Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Gnager opptreden for å vurdere funksjonelle underskudd skyldes Microelectrode implantasjon i rotte motorisk Cortex

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/57829
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Advanced Platform Technology Center, Rehabilitation Research and Development, Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Vi har vist at en microelectrode implantasjon i motorisk cortex rotter fører til umiddelbar og varig motor underskudd. Metoder foreslått her disposisjon en microelectrode implantasjon kirurgi og tre gnager atferdsmessige oppgaver å belyse mulige endringer i den fin eller grov motoriske funksjonen på grunn av implantasjon forårsaket skade motorisk cortex.

Abstract

Medisinsk implantert i hjernen holder enormt potensial. Som en del av en hjerne maskin grensesnitt (BMI) demonstrere intracortical microelectrodes evnen å fortegnelse handling potensialer fra individuelle eller små grupper av nerveceller. Slike innspilte signaler har vært brukt tillate pasienter å grensesnitt med eller kontrollere datamaskiner, robot lemmer og egne lemmer. Men har tidligere dyrestudier vist at en microelectrode implantasjon i hjernen ikke bare skader de omkringliggende vev, men kan også resultere i funksjonelle underskudd. Her diskuterer vi en rekke atferdsmessige tester å kvantifisere potensielle motor impairments etter implantering av intracortical microelectrodes i motorisk cortex av rotte. Metodene for åpne feltrutenettet, stigen krysset og grep styrke testing gi verdifull informasjon om mulige komplikasjoner som følge av en microelectrode implantasjon. Resultatene av atferdsmessige testing er korrelert med sluttpunktet histology, gir ytterligere informasjon om patologisk resultatene og virkningene av denne prosedyren på tilstøtende vev.

Introduction

Intracortical microelectrodes ble opprinnelig brukt til å tilordne krets av hjernen, og har utviklet seg til et verdifullt verktøy for å aktivere gjenkjenning av motor intensjoner som kan brukes til å produsere funksjonelle utganger1. Oppdaget funksjonelle utganger kan tilby personer som lider av ryggmargsskade, cerebral parese, amyotrofisk lateral sklerose (ALS) eller andre bevegelse-begrensende forhold kontrollen en datamaskin markøren2,3 eller robot arm4,5,6, eller gjenopprette funksjonen til sin egen deaktivert lem7. Derfor har intracortical microelectrode teknologi framstått som en lovende og raskt voksende felt8.

På grunn av at sett i feltet, er kliniske studier underveis for å forbedre og forstå mulighetene av BMI teknologi5,9,10. Ved å realisere det fulle potensialet i kommunikasjon med nerveceller i hjernen, oppfattes rehabilitering programmene som ubegrenset8. Selv om det er stor optimisme for fremtiden for intracortical microelectrode teknologi, er det også kjent at microelectrodes slutt mislykkes11, muligens på grunn av en akutt neuroinflammatory reaksjon etter implantasjon. Implantering av en utenlandsk materiale i hjernen fører til umiddelbar skade til omkringliggende vev og fører til ytterligere skade forårsaket av neuroinflammatory svaret som varierer avhengig av egenskapene til implantatet12. I tillegg et implantat i hjernen kan forårsake microlesion: en reduksjon i glukose metabolisme antatt å være forårsaket av akutt ødem og blødning på grunn av den enhet innsetting13. Videre er signalkvaliteten og tiden som nyttig signaler inkonsekvent, uansett dyremodell11,14,15,16. Flere studier har vist forbindelsen mellom neuroinflammation og microelectrode ytelse17,18,19. Konsensus av samfunnet er derfor at betennelsesreaksjon i nevrale vevet som omgir microelectrodes, minst delvis kompromisser elektrode pålitelighet.

Mange studier har undersøkt lokal betennelse11,20,21,22 eller utforsket metoder for å redusere skade på hjernen skyldes innsetting11,23, 24,25, med et mål om å forbedre innspillingen ytelsen over tid14,26. I tillegg har vi nylig vist at iatrogenic skade forårsaket av en microelectrode innsetting i motorisk cortex rotter forårsaker en umiddelbar og varig fine motor underskudd27. Derfor formålet med protokollene som presenteres her er å gi forskerne en kvantitativ metode for å vurdere mulig motor underskudd som følge av hjernen traumer etter implantasjon og vedvarende tilstedeværelse av intracortical enheter (microelectrodes i den tilfelle av dette manuskriptet). Virkemåten testene beskrevet her ble utformet å tease ut både brutto- og motorikk impairments, og kan brukes i mange modeller av hjerneskade. Disse metodene er enkel, reproduserbare, og kan enkelt implementeres i en gnager modell. Videre gi metodene presenteres her en sammenheng motor atferd til histologiske utfall, en fordel som inntil nylig forfatterne ikke har sett publisert i feltet BMI. Til slutt, som disse metodene ble utviklet for å teste fin funksjon28, grov motoriske funksjoner29og stress og angst atferd29,30, metodene presenteres her kan også implementeres i en rekke hodeskade modeller der forskerne ønsker å styre ut (eller inn) alle motorikk underskudd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer og dyr omsorg praksis ble godkjent av og utført i henhold til Louis Stokes Cleveland Institutt for Veteraner saker Center institusjonelle dyr helsetjenester og bruk komiteer.

Merk: For å utdanne forskere på avgjørelsen om bruk av stikk skade modell som en kontroll, er det anbefalt å vurdere arbeidet gjort av Potter et al. 21.

