Summary
En foto-optisk in situ mikroskopi enhet utvecklades för att övervaka storleken på enskilda celler direkt i cellsuspensionen. Realtids mätningen utförs genom att koppla den foto optiska steriliserbara sonden till en automatiserad bildanalys. Morfologiska förändringar visas med beroende av tillväxt tillstånd och odlingsförhållanden.
Abstract
In situ övervakning i mikrobiella bioprocesser är oftast begränsad till kemiska och fysikaliska egenskaper hos mediet (t. ex.pH-värde och upplöst syrekoncentration). Ändå kan morfologin av celler vara en lämplig indikator för optimala förhållanden, eftersom det förändras med beroende av tillväxt tillstånd, produkt ackumulering och cell stress. Dessutom ger encellig storleksfördelning inte bara information om odlingsförhållandena, utan också om befolkningens heterogenitet. För att få sådan information utvecklades en fotooptisk in situ -mikroskopi enhet1 för att möjliggöra övervakning av encelliga storleksfördelning direkt i cellsuspensionen i bioreaktorer. En automatiserad bildanalys är kopplad till mikroskopi baserat på en neurala nätverk modell, som är utbildad med användare-kommenterade bilder. Flera parametrar, som erhålls från fångar av mikroskopet, är korrelerade att bearbeta relevanta funktioner i cellerna, som deras metabolisk aktivitet. Fram till nu, den presenterade in situ mikroskopi sond serien tillämpades för att mäta pelleten storlek i trådformiga svampar suspensioner. Det användes för att skilja Single-cellstorlek i mikroalger odling och relatera det till lipid ackumulering. Formen på cellulära partiklar var relaterad till spirande i jästkulturer. Mikroskopi analys kan i allmänhet delas upp i tre steg: (i) bild förvärv, (II) partikel identifiering, och (III) dataanalys, respektive. Alla steg måste anpassas till organismen, och därför krävs specifik kommenterade uppgifter för att uppnå tillförlitliga resultat. Förmågan att övervaka förändringar i cellmorfologi direkt i linje eller på rad (i en by-pass) möjliggör realtidsvärden för övervakning och kontroll, i processutveckling samt i produktionsskala. Om off line data korrelerar med realtidsdata, den nuvarande tråkiga off linje mätningar med okända influenser på cellstorleken blir onödigt.
Introduction
Morfologiska egenskaper hos celler är ofta relaterade till fysiologiska tillstånd, en koppling mellan form och funktion finns för många program. Morfologin av en enda cell påverkas av tillståndet av tillväxt, cellens ålder, osmotiska och andra potentiella cellspänningar eller produkt ackumulering. Morfologiska förändringar av celler är ofta ett mått på tillväxt livskraften i en kultur. Intracellulär produkt syntes, lipid ackumulering i alger och inkludering organ formation i bakterier, bland annat, är relaterade med cellstorleken samt. Cell tätorten kan vara en annan faktor som är värt att utreda som sammanfattas nyligen2.
Befolknings heterogen kan kvantifieras baserat på morfologiska egenskaper hos enskilda celler. Studier visade att heterogenitet inom en kultur kan vara betydande, till exempelunder storskaliga produktionsvillkor3 den totala avkastningen kan påverkas av en låg prestanda av subpopulationer4.
Vanligtvis utförs bedömningen av cellernas morfologiska egenskaper genom manuell provtagning eller med en flödes kammare kopplad till en fotooptisk enhet. Detta leder till flera restriktioner: den begränsade mängden förvärvade data kan knappast ge statistiskt tillförlitliga mätningar; tidsfördröjningen mellan provtagning och resultatens tillgänglighet kan vara för lång i jämförelse med processens dynamik. och viktigast av allt är att provtagningsförfarandet (provtagnings hamnens lokalisering, förbehandling av provet före mätningen, ogynnsamma förhållanden i provtagnings-eller bypass-röret) kan utlösa ett partiskt fel eftersom själva urvalsförfarandet redan kan påverka cell Morfologi. Slutligen finns det alltid en hög risk för kontaminering under provtagning eller i by-pass lösningar, om de inte är steriliserbara på plats.
