Summary
우리는 쥐의 모터 피 질에서 microelectrode 주입 하면 즉각적이 고 지속적인 모터 적자는 나타났습니다. Microelectrode 이식 수술 및 3 설치류 행동 작업 모터 피 질에 주입 한 손상 때문에 또는 총 모터 기능에 잠재적인 변화를 명료 하 게 하는 방법 여기 개요 제안.
Abstract
뇌에 이식 하는 의료 기기는 엄청난 잠재력을 만요. 두뇌 기계 인터페이스 (BMI) 시스템의 일환으로, intracortical microelectrodes 신경의 개인 또는 작은 그룹에서 활동 전위를 기록 하는 기능을 보여 줍니다. 이러한 기록 된 신호를 환자를 허용 하거나 컴퓨터, 로봇 팔 다리, 그리고 그들의 자신의 사지를 제어 성공적으로 사용 되었습니다. 그러나, 이전 동물 연구는 두뇌에 있는 microelectrode 주입 주변 조직 손상 뿐만 아니라 기능적인 적자 발생 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 여기, 우리는 일련의 행동 테스트 intracortical microelectrodes 이식 쥐의 모터 피 질에 따라 잠재적인 모터 장애 척도를 논의. 오픈 필드 그리드, 사다리 교차점, 및 그립 강도 테스트 메서드 microelectrode 이식에서 발생 하는 잠재적인 합병증에 관한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 행동 테스트의 결과 병 적인 결과 인접 한 조직에서이 절차의 영향에 추가 정보를 제공 하는 끝점 조직학와 상관 된다.
Introduction
원래 intracortical microelectrodes 지도, 두뇌의 회로 그리고 기능 출력1을 생산 하기 위해 사용 될 수 있는 모터 의도의 탐지를 가능 하 게 하는 유용한 도구도 개발에 사용 되었다. 감지 기능 출력 제어 로봇 또는 컴퓨터 커서2,3 의 척수 상해, 뇌성 마비, 루 경화 증 (ALS), 또는 다른 운동 제한 조건에서 고통 개인을 제공할 수 있습니다. 4,,56, 팔 또는 그들의 자신의 장애 사지7기능을 복원 합니다. 따라서, intracortical microelectrode 기술 유망 하 고 신속 하 게 성장 하는 분야8로 떠오르고 있다.
때문에 분야에 성공, 임상 연구 진행 향상 BMI 기술5,,910의 가능성을 이해 하는. 뇌의 신경 세포와의 커뮤니케이션의 모든 잠재력을 실현 하 여 재활 응용 프로그램은 무한 한8로 인식 됩니다. Intracortical microelectrode 기술의 미래에 대 한 좋은 낙관론은, 비록 그것은 또한 유명한 microelectrodes 결국11, 이식 다음 급성 neuroinflammatory 응답으로 인해 실패. 두뇌에 있는 외국 물자의 주입 즉시 손상 주변 조직에 발생 하 고 이식12의 속성에 따라 달라 집니다 neuroinflammatory 응답으로 인 한 추가 피해를 연결. 더하여, 두뇌에 있는 임 플 란 트 microlesion 효과 발생할 수 있습니다: 포도 당 대사 감소 급성 부 종 및 출혈 때문에 장치 삽입13에 의해 발생할 수 생각. 또한, 신호 품질 및 유용한 신호는 기록 될 수 있는 시간의 길이 동물 모델11,14,,1516에 일치 하지 않습니다. 여러 연구 결과 neuroinflammation와 microelectrode 성능17,,1819사이 연결을 설명 했다. 따라서, 공동체의 일치 microelectrodes, 주변 신경 조직의 염증 반응 적어도 부분적으로, 전극 신뢰성 타협 이다.
많은 연구 조사 지역의 염증11,20,,2122 또는 삽입11,23, 으로 인 한 뇌 손상을 줄이기 위해 방법을 탐험 24,25시간14,26동안 녹음 성능 개선의 목표. 또한, 우리는 최근 쥐의 모터 피 질에서 microelectrode 삽입으로 인 한 의원 성 상해는 즉각적이 고 지속적인 좋은 모터 적자27발생 표시는. 따라서, 여기에 제시 된 프로토콜의 목적은 주고 연구자 주입 및 intracortical 장치의 영구 존재 하는 뇌 외상 결과로 가능한 모터 적자를 평가 하기 위해 양적 방법 (microelectrodes에는 이 원고의 경우)입니다. 여기 설명 하는 동작 테스트 모두 그로스와 잘 모터 기능 장애, 애타게 하도록 설계 되었습니다 그리고 뇌 손상의 많은 모델에서 사용할 수 있습니다. 이러한 방법 간단, 재현성, 및 설치류 모델에서 쉽게 구현 될 수 있습니다. 또한, 여기에 제시 된 방법 조직학 결과 모터 동작의 상관 관계에 대 한 혜택을까지 최근, 저자 안 본 BMI 필드에 게시 된 수 있습니다. 마지막으로,이 방법 괜 찮 모터 기능28, 총 모터 기능29, 그리고 스트레스와 불안 행동29,30, 테스트 하도록 설계 되었습니다으로 여기에 제시 된 방법을 구현할 수도 있습니다에 연구원은 밖으로 (또는)을 지배 하 고 머리 부상 모델의 다양 한 모든 모터 함수 적자.