1. microelectrode implantasjon kirurgisk prosedyre

  1. Pre kirurgisk dyr forberedelse
    1. Bedøve dyr i en induksjon kammer med isoflurane (2-4%). Under anestesi, kontinuerlig overvåke dyret med en viktig målesystem overvåke hjertefrekvensen og blod oksygen innholdet.
    2. Flytte dyret til en nesen kjegle å fortsette anesthetic. Subcutaneously (SQ) injisere cephalosporin antibiotika, f.eks cefazolin (25 mg/kg) og en ikke-steroide anti-inflammatorisk, f.eks carprofen (5 mg/kg) å forhindre infeksjon og administrere smerte, henholdsvis.
    3. Rikelig gjelde ophthalmica salve dyrets øyne å hindre tørking.
    4. Bruker små dyr nagle avklipt, klippe tåneglene for å hindre at dyret skrape bildet under sår helbredelse. Kontroller at neglene ikke beskjæres for kort, da dette kan føre til smerter og blødninger for dyret.
    5. Barbere dyrets hodet grundig bak ørene til mellom øynene med en elektrisk barberhøvel trimmer.
    6. Gi en lokal analgesi SQ injeksjon av bupivacaine (0,3 mL av 0,125% bupivacaine utvannet fra lagerløsning) på toppen av dyrets leder innen innsnitt.
    7. Montere dyr på en stereotaxic ramme, bruke øret barer for å holde hodet fra flytte under operasjonen. Plass en sirkulerende vann varmeputen under dyret å opprettholde dyrets temperaturen.
    8. Bruk en steril drapere, f.eks institusjonelt godkjent steril plast brytes, isolere kirurgiske feltet.
    9. Scrub det kirurgiske området med en vekslende betadine løsning og isopropanol scrubs.
    10. Utføre en tå knipe i henhold til institusjonelle protokollen å sikre dyret under kirurgisk flyet.
  2. Forberede dyr implantasjon
    1. Opprette et snitt på ca 1 i ned midtlinjen utsette skallen med en nr. 10 skalpell blad. Rett ut fjerne periosteum bruker en bomull-tipped applikatoren og stoppe enhver blødning bruker en gauze pute. Trekke de omkringliggende vev med alligator klipp og vaske og tørke skallen med hydrogenperoksid.
    2. Legg noen dråper cyanoacrylate-baserte vev lim på utsatte skallen å forbedre dental sement bånd i senere trinn.
    3. I den valgte halvkulen, merke området motorisk cortex tilsvarer forepaw bevegelse ca 3 mm lateral midtlinjen og 2 mm anterior bregma ved å opprette et kallenavn i benet.
    4. Fjerne en del av skallen bruke 1.75 mm runde spissen tannlege bore, tar spesielle hensyn ikke å bore for fort eller for dypt og støtte en hånd på stereotaxic ramme. Drill bør brukes til skallen midlertidig for å unngå overoppheting31.
    5. Gjenspeile dura bruker en fin hekta 45° dura hakke.
    6. Rengjør alle blødning bruker bomull-tipped applikatoren og saltvann, ta vare å ikke direkte berøring hjernen overflaten.
  3. Innsetting av microelectrode i motorisk cortex
    1. Nøye montere den sterilisert microelectrode i universell holderen på stereotaxic rammen, tar forsiktighet for ikke å støte skaft av elektroden. Kontroller at headstage-grensesnittkontakt av elektroden holdes fast av abonnenten.
      Merk: Her en ikke-fungerende Michigan-stil silisium shank elektrode måler 2 mm x 123 µm x 15 µm ble brukt, og skaft ble satt inn med fine tang.
    2. Bruker micromanipulators på stereotaxic rammen, plasser tuppen av elektroden over de åpne craniotomy.
    3. Forsiktig lavere elektroden omlag 2 mm i hjernen ved hjelp av micromanipulators som måler guide (avhengig av valg av elektrode, kan en automatisert innsetting på kontrollert priser være nødvendig.) Ta forsiktig å unngå alle synlige blodkar mulig. Når elektroden er plassert, nøye løse ut kontakten fra universal abonnenten og trekke innsetting armen.
    4. Rengjør alle blø fra rundt elektroden bruker bomull-tipped applikatoren og saltvann.
    5. Forsegle av craniotomy rundt implantert elektroden bruker en silikon-elastomer.
    6. Fastsette elektroden til skallen bruke dental sement.
    7. Når sement er helt tørt, bringe kantene av innsnitt sammen foran og bak sement headcap og Sutur dem stengt.
  4. Postoperativ pleie
    1. Tillate dyr å gjenopprette på en sirkulerende vann varmeputen mens du fortsetter å overvåke sine vitale. Unngå å bruke varme lamper som temperaturen fra lamper er vanskeligere å kontrollere og dyr kan overopphetes.
    2. Når Dyret er fullt våken, flytte dyret til en ren bur med lett tilgang til mat og vann.
    3. Under postoperativ dager 1-3, gi dyrene SQ cephalosporin antibiotika (25 mg/kg) og en ikke-steroide anti-inflammatorisk (5 mg/kg) å forhindre infeksjon og administrere deres smerte.
    4. Overvåke dyr daglig tegn på smerte eller ubehag, blødning, vekt endre eller Sutur spørsmål gjennom minst postoperativ dag 5.