Tillämpningen av in situ -mikroskopi (ISM) kan kringgå flera av dessa problem. Om celler upptäcks automatiskt kan en korrekt identifiering av deras morfologiska egenskaper undersökas5. Fram till nu var de huvudsakliga begränsningarna i denna metod (i) utvärderingstiden för bilder, som var för lång för in situ -tillämpningar, och (II) den dåliga upplösningen av bilder, särskilt vid höga cell tätheter. Även om de första lösningarna av ISM inkluderade Mekanisk provtagning, utspädning av sonden, eller begränsades till ett by-pass system6,7, ytterligare metoder tillåta avskiljning av cellsuspensionen direkt8.
De senaste framstegen inom ISM gör det möjligt att i linje eller på rad övervaka celler på en enda cell basis, vilket ger fördelningen av morfologiska parametrar i realtid direkt i cellsuspensioner vid betydligt höga cellkoncentrationer. Genom off line analyser av cellernas nyckelparametrar kan korrelationer med information som tillhandahålls av den kopplade automatiserade cell detekteringen och ISM identifieras. Sedan, nya mjuk sensor design uppnås, där en omätbar parameter uppskattas med Single-cell morfologi.
I denna rapport, ISM utförs genom att koppla en foto optisk sond till en automatiserad bildanalys. ISM består av en enda stång sensor sond som gör det möjligt att fånga bilder inom ett känt fokusområde i ett justerbart mått Gap med en högupplöst CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) och MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Blixt belysningen leds av transmission. Därför kommer ljuset från motsatt sida av kameran9 och dess intensitet kan justeras. Celler passerar kontinuerligt genom denna lucka med vätskeflödet. Därför erhålls en representativ prov population. Sonden kan monteras direkt på bio reaktorn så att den når in i cellsuspensionen, eller den kan användas i en steriliserbar by-pass. Sensor skalet är anslutet till systemet före sterilisering, de optiska delarna monteras efteråt i skalet.
Fram till nu, relevanta industriella mikroorganismer, t. ex., trådformiga svampar (diameter på upp till över 200 μm), den heterotrofiska mikroalger Crypthecodinium cohnii (genomsnittlig cell diameter på 20 μm), och jästen Saccharomyces cerevisiae (genomsnittlig cell diameter av 5 μm), undersöktes med denna eller liknande enheter, som kort beskrivas.
Filamentösa svampar tenderar att bilda pellets under vissa odlingsförhållanden. Dessa är av en storleksanpassa av upp till flera hundra μm. Den hyfer av svampceller utveckla olika längder i beroendet av den hydrodynamiska stressen i vätskefasen. Detta har en inverkan på metabolisk och tillväxt aktivitet, substrat upptag och produkt release. ISM tillämpades för att identifiera pellets storleksfördelning och bredden av zoner med lägre biomassa densitet vid kanterna av pellets (egna opublicerade data).
Storleken på C. cohnii förändrar mellan 15 och 26 μm när cellerna ackumuleras den fleromättade fettsyran dokosahexaensyra (DHA) under kväve begränsning. Denna bioteknologiska DHA produktionsprocess består av två delar, tillväxtfasen, där cellerna delar sig och blir mindre, och produktionsfasen, där celler ackumulerar produkten och därmed blir större. Därför användes cellstorleken för att bestämma process tillståndet, där antingen tillväxten eller DHA-produktionen var gynnsam. Slutligen hittades ett samband mellan cellstorleken och DHA-innehållet. I detta fall, ISM gör det möjligt att övervaka den intracellulära DHA ackumulering i realtid utan krav på provtagning, cell störningar, och den gemensamma gaskromatografi analys10.
