Summary
Белощекая балянусы (Amphibalanus) improvisus представляет собой модель для изучения осморегуляция и необрастающие. Однако природных сезонных нереста дает непредсказуемые питания личинок cyprid. Здесь описан протокол для культивирования круглый год б. improvisus , включая производство личинок. Иллюстрируется использование искусственного ракушки в исследованиях выражения гена.
Abstract
Ракушки, морские ракообразные с сидячими взрослого и свободноплавающих, планктонные личинки. Белощекая балянусы (Amphibalanus) improvisus особенно важна как модель для исследования osmoregulatory механизмов из-за его крайней толерантности к низкой солености. Он также широко используется как модель урегулирования биологии, в частности применительно к необрастающие исследований. Однако природных сезонных нереста дает непредсказуемые питания личинок cyprid исследований. Протокол для культивирования круглый год б. improvisus была разработана и подробное описание всех шагов в линии производства изложена (то есть, создание взрослых культур на панели, коллекции и воспитание белощекая личинок и администрация корма для личинок и взрослых). Это описание также предоставляет руководство по устранению неполадок и обсуждает критических параметров (например, удаления загрязнений, производства высокого качества кормов, необходимых людских ресурсов и важность высокого качества морской воды). Каждый пакет от культивирования системы максимально дает примерно 12 000 хитиновой и может доставить четырёх партий в неделю, так что до почти 50 000 личинок в неделю могут быть произведены. Метод, используемый для культуры B. improvisus является, вероятно, в значительной степени также применимы для других морских беспозвоночных с свободной swimminglarvae. Протоколы представлены для вскрытия различных тканей от взрослых, а также производство высокого качества РНК исследований на экспрессию генов. Это также описан как искусственный взрослых и воспитал cyprids могут быть использованы в широком массиве экспериментальных проектов для изучения экспрессии генов по отношению к внешним факторам. Использование искусственного ракушки в экспрессии генов иллюстрирован исследования возможных ролей osmoregulatory Na++ АТФаза /K и аквапоринов.
Introduction
Ракушки, морские ракообразные с сидячими взрослого и свободноплавающих, планктонные личинки. Большинство из 1200 видов ракушки населяют мелкой воде и многие часто подвергаются воздействию низкой солености. Один из видов, Барнакл Бэй, импровизирует балянусы (Amphibalanus) (б. improvisus), может терпеть почти пресной воды и Чарльз Дарвин описал этот вид от небольшой ручей в устье Рио-де-ла-Плата в Уругвай1. Соленость tolow экстремальных терпимости делает B. improvisus модель особенно актуально для исследования механизмов osmoregulatory2,3. Этот белощекая предпочитает солоноватых условиях, но способного жить в водах с солёностью от около 1.6 psu до уровня 40 питания4. Это единственный белощекая, обитающих в солоноватое Балтийское море. B. improvisus как полагают, происходят из Восточного побережья Американского континента, но сегодня встречается во всем мире благодаря разгон судоходства5. Это является крупным загрязнения организма и часто встречающиеся на скалах, пристаней и корпусов лодок и поэтому общий интерес для понимания механизмов биообрастания на конструкции в морской и солоноватой воды6,7.
Как и большинство других ракушки, б. improvisus гермафродиты с взаимного обогащения; Размножение происходит путем спаривания между соседними лица, используя удлиненные пенис и внутреннее оплодотворение. Репродуктивный период является главным образом с мая по сентябрь. B. improvisus имеет семь пелагических личиночной стадии (шесть хитиновой следуют один cyprid этап8). Оплодотворенное яйцо люки в nauplius личинка, которая свободноплавающих и каналы в столбце воды до нескольких недель до линьки в-кормления личинок cyprid. Cyprid использует несколько подсказок, чтобы найти подходящее место поселиться и затем подвергается метаморфозы в скальный несовершеннолетних белощекая9. Видов может быть культивировали в лабораторных условиях и имеет срок службы от 1 – 2 лет в море (2-3 лет в лаборатории культуре). В среднем б. improvisus вырастает до 10 мм в диаметре (с максимумом около 20 мм) и достигает максимальной высотой около 6 мм (хотя он может расти выше при стесненных условиях). Виды могут быть определены его гладкая известняковых даже оболочки (белый или сероватый), радиально узорной известняковых база пластины корпуса и форма спинной пластины1,10.
Белощекая B. improvisus имеет несколько выгодных возможностей как модель для изучения осморегуляция, с акцентом на молекулярных и физиологических механизмов, а также экологических взаимодействий и эволюционной последствия. Он также широко используется как модель для расследования урегулирования биологии, в частности применительно к необрастающие исследований и механизмов вовлеченных в7,11,12,13. Однако природных сезонных нереста дает непредсказуемые питания личинок cyprid исследований. Возможность круглый год культуры этот белощекая через весь жизненный цикл является, таким образом, основным активом для включения различных типов молекулярной и механистические исследований. Кроме того его присутствие в морской/солоноватых водах по всему миру позволяет сочетание полевых и экспериментальных исследований. Контролируемое разведения может также производить семей известных родословных для долгосрочного культивирования14, и поколения время несколько месяцев может позволить долгосрочной экспериментальной эволюции. Имеется также проект генома и несколько transcriptomes, и эти ресурсы были использованы для клонирования нескольких генов (например, генов значение osmoregulation)2,3.
Цель настоящего Протокола заключается в описывают, как создавать и поддерживать культуру белощекая б. improvisus в течение года для того, чтобы выполнять исследования выражение гена на взрослых или личинок этого организма. Rittschof и др. 15 кратко описал метод для культивирования ракушки из выпуска хитиновой поселение cyprids видов балянусы Амфитрита. Протокол был адаптирован для культивирования круглый год б. improvisus в Tjärnö, морской научно-исследовательской лаборатории (Швеция), и приводится подробное описание всех шагов в линии производства, включая производство и воспитание белощекая личинки, а также администрация корма для личинок и взрослых. Обзор полного процедуры см. Рисунок 1. Использование системы культивирования является примером с некоторых общих экспериментальных установок и показано в исследованиях функциональной геномики Na++ АТФаза /K и аквапоринов, выяснения их возможные функции осморегуляция2, 3. Иногда важно, чтобы рассмотреть выражение гена в определенных тканях, и некоторые из основ белощекая диссекции будут покрыты. С хорошим запасом высокого качества морской воды культивирование белощекая б. improvisus, и потенциально многих других видов, должно быть возможным в морских лабораторий во всем мире.
Protocol
1. сбор взрослых ракушки в поле, чтобы начать новый Broodstock
-
Развертывание термопласт (поли-метилметакрилат) прозрачные панели (110 x 110 x 1,5 мм3) на ≈ 1 – 3 м глубины в спокойных водах для того, чтобы собирать ракушки взрослых из поля. Использование кадров, которые могут занять несколько панелей (рисA), 2 отверстия (диаметром 6 мм) в верхнем углах каждой группы и attachthepanelstotherackusingcableties. Таким образом thepanelswillhangverticallyin воды.