2. atferdsmessige Testing

  1. For alle atferd testing teste dyrene 2 x per test i uken før elektrode implantasjon kirurgi å beregne deres pre-kirurgi planlagte score. Etter operasjonen, la dyrene hvile for 1 uke før begynnelsen atferd testing 2 x per uke på hver test. Konsekvent testing forhold bør brukes gjennom hele studiet for både før og etter kirurgiske testing for å redusere virkningene av stress på forestillingen, som kan føre til en måling av angst.
    1. Rengjør alle teste utstyr med klor dioxide-baserte sterilisering i begynnelsen av hver testing økt og etter hvert dyr.
    2. Filmen åpen rutenettet og stigen testing. Disse testene krever et videokamera (1080p, minimum 15 fps, 78° diagonale synsfelt), en bærbar PC, og plass til å lagre videodata.
    3. I begynnelsen av hver testing dag, ta dyrene til testing rom og tillate dem å acclimate til minst 20 min før du begynner testing. Rommet bør være lys og temperatur-kontrollert, og det samme personellet skal fullføre alle testing. Ideelt sett brukes samme rom for alle dyr i løpet av testingen uten endringer til rommet.
    4. Bruk mat belønninger å oppmuntre dyrene å fullføre oppgaver, spesielt i stigen trening. Korn eller små biter av banan chips eller kjeks gjøre god belønning.
    5. Normalisere alle ukentlige testing forestillinger til den pre-kirurgi score for hvert individuelle dyr (Formel 1).
      Formel 1:Equation 1
  2. Åpne feltet rutenettet testing
    Merk: Åpen rutenettet testen ble bygget huset og har en løpebånd av 1 m2 med ca 40 cm høye ugjennomsiktige siden vegger. Bunnen løpebånd av rutenettet er inndelt i 9 lik rutene fra undersiden med tape (figur 1A). Innspillingen kameraet er permanent montert over midten av rutenettet på stillaset.
    1. For å begynne testingen for åpne-feltet rutenett, plassere dyret i midten av rutenettet vendt fra testeren.
    2. Tillate dyr å løpe fritt for 3 min mens en video.
    3. Når Dyret er fullført testing, fjerne dyret fra nettet og returnere det til buret. Rengjør rutenettet grundig med klor dioxide-baserte sterilisering.
    4. Test hvert dyr 1 x per testing dag.
    5. Analyser antall rutenett krysset, den totale avstanden reist og maksimale hastigheten av dyret som beregninger av brutto motor funksjonen ved hjelp av en sporing.
      Merk: Dataene som presenteres her kvantifisert manuelt av trente forskere, men det er foretrekker å bruke en nylig utviklet internt sporing algoritmen32.
  3. Stigen testing
    Merk: Stigen testen ble bygget huset og består av 2 klar akryl sideveggene, hver 1 m lengde, forbundet med 3 mm diameter trinnene fordelt på 2 cm fra hverandre (figur 2A). Stigen testing er en dyktig test, og derfor krever en uke med trening før innspillingen de pre-kirurgi planlagte resultatene. Protokollen for trening og testing er den samme.
    1. Flytte dyret til en midlertidig ren holder bur skal begynne stigen testing.
    2. Angi stigen slik at den bygger 2 burene. Start slutten av stigen hviler på en ren bur og på Fullfør avslutte hviler på dyr hjem bur som en motivasjon for å fullføre kjøre.
    3. Plasser samme (eller lignende) video kameraet på et stativ på midten av stigen. Plasseringen av kameraet bør være rung høyde og at hele stigen sees.
    4. Med video kameraet kjører, holde dyr til startstreken på stigen, slik at sin front paws å ta den første rung.
    5. Tillate dyr å krysse stigen i eget tempo. Tid utløpt mellom tidspunktet når dyrets pote berører den første rung og mållinjen på tredje til siste trinn vil avgjøre dyrets tid å krysse.
    6. Hvis dyret snur seg på vegen eller ikke beveger for en periode på 20 s, vurdere dyret å ha mislyktes kjøre. Tilordne dyrene straff score gang for hver mislyktes kjører. Bestemme straffen tiden ved tregest ytelse under pre-kirurgi testing27.
    7. Lar hvert dyr å krysse stigen 5 x per testing dag ca 1 min resten mellom hver kjøre.
    8. Gjennomsnittlig de raskeste 3 går per dag som en beregning av fine motorikk. I tillegg Registrer antall ganger hver av foran paws slips av trinnene ved hjelp av en sporing.
      Merk: Dataene som presenteres her kvantifisert manuelt av trente forskere, men det er foretrekker å bruke en nylig utviklet in-house sporing algoritmen bruker Dona et al. 32.
  4. Grep styrke testing
    1. Kalibrere grep Passordstyrke meter før hver testing økt, og måle styrken i gram.
    2. Plasser styrkemåler grep på kanten av en teller med grep styret utvidet over gulvet.
    3. Tillate dyr å ta styret med både foran paws mens du holder dyret ved foten av halen (Figur 3A).
    4. Når Dyret har med hver pote, trekk dyr fra måleren ved foten av halen med langsom og jevn kraft.
    5. Registrere maksimalt styrke utøves av dyret som vises på digitalt utgang av grep styrke måleren.
    6. Test hvert dyr 3 x per testing dag med ca 2 min hvile mellom hver test.
    7. Som en beregning av fin funksjon, registrere og gjennomsnittlig maksimalt styrke utgang fra hver av 3.