Spirande jäst är vanligtvis av en storlek mellan 3 och 8 μm. Andelen celler som är i mogningen tillstånd i taget, som beskrivs med spirande index (BI), ger information om tillväxt vitalitet11,12, och även en relation med rekombinant protein sekretion har bevisats13. Med hjälp av ISM var blivande och icke-spirande jästceller (celler med och utan knopp) distingerade14. Stress villkor kan också leda till en bredare variation av Cellstorlek inom en jäst population, som nyligen visas i skala ner odlingar, där villkoren för storskalig näringsämne-begränsad Fed-batch odlingar härmade3.
Därför har ISM potential att övervaka tillväxt vitalitet och produkt bildning på en enda cellnivå under alla stadier av en Bioprocess för identifiering av optimala odlingsförhållanden, eller för ändamålet med processtyrning. De metoder som beskrivs här är inriktade på mikrobiella tillämpningar med enstaka celler, men är också tillämpliga på större partiklar som mänskliga och animaliska celler, cell agglomerater och pellets av trådformiga organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: följande steg är nödvändiga för att anpassa parametrarna till respektive mikroorganism och odlingsförhållanden. Justeringen av avsöknings inställningarna varar ca 20 min för en erfaren användare. En detaljerad beskrivning av verktyg och steg ges i motsvarande sond manual från SOPAT GmbH. I allmänhet behövs de verktyg som presenteras i följande protokoll: (i) sond Controller för sond justeringar och bild förvärv; (II) Fiji (ImageJ) för anteckningar om förvärvade bilder; (III) sopat stöd för artificiell neurala nätverk (Ann) utbildning och arbetsflöde skapande; (IV) Batcher för data satsvis bearbetning med hjälp av redan förvärvade bilder med ett arbetsflöde; (v) Resultatanalysator för resultat visualisering och utvärdering på batchbearbetade bilder; och (vi) Monitor för automatiserad realtidsmätning och resultat visualisering.
1. ställa in maskinvaruparametrar
- Förbered en kultur med den högsta cellkoncentrationen som kan uppnås under experimentet eller Centrifugera och Omsuspendera pelleten för att uppnå denna koncentration. I detta fall, 65 g L-1 av torr biomassa koncentration valdes för S. cerevisiae odlingar.
- Förbered olika utspädningar, som sträcker sig från den högsta till den lägsta koncentrationen så att det förväntade intervallet är helt täckt. Minst 4 olika koncentrationer rekommenderas.
- Identifiera cell storleksintervallet för mikroorganismen med konventionell mikroskopi. Definiera den förväntade maximala diametern (dMax) för respektive celler. Detta värde är inställt på 8 μm vid S. cerevisiae.
- Välj två mät luckor på 5x och 10X av den förväntade dMax av cellerna.
- Välj maximal stroboscopen-intensitet. Välj stroboskop-intensiteter för båda luckorna med den högsta cellkoncentrationen så att cellerna fortfarande syns på bilderna med den lägsta ljusintensiteten (de mörkaste bilderna).
- Välj minsta stroboskop-intensitet och välj sedan stroboskop-intensiteter för båda luckorna så att cellerna fortfarande är synliga på bilderna med den högsta ljusintensiteten (ljusaste bilder). Använd den lägsta cellkoncentrationen, som sannolikt visas under mätperioden.
- Välj en fokus position, som ger de skarpaste bilderna för varje Mät gap, för både stroboskop-intensiteter och för koncentrationsintervallet som behöver testas (se steg 2 för detaljer om fokusering). Fokus celler på lämpligt sätt så att bilddata kan kommentas efteråt (se steg 4).
- Mät den tidigare preparerade utspädnings serien för cellkoncentrationen (se steg 2) med både spaltbredder och stroboskop-intensiteter.
Bild 1: verktyget för koncentrations kalibrering. Vänster GUI: Ställ bild kataloger (minst 3) med kända koncentrationer; Central GUI: Välj funktioner som ska beräknas på bildkatalogen; rätt GUI: Välj den viktade roten medelkvadratfel (WRMSE) för att identifiera minimum. WRMSE och det bästa sambandet mellan någon bild funktion och cellkoncentrationen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Utvärdera experiment i utspädnings serien.