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Protocol
모든 절차 및 동물 관리 관행에 의해 승인 되었고 루이 스톡 클리블랜드 학과의 재향 군인 담당 센터 기관 동물 의료 및 사용 위원회 수행.
참고: 컨트롤 자상 부상 모델의 사용에 대 한 결정에 연구원 교육, 것이 좋습니다 외. 포터 의해 수행 하는 작업을 검토 하 21.
1. microelectrode 이식 수술
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미리 수술 동물 준비
- Isoflurane (2-4%)를 사용 하 여 유도 챔버에서 동물 anesthetize 마 취에서 지속적으로 심장 박동과 혈액 산소 함유량을 모니터링 하는 중요 한 측정 시스템을 사용 하 여 동물을 모니터링 합니다.
- 마 취를 계속 코 콘에 동물을 이동 합니다. 피하 (SQ) cephalosporin 항생제, 예: cefazolin (25 mg/kg) 및 비 스테로이드 항 염증, 감염을 방지 하 고 통증, 각각 관리를 예를 들면 carprofen (5 mg/kg) 주사.
- 후 한 건조에서 그들을 방지 하기 위해 동물의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 작은 동물성 손톱깎이 사용 하는 봉합 상처 치유 하는 동안 긁 기에서 동물을 방지 하기 위해 발톱 손질. 못 하지 잘린 너무 짧고, 통증과 출혈 동물에 대 한 발생할 수 있습니다으로 확인 합니다.
- 전기 면도기 트리머를 사용 하 여 눈 사이 귀 뒤에 철저 하 게 동물의 머리를 면도.
- 절 개의 영역에서 동물의 머리의 상단에 로컬 진통 bupivacaine (0.125 %bupivacaine 재고 솔루션에서 희석의 0.3 mL)의 SQ 주사 제공.
- 동물을 머리 수술 하는 동안 이동 하는 것을 막기 위해 귀 막대를 사용 하 여 stereotaxic 프레임에 탑재 합니다. 동물의 내부 온도 유지 하기 위해 동물 아래 패드 난방 순환 수를 놓습니다.
- 무 균 드 레이프, 예를 들어, 제도 승인 살 균 플라스틱 랩, 외과 분야를 분리 하는 적용.
- 스크럽 번갈아 betadine 솔루션을 사용 하 여 외과 영역 그리고 소 프로 파 놀 스크럽.
- 되도록 동물 외과 비행기 아래 기관 프로토콜에 따라 발가락 핀치를 수행 합니다.
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동물 이식 준비
- No. 10 메스 블레이드를 사용 하 여 두개골을 노출 하는 중간 선 아래에 약 1의 절 개를 만듭니다. 퉁 명 스럽게 솜 밀고 주걱을 사용 하 여과 제거 하 고 어떤 출혈 거 즈 패드 사용을 중지. 악어 클립을 사용 하 여 주변 조직 철회 하 고 깨끗 하 고 과산화 수소와 두개골을 탈수.
- 나중 단계에서 결합 치과 시멘트를 개선 하기 위해 노출 된 두개골에 cyanoacrylate 기반 조직 접착제의 몇 방울을 놓습니다.
- 선택한 반구에서 뼈에는 닉을 만들어 forepaw 운동 약 3 m m 중간을 2mm bregma에 앞쪽 측면에 해당 하는 모터 피 질 영역을 표시 합니다.
- 1.75 m m 둥근된 팁 치과 드릴을 사용 하 여, 특별 한 배려는 너무 빨리 또는 너무 깊이 드릴 하지 복용 및 stereotaxic 프레임에 한 손으로 지원 두개골의 일부를 제거 합니다. 드릴31과열 방지를 간헐적으로 두개골에 적용 되어야 한다.
- 잘 구부려 진된 45 ° dura 선택을 사용 하 여 경질을 반영 합니다.
- 어떤 출혈을 사용 하 여 면 밀고 주걱 및 염 분, 직접 터치를 돌보는 뇌 표면 청소.
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Microelectrode 모터 피 질에의 삽입
- 신중 하 게 복용 하지 전극의 정강이 범프를 주의 stereotaxic 프레임에 범용 홀더에서 소독된 microelectrode를 탑재 합니다. 전극의 headstage 인터페이스 커넥터 단단히 소유자에 의해 개최 됩니다 확인 하십시오.
참고: 여기, 그리고 2 m m x 123 µ m x 15 µ m 측정 비 기능 미시간 스타일 실리콘 생크 전극 사용, 생크 미세 집게를 사용 하 여 삽입 했다. - Stereotaxic 프레임에는 micromanipulators을 사용 하 여 신중 하 게 놓고 전극의 팁 오픈 craniotomy.