3. etter atferdsmessige protokollen

  1. Etter alle opptreden testing (f.eks, 8-16 uker etter implantation), bedøve dyrene dypt bruker ketamin (160 mg/kg) og xylazine (20 mg/kg), transcardially perfuse dem, høste deres hjerne og cryo-slice dem, og flekken vevet bruker immunohistochemical markører for å kvantifisere cellulær respons rundt implantasjon33,34,35,36,37,38.

4. statistisk analyse

Merk: En potensielle makt analyse er sterkt foreslått for noen studier søker å svare på en bestemt problemstilling. Makt-analyse, som informerer antall dyr kreves for å oppnå en statistisk betydning for en bestemt studie design, bør være basert på bestemt forskning hypotesen utformingen av forsøket, estimert effekt størrelse og variasjon av de tiltenkte behandlingene, som også effekt størrelsen kreves for å oppnå klinisk eller vitenskapelige relevans.

  1. Utføre statistiske analyser ved hjelp av vanlige statistisk programvare.
  2. Tabulere beskrivende statistikk, og vise dem i gjennomsnittlig ± standardfeil.
  3. Analysere atferdsmessige ytelsen [i åpne feltrutenettet (trinn 2.2), stige (trinn 2.3) og grep styrke testing (trinn 2.4)] på hver ukentlige tidspunkt å sammenligne kontroll vs implantert grupper bruker en t-test for to utvalg. Vurdere hver ukentlige tidspunkt en uavhengig mål.
  4. Kvantifisere langsgående ytelsen ved hjelp av en blandet effekt lineær modell. Uken og gruppen er faste faktorer og en eksperimentelle dyr er nestet i gruppen som en tilfeldig effekt. En variansanalyse (ANOVA) brukes til å bestemme faktoren effekten med en betydning p < 0,05.
  5. Sammenligne stigen resultatene med immunoglobin G (IgG) intensitet bruker en lineær regresjonsanalyse. Beregne korrelasjonskoeffisienten ved en Pearsons metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av metodene som presenteres her, er en microelectrode implantasjon kirurgi i motorisk cortex fullført følgende etablerte prosedyrer39,40,41,42, etterfulgt av åpen rutenettet testing for å vurdere grov motoriske funksjoner og stige og grep fungerer styrke testing for å vurdere fine motoren27. Funksjonstesting var fullført 2 x per uke for 16 uker etter operasjonen i implantert dyrene, med ingen kirurgi ikke implantert dyr som en kontroll. Alle etter operasjonen score var gjennomsnitt per uke og normalisert til hvert individuelle dyr pre-kirurgi planlagte score. Alle feil rapporteres som standard feil av gjsnitt (SEM).

Å måle deres grov motoriske funksjoner og stress atferd, ble dyr tillatt å løpe fritt i en åpen rutenettet test for 3 min (figur 1A). Ulike beregninger fra denne testen kan registreres, inkludert rutenettet linjer cross, den totale avstanden reist, og den maksimale hastigheten av dyret. Denne tidligere rapporterte data presenteres antall rutenettlinjer krysset27. I den første uken etter oppgangen perioden (2 ukers timepoint), en betydelig forskjell ble sett i åpne-feltet rutenettet ytelse mellom 2. Men var det ingen videre betydning gjennom resten av studien (figur 1B). Kontroll og microelectrode-implantert dyr scoret tilsvarende gjennom testing, og forskjellen i ytelse var relativt høy i settene av dyr. Ingen betydning ble sett ved sammenligning åpen rutenettet ytelsen i settene av dyr over hele eksperimentelle tiden. Fordi det var ingen forskjell i ytelse mellom 2 dyr, ble resultatet tolket som angir at det er ingen brutto motor underskudd eller sterkt begrenser stress på grunn av en microelectrode implantasjon i motorisk cortex27. Når den tolker dataene, en nedgang i antall rutenettlinjer krysset, den totale avstanden reist, eller den maksimale hastigheten av dyret alle tyder på en nedgang i sin brutto funksjon (tabell 1).

For å måle koordinert forståelse og fin funksjon, tok dyr del i en horisontal stigen test (figur 2A) hvor tiden det tok dyr å krysse stigen og hyppigheten av pote slips ble registrert. Etter operasjonen stigen krysset ganger var normalisert for hvert dyr til hvert individuelle dyr pre-kirurgi score. Derfor en positiv prosentverdi sammenfaller med en nedgang i krysser stigen og en økt ytelse og en negativ prosentverdi sammenfaller med en økning i krysser stigen og en redusert ytelse (figur 2B, Tabell 1).

I dette tidligere rapporterte data vises kontroll dyrene, etter å ha mottatt ingen implantat, tregest ytelse ganger (82.6 ± 26.0%) i løpet av første uken etter operasjonen testing umiddelbart etter utvinning fase27. Begynner den andre uken etter operasjonen stigen testing, kontroll dyrene gjenopptatt sine planlagte ytelse tider og vedlikeholdes score sammenlignes med deres opprinnelige score i løpet av studiet med lite avvik.

Dyrene mottar en intracortical microelectrode så en redusert ytelse straks etter kirurgi. Disse dyrene vist en økt stige over tid i forhold til deres opprinnelige 199.1 ± 61,4% i den første uken etter operasjonen testing. Implantert dyrene vises en redusert ytelse for varigheten av studien, og resultatene kom ikke tilbake til sine opprinnelige score. På sitt verste, implantert dyr redusert ytelse i løpet av uke 11 til et gjennomsnitt på 526.9 ± 139.4% i forhold til deres opprinnelige ytelse. I tillegg implantert dyrene viste en høyere varians sammenlignet med kontrollen dyr. Det var ingen signifikant forskjell mellom kontrollen og implantert dyr i løpet av første uken med testing. Imidlertid en betydelig forskjell i prosent endring i forhold til den opprinnelige tiden ble sett mellom alle etterfølgende uker i studien (p < 0,05) (figur 2B).

