisering
- Kommenter partikler for trening av det kunstige nevrale nettverket (ANN) (trenings sett).
- Belaste det ervervet profilen inn i kommentar verktøyet "Fiji, ImageJ" av flytter og drop filen inn i hovedavdeling "ImageJ" vindu (se GUI "Fiji" verktøyet inne skikkelsen 2)
- Åpne ROI Manager ved å velge: analyser | Verktøy | ROI Manager.
- Velg et markeringsverktøy. Wand (tracing) verktøy, frihånd, ovale eller elliptiske valg anbefales.
- Tegn en sirkel rundt partikkel som skal merkes med Utvalgsverktøy nevnt før og deretter avgrense den med pensel verktøyet.
- Legg til merknaden i ROI Manager ved å trykke på Legg til [t].
- Merk alle objekter av interesse (celler som skal identifiseres) på rundt 15 bilder.
Merk: for å dekke all nødvendig informasjon, det vil si, ulike former, størrelser, konsentrasjon av celler, lysstyrke, etc., bruker fem bilder fra starten, fem bilder fra i mellom, og fem bilder fra slutten av eksperimentet. - Bestem deg, hvis cellene må klassifiseres i ulike underklasser på grunn av deres form (f. eks, ulike faser av en celle syklus), eller hvis alle cellene er av samme klasse.
- Endre navnet på hver valgte partikler tilsvarende. Angi ett navn eller en forkortelse for hver klasse og en teller for hver partikkel i klassen (f.eks.cell_1, cell_2 osv.). Kommenter minst 50 partikler per klasse.
- Ikke Kommenter objekter, som ikke skal registreres, fordi de ikke er relevante for prosessen, for eksempel gassbobler eller andre partikler som uoppløste medie komponenter.
Merk: disse hendelsene vil ikke bli inkludert i trenings prosedyren for ANN og betraktes som bakgrunn. - Ikke Kommenter celler som er ute av fokus.
- Kommenter bildene så konsekvente som mulig. Hvis det er tvil, kan etiketten Ignorer brukes. Det anbefales sterkt å ikke misbruke bruken, siden ANN bare vil gjenkjenne strukturer som er merket.
Figur 2: brukergrensesnitt for Fiji-verktøy. Et opplæringssett opprettes med kommenterte bilder. En manuell merknad bestående av to klasser er avbildet, listen over kommenterte partikler vises i ROI Manager. Forskjellige navn og farger kan stilles inn for ulike klasser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Lagre kommenterte objekter og bildet til en ZIP-format og sende filen til trening nettverket, enten via laste opp til plattformen eller ved å sende ZIP-filen via e-post.
Merk: vanligvis tar det en rekke gjentakende trening runder for å identifisere tilstrekkelig spådommer av klassifiserte objekter på bildene. Hver opplærings runde fører til en arbeidsflyt som returneres av programmet. - Bruk arbeidsflyten (*. WF) med opplært objekt gjenkjennelse algoritmen til å analysere test bilder med data batch progresjon program batcher som kan startes i dashbordet.
- Sjekk objekt deteksjon på test bilder gjennom kvantifisering av falske positive og negative hendelser.
- Kvantifisere påvisning av falske positive hendelser: partikler feilaktig oppdaget som celler, celler som ikke er riktig klassifisert, og celler som konturen ikke har blitt godt identifisert.
- Kvantifisere de falske negative hendelsene (celler som ikke gjenkjennes som sådan).
- Visualiser resultatene i verktøy resultat analyse ved å starte programmet i instrumentbordet.
- Importer de ønskede resultatene filer med fil | Importer fil eller fil | Importere mapper.
- Visualiser resultatene etter diagram | Lag diagram på CHARTS GUI.
- Velg ett av følgende alternativer: fordelings diagram, følsomhet plot, karakteristisk over tid, karakteristisk over undersøkelsen poeng, og Feature vs funksjonen.
Merk: en manual om utnyttelse av resultat Analyzer kommer med systemet og er også tilgjengelig fra støtten. - Hvis resultatene er akseptable, kjører du arbeidsflyten i batcher på alle hentede bilder av eksperimentet. Samtidig kan overvåkingsprogrammet opprettes ved å kombinere de lagrede innstillingene fra sonde Controller (*. pcfg) med arbeidsflyten (*. WF), se også manualen.