- 부드럽게 측정 가이드로는 micromanipulators를 사용 하 여 뇌에 전극 약 2 m m 낮은 (전극의 선택에 따라 제어 속도에서 자동된 삽입 필요할 수 있습니다.) 어떤 표시 맥 관 구조 가능할 때마다을 피하기 위해 주의. 일단 전극 장소에, 신중 하 게 보편적인 홀더에서 커넥터 놓고 삽입 팔을 철회.
- 조심 스럽게 면 밀고 주걱 및 식 염 수를 사용 하 여 전극 주위에서 출혈이 청소.
- 실리콘 고무를 사용 하 여 이식된 전극 주위 craniotomy 오프 인감.
- 치과 시멘트를 사용 하 여 두개골에 전극 수정.
- 시멘트는 완전히 건조, 일단 절 개의 가장자리 함께 가져 앞에 그리고 시멘트 headcap 및 봉합 그들 종료 뒤.
- 신중 하 게 복용 하지 전극의 정강이 범프를 주의 stereotaxic 프레임에 범용 홀더에서 소독된 microelectrode를 탑재 합니다. 전극의 headstage 인터페이스 커넥터 단단히 소유자에 의해 개최 됩니다 확인 하십시오.
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수술 치료
- 동물의 생체 신호를 모니터링 하면서 패드를가 열 순환 물에 복구할 수 있습니다. 사용 하 여 열 램프 램프에서 온도 더 제어 하기 어려운 동물 과열 수 있습니다 하지 마십시오.
- 일단 동물은 완전히 깨어 있는, 음식과 물에 쉽게 접근할 깨끗 한 케이지를 동물을 이동 합니다.
- 수술 일 1-3 일 동안 스퀘어 cephalosporin 항생제 (25 mg/kg)와 비 스테로이드 항 염증 (5 mg/kg) 감염을 방지 하 고 그들의 고통을 관리 하는 동물을 제공 합니다.
- 매일 통증 또는 불편 함, 출혈, 체중 변화, 또는 적어도 수술 하루 5 문제를 봉합의 흔적에 대 한 동물을 모니터링 합니다.
2. 행동 테스트
- 모든 동작 테스트를 위해 테스트 동물 2 x 그들의 사전 수술 기준 점수를 계산 하기 위해 전극 이식 수술 전에 주에 테스트 당. 수술 다음 각 테스트에 주 당 2 x 테스트 동작을 시작 하기 전에 1 주 동안 휴식을 동물 허용. 일관 된 테스트 조건 사전 및 수술 후 불안의 측정에서 발생할 수 있는 성능에 스트레스의 영향을 최소화 하기 위해 테스트에 대 한 연구를 통해 사용 되어야 한다.
- 각 동물 전후 각 테스트 세션의 시작 부분에서 염소 이산화 기반 sterilant와 모든 테스트 장비를 청소 하십시오.
- 오픈 필드 그리드와 사다리 테스트 영화. 이러한 테스트 필요 비디오 카메라 (1080p, 15fps, 78 ° 대각선의 시야의 최소), 노트북, 및 비디오 데이터를 저장 하는 방.
- 각 테스트의 시작 부분에서 시험장에 동물을 가져오고 테스트를 시작 하기 전에 적어도 20 분 동안 적응 하도록 허용. 방에 빛과 온도 제어, 그리고 같은 인사는 모든 테스트 완료 해야 합니다. 이상적으로, 같은 방에 방에 변경 없이 테스트의 과정을 통해 모든 동물에 대 한 사용 됩니다.
- 작업을 완료 하는, 특히 사다리 훈련 기간 동안 동물을 장려 하기 위해 사용 하 여 음식 보상. 시리얼 이나 바나나 칩 또는 크래커의 작은 조각을 좋은 보상을 확인합니다.
- 각 개별 동물 (공식 1)에 대 한 사전 수술 점수에 모든 주간 테스트 공연 정상화.
방정식 1:
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필드 표 테스트 오픈
참고: 오픈 필드 그리드 테스트 사내 고 약 40 cm 높은 불투명 측 벽 1 m2 의 실행 표면 있다. 실행 하는 눈금의 표면 아래 테이프 (그림 1A)를 사용 하 여 아래쪽에서 9 동등 사각형으로 나뉘어져 있습니다. 기록 카메라 비 계에는 격자의 중심 위에 영구적으로 장착 됩니다.- 오픈 필드 그리드 테스트 하려면 동물 테스터 멀리 직면 하는 눈금의 중앙에 놓습니다.
- 동물 비디오를 기록 하는 동안 3 분 동안 자유롭게 실행을 허용 합니다.
- 동물 테스트 완료 되 면, 그리드에서 동물을 제거 하 고 감 금 소에 반환. 염소 이산화 기반 sterilant와 철저 하 게 그리드를 청소.
- 각 동물 1 테스트 x 하루 테스트 당.
- 비디오 추적 소프트웨어를 사용 하 여 총 모터 함수의 통계로 넘어 눈금선, 여행, 총 거리 및 동물의 최대 속도의 수를 분석 합니다.