Ytterligere bevis for fine motor verdifall ble demonstrert av hyppigheten av høyre slips mellom 2 grupper av dyr. Ytelsen til fronten høyre labben var av spesiell interesse fordi microelectrodes ble implantert i venstre halvkule av hjernen i regionen av motorisk cortex for foran labben kontrollen. Grundig video analyse, pote slips var chronicled og kvantifisert (figur 2C). Mens ingen signifikante forskjeller ble sett i frekvensen av venstre labb slips, ble det funnet at implantert dyrene opplevde betydelig mer høyre slips sammenlignet med kontrollen dyr (gjennomsnittlig 0.54 ± 0,07 foran rett pote glir per uke i den implantert dyr i forhold til et gjennomsnitt på 0.32 ± 0,02 høyre pote slips per uke i kontrollen dyr). Når den tolker dataene, viser en økning i tiden å krysse stigen eller en økning i antall pote følgesedler en nedgang i fine funksjon (tabell 1).

Som en sekundær koordinert forståelse og fin funksjon gjennomført dyrene grep styrke testing (Figur 3A) der maksimalt styrke utøves av dyrene ble registrert. Enkelte dyr ukentlige grep poeng var normalisert til deres pre-kirurgi planlagte grep styrke. Det var sett at implantert dyr etter operasjonen grep styrke var betydelig redusert sammenlignet med kontrollen dyr på nesten alle etter operasjonen tidspunkt. (Figur 3B). Kontrollen dyr grep styrke forbedret etter pre-kirurgi testing, sannsynligvis på grunn av treningseffekten. Videre var kontroll dyr grep styrke betydelig større enn opprinnelige i løpet av studien (p < 0,05). Interessant, ble implantert dyr grep styrke ytelse betydelig verre enn opprinnelige (p < 0,01) i den første uken i testing etter restitusjonsfasen, men langsomt tilbake til sin opprinnelige ytelse. Legg merke angir en nedgang i maksimalt styrken av dyret en nedgang i fine funksjon (tabell 1).

Ulike histologiske indikatorer kan brukes å visualisere microenvironment nær en hjerne implantat, inkludert neuronal kjerner, astrocyttene og blod - hjerne barrieren stabilitet. Her utført vi immunohistochemical flekker for IgG, et felles blod protein ikke ofte funnet i hjernen. Tidligere arbeid har vist at IgG er en nyttig indikator på blod - hjerne barrieren integritet som et antistoff funnet i blodet, og ikke normalt finnes i hjernen16,18, og derfor tilstedeværelsen av IgG i omkringliggende hjernevev kan samsvares med integriteten til blod - hjerne barrieren43. Her var IgG fluorescens intensitet normalisert bakgrunn hjernevevet og kvantifisert starter på grensen av elektroden explantation hullet og flytte i konsentriske hyller til IgG var ikke lenger i vevet. Implantert dyrene viste en betydelig økning i IgG intensitet nær hullet ut til 150 µm sammenlignet med kontrollen dyr. IgG intensiteten i implantert dyr etter hvert tilbake til bakgrunnen intensitet over avstand utstrålende fra implantert microelectrode hullet. I kontrollen dyr, har aldri blitt implantert med en microelectrode, var normalisert IgG intensiteten ikke tilstede i betydelig mengder over bakgrunnen intensitet som blod - hjerne barrieren ikke ble skadet av disse dyrene.

Fordi betydelige forskjeller ble sett både i stigen ytelse og IgG intensitet, to var korrelert (Figur 4). Her var normalisert fluorescerende intensiteten av IgG området under kurven fra 0-50 µm fra vev elektrode grensesnittet for hvert dyr korrelert med gjennomsnittet av hvert dyr stige ytelse i løpet av studiet. En korrelasjonskoeffisienten til 0.90 identifiserte, demonstrere en meget sterk korrelasjon mellom fin motor ytelse og skade blod - hjerne barrieren.