Merk: arbeidsflyten kan også brukes til å overvåke fremtidige eksperimenter for dette kultur mediet. - Hvis resultatene ikke er akseptable, kontrollerer du merknaden på trenings settet og/eller fortsetter med en annen gjentakende treningsrunde (se trinn 4,2).
4. sample størrelse kvantifisering
- Angi standardavviket (σ), som er akseptabelt blant de oppdagede partiklene.
Merk: standardavviket endres parallelt med homogenitet for cellestørrelsen. Det maksimale standardavviket indikerer prøven med den høyeste graden av størrelses heterogenitet. - Angi amplituden til sikkerhets intervallet eller ønsket nøyaktighet i forhold til forventet varians for målinger (e).
- Angi innrømmet feil (α) mellom 5% (z1-α/2 = 1,96) og 10% (z1-α/2 = 1,64).
- Beregn antall celler som skal identifiseres fra hver klasse fra Formel 1.
[Ligning 1]
Merk: basert på antall celler, antall bilder som må anskaffes kan defineres for hvert datapunkt. - Utfør en følsomhet analyse på tilfeldig tidspunkt poeng av eksperimentet for å kontrollere at analysen av n partikler fører til en variasjon av gjennomsnittlig Feret diameter og Dv90 på mindre enn 5%. Den kan beregnes automatisk i resultat analyse.
[Ligning 1]5. on line (by-pass) eller i linje måling
- Utfør først av-linje målings prosedyren (se trinn 2) for å stille inn maskinvare-og programvareinnstillinger som en funksjon av organismen og prosessen (konsentrasjon eller Media).
- Last opp de lagrede innstillingene fra den forrige delen ved å velge knappen Last inn og velg følgende sti: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol.
- Koble sonden til strømningscellen eller til bioreactor.
Merk: in situ -målinger kan utføres med en klype flens. - Utfør sterilisering.
Merk: det er bare det vanndampsteriliseres materialet til instrumentet som er fuktet gjennom dampsterilisering. Sonden fuktet lengde kan gå fra 6 til 222 mm (Figur 3).
Figur 3: skisse av ISM-enheter. Proben MM-Ho (A) kan installeres direkte i bioreactor, mens proben mm 2,1 (B) brukes som et by-pass. Kulturen kjøttkraft sirkulasjon er merket med piler i hvert bilde. Konverteringen faktorene er 0,166 μm pix-1 for mm-Ho og 0,087 μm pix-1 for mm 2,1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Definer bilde anskaffelses raten i GUI- utløsing i felt trigger intervallet [s].
Merk: avhengig av prosess dynamikken kan bilde anskaffelses raten tilpasses. For eksempel, hvis en lag-fase på 3 timer er forventet, kan frekvensen av oppkjøpet være lavere, enn hvis et stoffskifte SKIFT eller akkumulering av et produkt skal overvåkes. Vanligvis krever dette en mye kortere anskaffelsestid i minuttet rekkevidde. For eksempel gir et bilde oppkjøpet sekvens mellom 5 og 10 min under en batch gjær dyrking tilstrekkelig informasjon til å fange prosessen dynamikk. - Definer bildefrekvensen som forklart i trinn 2,10.
Merk: i on line og i linje målinger, kan bildefrekvensen økes, siden mekanisk omrøring kan øke strømningshastigheten gjennom gapet. - Start image oppkjøpet ved å aktivere knappen Start streaming av valgte sonde.
- Stopp anskaffelsen når eksperimentet er ferdig med knappen Stopp streaming av valgt sonde.
Merk: for 1St løpe, starte oppkjøpet like før inoculation av kulturen og gå videre til trinn 4. For følgende kjøringer åpner du program overvåkingen i dashbordet og velger den opprettede arbeidsflyten (se trinn 4). Start overvåkingen rett før inoculation av kulturen ved å trykke på Play -knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den Cellestørrelse deteksjon i gjær kulturer med ISM og automatisert bildegjenkjenning for å skille mellom spirende og ikke-spirende celler ble vellykket gjennomført. Både stroboscope intensitet og valg av måle gapet har en rekke toleranse, der partikkel identifikasjonen ikke påvirkes. For eksempel ble S. cerevisiae celler målt med ulike stroboscope intensitet innenfor et variasjonsområde på 11% ved en tørr biomasse konsentrasjon av 4 g L-1. De tilsvarende bildene gitt skarpe celle grenser, derfor partikkel identifikasjonen var gjennomførbart med en akseptabel variant av cellestørrelsen (1%) uavhengig av stroboscope intensitet. I tilfelle stroboscope intensiteten ikke er riktig justert, bildene lider av over-belysning og en riktig celle identifikasjon vil ikke være mulig (Figur 4).