- Använd verktyget för koncentrations kalibrering (CoCa) (se figur 1) för att identifiera det optimala sambandet mellan de extraherade bildfunktionerna (ljusstyrka eller skärpa) och de tidigare uppmätta koncentrationerna som tillhandahålls av användaren, till exempeltorr biomassa eller cellräkning. Följ instruktionerna i programvaruhandboken för mer information.
- Identifiera den optimala korrelationen mellan den extraherade informationen från bildfunktionerna vid olika koncentrationer jämfört med eventuella off line -mätningar. Se legenden i figur 1.
- Välj det mest rimliga Mät gapet och stroboskop-intensiteter under övervägande av koncentrations korrelations kurvan med de funktioner som resulterar i det minsta viktade roten medelkvadratfel (WRMSE).
Anmärkning: Mät gapet är fixat under experimentet, medan stroboskopintensiteten kan anpassas efter cellkoncentrationen.
2. off linje mätning
- Justera önskat Mät gap enligt steg 1 med hjälp av en tjockleksmätare.
- Öppna den grafiska användargränssnittet sond kontroll i sopat Dashboard.
- Anslut önskad sond till förstärkaren i programunderavsnittet åtgärder och tryck på Connect.
- Tryck på uppspelnings knappen för att starta streaming (livevisning).
- Rengör Mät gapet genom att spraya etanol i gapet och torka försiktigt damm eller smuts med ett optiskt papper. Kontrollera att glaset på sensorn är fritt från partiklar med Live View i camcontrol.
Observera: partiklar och damm stör mätningar och automatisk cell identifiering. - Placera ett torrt optiskt papper i Mät gapet. Öppna fliken sond kontroll och justera stroboscopen intensitet för att visualisera papperet. Vrid bindnings skruven tills den enda fibrer av papperet är tydligt sett.
- Fyll en tub med kultur buljong. Doppa mikroskopet i odlings buljong så att gapet är helt täckt med cellsuspension. Öppna fliken sond kontroll och justera önskad stroboskop intensitet enligt avsnitt 1. Fokusera på cellerna genom att finjustera fokus bindnings skruven. Fokus får inte ändras längre under experimentet
Anmärkning: 5-6 mL odlings buljong tillsätts till ett 50 mL koniskt centrifugalrör för att flyta Mät gapet tillräckligt. - Definiera antalet bildrutor per tidpunkt [-] i användargränssnittet i menyn som utlöser i GUI- ramar per utlösare. Ange antalet bildrutor till 200 bildrutor per utlösare.
Obs: antalet bildrutor kan reduceras till det lägsta värdet, vilket är nödvändigt för ett statistiskt tillförlitligt resultat. Detta beror på den urvalsstorlek som krävs för att erhålla en representativ morfologisk cell storleksfördelning (se även steg 5). - Definiera bildrutefrekvensen [Hz] i menyn som utlöses i GUI- ramhastigheten. Välj en bildrutefrekvens som garanterar att rörliga partiklar från en tidigare bildruta inte visas i följande bildruta.
Anmärkning: Detta kan bevisas med en test utlösare med 200 ramar. Inspektera bilderna för partiklar, som fångas upprepade gånger. Om så är fallet minskar du bildrutefrekvensen. För off line -mätningar rekommenderas 1 Hz. - Ange katalogen, där de förvärvade bilderna kommer att sparas, i menyn Allmänt.
- Utför en bild anskaffning genom att aktivera knappen Start bild trigger förvärv . Flytta röret med kultur suspensionen försiktigt upp och ner för att inducera ett flöde genom Mät gapet.
- Upprepa steg 2,5 efter varje mätning.
- Kontrollera de förvärvade bilderna. Celler måste vara skarpa nog för anteckning. Inspektera bilderna för partiklar, som fångas upprepade gånger. Om så är fallet minskar du bildrutefrekvensen.
- Spara inställningarna genom att välja följande väg: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol, och tryck på Spara.
3. partikel identifiering
- Kommentera partiklar för utbildning av artificiell neurala nätverk (ANN) (utbildning set).