Figure 1
Figur 1 . Representant åpne feltet rutenettet testresultater. (A) dette panelet viser en opptreden testing oppsett for en åpen feltrutenettet test (for brutto motor og angst testing). Åpen rutenettet testen består av en 1 m2 akryl ark med 4 ugjennomsiktig vegger 40 cm i høyden og firkantet nedre deler av ca 33 cm hver. (B) dette panelet viser en grov motoriske funksjoner ytelse målt i antall rutenettlinjer krysset, sammenlignet med den opprinnelige ytelsen. En betydelig forskjell i ytelse ble sett mellom kontrollen (n = 10) og den implanterte (n = 17) grupper på to uker etter operasjonen (p < 0,05). Alle feil rapporteres som SEM. Dette tallet er gjengitt fra Goss-Varley et al. 27 med tillatelse fra naturen Publishing Group. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Representant stigen testresultater. (A) dette panelet viser en opptreden testing oppsett for en stige test (for fin funksjonstesting). Stigen består av 2 klar akryl sider av 1 m i lengde og 25 cm i høyden, sammen med rustfritt stål trinnene fordelt på 2 cm 3 mm diameter. (B) dette panelet viser fin funksjon ytelse målt ved krysser stigen, sammenlignet med den opprinnelige ytelsen. Resultatene under den stiplede linjen indikerer en reduksjon i ytelse i forhold til den opprinnelige ytelsen. En betydelig forskjell i ytelse ble oppdaget mellom kontrollen (n = 10) og den implanterte (n = 17) grupper etter operasjonen uker 3-16 (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) og studere langs (over hele # = p < 0,05). (C) dette panelet viser en kvantifisert forekomst av rett foran labben følgesedler. En betydelig forskjell ble oppdaget i forekomsten av rett foran labben slips per uke ved sammenligning av kontrollen og implantert grupper (* = p < 0,05). (D) Dette er et eksempel på en labb slip. Alle feil rapporteres som SEM. Dette tallet er gjengitt fra Goss-Varley et al. 27 med tillatelse fra naturen Publishing Group. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Representant grep styrke testresultater. (A) dette panelet viser en opptreden testing oppsett for grep styrke (for fin funksjonstesting). Grep styrkemåler består av en veiede basis med en montert styrken måle koblet til en grep styret. (B) dette panelet viser fin funksjon ytelsen, målt ved maksimalt styrke utøvde sammenlignet med den opprinnelige ytelsen. Resultatene under den stiplede linjen indikerer en reduksjon i ytelse i forhold til den opprinnelige ytelsen. Betydelige forskjeller ble sett mellom kontrollen (n = 5) og den implanterte (n = 6) dyr i nesten alle post-kirurgiske uker (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Videre betydning ble sett mellom kontrollen dyr ukentlige og planlagte forestillinger (# = p < 0,05) og mellom implantert dyr ukentlige og planlagte forestillinger (## = p < 0,01). Kontrollen og implantert dyrene utført signifikant forskjellig langs over hele undersøkelsen (@@@ = p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Korrelasjon av IgG og stigen. En normalisert IgG fluorescens intensitet rundt implantasjon var korrelert med en endring i stigen ytelse, og en korrelasjonskoeffisienten til 0.901 ble funnet (p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1. Samlet representant atferd data viser øke og reduksjon i ytelse i forhold til grunnlinjen score for hver testing beregning. De grønne boksene representerer en forbedret ytelse som gjør motor underskudd usannsynlig, og de røde boksene representerer en redusert ytelse som gjør motorikk underskudd sannsynlig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen skissert her har brukt effektivt og reproduserbar måle både fin og grov motoriske underskudd i en modell av gnager hjerneskade. I tillegg gir det korrelasjon av fine motor virkemåten til histologiske utfall etter en microelectrode implantasjon i motorisk cortex. Metodene er enkle å følge, rimelig å sette opp, og kan endres for å passe forskerens individuelle behov. Videre medfører atferd testing ikke mye stress eller smerte til dyrene; Snarere, forskerne mener dyrene vokste til trening og belønninger som fulgte med testing. Tidligere studier har antydet at motorisk cortex skade kan forårsake motor, minne og funksjonelle skade44,45. Men til tross for denne kunnskapen er det begrenset informasjon på funksjonell effekten forårsaket av en microelectrode implantasjon i de motorisk cortex27, som kan negativt påvirke de kliniske utfallene hos pasienter.

Endringer kan gjøres gjennom protokollen, både i den kirurgiske prosedyren og atferd testing. Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å implantatet microelectrodes i motorisk cortex av dyr i regionen påvirker forepaws. Denne fremgangsmåten kan lett tilpasses for å variere implantatet, inkludert elektroder elektrisk stimulering46 eller cannulas for stoffet levering47eller av skade, inkludert en TBI modell48. Ytterligere endringer kan gjøres scoring beregningene som brukes på åpen rutenettet test og stigen testing apparater. I tillegg til antall støttelinjer krysset, den totale avstanden reist, og maksimale hastigheten av dyret, tidsbruk stillestående og antall høyre og venstre svinger kan også registreres som tilleggsparametere motor, er ytelsen32 . I stigen testen, kan fjerne trinnene49 eller plassere stigen på en skråning50 øke problemer, selv om med gjeldende implantater forfatterne ikke fant nødvendig å tease ut fine motor underskudd i dette programmet. Til slutt, selv om testing apparatet presenteres her er utformet for bruk med rotter enhetene kan skaleres opp eller ned skal brukes med ulike størrelse gnagere. Det er viktig å merke seg at hvis det oppstår problemer der et dyr er ikke kjøpedyktig fullstendig pre-kirurgi testing konsekvent, dyr bør fjernes fra studien.

Som med alle opptreden testing, er det avgjørende å være så konsekvent som mulig i løpet av studiet. Det har vist at testresultatene kan variere basert på forskeren arbeider med dyr51, plasseringen der testing er utført52og miljømessige faktorer inkludert dyr bolig og røkting prosedyrer53. I tillegg har forskning vist stor variasjon i produksjon en hjerneskade som skallen oppvarming under en craniotomy prosedyre31 og modeller av TBI inkludert vekt-slipp modell54 og mekanisk variasjon i en kontrollert kortikale påvirke modell55. Forskere bør derfor ta spesiell omsorg å beholde konsekvensen i kirurgiske prosedyren, testing og boforhold og i testing personellet, blant andre.

Fremtidige retninger av disse atferd testmetoder kan utvide ved testing presenteres her for å gi mer grundig resultater. For eksempel kan en vann labyrint eller en rotor rod testen være innarbeidet ytterligere ekstra angst56 eller grov motoriske funksjoner57 underskudd, henholdsvis. I tillegg kan fremtidige arbeidet også sikte på å redusere vevsskade forårsaket av en enhet innsetting i hjernen. Nåværende arbeid på dette området har fokusert på betennelse klimatiltak gjennom antioksidant behandlinger42,58, mekanisk kompatibel implantater41,59,60, hemming av det medfødte immunitet signalering veien14,15, og redusere vaskulære skader under en enhet implantasjon31,61.