참고: 여기에 제시 된 데이터는 수동으로 훈련 된 연구원에 의해 계량 했다 하지만 그것은 사내 최근에 개발 된 사용 하 여 선호 추적 알고리즘32.
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사다리 테스트
참고: 사다리 테스트 사내 고 2 취소 아크릴 측 벽, 길이, 직경 3 mm 가로 2 c m 간격 (그림 2A)에서 간격으로 연결 된 각 1 m의 구성 됩니다. 사다리 테스트 숙련 된 시험 이며 따라서 사전 수술 기준 점수를 기록 하기 전에 훈련의 1 주를 요구 한다. 교육에 대 한 프로토콜 테스트는 동일.- 사다리 테스트 하려면 임시 깨끗 한 보관 케이지를 동물을 이동 합니다.
- 2 감 금 소 교량을 사다리 설정 합니다. 깨끗 한 케이지 달려있다 사다리의 시작 끝 그리고 끝 끝 실행을 완료 하는 데 동기 부여로 봉사 하는 동물의 집 케이지에 달려있다.
- 사다리의 중심에 삼각대에 동일한 (또는 유사한) 비디오 카메라를 배치 합니다. 카메라의 위치 가로 대 높이에 있어야 볼 수 전체 사다리에 대 한 허용 합니다.
- 실행 비디오 카메라와 함께 첫 번째 울 렸으 면 터치를 그들의 정면 발을 수 있도록 사다리의 출발선에 동물을 개최.
- 그들의 자신의 걸음에 사다리를 건너 동물 허용. 동물의 발 닿은 첫 번째 울 렸으 면 마지막 가로 대에 제 3에서 결승 선을 교차 하는 동물의 시간 결정 순간 사이의 시간 경과.
- 동물 사다리에 돌아서 또는 20의 기간 동안 이동 하지 않습니다 경우 s, 실행 실패 하 동물을 고려 하십시오. 동물 페널티킥 실패 각 시간 실행 점수를 할당 합니다. 사전 수술 테스트27동안 기록 느린 성능에 의해 형벌 시간을 결정 합니다.
- 건너 사다리 5 각 동물 허용 x 각 실행 사이 약 1 분 나머지와 함께 하루를 테스트 당.
- 정밀한 모터 함수의 통계로 하루 빠른 3 실행의 평균입니다. 또한, 각각의 소프트웨어를 추적 하는 비디오를 사용 하 여 가로 대에서 미끄러져 발 횟수를 기록 합니다.
참고: 여기에 제시 된 데이터는 수동으로 훈련 된 연구원에 의해 계량 했다 하지만 그것은 나 외. 를 사용 하 여 최근에 개발 된 사내 추적 알고리즘을 사용 하 선호 32.
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그립 강도 테스트
- 각 테스트 세션 전에 그립 강도 측정기를 교정 하 고 그램의 강도 측정.
- 위치는 카운터 바닥 위에 확장 그립 핸들의 가장자리에 그립 강도 미터입니다.
- (그림 3A) 꼬리의 기지에 의해 동물을 잡고 두 앞 발과 자전거 핸들을 잡아 동물 허용.
- 일단 동물에는 각 발에와 함께 확고 한 그립, 느리고 꾸준한 힘으로 꼬리의 기지에 의해 미터에서 동물을 당겨.
- 디지털 그립 강도 측정기에 의해 출력에 표시 되는 동물에가 해지는 최대 그립 강도 기록 합니다.
- 각 동물 3 테스트 x 각 테스트 사이 약 2 분 나머지와 함께 하루를 테스트 당.
- 정밀한 모터 함수의 통계로 기록 하 고 3의 각 출력 최대 그립 강도 평균.
3. 사후 행동 프로토콜
- 동물 마 취 제 (160 mg/kg)를 사용 하 여 깊이 anesthetize 모든 행동 (예를 들어, 주입 후 8-16 주), 테스트 수행 및 xylazine (20 mg/kg), transcardially 그들을 perfuse, 그들의 두뇌 및 곳을 알아내는-슬라이스를 수확, 그리고 조직 얼룩 immunohistochemical 마커를 사용 하 여 계량 주입33,34,35,36,,3738의 사이트 주위 세포 응답.
4. 통계 분석
참고: 예비 전력 분석은 특정 연구 질문에 대답을 추구 하는 어떤 학문 든 지에 대 한 강력 하 게 제안 했다. 특정 연구 디자인에 대 한 통계적 의미를 달성 하는 데 필요한 동물의 수를 알려 줍, 전력 분석, 특정 연구 가설, 실험, 예상된 효과 크기의 다양성의 디자인에 따라 결정 되어야 의도 된 치료, 임상 또는 과학적인 관련성을 달성 하는 데 필요한 잘 효과 크기.
- 일반적인 통계 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다.
- 설명 통계를 집계 하 고 평균 ± 표준 오차도 그들을 표시 합니다.