- При поселении ракушки произошла (определены как небольшие белые жесткий точки на панели), оставьте панелей для по крайней мере 2-3 недели, чтобы убедиться, что ракушки большой достаточно (5 мм) могут быть переданы в лабораторию без получения сушеные или повреждены.
- Принесите панелей в лабораторию, когда они покрыты поселились б. improvisus , достигли размера ЦС. 5 мм indiameter.
Примечание: Время для взрослых развить до 5 мм в поле сильно зависит от наличия продовольствия и температуры. Как правило, это занимает около 3 недель в морской научно-исследовательской лаборатории Tjärnö (58.87 с.ш., 11.14 ° E). Чаще всего панели для новых broodstock обычно развертываются в конце июня и собраны в конце августа. - Перед внедрением панелей в объекте культуры, очистите других организмов от панелей. Наиболее важно удалить другие виды белощекая. Пожалуйста, обратите внимание, что важно часто чистить панели, чтобы избавиться от загрязняющих видов во время выращивания, так как это значительно повысит шансы на выживание broodstock.
- Разместите панели вертикально на краю в стенд с фрезерованные пазы в подносе полиэтилена (400 x 400 x 20 мм3) (цифры 2 c и 2E). Канавки на стенде являются 15 мм друг от друга.
- Чтобы подготовить лотки, сделайте вход порт на базе и порт выхода на вершине на противоположной стороне каждого лотка. Подключите порт входа каждого лотка 100 L водохранилище, содержащий около 30 Л воды с входом открытой морской воды при 20 ° C разрешить через потока со скоростью около. 2 Л / мин.
Примечание: До 8 лотков были подключены к одной водохранилища 100 Л. - Подключите водохранилища 100 Л к контролируемой температуры морской воды (20 ° C) (например, предоставляемые обмена тепла от входящей морской воды теплового насоса).
Примечание: Белощекая B. improvisus могут расти и размножаться в полной морской соленость (30 – 35 БП); Однако уменьшение солености в ЦС. 25 psu, добавив пресной воды в водохранилище 100 L увеличивает выход личинок от культуры.
2. Запуск новых поколений взрослых от искусственного Cyprids
- Конструкция кубов термопластичных панелей открыть в верхней лентой 5 панелей, вместе с помощью нетоксичных, водостойкие ленты.
- Место куб в небольшой лоток (в случае утечки) и заполнить его с морской водой (25 psu). Сохранить воду при комнатной температуре (ОК. 20 ° C). Добавьте примерно 200 cyprids в верхней части куба.
- Выкармливают птенцов с 100 мл Skeletonema marinoi каждый день (см. шаг 5) в то время как в Кубе.
Примечание: Несовершеннолетних ракушки может иметь трудности с глотая артемии Салина (см. шаг 3) так как они большие и, следовательно, трудно глотать для недавно поселились белощекая. - Измените воды 1 раз в неделю.
- После 2 недель, когда панели содержат достаточно установленным несовершеннолетних минимум 5 мм в диаметре, разобрать куб и переместить панели с несовершеннолетними лотки с потоком throughseawater и, впоследствии, кормить ракушки с A. Салина хитиновой.
3. Культура науплий артемии Салина как корм для взрослых ракушки
- Создать систему культивирования для а. Салина , используя пластиковую бутылку 1,5 Л где bottomis cut off и бутылка помещается вверх вниз в стенд и освещенной стороны. Соответствовать узким местом в силиконовой трубки с струбциной и прикрепить его к аэрации насоса (рис. 2D).
- Чтобы высиживают яйца, добавьте 1 Л ofseawater около 15 мл сухого отдыхая яиц артемии .
Примечание: Люк яйца артемии в nauplius личинок после 24-48 ч. Задерживать отрождение A. Салина хитиновой (например, в выходные дни), чтобы уменьшить температуру немного можно отключить свет. - Чтобы урожай науплий артемии , выключите аэрации и темнее верхнюю часть бутылки с алюминиевой фольгой (или аналогичных например, can)... Освещения, которые будут плавать в нижней части бутылки для науплий артемии Hatched 10 минут к свету. Кисты не вылупились будет опускаться на дно, и кисты снарядов будет плавать на поверхности.
- Откройте зажим на дне. Соберите промежуточные фракции как высокая плотность населения хитиновой плавательный.
Примечание: Каждый день (кроме выходных), 1 Л густой подвеска науплий артемии вручную добавляется водохранилища 100 Л, подключение к лотки с взрослого ракушки. Избегайте любых кормления с пустой кисты оболочки, так как они не обеспечивают питание и главным образом привести к необходимости чистой культуры в более короткие промежутки времени.
4. сбор и воспитания белощекая личинок
- Очистить панелей с взрослого ракушки, слегка поливая их с пресной водой и, при необходимости, удалите любые загрязнения из Барнакл раковины и панелей, используя мягкую зубную щетку. Кроме того, чистые подносы (без ракушки) и трубы в горячей (75 ° C) пресной воды.
- Место сито из 90 мкм планктон net приклеены к концу отрезанные куски трубы ПВХ (16 см в диаметре, 15 см в высоту) в полиэтиленовой лоток (30 x 20 x 10 см3) с портом переполнения. Соберите B. improvisus личинок в одночасье сито (рис. 2C).
Примечание: Сито был расположен чуть ниже порт выхода лотка белощекая панелей для получения непопадание воды и отфильтровать хитиновой. Личинки оставались в сито, а морская вода захлестнула небольшой лоток. Этот небольшой лоток обеспечивает сито никогда не driedout. - Место ведро 30 Л в большой водяной бане, где поддерживается температура 26 ° c, с использованием Аквариумные рыбы танк нагреватели (Рисунок 2E). Гарантируется, что пузырьков воздуха через систему аэрации и агитации.
- Заполните ведро 20 Л отфильтрованной морской воды (0,2 мкм; 25 psu). Добавьте 1 Л ведро смеси 60/40 2 диатомовых водорослей, S. marinoi и C. gracilis (см. шаг 5). Это даст Начальная плотность диатомовых водорослей4 5 x 10 мл в ведро.
Примечание: Белощекая хитиновой личинки положительно phototactic. Ведра были сделаны из непрозрачного белого пластика с крышками, которые пропускают свет. Во время зимы номер был зажжен в дневное время (8:00 – 17:00), но темные в ночное время. В течение лета внешний свет вошел в комнату в течение большей части дня. - Передавать собранные хитиновой б. improvisus к кристаллизации блюдо (50 мм в высоту, 300 мл; 90 мм в диаметре).
- Осветить блюдо от стороны, которая будет привлекать личинки к источнику света. Соберите белощекая науплий, которые собираются на входящего света с пипетки и перенести их в другое блюдо кристаллизации. Удалите любые оставшиеся личинки артемии .