- Ladda de förvärvade bilderna i anteckningsverktyget "Fiji, ImageJ" genom att dra och släppa filen i huvudfönstret "imagej" (se GUI "Fiji" verktyg i figur 2)
- Öppna ROI-hanteraren genom att välja: analysera | Verktyg | ROI-ansvarig.
- Välj ett markeringsverktyg. Verktyget Trollstav (spårning), FreeHand, oval eller elliptisk markering rekommenderas.
- Rita en cirkel runt partikeln som ska förses med de markeringsverktyg som nämnts tidigare och sedan förfina den med penselverktyget.
- Lägg till anteckningen i ROI-hanteraren genom att trycka på Lägg till [t].
- Markera alla objekt av intresse (celler som ska identifieras) på cirka 15 bilder.
Anmärkning: för att täcka all nödvändig information, dvs olika former, storlekar, koncentration av celler, ljusstyrka, etc., använda fem bilder från början, fem bilder från däremellan, och fem bilder från slutet av experimentet. - Bestäm, om celler måste klassificeras i olika underklasser på grund av sin form (t. ex.olika faser i en cell cykel), eller om alla celler är av samma klass.
- Ändra namnet på varje vald partikel i enlighet med detta. Ange ett namn eller en förkortning för varje klass och en räknare för varje partikel klass (t. ex.cell_1, cell_2 etc.). Kommentera minst 50 partiklar per klass.
- Anteckna inte objekt, som inte bör upptäckas, eftersom de inte är relevanta för processen, såsom gasbubblor eller andra partiklar som oupplösta Media komponenter.
Obs: dessa händelser kommer inte att ingå i utbildnings förfarandet för ANN och betraktas som bakgrund. - Kommentera inte celler som inte är i fokus.
- Kommentera bilderna så konsekvent som möjligt. Om det finns tvivel kan etiketten Ignorera användas. Det rekommenderas starkt att inte missbruka dess användning, eftersom ANN kommer bara att erkänna strukturer som är märkta.
Bild 2: Fiji verktyg användargränssnitt. En tränings uppsättning skapas med de kommenterade bilderna. En manuell anteckning som består av två klasser avbildas visas listan över kommenterade partiklar i ROI-hanteraren. Olika namn och färger kan ställas in för olika klasser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Spara de kommenterade objekten och bilden i ett ZIP-format och skicka filen till utbildnings nätverket, antingen via uppladdning till plattformen eller genom att skicka zip-filen via e-post.
Observera: vanligtvis tar det ett antal iterativa träningsrundor för att identifiera lämpliga förutsägelser om de klassificerade objekten på bilderna. Varje träningsrunda leder till ett arbetsflöde som returneras av programmet. - Använd arbetsflödet (*. WF) med den tränade objektet erkännande algoritm för att analysera test avbildningar med data batch fortskrider program Batcher som kan startas i instrumentpanelen.
- Kontrollera Objektidentifieringen på test bilderna genom att kvantifiera falska positiva och negativa händelser.
- Kvantifiera identifieringen av falskt positiva händelser: partiklar som felaktigt detekterats som celler, celler som inte är korrekt klassificerade och celler som inte har konstaterats väl.
- Kvantifiera de falska negativa händelserna (celler som inte känns igen som sådana).
- Visualisera resultaten i verktyget resultat Analyzer genom att starta programmet i instrumentpanelen.
- Importera önskade resultatfiler med fil | Importera fil eller fil | Importera mappar.
- Visualisera resultaten efter diagram | Skapa diagram på diagrammets GUI.
- Välj ett av följande alternativ: fördelningsdiagram, känslighet Plot, karakteristiska över tid, karakteristiska över undersöknings punkter och funktion kontra funktion.
Obs: en manual om användningen av Resultatanalysatorn kommer med systemet och är även tillgänglig från supporten. - Om resultaten är acceptabla, kör arbetsflödet i Batcher på alla förvärvade avbildningar av experimentet. Samtidigt då övervakningsprogrammet kan skapas genom att kombinera de sparade inställningarna från sonden Controller (*. pcfg) med arbetsflödet (*. WF), se även manualen.
Arbetsflödet kan också användas för att övervaka framtida experiment för kultur mediet. - Om resultaten inte accepteras, kontrollera anteckningen på tränings uppsättningen och/eller Fortsätt med en annan iterativ träningsrunda (se steg 4,2).
4. kvantifiering av urvalsstorlek
- Ställ in standardavvikelsen (σ), som är godtagbar bland de upptäckta partiklarna.
Anmärkning: standardavvikelsen ändras parallellt med cellens storlek homogenitet. Den maximala standardavvikelsen indikerar provet med den högsta graden av storlek heterogenitet. - Ställ in amplituden för konfidensintervallet eller önskad noggrannhet i förhållande till den förväntade variationen av mätningar (e).
- Ställ in det vedertagna felet (α) mellan 5% (z1-α/2 = 1,96) och 10% (z1-α/2 = 1,64).
- Beräkna antalet celler som ska identifieras från varje klass från ekvation 1.
[Ekvation 1]
ANMÄRKNINGAR: baserat på antalet celler kan antalet bilder som behöver förvärvas definieras för varje datapunkt. - Utföra en känslighetsanalys på slumpmässiga tidpunkter i experimentet för att kontrollera att analysen av n-partiklar leder till en variation av medelvärdet för FERET-diametern och Dv90 på mindre än 5%. Den kan beräknas automatiskt i Resultatanalysatorn.
[Ekvation 1]5. on-line (by-pass) eller i linje mätning
- Utför den off line mätning proceduren först (se steg 2) för att ställa in maskinvaru-och programvara inställningar som en funktion av organismen och processen (koncentration eller media).
- Ladda upp de sparade inställningarna från föregående avsnitt genom att välja knappen load och välj följande väg: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol.
- Anslut sonden till flödes cellen eller till bio reaktorn.
Obs: in situ mätningar kan utföras med en nypa fläns. - Utför sterilisering.
Anmärkning: endast det sond-fuktade materialet i instrumentet är Steriliserbart genom ångsterilisering. Sonden fuktade längd kan gå från 6 till 222 mm (figur 3).
Figur 3: skiss av ISM-enheterna. Sonden MM-Ho (a) är installerbar direkt i bio reaktorn, medan sonden mm 2,1 (B) kan användas som en by-pass. Kultur buljong cirkulationen är markerad med pilar i varje bild. Konverteringsfaktorerna är 0,166 μm pix-1 för mm-Ho och 0,087 μm pix-1 för mm 2,1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Definiera bildens anskaffningsvärde i det GUI som utlöser i fält utlösarintervallet [s].
Beroende på processdynamiken kan bildens förvärvsfrekvens anpassas. Till exempel, om en lag-fas på 3 timmar förväntas, kan förvärvsfrekvensen vara lägre, än om en metabolism Skift eller ackumulering av en produkt ska övervakas. Vanligtvis kräver detta en mycket kortare förvärvs tid i minut intervallet. Till exempel, en bild förvärv sekvens mellan 5 och 10 min under en batch jäst odling ger tillräcklig information för att fånga processdynamik. - Definiera bildrutefrekvensen enligt beskrivningen i steg 2,10.
Obs: i on line och i linje mätningar, kan bildhastigheten ökas, eftersom den mekaniska omrörning kan öka flödet genom gapet. - Starta bild anskaffning genom att aktivera knappen Starta streaming av vald sond.
- Stoppa förvärvet när experimentet är klar med knappen stoppa streaming av valda sonden.
Anmärkning: för 1St kör, starta förvärvet strax före inympning av kulturen och gå vidare till steg 4. För följande körningar, öppna program övervakningen i instrumentpanelen och välj det skapade arbetsflödet (se steg 4). Starta övervakningen strax före inokuleringen av kulturen genom att trycka på Play -knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cell storleks upptäckten i jästkulturer med ISM och automatiserad bild detektering för att skilja mellan spirande och icke-knoppade celler genomfördes framgångsrikt. Både stroboskopintensiteten och valet av mät gap har en rad tolerans, där partikel identifieringen inte påverkas. Till exempel, S. cerevisiae celler mättes med olika stroboskop intensiteter inom ett variationsintervall på 11% vid en torr biomassa koncentration av 4 g L-1. Motsvarande bilder gav skarpa cell gränser, därför var partikel identifieringen möjlig med en godtagbar variation av cellstorleken (1%) oavsett stroboskop intensitet. Om stroboskopintensiteten inte är korrekt justerad, utsätts bilderna för överbelysning och en korrekt cell identifikation kommer inte att vara möjlig (figur 4).
Figur 4: funktioner för bild förvärv. Exempel på olika stroboskop-intensiteter (SI-%) och mät luckor (MG-μm) för att fånga S. cerevisiae celler (nuvärdet av Si och mg anges inom parentes): a (25, 50); B (50, 50); C (25, 80); och D (50, 80). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Hittills kan inte Mät gapet omjusteras under en in situ -mätning. Därför är utspädnings seriens experiment avgörande för att garantera tillförlitlig data genom odling. Det huvudsakliga problemet är förekomsten av oidentifierade överlappande händelser på grund av ökningen i cellkoncentrationen.
En känslighets profil (känslighetsanalys av karakteristiska värden, t. ex.genomsnittlig cell diameter med avseende på partikel nummer n) för alla upptäckta celler från den inlästa datafilen kan visualiseras (figur 5). Användaren måste bestämma vilken stabilitet för en viss processparameter som behövs. I det här fallet det minsta antalet celler som behövs för en giltig datapunkt. Följaktligen kan mer eller mindre bilder analyseras för en datapunkt.
Figur 5: komplott med genomsnittlig känslighet för cell diameter. Variationen av den genomsnittliga cell diametern i beroende av antalet upptäckta partiklar. Ett konstant värde av den genomsnittliga cell diametern uppnås med cirka 1 000 celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Anteckningen är den viktigaste punkten för att uppnå den önskade noggrannheten av partikel identifieringen. Figur 6 visar ett exempel på en "användar anteckning" (a), som används som en utbildning för neurala nätverk, samt partikel identifiering på en bild av testuppsättningen (okända data för neurala nätverk), som används för sin utvärdering (B). Båda bilderna bör ha en liknande frekvens av identifierade händelser.
Figur 6: jämförelse av användar anteckning (tränings uppsättning) och automatisk detektering (testuppsättning). Tränings uppsättning: kommenterade och originalbilder avbildas i a, och a, respektive. Informationen i den här bilden används för att träna ANN. test uppsättning: arbetsflödet som skapats efter träning ANN tillämpas på fångar, som inte har använts för utbildning: automatiskt identifierade celler (visas i b) från den ursprungliga Capture B. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som ett exempel på effekten av intracellulär produkt ackumulering på cell storleksfördelning, ackumulering av fleromättade fettsyror dokosahexaensyra (DHA) genom kväve begränsning undersöktes i heterotrofiska mikroalger C. cohnii. Det visades att ackumuleringen av produkten kan upptäckas kvantitativt med hjälp av ISM10. Metoden används för närvarande för att undersöka effekten av skjuvkrafter i omrörda bioreaktorer på cellernas morfologiska heterogenitet.
Mogningen tillstånd av spirande jäst S. cerevisiae kvantifierades. När det gäller spirande, den andel av celler som är i mogningen staten i taget (beskrivs med BI), ger information om tillväxt aktivitet och befolknings heterogenitet. Den automatiska cell igenkänning kunde identifiera och särskilja blivande och icke-spirande (eller dotter) celler framgångsrikt i cellsuspension15. Cell storleksfördelningen för tre prover visas i figur 7. En förskjutning till mindre celler indikerar en lägre andel av spirande celler inom populationen.