- 두 표본 t-검정을 사용 하 여 그룹 대 이식 컨트롤 비교 주간 각 시간 점에서 [오픈 필드 그리드 (2.2 단계), 사다리 (2.3 단계), 및에서 그립 강도 테스트 (2.4 단계)] 행동 성능 분석. 독립적인 측정 각 주간 시간 포인트를 고려 하십시오.
- 혼합된 효과 선형 모델을 사용 하 여 경도 성능을 수량화 합니다. 주 및 그룹 요소를 고정 되 고 실험 동물 임의의 효과 서 그룹 내에 중첩 된. 분산 분석 (ANOVA) p < 0.05의 의미 수준 요인 효과 결정 하는 데 사용 됩니다.
- 사다리 성능을 비교 하 여 선형 회귀 분석을 사용 하 여 immunoglobin G (IgG) 강도. 상관 계수는 Pearson의 방법으로 계산 합니다.
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Representative Results
여기에 제시 하는 방법을 사용 하 여, 모터 피 질에서 microelectrode 이식 수술은 완료 된 다음 설립된 절차39,40,41,42, 오픈 필드 그리드 테스트 하 여 다음 총 모터 기능 및 사다리 그립을 평가 강도 정밀한 모터를 평가 하기 위해 테스트 기능27. 모터 기능 테스트는 완료 된 2 x 컨트롤 없이 수술 비 이식 동물 이식된 동물에서 수술 후 16 주 동안 주당. 모든 수술 후 점수 주당 평균 하 고 각 개별 동물의 사전 수술 기준 점수를 표준화 했다. 모든 오류는 평균 (SEM)의 표준 오류로 보고 됩니다.
그들의 심한 운동 기능 측정 스트레스 하 고 행동, 동물 3 분 (그림 1A)에 대 한 오픈 필드 그리드 테스트에서 자유롭게 실행 허용 되었다. 이 테스트에서 다양 한 메트릭을 기록할 수 있습니다, 그리드 라인 크로스, 여행, 총 거리와 동물에 의해 달성 하는 최대 속도의 수를 포함 하 여. 이 이전에 보고 된 데이터에서 교차 하는 그리드 라인의 수는27여. 복구 기간 뒤 첫 주에 (2 주 timepoint), 오픈 필드 그리드 성능 2 그룹 사이에서 상당한 차이 보였다. 그러나, 연구 (그림 1B)의 나머지 부분에 걸쳐 더 아무 의미가 없었다. 제어 및 microelectrode 이식 동물 테스트를 통해 유사 하 게 득점 하 고 성능에 대 한 분산을 동물의 두 세트에서 상대적으로 높았다. 아무 의미가 전체 실험 시간에 걸쳐 동물의 두 세트에 오픈 필드 그리드 성능을 비교할 때 보였다. 동물의 두 그룹 사이 성능 상의 차이가 없습니다 때문에,이 결과 총 모터 적자 또는 모터 피 질27에 microelectrode 주입에 의해 발생 하는 심각 하 게 제한 스트레스 임을 나타내기 위해 해석 했다. 데이터를 해석할 때 그리드 라인의 수에 있는 감소를 넘어, 여행, 총 거리 또는 최대 속도 모든 동물에 의해 달성 총 모터 기능 (표 1) 감소를 나타냅니다.
조정된 이해 및 정밀한 운동 기능 측정, 동물 동물 사다리와 발 전표의 주파수를 교차 했다 시간 기록 했다 수평 사다리 테스트 (그림 2A)에 참여를 했다. 수술 후 사다리 건너 번 각 개별 동물의 사전 수술 점수를 각 동물에 대 한 정규화 된. 따라서, 사다리 및 성능 향상된을 교차 하는 시간에 감소와 일치 하는 양수 백분율 및 부정적인 비율 사다리와 성능 저하 (그림 2B, 교차 하는 시간에 있는 증가와 일치 표 1).
이 이전에 보고 된 데이터에서 임 플 란 트를 받은 데 제어 동물, 수술 후 회복 단계27후에 바로 테스트의 첫 번째 주 동안 (82.6 ± 26.0%) 시간 느린 성능 표시. 수술 후 사다리 테스트의 두 번째 주에 시작, 제어 동물 그들의 기준선 성능 시간을 다시 시작 하 고 유지 점수 그들의 기준선 점수 비교 연구의 과정을 통해 아주 작은 차이.
동물 intracortical microelectrode 수신 성능 저하 곧바로 다음 수술을 보았다. 이 동물 수술 후 테스트의 첫 번째 주에 199.1 ± 61.4%의 그들의 기준선에 비해 시간을 넘어 증가 사다리를 시연 했다. 이식된 동물 연구 기간에 대 한 성능 저하를 표시 하 고 그들의 성과 기준 점수를 반환 하지 않았습니다. 그들의 최악의 이식된 동물에 그들의 초기 성능에 비해 526.9 ± 139.4%의 평균에 11 주 동안 성능이 감소 합니다. 또한, 이식된 동물 제어 동물에 비해 더 높은 차이 보였다. 테스트의 첫 번째 주 동안 제어 및 이식된 동물 사이 상당한 차이가 있었습니다. 그러나, 기준 시간에 비해 백분율 변화에 중요 한 차이 (p < 0.05) 연구에 모든 주에 그룹 사이 보였다 (그림 2B).
정밀한 모터 손상의 증거는 동물의 2 그룹 사이 정면 오른쪽 앞 발 전표의 주파수에 의해 입증 되었다. 전면 오른쪽 앞 발의 성능을 microelectrodes 모터 피 질 앞 발 컨트롤에 대 한 책임의 영역에 있는 두뇌의 왼쪽된 반구에 이식 했다 때문에 특정 관심의 이었다. 세심 한 비디오 분석에 의해 발 전표 chronicled 있었다 고 정량 (그림 2C). 그것은 이식된 동물 제어 동물에 비해 훨씬 더 많은 전면 오른쪽 앞 발 전표를 경험 하는 것을 발견 했다 중요 한 차이가 왼쪽된 발 전표의 주파수에서 볼 수 있었다, 그러나 (0.54 ± 0.07 전면 오른쪽 앞 발의 평균 주당 전표는 0.32 ± 0.02 정면 오른쪽의 평균에 비해 이식된 동물 발 전표 제어 동물에 주 당). 데이터를 해석할 때 사다리를 교차 하는 시간에 증가 또는 발 미 끄 러 짐의 증가 괜 찮 모터 기능 (표 1)에 있는 감소를 나타냅니다.
모터 기능과 미세 조정된 이해의 보조 수단, 동물 동물에 의해가 해지는 최대 그립 강도 기록 된 그립 강도 테스트 (그림 3A) 완료. 개별 동물의 주간 그립 점수는 그들의 사전 수술 기준 그립 강도를 정상화 했다. 그것은 이식된 동물의 수술 후 그립 강도 크게 거의 모든 수술 후 시간 지점에서 제어 동물에 비해 감소 했다 보였다. (그림 3B). 사전 수술 훈련 효과, 가능성이 테스트 다음 제어 동물 그립 강도 향상. 또한, 제어 동물 그립 강도 연구 (p < 0.05)의 과정을 통해 기준 보다 상당히 큰 했다. 흥미롭게도, 이식된 동물 그립 강도 성능 크게 복구 단계 테스트의 첫 번째 주에 초기 (p < 0.01) 보다 더 하지만 천천히 돌아왔다 그들의 기준 성능을. 메모의 동물에 의해 달성 최대 그립 강도 감소 괜 찮 모터 기능 (표 1)에 있는 감소를 나타냅니다.
다양 한 조직학 마커는 두뇌 임 플 란 트, 신경 핵, 이다, 혈액-뇌 장벽 안정성 등 근처 microenvironment 시각화를 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 immunohistochemical IgG, 주로 두뇌에서 찾아낸 일반적인 혈액 단백질에 대 한 얼룩을 수행. 이전 작품이 나타났습니다 IgG 혈액-뇌 장벽 무결성의 유용한 표시기로 항 체 혈액에서 발견 하 고 일반적으로 두뇌16,18에 따라서 주변 뇌 조직에 IgG의 존재 제시 혈액-뇌 장벽43의 무결성에 상관 될 수 있다. 여기, IgG 형광 강도 배경 뇌 조직 및 정량 전극 explantation 구멍의 경계에서 시작 하 고 IgG는 조직에 더 이상 때까지 동심 쓰레기통에 밖으로 이동로 정규화 되었다. 이식된 동물 IgG 강도 제어 동물에 비해 150 µ m 밖으로 구멍 근처에 상당한 증가 보였다. 점차적으로 이식된 microelectrode 구멍에서 발산 하는 거리를 통해 배경 강도 반환 이식된 동물에서 IgG 강도. microelectrode와 이식 적 데 제어 동물에서 혈액-뇌 장벽 없는이 동물에 손상 된 경우 정규화 된 IgG 강도 배경 강도 위에 상당한 수량에 되지 않았습니다.
두 상관 된 중요 한 차이점이 사다리 성능 및 IgG 강도에 보인, 때문에 (그림 4). 여기, 각 동물에 대 한 조직-전극 인터페이스에서 µ m 0-50에서에서 곡선에서 IgG 영역의 정규화 된 형광 강도 연구의 과정을 통해 각 동물의 사다리 공연의 평균와 상관 했다. 상관 계수 0.90의 좋은 모터 성능 및 손상 혈액-뇌 장벽 사이 매우 강한 상관 관계를 보여주는 결정 했다.
그림 1 . 대표적인 오픈 필드 그리드 테스트 결과. 오픈 필드 눈금에 대 한 행동 테스트 설치 테스트 (총 모터와 불안 테스트) (A)이이 패널 표시 합니다. 높이 40cm의 4 불투명 한 벽과 약 33 c m 각의 사각형 아래쪽 섹션 1 m2 아크릴 시트 오픈 필드 눈금 시험에 의하여 이루어져 있었다. 그리드 라인의 수로 심한 모터 함수 성능 측정 (B)이이 패널 쇼 넘어, 기준 성능에 비해. 제어 성능에 상당한 차이 보였다 (n = 10)와 이식 (n = 17) 수술 후 2 주 (p < 0.05)에서 그룹. 모든 오류가 SEM.로 보고 이 그림은 고 스 알라 외. 에서 증 쇄 27 자연 출판 그룹 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 대표 사다리 테스트 결과. (A)이이 패널 표시 (정밀한 모터 기능 테스트)에 대 한 사다리에 대 한 행동 테스트 설치를 테스트 합니다. 2 1 m의 아크릴 면 스테인리스 가로 3 m m 직경 2 센티미터 간격으로 합류 하는 길이 높이, 25 cm 분명 사다리에 의하여 이루어져 있다. (B)이이 패널은 정밀한 모터 기능 성능을 기준 성능에 비해 사다리를 교차 하는 시간에 의해 측정을 보여줍니다. 점선 아래 결과 기준 성능에 비해 성능 저하를 나타냅니다. 성능에 큰 차이 제어 발견 되었다 (n = 10)와 이식 (n = 17) 수술 후 주 3-16에 대 한 그룹 (* p < 0.05 = * * = p < 0.01) 경도 (전체에 걸쳐 공부 하 고 # p < 0.05 =). (C)이이 패널의 오른쪽 앞 발 전표 정량된 인스턴스를 보여 줍니다. 주당 오른쪽 앞 발 전표 발생에 상당한 차이 발견 했다 컨트롤 및 이식된 그룹 비교할 때 (* p < 0.05 =). (D)이 발 슬립의 예입니다. 모든 오류가 SEM.로 보고 이 그림은 고 스 알라 외. 에서 증 쇄 27 자연 출판 그룹 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 대표 그립 강도 테스트 결과. (A)이이 패널 (정밀한 모터 기능 테스트)에 대 한 그립 강도 대 한 설치 행동 테스트를 보여줍니다. 그립 핸들에 연결 된 탑재 강도 게이지와 가중치 기지 그립 강도 미터에 의하여 이루어져 있었다. (B)이이 패널 표시 기준 성능에 비해 정밀한 모터 기능 성능, 최대 그립 강도 발휘 하 여 측정 합니다. 점선 아래 결과 기준 성능에 비해 성능 저하를 나타냅니다. 중요 한 차이 제어 볼 수 있었다 (n = 5)와 이식 (n = 6) 수술 후 거의 모든 주에 대 한 동물 (* p < 0.05 = * * p < 0.01, = * * * p < 0.001 =). 더 의미 제어 동물 주간 및 기준선 공연 사이 보였다 (# = p < 0.05) 이식된 동물 주간 및 기준선 성과 사이 (# # = p < 0.01). 컨트롤 및 이식된 동물 수행 크게 다른 경도 전체 연구 (@ @ @ p < 0.001 =). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . IgG 및 사다리 성과의 상관 관계. 이식의 사이트 정규화 된 IgG 형광 강도 사다리 성능에서 변화를 연관 되었다 그리고 0.901의 상관 계수 (p < 0.001)를 발견 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1. 전반적으로 보여주는 대표적인 동작 데이터 증가 하 고 각 테스트 메트릭에 대 한 초기 계획 점수에 비해 성능이 감소. 녹색 상자는 모터 적자 가능성, 향상된 된 성능을 나타내고 빨간색 상자 모터 기능 적자 가능성이 만드는 성능 저하를 나타냅니다.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜을 효과적으로 그리고 reproducibly 측정 벌금과 총 모터 적자의 설치류 뇌 손상 모델에서 사용 되었습니다. 또한, 모터 피 질에서 microelectrode 주입 다음 조직학 결과 괜 찮 모터 동작의 상관 관계에 대 한 수 있습니다. 메서드는 따라 하기 쉽고, 설정, 저렴 하 고 연구원의 개별 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 또한, 동작 테스트 발생 하지 않습니다 큰 스트레스 나 통증 동물; 오히려, 연구원은 동물 성장 운동 및 테스트와 함께 제공 된 보상을 믿습니다. 이전 연구는 모터, 메모리, 및 기능 손상을44,45모터 피 질 손상이 발생할 수 있습니다 제안 했다. 그러나,이 지식에도 불구 하 고 거기에는 모터 피 질27, 환자의 임상 결과 부정적인 영향을 미칠 수 있는 microelectrode 주입으로 인 한 기능적 영향에 대 한 제한 된 정보가입니다.