Figur 4: bilde anskaffelses funksjoner. Eksempler på ulike stroboscope intensitet (SI-%) og måling hull (MG-μm) for å fange S. cerevisiae celler (nåværende verdier av si og mg er angitt i parentes): A (25, 50); B (50, 50); C (25, 80); og D (50, 80). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Så langt kan ikke måle gapet justeres på nytt under en in situ -måling. Derfor er fortynning serien eksperimentet avgjørende for å garantere pålitelige data gjennom en dyrking. Den største bekymringen er forekomsten av uidentifiserbar overlappende hendelser på grunn av økningen i celle konsentrasjon.
En følsomhet plot (følsomhet analyse av karakteristiske verdier, f. eks, gjennomsnittlig celle diameter med hensyn til partikkel nummer n) av alle oppdagede celler fra den lastede datafilen kan bli visualisere (figur 5). Brukeren må bestemme hvilken stabilitet av en bestemt prosess parameter er nødvendig. I dette tilfellet minste antall celler som trengs for ett gyldig datapunkt. Som følge av dette kan mer eller mindre bilder analyseres for ett datapunkt.
Figur 5: gjennomsnittlig celle diameter følsomhet plot. Variasjon av gjennomsnittet celle diameter i avhengighet av antall oppdagede partikler. En konstant verdi av gjennomsnittet celle diameter er oppnådd med ca 1 000 celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merknaden er det viktigste punktet for å oppnå ønsket nøyaktighet av partikkel identifikasjonen. Figur 6 viser et eksempel på en "bruker merknad" (a), som brukes som en opplæring satt for nettverk, samt partikkel identifikasjon på et bilde av test sett (ukjente data for nettverk), som brukes for evalueringen (B). Begge bildene bør ha en lignende hastighet av identifiserte hendelser.
Figur 6: sammenligning av bruker merknader (opplæringssett) og automatisk gjenkjenning (test sett). Opplæringssett: kommenterte og originale bilder er avbildet i henholdsvis aog a. Informasjonen i dette bildet brukes til å trene ANN. test sett: arbeidsflyten opprettet etter trening ANN er brukt på fanger, som ikke har blitt brukt for trening: automatisk identifiserte celler (vist i B) fra den opprinnelige Capture B '. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som et eksempel på effekten av intracellulære produkt akkumulering av celle størrelsesfordelingen, ble akkumulering av flerumettede fatty acid dokosaheksaensyre acid (DHA) ved nitrogen begrensning undersøkt i heterotrofe mikroalger C. cohnii. Det ble demonstrert at akkumulering av produktet kan kvantitativt oppdages ved hjelp av ISM10. Metoden er i dag brukes til å undersøke virkningen av skjærkrefter i rørt bioreaktorer på morfologiske heterogenitet av celler.
Den modning tilstand av spirende gjær S. cerevisiae var kvantifisert. Ved spirende vil andelen celler som er i modnings tilstand om gangen (beskrevet med BI), gi informasjon om vekst aktiviteten og befolknings heterogenitet. Den automatiske celle gjenkjennelse var i stand til å identifisere og skille spirende og ikke-spirende (eller datter) celler med hell i celle suspensjon15. Celle størrelsesfordelingen av tre prøver vises i figur 7. Et skift til mindre celler angir en lavere del av spirende celler i populasjonen.
Figur 7: kumulativ enkelt celle størrelsesfordeling. Cellestørrelse distribusjoner målt i løpet av tiden løpet av en dyrking på 3 h (rett linje), 7 h (stiplet linje), og 13 h (stiplet linje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ISM som presenteres her med samme eller svært like enheter ble brukt til å måle morfologiske dynamikk av sopp, mikroalger, og gjærceller, som gjorde det mulig fastsettelse av vekst aktivitet, og i tilfelle av alger, intracellulære produkt akkumulering. Sensoren har ingen bevegelige deler og er direkte anvendelig i enhver standard rørt tank bioreactor, enten gjennom en standard port eller i en vanndampsteriliseres by-pass. Siden gjær er mye mindre enn alger, reduksjonen i Cellestørrelse kreves noen nyere maskinvare tilpasninger som en høyere kamera oppløsning og belysning av overføringen for å få en tilstrekkelig piksel oppløsning av gjær (for tekniske detaljer, se15). Det finnes imidlertid fortsatt en begrensning for å måle enda mindre celler som bakterier. Den aktuelle in situ Foto-optiske instrumentering indikerer begrensninger vedrørende overlappende partikkel informasjon i høy konsentrasjon og forstyrrelser effekter med strukturer under UV/Vis spekteret. Oppdatert, bildeanalyse algoritmer for bakteriell suspensjoner har ikke blitt brukt, bortsett fra lysstyrke sammenhenger16.
Andre tidligere brukte ISM-verktøy ble brukt til å bestemme celle konsentrasjonen for å vise påliteligheten. Dette ble imidlertid avgjørende hvis cellene overlappet hverandre ved forhøyede konsentrasjoner. Derfor er fokuset i denne studien ikke celle kvantifisering, men morfologiske funksjonen deteksjon, mens bildefunksjoner som lysstyrke kan være korrelert til celle tettheten som utføres med andre enheter, for17. Ellers vil alle disse enhetene være begrenset til lave celle konsentrasjoner; en maksimal konsentrasjon av ca. 20 g L-1 av gjærceller ble evaluert ved bruk av en celle anerkjennelse tilnærming vs. ca. 80 g L-1 når du bruker en klyngestørrelse algoritme.
For å spore de morfologiske funksjonene i en celle, må kantene være oppdaget nøyaktig. Når det gjelder alger, er dette ganske enkelt som størrelsen endres, men skjemaet forblir konstant gjennom overgangen av prosessen stadier. I kontrast, gjærceller gir en større utfordring på grunn av sin form, som ikke kan anslås til en sfære eller ellipse når cellene er spirende. Likevel, inntil nå cellestørrelsen ble beregnet under forutsetning av at en celle er en perfekt sfære i ISM målinger18. Selv om denne tilnærmingen er nær virkeligheten for noen tilfeller, kan mer kompliserte former som spirende celler eller stang-formede celler ikke bli skikkelig vurdert. I denne studien ble imidlertid ulike skjemaer analysert på grunn av den fleksible grense gjenkjenningen som er aktivert gjennom algoritmer for maskinlæring. Videre overlappende hendelser er fortsatt under etterforskning19 for å oppnå en videre utvikling scenen.
For tiden er gullstandarden for vitalitet og levedyktighet vurdering å telle koloni forming enheter eller å flekken en prøve med en levedyktighet fargestoff20, f. eks, metylen blå eller metylen Violet21; denne fremgangsmåten kan imidlertid påvirke resultatene. Når slike funksjoner er relatert til cellen morfologi22, potensialet i raskt å vurdere dem bør utforskes ved det økende potensialet i ISM. Videre kan kritiske prosessparametre og/eller kvalitetsegenskaper23 være relatert til form, agglomerering og pellet dannelse, som alle kan OVERVÅKES av ISM.
Undersøkelser med andre viktige mikroorganismer som brukes hyppig i bioprosessen, utføres nå. Tidspunktet for tilpasningen av objektet anerkjennelse algoritmer og funksjonen utvinning for funksjonen analyse avhenger i hovedsak på kompleksiteten av bildene og forventet nøyaktigheten av resultatene. I fremtiden vil farget bilde fangst bli vurdert for å ytterligere utvide omfanget av informasjon, som kan fås på et enkelt cellenivå, for eksempelhvis pigmenter er akkumulert eller i genmodifiserte organismer, der fargede markører ble integrert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlig for støtte fra det tyske føderale departementet for økonomi og energi innenfor rammeverket ZIM-Koop, prosjektet "Smart Process inspeksjon", gi nei. ZF 4184201CR5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor MM 2.1 - MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
References
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