Figur 7: Kumulativ encellig storleksfördelning. Cell storleks fördelningar mätt under tidsförloppet för en odling vid 3 h (rak linje), 7 h (prickad linje) och 13 h (streckade linjen). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ISM som presenteras här med samma eller mycket liknande anordningar användes för att mäta morfologisk dynamik av svampar, mikroalger, och jästceller, vilket möjliggjorde bestämning av tillväxt aktivitet, och i händelse av alger, intracellulär produkt ackumulering. Sensorn har inga rörliga delar och är direkt tillämplig i någon vanlig omrörd tank bioreaktor, antingen genom en standard port eller i en steriliserbar by-pass. Eftersom jäst är mycket mindre än alger, minskning av Cellstorlek krävde några nya hårdvaruadaptioner som en högre kamera upplösning och belysning genom överföring för att få en tillräcklig Pixel upplösning av jästen (för tekniska detaljer, se15). Men det finns fortfarande en begränsning för att mäta ännu mindre celler som bakterier. Den nuvarande in situ Photo-optisk instrumentering indikerar begränsningar avseende överlappande partikel information i hög koncentration och störningar effekter med strukturer under UV/VIS spektrum. Uppdaterad, bildanalys algoritmer för bakterie suspensioner har inte tillämpats, bortsett från ljusstyrka korrelationer16.
Andra tidigare tillämpade ISM-verktyg användes för att bestämma cellkoncentrationen för att visa deras tillförlitlighet. Detta blev dock avgörande om cellerna överlappade varandra vid förhöjda koncentrationer. Därför var fokus i denna studie inte cell kvantifiering, men morfologisk funktions detektering, medan bildfunktioner som intensitet kan korreleras till CELLTÄTHETEN som utförs med andra enheter, för17. Annars skulle alla dessa anordningar begränsas till låga koncentrationer av celler; en maximal koncentration av ca. 20 g L-1 av jästceller utvärderades när du använder en metod för cell igenkänning jämfört med ca 80 g l-1 när du använder en algoritm för klusterstorlek.
För att kunna spåra morfologiska egenskaper hos en cell måste dess kanter upptäckas korrekt. När det gäller alger, är detta ganska enkelt som storleken ändras, men formen förblir konstant under hela övergången av processteg. Däremot jästceller ger en större utmaning på grund av sin form, som inte kan approximeras till en sfär eller ellips när cellerna spirande. Ändå, tills nu cellstorleken beräknades under antagandet att en cell är en perfekt sfär i ISM mätningar18. Även om denna tillnärmning är nära verkligheten i vissa fall, kan mer komplicerade former som spirande celler eller stavformade celler inte bedömas på rätt sätt. I den här studien analyserades dock olika former med framgång tack vare den flexibla gräns identifieringen som möjliggörs genom maskininlärningsalgoritmer. Dessutom är överlappande händelser fortfarande under utredning19 för att uppnå ett ytterligare utvecklingsstadium.
För närvarande är guldmynt-standarden för vitalitet och lönsamhet bedömning att räkna Colony Forming enheter eller att färga ett prov med en livskraftig färg20, e.g., metylenblått eller metylenviolett21; Detta förfarande kan dock påverka resultaten. Närhelst sådana funktioner är relaterade till cellens morfologi22, potentialen att snabbt bedöma dem bör utforskas av den ökande potentialen av ISM. Dessutom kan kritiska processparametrar och/eller kvalitetsattribut23 relateras till form, tätbebyggelse och pelletbildning, som alla kan övervakas av ISM.
Utredningar med andra viktiga mikroorganismer som ofta används i Bioprocess utförs för närvarande. Tiden för anpassning av algoritmer för objektigenkänning och funktionen extraktion för funktionen analys beror främst på komplexiteten i bilderna och förväntad noggrannhet av resultaten. I framtiden kommer färgad bildfångst att övervägas för att ytterligare bredda utbudet av information, som kan erhållas på en enda cellnivå, t. ex., om pigment ackumuleras eller i genetiskt modifierade organismer, där färgade markörer integrerades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för stödet från det tyska federala ministeriet för ekonomi och energi inom ramen ZIM-Koop, projektet "Smart process Inspection", Grant No. ZF 4184201CR5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor MM 2.1 - MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
References
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