수정은 프로토콜, 수술 절차와 동작 테스트를 통해 만들 수 있습니다. 이 프로토콜은 forepaws에 영향을 미치는 지역에서 동물의 모터 피 질에서 microelectrodes 임 플 란 트 하는 절차를 설명 합니다. 이 절차는 전기 자극46 에 대 한 전극 또는 뉼 마약 배달47, 또는 TBI 모델48를 포함 하 여 상해의 종류를 포함 하 여 임 플 란 트를 쉽게 적응 될 수 있다. 추가 수정 점수 통계 오픈 필드 눈금 시험에 사용 하 고 장치를 테스트 하는 사다리를 만들 수 있습니다. 넘어 눈금선의 수 이외에 총 거리 여행, 그리고 최대 속도 동물에 의해 달성, 시간 소비 정체 오른쪽과 왼쪽 회전 수는 모터 성능32 의 추가 매개 변수로 또한 기록 될 수 있습니다. . 사다리 테스트에서 가로49 를 제거 하거나 경사50 에 사다리 증가할 수 있다 어려움, 비록 현재 임 플 란 트와 저자 찾지 못했습니다이이 응용 프로그램에서 잘 모터 적자 애타게 하는 데 필요한. 마지막으로, 여기에 제시 된 테스트 기구 쥐와 함께 사용 하도록 설계 되었습니다, 비록 단위 수 있습니다. 조절 위나 아래로 다양 한 크기의 설치류와 함께 사용할 수 있습니다. 그것은 문제가 발생할 경우 동물 사전 수술 지속적으로 테스트를 완료할 수지 않습니다, 동물은 연구에서 제거 해야 하는 것이 중요.
모든 행동 테스트와 마찬가지로 그것은 중요 한 연구의 과정을 통해 최대한 일관성을 유지 하입니다. 그것은 보였다 테스트 결과 다 수 동물51협력 연구원에 따라, 위치에는 테스트 수행52, 그리고 동물 주택 및 축산 절차53를 포함 하는 환경 요인. 또한, 연구 생산 하는 두개골 craniotomy 절차31 및 무게-드롭 모델54 등 대뇌 피 질의 제어 기계적 변형 TBI의 모델 중 난방 방법으로 뇌 손상에 큰 변화를 보이고 있다 모델55영향. 연구원은, 따라서, 주의 특별 한 수술, 테스트, 주택 조건, 그리고 테스트 인력, 다른 사람 사이에서 일관성을 유지 하기 위해.
이러한 동작 테스트 방법의 미래 방향 수 더 철저 한 결과 제공 하기 위해 여기에 제시 하는 테스트에 따라 확장 됩니다. 예를 들어 물 미로 테스트 또는 터 로드 테스트 더 불안56 추출 또는 모터 기능57 적자를 각각 총 통합 될 수 있습니다. 또한, 미래의 일 또한 뇌에 장치 삽입으로 인 한 조직 손상을 줄이기 위해 목표 수 있습니다. 이 지역에서 현재 작업 산화 치료42,58통해 염증 완화에 초점을 맞춘, 기계적으로 준수41,,5960, 억제는 타고 난의 임 플 란 트 면역 신호 통로14,15및 장치 이식31,61동안 혈관 손상을 감소.
마지막으로, 그것은 현재 일 반드시 두뇌 임 플 란 트를 받는 전형적인 인간의 환자의 특성을 구현 하지 않는 건강, 청소년, 남성 쥐를 사용 하 여 완료 되었다 고려 되어야 한다. 탐구 더 정밀 하 고 심한 모터 기능 작업 특성 질병 모델에 추가 연구 결과 여기에 제시 된 비준 필요 합니다. 다양 한 질병 모델, 이식 및 이식 비 가짜 동물 간의 차이 조건 테스트를 위에서 언급 한 수정 필요할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 지원 부분에서 장점을 검토 수상 #B1495-R (Capadona)과 대통령 이른 경력 포상에 의해 과학자와 엔지니어 (PECASE, Capadona)에서 미국 (미국) 학과의 재향 군인 담당 재활 연구 및 개발 서비스입니다. 또한,이 작품 일부 사무실의 길잡이 국방 장관의 피어 검토 의료 연구에서 프로그램 수상 번호를 통해 건강 문제에 의해 지원 되었다 W81XWH-15-1-0608입니다. 내용을 미국 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다. 저자 박사 히로유키 아라카와 CWRU 쥐 행동 코어 설계 및 테스트 설치류 행동 프로토콜에 대 한 그의 감사 하 고 싶습니다. 저자 또한 제임스 드레이 크와 케빈 탤벗 CWRU 부 기계 및 항공 우주 공학에서 설계 하 고 제조 설치류 사다리 테스트에 그들의 도움에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rats, male, 201-225g | Charles River | CD | |
| Compac5 anesthesia system | Vetequip | 901812 | |
| Electric trimmers | Wahl | 9918-6171 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | 1760 | |
| Gaymar heated water pad and pump | Braintree Scientific Inc | TP-700 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 07-805-5031 | |
| Dental drill | Pearson Dental | O60-0045 | |
| Dura pick | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Silicon shank microelectrode | Made in-house at Cleveland VA Medical Center | N/A | |
| KwikCast silicone elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | |
| Teets dental cement | A-M Systems | 525000 | |
| Webcam HD Pro c920 | Logitec | 960-000764 | |
| Grip strength meter | Harvard Apparatus | 565084 | |
| Minitab 17 statistical software | Minitab Inc | ||
| Open field grid test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A | |
| Ladder test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A | |
| Rabbit anti rat IgG antibody | Bio-Rad | 618501 |
References
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