Til slutt må det vurderes at arbeidet ble fullført med sunn, juvenile, mannlig rotter som ikke nødvendigvis legemliggjøre kjennetegner typiske menneskelige pasienten mottar en hjerne implantat. Ytterligere forskning å utforske videre fin og grov motoriske funksjoner aktiviteter i karakteristiske sykdom modeller må ratifisere resultatene presenteres her. I varierende sykdom modeller krever forskjellene mellom implantert og ikke-implantert humbug dyr nevnte endringene teste betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet delvis av Merit gjennomgang Award #B1495-R (Capadona) og Presidential tidlig karriere Award for forsker og ingeniører (PECASE, Capadona) fra USA (US) Institutt for Veteraner saker rehabilitering forskning og Webområdeutvikling tjeneste. I tillegg, var dette arbeidet støttes delvis av Office for Assistant Secretary of Defense for helse saker gjennom Peer vurdert medisinsk forskningsprogrammet under prisen nr. W81XWH-15-1-0608. Innholdet representerer ikke synspunktene til det amerikanske Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Hiroyuki Arakawa i CWRU gnager atferd kjernen for hans veiledning i å utforme og teste gnager atferdsmessige protokoller. Forfatterne vil også gjerne takke James Drake og Kevin Talbot fra CWRU avdeling av mekanisk og luftfartsteknologi for deres hjelp i design og produksjon gnager stigen testen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley rats, male, 201-225g Charles River CD
Compac5 anesthesia system Vetequip 901812
Electric trimmers Wahl 9918-6171
Stereotaxic frame David Kopf Instruments 1760
Gaymar heated water pad and pump Braintree Scientific Inc  TP-700
Vetbond tissue adhesive 3M 07-805-5031
Dental drill Pearson Dental O60-0045
Dura pick Fine Science Tools 10064-14
Silicon shank microelectrode Made in-house at Cleveland VA Medical Center N/A
KwikCast silicone elastomer World Precision Instruments KWIK-CAST
Teets dental cement  A-M Systems 525000
Webcam HD Pro c920 Logitec 960-000764
Grip strength meter Harvard Apparatus 565084
Minitab 17 statistical software Minitab Inc
Open field grid test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Ladder test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Rabbit anti rat IgG antibody Bio-Rad 618501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donoghue, J. P. Bridging the brain to the world: a perspective on neural interface systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
  2. McFarland, D. J., Sarnacki, W. A., Wolpaw, J. R. Electroencephalographic (EEG) control of three-dimensional movement. Journal of Neural Engineering. 7 (3), 036007 (2010).
  3. Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17849-17854 (2004).
  4. Bell, C. J., Shenoy, P., Chalodhorn, R., Rao, R. P. Control of a humanoid robot by a noninvasive brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 5 (2), 214-220 (2008).
  5. Collinger, J. L., et al. High-performance neuroprosthetic control by an individual with tetraplegia. The Lancet. 381 (9866), 557-564 (2013).
  6. Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
  7. Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping movements through brain-controlled muscle stimulation in a person with tetraplegia: a proof-of-concept demonstration. The Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
  8. Bowsher, K., et al. Brain-computer interface devices for patients with paralysis and amputation: a meeting report. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 023001 (2016).
  9. Taylor, D. M., Tillery, S. I., Schwartz, A. B. Direct cortical control of 3D neuroprosthetic devices. Science. 296 (5574), 1829-1832 (2002).
  10. Taylor, D. M., Tillery, S. I., Schwartz, A. B. Information conveyed through brain-control: cursor versus robot. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (2), 195-199 (2003).
  11. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
  12. Anderson, D. J. Penetrating multichannel stimulation and recording electrodes in auditory prosthesis research. Hearing Research. 242 (1-2), 31-41 (2008).
  13. Pourfar, M., et al. Assessing the microlesion effect of subthalamic deep brain stimulation surgery with FDG PET. Journal of Neurosurgery. 110 (6), 1278-1282 (2009).
  14. Hermann, J. K., et al. Inhibition of the cluster of differentiation 14 innate immunity pathway with IAXO-101 improves chronic microelectrode performance. Journal of Neural Engineering. , (2018).
  15. Bedell, H. W., et al. Targeting CD14 on blood derived cells improves chronic intracortical microelectrode performance in chronic modified state of neuroinflammation. Biomaterials. 163, 163-173 (2018).
  16. Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
  17. Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
  18. Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
  19. Kozai, T. D., et al. Effects of caspase-1 knockout on chronic neural recording quality and longevity: insight into cellular and molecular mechanisms of the reactive tissue response. Biomaterials. 35 (36), 9620-9634 (2014).
  20. Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
  21. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
  22. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983 (1-2), 23-35 (2003).
  23. Gunasekera, B., Saxena, T., Bellamkonda, R., Karumbaiah, L. Intracortical recording interfaces: current challenges to chronic recording function. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 68-83 (2015).
  24. Villalobos, J., et al. Preclinical evaluation of a miniaturized Deep Brain Stimulation electrode lead. Conference Proceedings: Annual International Conferences of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 6908-6911 (2015).
  25. Zhong, Y., Bellamkonda, R. V. Controlled release of anti-inflammatory agent alpha-MSH from neural implants. Journal of Controlled Release. 106 (3), 309-318 (2005).
  26. Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), e3565 (2012).