- Передать личинки хитиновой B. improvisus стакан с 1 Л отфильтрованной морской воды.
- Подсчитать количество науплий, помешивая стакан осторожно, чтобы получить даже подвеска личинок и затем принимать пять 1 мл образцов из разных мест в стакан. Перевод каждого образца на Гонав для визуального осмотра с стереомикроскопом. Подсчитать количество науплий в каждом из пяти образцов и добавить их.
- Подсчитано число умножьте на 200 (1000 мл/5 мл), чтобы оценить, как много тысячи личинок находятся в целый стакан. Если есть слишком много nauplius личинок в стакан, разбавляют образец до тех пор, пока плотность не более 14 000 личинок/Л (обычно в диапазоне от 11000-12000 личинок/Л).
- Добавьте 1 Л б improvisus хитиновой одно ведро, тем самым добавив примерно 11000-12000 личинок в ведро.
Примечание: Не забудьте добавить больше науплий, так как это приведет к слишком мало продовольствия по отношению к личинки и, следовательно, увеличение смертности. - После 3 дней Соберите белощекая хитиновой на сито 90 мкм. Затем очистить ведро (с пресной водой 75 ° C), заполнить его с фильтрованной морской водой, добавить новый канал диатомовые водоросли (столько же, как в начале) и наконец добавить хитиновой снова. Cyprids начинают появляться примерно через 6 дней (± 1 день).
- Сначала собирают cyprids с 90 мкм сито (разработан как в пункте 4.2 выше). Затем отдельные хитиновой Барнакл moulted и cyprids с 320 мкм сито на вершине 160 мкм сито. B. improvisus хитиновой будет собирать в 320 мкм сито и cyprids в сито 160 мкм.
Примечание: Cyprid личинки могут храниться на 10 ° C в кристаллизации блюдо в темноте для последующего использования, до центра сертификации. 6 дней. Однако хранения может повлиять на качество и производительность белощекая личинок, поэтому эксперименты, сравнение различных методов лечения в идеале следует использовать личинок из одной партии (и аналогичные время хранения) чтобы избежать смешанные эффекты16.
5. Культура микроводорослей в качестве корма для белощекая Nauplius личинок
Примечание: Водоросли были выращены в 3 различных типов культур: (i) сток культур, которые предназначены для долгосрочного обслуживания штаммов, которые использовались для прививки масштабирования; (ii) начало культур, которые являются первым шагом в рамках шкалы; и наконец (iii) производства культуры, которая является масштаб окончательного производства большого количества водорослей как белощекая кормов.
- Заказать видов диатомовых от культуры коллекции водоросли и простейшие (ПДИК) для использования в качестве корма для белощекая nauplius личинки. 2 вида Skeletonema marinoi (ПДИК штамм 1077/5) и Chaetoceros симплекс var. gracilis (ПДИК штамм 1085/3) дают хорошие результаты в качестве корма.
- Фильтр все морской воды для использования в водорослей культуры, с помощью системы фильтрации картриджа с номинальным порами размером 0,2 мкм. (фильтрованной морской воды является также использоваться для инкубационных яиц а. Салина и культивирования белощекая nauplius личинок). Автоклав фильтрованной морской воды для водорослей культур (при 105 ° C за 5 мин).
- Подготовка среднего для культуры микроводорослей, используя газобетона с морской водой, обогащен Guillard f/2 раствор, содержащий неорганических питательных веществ, остаточными металлами и витамины (см.17 Guillard 1975 за подробный рецепт). Кроме того приготовляют раствор силиката (Na2SiO3), но это отделить от обогащения f/2 для предотвращения твердых осадков.
Примечание: Концентрации Стоковый раствор обогащения и Стоковый раствор силиката были подготовлены для использования в качестве добавления 1 мл каждого до 1 Л морской воды. - Автоклав все оборудование используется в водорослей культуры при 120 ° С 20 мин автоклав винт максимум пробирки с 1 мл f/2 обогащения и 1 мл раствора силикат. Добавьте обогащения и силикатных решения theseawater когда из стекла и жидкости остыли до комнатной температуры.
-
Рост запасов культур микроводорослей в 40 мл пробирки с колпачки.
- Заполните пробирки с около 30 мл обогащенного морской воды. Прививать культуру с стерильные пипетки Пастера используя около 1 мл 2 неделя старый фондовый культуры. Колпачок затем установлены, но не затягивать, чтобы позволить некоторые газообмена. Если доступно, прививка должна осуществляться в ламинарные кабинета для снижения риска заражения.
Примечание: Цель фондовых культур является для поддержания водорослей культур на долгосрочной основе и служить посевным материалом для начала культур. Складе культур были повторно привиты каждые 2 недели. - Подвергайте новой культуры запасов на белый свет с интенсивностью ЦС. 25 – 50 µmole m-2s-1 (с свето тени циклом 16:8 h). Перемещение старых запасов культур к низкой интенсивности света как back-up. Отменить любые 2 неделя старый фондовый культур.
- Заполните пробирки с около 30 мл обогащенного морской воды. Прививать культуру с стерильные пипетки Пастера используя около 1 мл 2 неделя старый фондовый культуры. Колпачок затем установлены, но не затягивать, чтобы позволить некоторые газообмена. Если доступно, прививка должна осуществляться в ламинарные кабинета для снижения риска заражения.
-
Для расширения масштабов производства культуры водорослей, прививок начала культур от фонда культуры и вырастить их в 500 мл Erlenmeyerflasks.
- Автоклав 4 Эрленмейер колбы, пипетки и хлопка пробки с 300 мл отфильтрованных (0,2 мкм) с морской водой и 4 пробирки с 0,3 мл f/2 обогащения и 4 с решения силикат. Охлаждать f/2 обогащения и силикатных до комнатной температуры и добавить решения Эрленмейер колбы. Прививать им с ЦС. 1 мл раствора 2 - неделя старый фондовый культуры.
Примечание: Подготовьте 2 фляги с S. marinoi и 2 с C. симплекс. - Поставьте колбы на тряску таблицы в интенсивности света 50 µmole m-2s-1. Когда начала культуры приобрели популяциями водорослей (желто коричневого цвета), они готовы для использования в качестве посевным материалом для производства культур, которые будут предоставлять белощекая личинки с пищей.
- Автоклав 4 Эрленмейер колбы, пипетки и хлопка пробки с 300 мл отфильтрованных (0,2 мкм) с морской водой и 4 пробирки с 0,3 мл f/2 обогащения и 4 с решения силикат. Охлаждать f/2 обогащения и силикатных до комнатной температуры и добавить решения Эрленмейер колбы. Прививать им с ЦС. 1 мл раствора 2 - неделя старый фондовый культуры.
-
Расти производства культур в 4 Л поликарбонатные бутыли с силиконовые пробки с 2 просверленные портами оснащены стеклянной трубки.
- Подключение 1 стеклянная трубка, достигнув в нижней части бутылки насос воздуха через силиконовые трубки установлен фильтр воздуха 0,2 мкм. Убедитесь, что второй стеклотрубки заканчивается чуть ниже пробки и наполнен хлопок разрешить выход вводят воздуха.
- Каждую неделю, заполнить четыре 4 Л бутылки с фильтрованной морской и автоклав их вместе с пробками. Кроме того Автоклавы 4 пробирки с 4 мл f/2 обогащения и силикатных решений.
- После охлаждения, добавить f/2 обогащения и силикатных решения в бутылки и прививать им с половина объема начального культур в колбах Эрленмейера.
- Поместите четыре 4 Л бутылки в интенсивности света, 50-100 µmole m-2s-1.
- Урожай производства культур после ЦС. 1 неделя; Затем они достаточно плотной, чтобы использоваться для кормления белощекая nauplius личинки.
Примечание: Производство культур имеют срок службы около 2 недель, что означает, что есть 8 активных производства бутылок в любое время.
6. Разработка экспериментальных исследований с использованием ракушки
-
Разместите панели с несовершеннолетних или взрослых ракушки в контролируемых аквариумов, где они могут быть выращены под identicalconditions. Это называется общим сад эксперимент, который, например, может использоваться для понимания местной адаптации или фенотипические пластичности18, или для изучения изменения выражения гена с учетом внешних факторов (например, солености, температуры или рН).
Примечание: Это также можно использовать ракушки, непосредственно собранные из поля на панели. Преимуществом использования лабораторных разводят людей является, что матери эффектов можно избежать при использовании следующего поколения потомков.- Разоблачить ракушки для конкретных условий окружающей среды во время chosentime интервал, после сбора урожая взрослых (например, для исследования по экспрессии генов)2.
-
Для экспериментов с cyprid личинок для изучения выражения гена3место cyprids в контролируемых аквариумов, где личинки могут культивироваться в одинаковых условиях.
- Урожай cyprids после определенного периода времени путем фильтрации с сита (как описано в шаге 4.7) и извлечь РНК согласно протоколам ниже (шаг 8).
7. рассечение ракушки
- Очистить пространство лаборатории где исполняются диссекции и проб ДНК, bothbefore и между людьми, включая все инструменты рассечение. Это делается с использованием хлора для скамьи (или этанол 96% для щипцов).
Примечание: Маркированные пробирки, содержащие фиксации СМИ (этанол или стабилизации решение РНК) готовятся заранее. - Выбор большой и краткосрочных голодали лиц (не кормить их за 2 дня до вскрытия). Очистите белощекая оболочки с зубной щеткой, чтобы свести к минимуму риск загрязнения от других видов (например, бактерии, водоросли) и промойте его водой.
Примечание: Для краткосрочного голода людей перед рассечение причина избежать любого загрязнения ДНК (например, от артемии в кишечнике ). -
Место отдельных ракушки на ровной поверхности, прилагаемый к панели или насыпью в блюдо. Анализировать соответствующие ткани от взрослого. Есть несколько способов, чтобы вскрывать ракушки, в зависимости от цели исследования.
- Метод вскрытия A: фиксации весь белощекая как можно быстрее.
- Удалите весь белощекая из панели с помощью скальпеля, вставив его под белощекая и близко к поверхности панели.
Примечание: В большинстве случаев, эта манипуляция оставляет базальной пластине почти нетронутыми, таким образом, не затрагивая белощекая внутри. - Тщательно трещины внешней оболочки на одной стороне, вставив щипцы (рис. 3). Это делается для облегчения вскрытия fixating среды внутри корпуса.
Примечание: Если оболочка не разбивается на всех перед размещением белощекая в пробирке, это может привести к медленный процесс фиксации и низкого качества ДНК позже. - Положите сломанной белощекая в пробирки, содержащие РНК хранения решения или этанола. Оставьте белощекая в решение для по крайней мере 24 часа для его фиксации. Когда фиксируется белощекая, животное может из фиксации СМИ и помещены на подносе рассечение. Усиков, мантии и Сома (тело) может быть отделены друг от друга и помещены в отдельные Пробирки для дальнейшей экстракции ДНК или РНК.
Примечание: Важно соблюдать, если яйцо ламели с оплодотворенные яйца присутствуют внутри белощекая. Если он присутствует, они должны быть удалены перед экстракции ДНК избегать поиска несколько генотипов в образце.
- Удалите весь белощекая из панели с помощью скальпеля, вставив его под белощекая и близко к поверхности панели.
- Метод вскрытия B: удаление белощекая из оболочки до его фиксации.
Примечание: Этот метод не всегда приводят к мантии, исследуемом методом выборки, поскольку он присоединен к внутренней calcareousshell. Но это может быть быстрый метод отбора проб ДНК от индивидуума.- Тщательно удалите, с помощью рассечение щипцы, спинной и scutal пластины (рис. 3), вставив кончик щипцы между спинной и scutal плитами, схватив удерживайте пластины и потянув аккуратно удалить их.
- Схватить владение усиков с щипцами и тянуть белощекая прямо и поместите его непосредственно в 96% этанола или РНК, стабилизации решение для фиксации...
Примечание: Иногда, мантии будут также отбираться в то же время, как видно как тонкий эпителий с темной пигментации (в б. improvisus). В противном случае мантии можно быть удалены из внутренней части корпуса с помощью скальпеля и, впоследствии, помещены в этанол или РНК, стабилизации решение.
Примечание: Спинной и scutal пластин (если нетронутыми) можно сушеные и сохранены, поскольку они полезны для идентификации видов10. Общая рекомендация, если есть сомнения видов, является также сфотографировать весь белощекая до инициализации рассечение.
- Метод вскрытия A: фиксации весь белощекая как можно быстрее.
8. РНК добыча для количественного PCR
- Положить взрослых, которые будут использоваться для извлечения РНК в РНК, стабилизации решения, инкубировать их на ночь (до 24 ч) при температуре 4 ° C и затем сохранять их в-80 ° C.
Примечание: Cyprid личинок преимущественно сухой замороженные, без РНК позднее непосредственно в-80 ° C, поместив их в cryotubes и затем погружаясь трубы кратко (30 s) в жидком азоте перед их сохранением в-80 ° C. - В то время извлечение RNA, оттепель ракушки на льду и использование их нетронутой или вскрыть из тканей, которые будут использоваться (см. шаг 7).
Примечание: из-за высокой генетического разнообразия между людьми (≈ 3 – 5% вариации в Кодирующие области; АЛМ Росенблада et al., неопубликованные данные) желательно Польша число взрослых лиц, который минимизирует влияние последовательности различия между людьми на позднем этапе ПЦР. - Для RNAextraction 350 мкл буфера lysis, обеспечены подготовка комплекта РНК в гомогенизации пробирки, содержащие 2,8 мм керамический бисер.
Примечание: Керамический бисер обеспечивают лучшую доходность РНК, по сравнению с sonication (Представитель результаты). - Возьмите взрослых белощекая (целое или тканей) или собрать как минимум 20 cyprid личинки, с помощью щипцов и положить их в гомогенизации трубы.
- Приступить непосредственно к нарушение и гомогенизацию бисерная мельница.
- Положите гомогенизации трубы с образцом и бусы в держателе Стан шарика. Shake их с частотой 4,0 м/с для 20 s. Cool образца за 1 мин на льду. Повторите 2 x.
- Подготовьте РНК согласно протоколу в коммерчески доступных комплект изоляции РНК.
Примечание: Оценки риска (включая чтение листы данным по безопасности) должны выполняться перед использованием методов извлечения РНК, для выявления опасных химических веществ, которые требуют использования зонта и другой защитной одежды, включая перчатки (например, Добавление β-меркаптоэтанол для литического буфера во время извлечения РНК должно выполняться в вытяжного шкафа). - Количественного определения РНК. Приготовить рабочий раствор и добавить стандартного и образцы в суммарный объем 200 мкл. Vortex их за 2-3 s и инкубировать их на 2 мин Вставка трубы в флуориметр и принимать чтениях.
- Проверьте образцы РНК для любых белковых загрязнений с спектрофотометр и проверить их целостность РНК с системой автоматизированной электрофореза (Представитель результаты).
Примечание: Для хорошего качества препаратов, РНК рекомендуется иметь отношение 260/280 Нм 2 – 2.2 и ДНК около 1.8. Более низкие значения указывают белковых загрязнений и что процедура извлечения должен быть оптимизирован.
9. ген выражение: синтез cDNA и ПЦР
-
Рассматривать полученные RNAwith DNase для удаления любых remainingDNA прежде чем cDNA для ПЦР.
- Проверьте наличие загрязняющих геномной ДНК, добавив пример РНК, но не обратной транскриптазы при подготовке cDNA. Если есть PCR амплификация гена выбранного на cDNA, сделанные без обратной транскриптазы, загрязнения ДНК на РНК.
Примечание: Для образцов для РНК seq (с использованием технологии следующего поколения последовательности РНК последовательности), шаг DNase менее важен. В частности, для образцов с низким уровнем РНК, DNase шаг может быть опущен в порядке, чтобы не потерять слишком много из РНК в процессе.
- Проверьте наличие загрязняющих геномной ДНК, добавив пример РНК, но не обратной транскриптазы при подготовке cDNA. Если есть PCR амплификация гена выбранного на cDNA, сделанные без обратной транскриптазы, загрязнения ДНК на РНК.
- Выполните синтез cDNA DNase лечение РНК с помощью количества РНК в диапазоне, указанном в комплект синтеза cDNA коммерческого, но как правило, использование по крайней мере 50 нг.
- Дизайн ПЦР праймеры, таким образом, чтобы они обжигают в частях гена интереса, где идентификатор последовательности между людьми как можно выше, но идентификатор последовательности между гена паралоги как можно более низкой. Пожалуйста, смотрите соответствующие публикации для конкретных грунт пар используется для изучения выражения гена Na+/k+ АТФаза3 и аквапоринов2 (рис. 5).
Примечание: Для этой цели может использоваться РНК seq последовательность данных из сотен cyprids или несколько взрослых. - Праймеры дизайн для ген использоваться для нормализации уровня выражения (например, актин). Праймеры успешно используется для актина, вперед: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3' и обратное: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
Примечание: Актина является геном обычно используется элемент управления. Однако другие также было предложено как ссылка и испытаны на ракушки19. Помимо актина использование RPL8, 36B4, EF1 и NADHd1 как ссылка была протестированных3. Был сделан вывод, что есть нет большого различия в уровнях выражение генов соответствующих ссылок между сома, усики, взрослых или cyprids. - Оптимизируйте отжига температура для разработанных праймеры, добавляя все большее количество cDNA (обычно в диапазоне 0,25-50 нг) к смеси, содержащие SYBR зеленый, dNTP, полимеразы и 0,3 мкм прямого и обратного праймера.
- Запуск ПЦР протоколы при разных температурах отжига следующим: первоначальный денатурации температуры 95 ° C в течение 3 мин, шага denaturation на 95 ° C для 20 s, отжига Температура 55 – 63 ° c для 20 s и удлинения при 72 ° C для 30 s. В общей сложности запустите 40 циклов PCR.
Примечание: Эффективность грунт должен лежать в диапазоне от 90-105% и рассчитываются как E = (10^(-1/slope)-1) x 100 где склона является наклон кривой, полученные при печати журнала значение концентрации cDNA против их значения порога (Ct) цикла. - Выполняйте ПЦР, используя соответствующее количество cDNA, обычно 1-10 нг, используя протокол PCR, описанных в шаге 3 с оптимальной температуры отжига найдено.
Примечание: Выше количество cDNA используется только для генов, которые выражаются в чрезвычайно низких объемах.
Representative Results
С описанной процедурой для культивирования взрослых ракушки б. improvisusдо четырех серий nauplius личинки могут быть изготовлены в неделю. Можно было бы собирать личинок nauplius почти каждую ночь, но это требует больше людей и инфраструктуры (с много ракушки в broodstock, культура выпустит личинки постоянно). Дополнительные ограничивающим фактором для производства личинки, как представляется, быть доступности корма высокого качества, в частности относительно диатомовых Skeletonema. Максимально каждый пакет от культивирования системы состоит из примерно 12 000 науплий, поэтому до 50000 науплий в неделю может быть культивировали. Однако несколько недель могут существовать до десять раз меньше личинки производства. Один взрослый может производить до 7000 личинок в день14, что означает, что 1-2 взрослых выпускают личинок для каждой партии. В течение недели около 70-90% собранных хитиновой превратится в cyprids (приносит примерно 30 000 cyprids в неделю, максимально), который может использоваться для урегулирования анализов и молекулярные исследования.
Следует подчеркнуть, что существуют различия в cyprid функции между партиями, и в целом, есть большие вариации между партиями чем внутри пакетов. Например усадки успех в урегулировании анализов колеблется между 30 и 70% для различных пакетов. Скорее всего это вызвано индивидуальные генетические различия между определенными парами взрослых, выпуская личинок в периоды выборки. Конечно, рекомендуется что неоднократные эксперименты (биологические реплицирует) должна включать cyprids от ряда партий, если более общего заявления о результатах должны быть сделаны. Партии партии вариации ставит требования на экспериментальный дизайн, где должен применяться надлежащего контроля и нормировок в исследованиях выражения гена. Однако даже после того, как были осуществлены несколько статистических нормализации процедуры, значительно уменьшить различия между партии, некоторые эффекты партии, как правило, по-прежнему очевидной (неопубликованные данные).
После указанный протокол, можно получить, в среднем 500 нг РНК высокого качества от всего лишь 20 cyprids, независимо от стадии урегулирования белощекая (Таблица 1). Качество РНК обычно измеряется как соотношение между 18S и 28S пиков (ожидаемое положение двух пиков указаны на рис. 4). Однако в случае ракушки и многих других членистоногих, 28S рРНК ломается при нагревании (в рамках метода анализа) и переносит вместе с пик 18S20. Именно поэтому, в принципе, нет одного единого рРНК пик в этот тип анализа для ракушки. Это ясно из этого теста (рис. 4) что гомогенизацией, керамический бисер обеспечивает РНК с высокой целостности и, следовательно, метод выбора. РНК является достаточного количества и качества для создания высокого качества последовательности библиотек для виртуализации, что приводит к в среднем 70 миллионов чтений на сэмпл (количество операций чтения, конечно, зависит от уровня мультиплексирования во время виртуализации). Количество РНК также является достаточным для cDNA синтеза и ПЦР анализ выражения большого числа генов.
Рисунок 5 показывает результат ПЦР анализ аквапоринов и Na+/k+ АТФаза (NAK1) сплайсинг варианты, где изменения выражения были расследованы в ответ на изменения в окружающей среды подсказки2,3. Сравнение относительной выражения длинный и короткий сплайс варианты NAK1 шоу, двукратное увеличение для долгого мРНК NAK1 низкой солености относительно короткие NAK (рис. 5A). Таким образом данные показывают, что Альтернативный сплайсинг делает длинная форма преобладает в условиях низкой солености. В случае аквапоринов очевидно, что два транспортировки воды паралоги AQP1 и AQP2 дисплей дифференциального выражение (рис. 5B). В частности в ткани мантии, очевидно, что AQP1 существенно вниз регулируется на нижней засоленность, который не виден для AQP2. Вместо этого AQP2 показывает выражение, возросла на нижней засоленность, но в Сома. Эти результаты обеспечивают основу для исследования функциональных ролей различных ионных транспортеров б. improvisus и аквапоринов в белощекая осморегуляция.
Рисунок 1 : Обзор состава, культивирование процедуры и извлечение RNA для исследования выражение гена в взрослых. Чтобы начать новую культуру, панели прикреплены к раме и развернуты в море на глубине 1-3 м. После нескольких недель панелей с взрослых/несовершеннолетних помещены вертикально в стойки в лотки в лаборатории. Каждый лоток около 40 панелей с взрослыми. С примерно 100 взрослых в группы в целом примерно 4000 взрослых особей культивировали в лоток. Взрослый ракушки кормят артемии и может храниться год-вокруг. Личинки nauplius собраны несколько раз в неделю от лотков через фильтрацию через сито. Собранные хитиновой передаются ведра на 26 ° C в ванну с водой и кормили с микроводорослей. Хитиновой выращиваются до тех пор, пока они линяют в cyprids кормления, которые собираются путем фильтрации. Новые панели могут быть установлены в лаборатории урегулирования cyprids на панели, либо предоставить новые панели на год-вокруг культуры или использоваться для конкретных экспериментальных установок с изменения внешних условий. Затем РНК добывается из несовершеннолетних и взрослых в конце эксперимента или в конкретные моменты времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Изображения некоторые важные шаги в процедуре культивирования. (A) это изображение показывает кадры с панелями для сбора новых популяций из поля. (B) это изображение показывает панелей с взрослого ракушки б. improvisus в стойки, которые помещены в лотки. Панели размещены около 2 см друг от друга. (C) это изображение показывает лотки с белощекая панелей и вскармливания танка слева. От каждого лотка есть выход помещены сита для коллекции nauplius личинок. (D) это изображение показывает, что производство артемии канал для взрослых ракушки. (E) это изображение показывает выращивания науплий в ведра, помещены в ванну с водой, равным 26 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Описание первоначальных рассечение шагов взрослых ракушки: Удаление тела из своей скорлупы. (A) захватить один из opercular плит, вставив щипцами осторожно через отверстие. Потяните мягко удалить пластину и подвергать животного. (B) вытащить животного, захватывая часть Сома чуть ниже усиков. (C) Эта группа показывает общую Анатомия желудь ракушки. Мантии и потенциально оплодотворенных яиц (в яичнике) остаться в полости корпуса, когда тело вытащил. Записка о белощекая анатомии (для более глубокого учета, см. Андерсон)9: настенные тарелки белощекая уклон внутрь, и вместе они образуют конус вулкана как. Открытие, диафрагмы, покрыта opercular пластинами, которые формируют дверь, или крышечки, чтобы закрыть диафрагму. Желудь ракушки, как правило, имеют известняковых базальной пластина, которая прочно приклеивается к субстрата; Однако некоторые виды ракушки отсутствие этой известняковой плиты (например, S. balanoides). Ракушки выделяют экзоскелет из мрачно пигментированной мантии (карапакса). Внешней поверхности мантии двуслойная кальцинированная стать жесткими, в то время как на внутренней поверхности мантии не кальцинированная и поэтому является гибким. Внутри проема усики, присутствуют в задвинутом положении. Они являются грудной придатков, использующие ракушки для кормления подвеска. Яичников расположены близко к основанию белощекая, в то время как яички лежат в Сома. Эта цифра была принята от Панова и др. 21 и была опубликована с разрешения Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Определение целостности рРНК Капиллярный электрофорез. РНК было подготовлено два разных гомогенизации методы: sonication (A) и (B) керамический бисер. Единицы по оси y, Фу, стенды для флуоресценции единиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Выражение гена приводит к от двух различных исследований генов, важные для осморегуляция в б. improvisus. (A) Эта группа показывает дифференциального выражение как измеряется ПЦР сращивания вариантов Na+/k+ NAK1 АТФазы в ответ на различные солёностью и ЦУП2 уровнях3. В лечении низкая соленость, выражение длинные изоформы (NAK1-L) увеличивается относительно короткий (ANOVA, P < 0,001). (B) Эта группа показывает выражение аквапоринов взрослых б. improvisus во время их подверженности различным солёностью2. ПЦР была использована для определения уровней выражение Аквапорин относительно актина. Взрослые особи были инкубировали в 3 различных солёностью (3, 20 и 33 PSU) на 14 дней. Для подготовки РНК сома, усиков и мантии взрослых были отделены. В обе цифры погрешностей указать стандартное отклонение. ** И *** укажите уровень значимости (ANOVA), 0.01 и 0,001, соответственно. Эти цифры были изменены от Линд и др. 2 , 3. Обе цифры публикуются с разрешения PLoS ONE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Поселение фаза | Общая сумма РНК (НГ) |
| Бесплатный бассейн | 512 |
| Разведка: Закрыть Поиск | 518 |
| Вложенные cyprid | 550 |
| Недавно превратились несовершеннолетних | 832 |
Таблица 1: урожайность РНК. Эта таблица показывает количество РНК, извлеченные с подготовки комплекта РНК из пулов 20 cyprid лиц, собранных на различных этапах в процессе урегулирования.
Discussion
Белощекая культуры в Tjärnö, морской научно-исследовательской лаборатории (Швеция) работает уже более 20 лет и был использован для исследования во многих областях различных исследований. Более 30 научных работ были опубликованы которые использовали системе культивирования в течение последних лет, включая исследования в необрастающие13,22, гидродинамика23, химической экологии24, изменение климата16 ,5эволюционной биологии и молекулярной биологии2.
Чтобы избежать отбора отдельных лиц, которые более приспособлены к лабораторной среде (физические лица, которые не могут быть представитель диких населения), рекомендуется собрать новый broodstock от области каждый год. Кроме того это также хорошая практика, чтобы омолодить культуры ежегодно, поскольку в течение обычного года примерно 50-80% смертности среди взрослых. Однако если целью производить инбредных линий или настроить исследования по экспериментальной эволюции, только лаборатории выращены семьи должны использоваться.
Хорошее время для сбора б. improvisus на панели Tjärnö морской исследовательской лаборатории находится в июне-августе, потому что в то время, есть хороший запас cyprid личинок в море. Проверьте панели еженедельный увидеть, когда начинается белощекая урегулирования и вручную удалить другие поселились видов чем б. improvisus (например, мидии, оболочники, bryozoans, гидроиды, немертин/метаном и других видов белощекая) от панели (например, зубной щеткой). Вокруг Tjärnö есть три мелководье белощекая видов (б. improvisus, Semibalanus balanoidesи crenatus балянусы). Однако б. improvisus является доминирующим нарочно гладких твердых поверхностей в июле-августе. S. balanoides имеет свой расчетный период во время ранней весной и предпочитает главным образом природных субстратов (например, камни). B. crenatus может произойти на низких числах на панелях в летнее время.
Это также возможно для начала новых поколений взрослых белощекая из искусственного cyprids, который будет иметь важное значение, если были установлены некоторые linages с специфические черты, или исследования по экспериментальной эволюции. Наиболее удобный способ для начала новых поколений взрослых является поселиться на термопластичных панелей в лаборатории cyprids. Эти панели с недавно поселились cyprids может также использоваться в экспериментальные методы лечения или для воздействия на местах. В экстренных случаях можно также использовать взрослых на валуны из близлежащих сайта (например, Idefjorden в случае морской научно-исследовательской лаборатории Tjärnö) где б. improvisus является распространенным явлением. Эти уже установленных взрослых обработаны таким же образом, как взрослые на панелях, таким образом помещены в лотки и кормили через поток через систему. Поток клетки могут также использоваться для создания панелей с ракушки25. Это поток через камеры с планктона нетто по бокам, на которых cyprids не соглашайтесь, с панелями как единственное поселение поверхность для личинок.
Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для создания долгосрочного функционирования белощекая культуры, включая все этапы жизни. Методы, используемые для культуры B. improvisus , вероятно, в значительной степени, также применимы к другим морских беспозвоночных с свободноплавающих, planktotrophic личинки. Культивирования процедур для некоторых видов, уже хорошо описал (например, для различных видов устриц и голубые мидии)26, в то время как для других морских беспозвоночных, существует лишь несколько примеров долгосрочного культур, охватывающих всю свою жизнь цикла. Одна из первых успешных попыток культуры ракушки (B. amphitrite) было сделано на Rittschof и др. 15. долгосрочные финансовые и личные ресурсы должны быть на месте до рассматривает вопрос о создании белощекая культивирования объекта. Поддержание такого рода год-вокруг белощекая культуры требует по крайней мере один человек рабочих половине времени. Там могут быть некоторые возможности для будущего автоматизации некоторых шагов в производственной линии, в основном культивирования микроводорослей27. Кроме того чтобы добиться успеха, важно иметь доступ к большое количество морской воды высокого качества. Выращивание микроводорослей, Артемия, и ракушки не предполагает каких-либо конкретных безопасности процедур. Однако испытания некоторых необрастающие веществ или токсичных химических веществ может потребоваться особые меры предосторожности.
Панели были проверены несколько раз в неделю для загрязнений. Морская вода используется в культуре был перекачивается вверх с глубиной 40 м в фьорда костер вне морской научно-исследовательской лаборатории Tjärnö и был принят через два песочных фильтров перед входом в систему водоснабжения лаборатории. Если фильтрация воды не было сделано, будет гораздо больше загрязнения в культуре. Важно регулярно очищайте панелей в культуре из щебня и других беспозвоночных (например, гидроиды Столон потенциала и хищных немертин), войти в систему через поставки морской воды из поля. Например, если не личинки производятся несмотря на тот факт, что культура был сытым и иным образом, кажется, быть в хорошем состоянии, проблема может быть наличие немертин, которые подавляют спаривания. Естественно многие загрязняющие организмов в культуре в морской научно-исследовательской лаборатории Tjärnö были конкретные на Западном побережье Швеции, и другие виды загрязнения организмы будут распространены и быть более сложной задачей в других географических районах. На Западном побережье Швеции является необычным, чтобы найти загрязнения от других видов белощекая на панели. Иногда создание S. balanoides был найден, но это очень маргинальных проблема (в большинстве, один S. balanoides загрязнений для 10 000 образцов, б. improvisus ). Отсутствие загрязнения видов был скорее зависит от режима для создания новых культур в течение лета, когда larvaefrom B. improvisus были весьма доминирующим. Кроме того было также ясно обогащения б. improvisus на панели так как этот вид селективного для гладких поверхностей13.
Важно, чтобы удалить мертвые взрослых ракушки. Если пустые гильзы остаются на панелях, они могут стать приют как для науплий артемии , так и для различных видов загрязнения. Кроме того было замечено, что мертвые люди влияние благосостояния соседних лица, вероятно с выпуском токсичных соединений при разложении. Дополнительные последствия смертности взрослого населения является, что некоторые люди останутся самостоятельно и слишком далеко от любых других взрослых, чтобы позволить спаривания (хотя ракушки имеют длинный пенис в мире животных по отношению к его размер)28. Эти лица выживет, но непроизводственной для личинок. Однако эти одиночные взрослых особей нежно могут быть удалены без ущерба пластину основания и располагаться горизонтально рядом других, чтобы включить спаривания. Ракушки также может быть повязана путем размещения панелей с одним взрослым по каждому, но достаточно близко, так что взаимообогащение может произойти. Таким образом генетические линии могут быть произведенные14.
Важно, чтобы создать канал высокого качества и кормить культур почти каждый день. Даже через несколько дней без пищи может привести к снижению выхода личинок. Предыдущие испытания рациона показали, что диатомеи важны для роста и выживания белощекая хитиновой. Несколько видов диатомовых, как представляется, как кормить, хотя небольшой или одиночные клетки (менее 10 мкм в диаметре) могут быть необходимы для заглатывания хитиновой. Видов S. marinoi, C. симплекси т. pseudonana все оказались адекватных кормов для хитиновой б. improvisus , а также легко выращивать. Кроме того качество корма как правило, выше для экспоненциально растущих водорослей. Он также сообщил, что диатомеи важны для установления продуктивных культуры B. amphitrite15. Теория о важности диатомовых водорослей, что они имеют уникальный жирных кислот профиль и особенно богаты жирные кислоты высоко полиненасыщенные 20:529. Это было показано что некоторые жирные кислоты имеют важное значение для успешного развития личинки устриц30.
За годы там было без случаев пагубные последствия заболеваний в культуре белощекая. В многих коммерческих водохозяйства беспозвоночных, как устрицы и мидии заболевания являются довольно общими и могут быть очень опасны. От диких популяций Сообщалось также пагубные последствия вирусов. Родной oyster во Франции была заменена португальских устриц Crassostrea angulata в 1925 году, но этот вид была уничтожена iridovirus вокруг 1970 года31. Совсем недавно были массовые смертности события в тихоокеанских устриц Crassostrea gigas в культурах во всем мире, которая появляется ассоциироваться с ostreid герпеса 132. Никаких сообщений о патогенных микроорганизмов, бактерий или вирусов на ракушки были опубликованы до сих пор. Однако в текущих-проект генома на б. improvisus, были найдены вирус последовательности (Alm Росенблада et al., неопубликованные данные), но без очевидной связи с симптомов заболеваний. Смеси антибиотиков применялись ранее к культурам, чтобы свести к минимуму риск бактериальных инфекций; Однако эта процедура в настоящее время заброшены и до настоящего времени, это не вызвало никаких проблем загрязнения.
Если морская вода нагревается (как описано выше), перегрев может быть наиболее серьезный риск в культуре производственной линии. Это, конечно, трудно для защиты от перегрева, хотя соответствующие оповещения систем и датчиков могут быть использоваться (например, отправка электронной почты или текстовых сообщений для ответственных лиц). Случаи такого рода в прошлом привели к существенной убийства взрослых в культуре. Это может, конечно, быть разрушительными и уничтожить долгосрочные инвестиции времени и денег. В частности это будет иметь катастрофические последствия, если были созданы инбредных генетических линий. Чтобы обеспечить долговечность таких линий и их защиты от случайной потери, было бы желательно разработать методики криоконсервирования ракушки. Сообщается, что личинки из тихоокеанских устриц может быть заморожен вниз и ожил с частичным успехом33. Cryobanking был также ценным инструментом для сохранения генетических ресурсов широкий спектр видов34. Сообщается, что даже хитиновой от B. amphitrite выживать замораживание35, и выяснилось, что 20% лиц, замороженные вниз успешно превратились в cyprids36. Однако применяя замораживания для обеспечения долгосрочной устойчивости культур до настоящего времени не был принят, но это действительно необходимо для поддержания выбранных линий; Это было бы важным шагом к твердо установления б. improvisus в мощный морской modelsystem.
Здесь протокол был представлен для вскрытия различных тканей от взрослых б. improvisus (то есть, усики, сома и каминные). Однако следует подчеркнуть, что другие ткани также могут быть извлечены. К примеру мягких тканей между внешней и внутренней мантии видов мембранных база Tetraclita japonica формозский был тщательно изолированы и используется для извлечения РНК и РНК seq анализ гена выражение37. Протокол изложил оптимизации добычи, описанных здесь обеспечивает достаточного количества качественных РНК последовательности от минимальное количество исходного материала. Во-первых коллекция отдельных личинок прямо в штуцере гомогенизации минимизирует потери во время перевода из одной трубы в другую. Кроме того среди различных методов испытания, гомогенизации с керамической дробью, оказался наиболее эффективным с точки зрения РНК доходность и целостности, по сравнению с sonication или пестик гомогенизации. При планировании для экспрессии генов или геномики эксперименты, надо иметь в виду проблема высокой генетической вариации в ракушки, по крайней мере для б. improvisus. Белощекая имеет генетического разнообразия в диапазоне 3-5%, даже в Кодирующие области (Alm Росенблада et al., неопубликованные данные). Это, конечно, ставит конкретные требования на дизайн праймеров для ПЦР-анализа, где сохраняется регионов следует выявлять и использовать в качестве шаблонов для грунтовки для того чтобы получить последовательное выражение результатов betweenbatches. Сохранившихся регионов для целевых генов, как аквапоринов и Na +/ K + ATPases, можно определить путем изучения изменчивости последовательности этих генов в РНК seq данных, полученных от населения cyprids, содержащих сотни людей. Для анализа генома будет пробы ДНК. Однако получение высококачественных ДНК от B. improvisus может быть сложным21.
В заключение установленным белощекая культура оказалась важную роль в различных видах экспериментальных исследований. В частности, все год вокруг личинок производство позволяет нам проводить эксперименты не ограничиваясь естественным нерестовый период (для б. improvisus, это в летнее время). Полученные личинок может использоваться для выполнения широкого набора экспериментальных исследований, в том числе урегулирования анализов, поведение анализов, выражение исследования на конкретных генов, а также исследования генома общесистемной транскриптом.
Disclosures
Авторы не имеют ничего объявить.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Грант 2017-04559 от шведского Совета научных исследований (VR) и поддерживает проект ЕС набережной Андерс Blomberg. В частности, создание объекта культивирования с годами, была поддержана грантов для за Jonsson р. от следующих финансовых учреждений: ФСО (шведский фонд стратегических исследований) через программу морской науки и технологии и Мистра через программу морских краской. Кент Бернтссон сыграла важную роль на ранних этапах создания culturingfacility. Дополнительное финансирование для создания объекта культивирования пришло от центра морской эволюционной биологии (www.cemeb.science.gu.se), который является Карл Линней грант от шведского научно-исследовательских советов АНКЕТАХ и VR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels | Plastic produkter, Bromma, Sweden | transparent glas | |
| 1.5 L PET bottle | |||
| Artemia | INVE Aquaculture, Belgium | We have tested different companies; this is really the best one | |
| Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1077/5 | |
| Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1085/3 | |
| Millipore cartridge filter system | Millipore | ||
| cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm | Millipore | cartridge CWSS01S03 | High capacity for large volumes |
| polycarbonate bottle | Nalgene | autoclavable | |
| RNA later | Qiagen | 76106 | Fixation solution to preserve RNA |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen/Thermofisher Scientific | AM1907 | DNAse kit to remove DNA from prepared RNA |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708890 | cDNA synthesis kit |
| SYBR Green supermix | Biorad | 1708880 | Dye for QPCR |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | RNA extraction of adults or many cyprids |
| Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes | Precellys | KT03961-1-003.2 | Ceramic beads for homogenisation |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | RNA extraction of few cyprids |
References
- Darwin, C. A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , Ray Society. London, UK. (1854).
- Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
- Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
- Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
- Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
- Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
- Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
- Anderson, D. T. Barnacles - structure, function, development and evolution. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).
- Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
- Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
- Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
- Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
- Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
- Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
- Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).
- Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
- Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
- Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
- Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
- Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
- Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
- Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
- Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
- Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
- Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
- Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
- Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
- Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
- Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
- Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
- Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
- Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
- Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
- Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).