  27. Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: implications on potential considerations to brain computer interfacing and human augmentation. Scientific Reports. 7, 15254 (2017).
  28. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  29. Bailey, K. R., Crawley, J. N. Anxiety-related behaviors in mice. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. chapter 5 (2009).
  30. Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. European Journal of Pharmacology. 463 (1-3), 3-33 (2003).
  31. Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy procedure: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. , (2017).
  32. Dona, K. R., et al. A novel single animal motor function tracking system using MATLAB's computer vision toolbox to assess functional deficits. Journal of Visualized Experiments. , Under Review (2018).
  33. Ereifej, E. S., et al. Implantation of neural probes in the brain elicits oxidative stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2018).
  34. Ereifej, E. S., et al. The neuroinflammatory response to nanopatterning parallel grooves into the surface structure of intracortical microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
  35. Ravikumar, M., et al. The roles of blood-derived macrophages and resident microglia in the neuroinflammatory response to implanted intracortical microelectrodes. Biomaterials. 0142-9612 (35), 8049-8064 (2014).
  36. Potter-Baker, K. A., et al. A comparison of neuroinflammation to implanted microelectrodes in rat and mouse models. Biomaterials. 34, 5637-5646 (2014).
  37. Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
  38. Ravikumar, M., et al. The effect of residual endotoxin contamination on the neuroinflammatory response to sterilized intracortical microelectrodes. Journal of Materials Chemistry B. 2, 2517-2529 (2014).
  39. Potter, K. A., Simon, J. S., Velagapudi, B., Capadona, J. R. Reduction of autofluorescence at the microelectrode-cortical tissue interface improves antibody detection. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 96-105 (2012).
  40. Potter, K. A., et al. Curcumin-releasing mechanically-adaptive intracortical implants improve the proximal neuronal density and blood-brain barrier stability. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2209-2222 (2014).
  41. Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11, 056014 (2014).
  42. Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
  43. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
  44. Hamm, R. J., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Lyeth, B. G., Jenkins, L. W. The rotarod test: an evaluation of its effectiveness in assessing motor deficits following traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 11 (2), 187-196 (1994).
  45. Teuber, H. L. Recovery of function after brain injury in man. Ciba Foundation Symposium. (34), 159-190 (1975).
  46. Carmel, J. B., Kimura, H., Martin, J. H. Electrical stimulation of motor cortex in the uninjured hemisphere after chronic unilateral injury promotes recovery of skilled locomotion through ipsilateral control. Journal of Neuroscience. 34 (2), 462-466 (2014).
  47. Hayn, L., Koch, M. Suppression of excitotoxicity and foreign body response by memantine in chronic cannula implantation into the rat brain. Brain Research Bulletin. 117, 54-68 (2015).
  48. Marklund, N. Rodent models of traumatic brain injury: methods and challenges. Methods in Molecular Biology. 1462, 29-46 (2016).
  49. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
  50. Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
  51. Chesler, E. J., Wilson, S. G., Lariviere, W. R., Rodriguez-Zas, S. L., Mogil, J. S. Influences of laboratory environment on behavior. Nature Neuroscience. 5 (11), 1101-1102 (2002).
  52. Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284 (5420), 1670-1672 (1999).
  53. Richter, S. H., Garner, J. P., Auer, C., Kunert, J., Wurbel, H. Systematic variation improves reproducibility of animal experiments. Nature Methods. 7 (3), 167-168 (2010).
  54. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  55. Osier, N. D., Dixon, C. E. The controlled cortical impact model: applications, considerations for researchers, and future directions. Frontiers in Neurology. 7, 134 (2016).
  56. Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behavioural Brain Research. 198 (1), 247-251 (2009).
  57. Jackson, J. R., et al. Reduced voluntary running performance is associated with impaired coordination as a result of muscle satellite cell depletion in adult mice. Skeletal Muscle. 5, 41 (2015).
  58. Potter-Baker, K. A., et al. Implications of chronic daily anti-oxidant administration on the inflammatory response to intracortical microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046002 (2015).
  59. Ware, T., Simon, D., Rennaker, R. L., Voit, W. Smart polymers for neural interfaces. Polymer Reviews. 53 (1), 108-129 (2013).
  60. Ecker, M., et al. Sterilization of thiol-ene/acrylate based shape memory polymers for biomedical applications. Macromolecular Materials and Engineering. 302 (2), 160331 (2017).
  61. Kozai, T., et al. Reduction of neurovascular damage resulting from microelectrode insertion into the cerebral cortex using in vivo two-photon mapping. Journal of Neural Engineering. 7 (4), 046011 (2010).

Tags

Bioteknologi problemet 138 atferd rotte iatrogenic skade hjernen traumer TBI stige åpne feltrutenettet grep styrke
Gnager opptreden for å vurdere funksjonelle underskudd skyldes Microelectrode implantasjon i rotte motorisk Cortex
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goss-Varley, M., Shoffstall, A. J.,… More

Goss-Varley, M., Shoffstall, A. J., Dona, K. R., McMahon, J. A., Lindner, S. C., Ereifej, E. S., Capadona, J. R. Rodent Behavioral Testing to Assess Functional Deficits Caused by Microelectrode Implantation in the Rat Motor Cortex. J. Vis. Exp. (138), e57829, doi:10.3791/57829 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter