Summary
Vi har visat att en mikroelektrod implantation i motor cortex av råttor orsakar omedelbar och varaktig motor underskott. Metoderna som föreslås häri disposition en mikroelektrod implantation kirurgi och tre gnagare beteendemässiga uppgifter att belysa potentiella förändringar i den fin eller grov motorik på grund av implantation-orsakade skador på motoriska cortex.
Abstract
Medicintekniska produkter som implanteras i hjärnan håller enorm potential. Som en del av ett system för hjärnan Machine Interface (BMI) Visa intracortical mikroelektroder förmåga att registrera handlingspänningar från enskilda eller små grupper av nervceller. Sådana inspelade signaler har framgångsrikt använts för att tillåta patienter att gränssnitt med eller styra datorer, robotic lemmar och deras egna lemmar. Dock har tidigare djurstudier visat att en mikroelektrod implantation i hjärnan inte bara skadar omgivande vävnad, men kan också resultera i funktionella underskott. Här diskuterar vi en serie beteendemässiga tester kvantifiera potentiella motoriska funktionsnedsättningar efter implantation av intracortical mikroelektroder i motor cortex av en råtta. Metoderna för öppen fältrutnätet, stege korsning och grepp styrka tester ger värdefull information om de komplikationer som följd av en mikroelektrod implantation. Resultaten av den beteendemässiga testning är korrelerade med endpoint histologi, att tillhandahålla ytterligare information om patologiska resultaten och effekterna av detta förfarande på intilliggande vävnad.
Introduction
Intracortical mikroelektroder användes ursprungligen för att kartlägga kretsen av hjärnan, och har utvecklats till ett värdefullt verktyg för att möjliggöra detektion av motor avsikter som kan användas för att producera funktionella utgångar1. Identifierade funktionella utgångar kan erbjuda individer lider ryggmärgsskador, cerebral pares, amyotrofisk lateralskleros (ALS) eller andra rörelse-begränsande villkor kontroll av en dator markören2,3 eller robotic arm4,5,6, eller återställa funktionen i sina egna funktionshinder lem7. Intracortical mikroelektrod teknik har därför vuxit fram som en lovande och snabbt växande fält8.
På grund av framgångarna sett i fältet, pågår kliniska studier för att förbättra och bättre förstå möjligheterna till BMI teknik5,9,10. Genom att inse den fulla potentialen av kommunikation med nervceller i hjärnan, uppfattas programmen rehabilitering som gränslös8. Även om det finns stor optimism för framtidens intracortical mikroelektrod teknik, är det också välkänt att mikroelektroder så småningom misslyckas11, möjligen på grund av en akut neuroinflammatoriska svar efter implantation. Implantation av främmande material i hjärnan leder till omedelbara skador på omgivande vävnad och leder till ytterligare skador som orsakats av den neuroinflammatoriska svar som varierar beroende på egenskaper hos implantatet12. Dessutom ett implantat i hjärnan kan orsaka en microlesion effekt: en minskning av glukosmetabolism tros orsakas av akut ödem och blödningar på grund av den enhe införande13. Dessutom är signalkvaliteten och längden av tid som användbara signaler kan registreras inkonsekvent, oavsett de djurmodell11,14,15,16. Flera studier har visat sambandet mellan neuroinflammation och mikroelektrod prestanda17,18,19. Konsensus av gemenskapen därför att den inflammatoriska reaktionen av neural vävnad som omger mikroelektroder, åtminstone delvis, äventyrar elektrod tillförlitlighet.
Många studier har undersökt lokal inflammation11,20,21,22 eller utforskat metoder för att minska skador till hjärnan orsakad av införande11,23, 24,25, med målet att förbättra inspelning prestanda över tid14,26. Vi har dessutom nyligen visat att en iatrogen skada som orsakas av en mikroelektrod isättning i motor cortex hos råttor orsakar en omedelbar och varaktig fina motor underskott27. Därför, syftet med de protokoll som presenteras här är att ge forskare en kvantitativ metod för att bedöma möjliga motor underskott till följd av hjärnan trauma efter implantation och ihållande närvaro av intracortical enheter (mikroelektroder i den fall av detta manuskript). De beteende-prov som beskrivs här var utformade för att locka fram både grov och fin motorik försämringar, och kan användas i många modeller av hjärnskada. Dessa metoder är okomplicerad, reproducerbar och kan enkelt implementeras i en gnagare modell. Dessutom möjliggör de metoder som presenteras här en korrelation på motoriska beteende till histologiska resultat, en förmån som tills nyligen, författarna inte har sett publicerade i fältet BMI. Slutligen, eftersom dessa metoder var avsedd att testa fina motorik28, grov motorik29och stress och ångest beteende29,30, de metoder som presenteras här kan också implementeras i en mängd huvudskada modeller där forskarna vill härska ut (eller in) motorik underskott.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden och djurvård praxis godkändes av och utförs i enlighet med Louis Stokes Cleveland institutionen av veteraner frågor medicinska Center institutionella djur vård och användning kommittéer.
Obs: För att utbilda forskare på beslutet om användningen av ett hugg skada modell som en kontroll, det rekommenderas att granska det arbete som Potter o.a. 21.
1. mikroelektrod Implantation kirurgiskt ingrepp
-
Före kirurgisk djur beredning
- Söva djuret i en induktion kammare med isofluran (2-4%). Medan under anestesi, kontinuerligt övervaka djuret använder ett avgörande mätsystem för att övervaka hjärtfrekvensen och blod-syrehalt.
- Flytta djuret till en Kona att fortsätta bedövningsmedlet. Subkutant (SQ) injicera ett cefalosporin antibiotika, t ex cefazolin (25 mg/kg) och en icke-steroida antiinflammatoriska, t.ex. karprofen (5 mg/kg) att förhindra infektion och hantera smärtan, respektive.
- Frikostigt tillämpa oftalmologiska salva till djurets ögon att hindra dem från att torka.
- Använder små djur nagelklippare, trimma tånaglar för att förhindra att djuret kliar suturerna under de sårläkning. Se till att naglarna inte klipps för kort, eftersom detta kan leda till smärta och blödning för djuret.
- Raka djurets huvud grundligt bakom öronen till mellan ögonen med en rakapparat trimmer.
- Ge en lokal smärtlindring en SQ injektion av bupivakain (0,3 mL 0,125% bupivakain utspädd från stamlösning) överst på djurets huvud i området i snittet.
- Montera djuret på en stereotaxic ram, med örat barer för att hålla huvudet rör sig under operationen. Placera en cirkulerande vatten värmedyna under djuret att hålla djurets inre temperatur.
- Applicera en steril draperi, t.ex., institutionellt godkänd steril plastfolie, att isolera operationsområdet.
- Scrub kirurgiska området med en alternerande betadine lösning och isopropanol scrubs.
- Utföra en tå nypa det institutionella protokoll för att säkerställa att djuret är under kirurgiska planet.
-
Förbereda djuret för implantation
- Skapa ett snitt av ungefär 1 ner mittlinjen utsätta skallen med hjälp av en nr 10 skalpell blad. Rakt på sak bort periostet använder en bomull spets applikator och stoppa eventuella blödningar med en kompress. Återkalla den omgivande vävnaden med hjälp av alligator clips och rengör och torkar ut skallen med väteperoxid.
- Placera några droppar av cyanoakrylat-baserade vävnad lim på exponerade skallen att förbättra dentala cement limning i senare steg.
- I den valda hemisfären, markera regionen i motor cortex motsvarar framtassen rörelse ca 3 mm i sidled till mittlinjen och 2 mm anterior bregma genom att skapa en nick i benet.
- Bort en del av skallen med en dental borr 1,75 mm rundad spets, ta särskild hänsyn inte att borra alltför snabbt eller alltför djupt och stödja å ena sidan på stereotaxic ram. Borren bör tillämpas på skallen periodvis för att undvika överhettning31.
- Återspegla dura använder en fin hooked 45° dura plocka.
- Ren eventuella blödningar med en bomull spets applikator och koksaltlösning, ta hand inte direkt beröring hjärnan ytan.
-
Införande av mikroelektrod i motor cortex
- Noggrant montera den steriliserade mikroelektrod i universalhållare på stereotaxic ramen, tar försiktighet att inte stöta i shanken av elektroden. Se till att kopplingen headstage gränssnitt av elektroden hålls fast av innehavaren.
Obs: Här, en icke-funktionella Michigan-stil kisel shanken elektrod mäta 2 mm x 123 µm x 15 µm användes, och skaftet infogades med fin pincett. - Med hjälp av micromanipulators på stereotaxic ram, noggrant placera spetsen på elektroden över den öppna kraniotomi.
- Försiktigt sänka elektroden cirka 2 mm i hjärnan med hjälp av micromanipulators som en måttguide (beroende på valet av elektrod, en automatiserad infogning på kontrollerade priser kan krävas.) Ta försiktighet för att undvika eventuella synliga vaskulatur när så är möjligt. När elektroden är på plats, försiktigt släppa kopplingen från universalhållare och dra tillbaka insättning armen.
- Ren försiktigt någon blödning från runt elektroden med hjälp av bomull spets applikator och koksaltlösning.
- Isolera kraniotomi runt inopererade elektroden med en silikonelastomer.
- Fixa elektroden till skallen med dentala cement.
- När cementen är helt torr, sammanföra kanterna på snittet på framsidan och baksidan av den cement headcap och sutur dem stänga.
- Noggrant montera den steriliserade mikroelektrod i universalhållare på stereotaxic ramen, tar försiktighet att inte stöta i shanken av elektroden. Se till att kopplingen headstage gränssnitt av elektroden hålls fast av innehavaren.
-
Postoperativ vård
- Låt djuret att återhämta sig på ett cirkulerande vatten värmedyna medan man fortsätter att övervaka dess vitala tecken. Undvik att använda värmelampor som temperaturen från lampor är svårare att kontrollera och djur kan överhettas.
- När djuret är helt vaken, flytta djuret till en ren bur med enkel tillgång till mat och vatten.
- Postoperativa dagarna 1-3, ge djuren SQ cefalosporin antibiotika (25 mg/kg) och en icke-steroida antiinflammatoriska (5 mg/kg) att förhindra infektion och hantera sin smärta.
- Övervaka djuren dagligen för tecken på smärta eller obehag, blödning, viktförändring eller sutur frågor genom minst postoperativ dag 5.
2. beteendemässiga testning
- För alla beteende testning, testa djuren 2 x per test i veckan före den elektrod implantation kirurgin att beräkna sina före kirurgi baslinjen poäng. Efter operationen, att djuren vila i 1 vecka innan du börjar beteende testa 2 x per vecka på varje test. Konsekvent provningsvillkoren bör användas under hela studien för både pre- och postoperativa testning för att minimera effekterna av stress på prestanda, vilket kan resultera i en mätning av ångest.
- Ren alla testutrustning med en klor koldioxid-baserade steriliserande i början av varje test session och efter varje djur.
- Film öppet fält rutnät och stege testning. Dessa tester kräver en videokamera (1080p, minst 15 fps, 78° diagonal synfält), en laptop, och utrymme att lagra videodata.
- I början av varje testing dag, ta djuren till testning rummet och låta dem acklimatisera i minst 20 min innan du börjar att testa. Rummet ska vara ljus och temperatur-kontrollerad, och samma personal bör slutföra alla tester. Helst kommer i samma rum att användas för alla djur under hela testningen utan ändringar i rummet.
- Användning mat belöningar att uppmuntra djuren att utföra uppgifter, särskilt under stege utbildningen. Spannmål eller små bitar av Bananchips eller kex göra bra belöningar.
- Normalisera alla veckovisa testning föreställningar att de före kirurgi poängen för varje enskilt djur (ekvation 1).
Ekvation 1:
-
Öppna fältprovning av rutnät
Obs: Testet öppet fält rutnät byggdes internt och har en löpande yta på 1 m2 med ca 40 cm hög ogenomskinlig sidoväggar. Botten glidyta i rutnätet är uppdelad i 9 lika rutor från undersidan med tejp (figur 1A). Inspelning kameran är fast monterad ovanför mitten av rutnätet på byggnadsställningar.- För att börja öppna fältprovning rutnät, placera djuret i mitten av nätet vänd bort från testaren.
- Låt djuret att köra fritt i 3 min vid videoinspelning.
- När djuret har genomfört tester, ta bort djuret från rutnätet och returnera den till buren. Rengöra rutnätet noggrant med klor koldioxid-baserade steriliserande.
- Testa varje djur 1 x per test dag.
- Analysera antalet stödlinjer korsade, den totala tillryggalagda och den högsta hastigheten av djuret som mätvärden av brutto motoriska funktion med en video som spårning programvara.
Obs: De uppgifter som presenteras här kvantifierades manuellt av utbildade forskare, men det är att föredra att använda en nyligen utvecklad internt spårning algoritm32.
-
Stege testning
Obs: Testet stege byggdes in-house och består av 2 klar akryl sidoväggar, varje 1 m i längd, ansluten med diameter 3-mm stegpinnar fördelade på 2 cm mellanrum (figur 2A). Stege testning är en skicklig test, och därför kräver 1 vecka utbildning före inspelning före kirurgi baslinjen poängen. Protokollet för utbildning och testning är samma.- Flytta djuret till en tillfällig ren anläggning bur att börja stege testa.
- Ställa stegen så att det överbryggar 2 burar. Start slutet av stegen vilar på en ren bur, och slutför slutet vilar på djurets buren att fungera som en motivation att slutföra körningen.
- Placera den samma (eller liknande) video kameran på ett stativ i mitten av stegen. Placeringen av kameran bör på rung höjd och möjliggör för hela stegen ska synas.
- Med videokameran kör, hålla djuret till startlinjen av stegen, att låta sina främre tassar att beröra den första stegpinnen.
- Låt djuret att korsa stegen i sin egen takt. Tid som förflutit mellan den tidpunkt när djurets tass berör den första stegpinnen och mållinjen på tredje sista stegpinnen kommer att avgöra djurets tid att korsa.
- Om djuret vänder på stege eller inte rör sig under en period av 20 s, överväga djuret har misslyckats kör. Tilldela de djur som ett straff Poäng tid för varje misslyckades köra. Bestämma påföljd tid av den långsammaste prestanda som noterats under före kirurgi tester27.
- Låt varje djur korsa stegen 5 x per test dag med ca 1 min vila mellan varje körning.
- Genomsnitt de snabbaste 3 körningarna per dag som ett mått på fina motorik. Dessutom spela in antalet gånger varje främre tassar glider utanför stegpinnarna med en video som spårning programvara.
Obs: De uppgifter som presenteras här kvantifierades manuellt av utbildade forskare, men det är att föredra att använda en nyligen utvecklad intern spårning algoritm använder Dona o.a. 32.
-
Grepp styrka tester
- Kalibrera grepp styrka mätaren innan varje test session, och mäter styrkan i gram.
- Placera grepp styrka mätaren på kanten av en räknare med grepp styret fördjupa över golvet.
- Låt djuret att greppa styret med båda främre tassar samtidigt som du håller djuret av basen av svansen (figur 3A).
- När djuret har ett fast grepp med varje tass, dra djuret från mätaren av basen av svansen med långsam och stadig kraft.
- Spela in den maximala greppstyrka utövas av djuret som visas på den digitala utgången av grepp styrka mätaren.
- Testa varje djur 3 x per test dag med ca 2 min vila mellan varje test.
- Som ett mått på fina motorik, spela in och genomsnitt maximalt grepp styrkan utgång från varje 3 försök.
3. efter beteendevetenskapliga protokoll
- Efter alla beteendemässiga testning (e.g, 8-16 veckor efter implantation), söva djuren djupt med ketamin (160 mg/kg) och xylazin (20 mg/kg), transcardially BEGJUTA dem, skörda deras hjärnor och cryo-skiva dem, och fläcken vävnaden med immunhistokemiska markörer för att kvantifiera den cellulära Svaren runt platsen för implantation33,34,35,36,37,38.
4. statistisk analys
Obs: En prospektiv power-analys rekommenderas starkt för alla studier som syftar till att besvara en viss fråga. Den power-analys, som informerar antalen djur som krävs för att uppnå en statistisk signifikans för en särskild studiedesign, bör baseras på viss forskning hypotesen, utformningen av experimentet, skattade effekten storlek och variation av de planerade behandlingarna, som väl effekt storlek krävs för att uppnå klinisk eller vetenskaplig relevans.
- Genomföra statistiska analyser med hjälp av gemensamma statistisk programvara.
- TABULERA beskrivande statistik och visa dem som medelvärde ± standardavvikelse.
- Analysera beteendemässiga prestanda [i öppet fält rutnät (steg 2.2), stege (steg 2.3), och grepp styrka tester (steg 2,4)] varje vecka tidpunkt att jämföra vs. implanteras kontrollgrupperna med ett två-sampel t-test. Överväg varje vecka tidpunkt en oberoende åtgärd.
- Kvantifiera den längsgående prestanda med en blandad effekt linjär modell. Veckan och gruppen är fasta faktorer och experimentella djur är kapslat i koncernen som en slumpmässig effekt. En variansanalys (ANOVA) används för att bestämma vilken faktor effekt med en signifikansnivå på p < 0,05.
- Jämföra stege prestanda med immunglobulin G (IgG) intensitet använder en linjär regressionsanalys. Beräkna korrelationskoefficienten genom en Pearsons metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av metoder som presenteras här, är en mikroelektrod implantation kirurgi i motor cortex slutfört följande etablerade förfaranden39,40,41,42, följt av öppna fältprovning rutnät för att bedöma grov motorik och stege och grepp fungera styrka tester för att bedöma den fina motorn27. Motorisk funktion testning var ifyllda 2 x per vecka i 16 veckor efter operationen i implanterade djur, med ingen operation icke-implanterade djur som en kontroll. Alla efter operationen poäng var i genomsnitt per vecka och normaliserade till varje enskilt djur före kirurgi baslinjen noter. Alla fel rapporteras som standardavvikelsen för medelvärdet (SEM).
För att mäta deras grov motorik och betona beteende, tilläts djur springa fritt i ett öppet fält rutnät test för 3 min (figur 1A). Olika mätvärden från detta test kan registreras, inklusive antalet rutnät fodrar argt, den totala tillryggalagda, och den maximala hastigheten uppnåtts av djuret. I detta tidigare rapporterade data presenteras antalet rutnätslinjer korsade27. I den första veckan efter återhämtningsperioden (den 2 veckors tidpunkt), en signifikant skillnad sågs i öppet fält rutnät prestanda mellan de 2 grupperna. Det fanns dock ingen ytterligare betydelse resten av studien (figur 1B). Kontroll och mikroelektrod-implanterade djur gjorde på samma sätt i hela testning och variansen i prestanda var relativt hög i båda uppsättningarna av djur. Ingen signifikans sågs när man jämför öppet fält rutnät prestanda i båda uppsättningar av djur över hela experimentella tiden. Eftersom det fanns ingen skillnad i prestanda mellan de 2 grupperna av djur, tolkades detta resultat för att indikera att det finns ingen brutto motoriska underskott eller kraftigt begränsa stress orsakad av en mikroelektrod implantation i motor cortex27. När tolkning av data, en minskning av antalet rutnätslinjer korsade, den totala tillryggalagda, eller högsta hastighet uppnås genom djuret alla tyder på en minskning av dess grov Motorik (tabell 1).
För att mäta samordnat grepp och fina motorik, deltog djur i en horisontell stege test (figur 2A) där den tid det tog djuret att korsa stegen och frekvensen av tass följesedlar registrerades. Efter operationen stege passagetiderna var normaliserade för varje djur till varje enskilt djur före kirurgi noter. Därför en positiv procentsats sammanfaller med en minskning av tid att korsa stegen och en ökad prestanda och ett negativt procenttal sammanfaller med en ökning av tid att korsa stegen och en minskad prestanda (figur 2B, Tabell 1).
I detta tidigare rapporterade data visas de djuren i kontrollgruppen, som fick inget implantat, långsammaste prestanda gånger (82,6 ± 26,0%) under första veckan efter operationen testning omedelbart efter återhämtningen fas27. Börjar den andra veckan efter operationen stege provning, kontroll djuren återupptog sin baslinje prestanda gånger och underhålls noter jämförbar med deras baslinjen poäng under loppet av studien med mycket lite varians.
Djuren får en intracortical mikroelektrod såg en reducerad prestanda genast efter operationen. Dessa djur visade en ökad stege överfart jämfört deras baslinje på 199,1 ± 61,4% under den första veckan efter operationen testning. Implanterade djuren visas en reducerad prestanda under hela studien och deras prestanda återvände inte till deras baslinjen poäng. På sina värsta, inopererad djur minskade prestanda under vecka 11 i genomsnitt 526.9 ± 139,4% jämfört med deras baslinjeprestanda. Dessutom implanterade djuren visade en högre varians jämfört med kontroll djuren. Det var ingen signifikant skillnad mellan kontroll och implanterade djur under den första veckan av testning. Dock en betydande skillnad i procentuell förändring jämfört med baslinjen tider sågs mellan grupperna vid alla efterföljande veckor i studien (p < 0,05) (figur 2B).
Ytterligare bevis för fina motorisk försämring demonstrerades av frekvensen av främre höger tass glider mellan de 2 grupperna av djur. Prestanda för främre höger tass var av särskilt intresse eftersom mikroelektroder var implanteras i den vänstra hjärnhalvan i regionen i motor cortex ansvarar för front tass kontroll. Genom noggrann videoanalys, tass följesedlar var en krönika och kvantifieras (figur 2C). Medan inga signifikanta skillnader sågs i frekvensen av vänstra tass följesedlar, konstaterades det att de implanterade djur upplevt betydligt mer främre höger tass glider jämfört med kontroll djuren (ett genomsnitt på 0,54 ± 0,07 främre höger tass glider per vecka i den implanterade djur jämfört med ett genomsnitt på 0,32 ± 0,02 främre höger tass följesedlar per vecka på kontroll djur). När tolkning av data, visar en ökning av tid att korsa stegen eller en ökning av antalet tass följesedlar en minskning av fina Motorik (tabell 1).
Som en sekundär åtgärd samordnat grepp och fina motorik avslutade djuren ett grepp styrka test (figur 3A) där den maximala greppstyrka som utövas av djuren spelades. Det enskilda djurets weekly grepp noter var normaliserade till sin före kirurgi baslinjen greppstyrka. Det sågs att implanterade djurens efter operationen greppstyrka minskade signifikant jämfört med kontroll djurens nästan varje efter operationen tidpunkt. (Figur 3B). Kontroll djurens greppstyrka förbättrades efter före kirurgi testning, sannolikt på grund av träningseffekten. Vidare var kontroll djurens greppstyrka betydligt större än baslinjen under hela studien (p < 0,05). Intressant, var implanterade djurens väggrepp styrka betydligt värre än baslinjen (p < 0,01) under den första veckan av testning efter återhämtningsfasen, men långsamt tillbaka till deras baslinjeprestanda. Notera visar en minskning av maximalt greppstyrka uppnås genom djuret en minskning av fina Motorik (tabell 1).
Olika histologiska markörer kan användas för att visualisera närmiljön nära ett hjärnan implantat, inklusive neuronala atomkärnor, astrocyter och blod - hjärnbarriären stabilitet. Här, utfört vi immunhistokemisk färgning för IgG, ett vanligt blodprotein inte vanligt förekommande i hjärnan. Tidigare arbete har visat att IgG är en användbar indikator på blod - hjärnbarriären integritet eftersom det är en antikropp i blodet, och som inte normalt finns i hjärnan16,18, och därmed förekomsten av IgG i omgivande hjärnvävnad kan korreleras till blod - hjärnbarriären43integritet. Här, var IgG fluorescensintensiteten normaliserade till bakgrunden hjärnvävnad och kvantifierade börjar vid gränsen av elektroden explantation hålet och flyttar ut i koncentriska lagerplatser tills IgG inte längre var närvarande i vävnaden. Implanterade djuren uppvisade en betydande ökning i IgG intensitet nära hålet ut till 150 µm jämfört med kontroll djuren. IgG intensiteten i de implanterade djur återvände gradvis till bakgrunden intensitet över den sträcka som strålar ut från implanterade mikroelektrod hålet. I kontroll djuren, har aldrig varit implanteras med en mikroelektrod, var normaliserade IgG intensiteten inte närvarande i betydande kvantiteter över bakgrunden intensitet som den blood - brain barriären inte var skadad i dessa djur.
Eftersom signifikanta skillnader sågs i både stege prestanda och IgG intensitet, två var korrelerade (figur 4). Här, var normaliserade fluorescerande intensiteten av IgG arean under kurvan från 0-50 µm från vävnad-elektrod gränssnittet för varje djur korrelerad med genomsnittet av varje djur har stege prestanda under loppet av studien. En korrelationskoefficient på 0,90 var beslutsamt, visar en mycket stark korrelation mellan fina motor prestanda och skada på blod - hjärnbarriären.
Figur 1 . Representativa öppet fält rutnät testresultat. (A) denna panel visar en beteendemässiga testning setup för en öppen fältrutnätet testa (för brutto motor och ångest test). Öppna fältet rutnät provet består av en 1 m2 akryl blad 4 ogenomskinlig väggar på 40 cm i höjd, med fyrkantig botten delar av cirka 33 cm vardera. (B) denna panel visar en grov motorik prestanda mätt i antalet för rutnätslinjer korsade, jämfört med baslinjeprestanda. Sågs en signifikant skillnad i prestanda mellan kontroll (n = 10) och den implanterade (n = 17) grupper på 2 veckor efter operationen (p < 0,05). Alla fel rapporteras som SEM. Denna siffra är omtryckt från Goss-Varley o.a. 27 med tillstånd från de Nature Publishing Group. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representativa stege testresultat. (A) denna panel visar en beteendemässiga testning setup för en stege test (för fina motorik testing). Stegen består av 2 klar akryl sidor 1 m lång och 25 cm i höjd, sällskap av rostfritt stål stegpinnarna fördelade på 2 cm med en 3-mm diameter. (B) i denna panel visas fina motorik prestanda mäts av tid att korsa stegen, jämfört med baslinjeprestanda. Resultaten under den streckade linjen visar en minskning av prestanda jämfört med baslinjeprestanda. En signifikant skillnad i prestanda upptäcktes mellan kontroll (n = 10) och den implanterade (n = 17) grupper för de efter operationen veckorna 3-16 (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) och längsled i hela studien () # = p < 0,05). (C), denna panel visar en kvantifierad instans av höger tass följesedlar. En signifikant skillnad upptäcktes i förekomsten av höger tass följesedlar per vecka när man jämför kontrollen och de implanterade grupperna (* = p < 0,05). (D) Detta är ett exempel på en tass slip. Alla fel rapporteras som SEM. Denna siffra är omtryckt från Goss-Varley o.a. 27 med tillstånd från de Nature Publishing Group. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Representativa grepp styrka testresultat. (A) denna panel visar en beteendemässiga testning setup för greppstyrka (för fina motorik testing). Grepp styrka mätaren består av en viktad bas med en monterad styrka mätaren ansluten till en grepp handtag. (B) denna panel visar fina motorik prestanda, mätt med den maximala greppstyrka utövade jämfört med baslinjeprestanda. Resultaten under den streckade linjen visar en minskning av prestanda jämfört med baslinjeprestanda. Signifikanta skillnader sågs mellan kontroll (n = 5) och den implanterade (n = 6) djur för nästan alla postoperativa veckorna (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Ytterligare betydelse sågs mellan kontroll djurens vecka och baslinjen prestationer (# = p < 0,05) och mellan inopererade djurens vecka och baslinjen prestationer (## = p < 0,01). Kontroll och implanterade djur utförs betydligt olika längdriktningen över hela studien (@@@ = p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Korrelation mellan IgG och stege prestanda. En normaliserad IgG fluorescensintensiteten runt implanteringsstället var korrelerad med en förändring i stege prestanda och en korrelationskoefficient på 0.901 hittades (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Övergripande representativt beteende data visar ökning och minskning i prestanda jämfört med baslinjen noter för varje provning metriska. De gröna rutorna representerar en förbättrad prestanda som gör en motor underskott osannolikt, och de röda rutorna representerar en reducerad prestanda vilket gör motorik underskott sannolikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här har använts effektivt och reproducibly mäta både fina och brutto motoriska underskott i en modell av gnagare hjärnskada. Det möjliggör dessutom korrelationen av fina motoriska beteende till histologiska resultat efter en mikroelektrod implantation i motor cortex. Metoderna är lätta att följa, billig att ställa in, och kan ändras för att passa en forskares enskilda behov. Ytterligare, beteende testning inte orsakar stor stress eller smärta djur. Forskarna tror snarare, djuren växte att njuta av träning och belöningar som medföljde testning. Tidigare studier har föreslagit att motoriska cortex skador kan orsaka motor, minne och funktionella skador44,45. Men trots denna kunskap finns det begränsad information om funktionella inverkan orsakad av en mikroelektrod implantationen i motor cortex27, som negativt kan påverka de kliniska utfall hos patienter.
Ändringar kan göras i hela protokollet, både i det kirurgiska ingreppet och beteende testning. Detta protokoll beskrivs förfarandet för att implantatet mikroelektroder i motor cortex av djur i regionen påverkar framtassarna. Detta förfarande kan enkelt anpassas för att variera implantatet, inklusive elektroder för elektrisk stimulering46 eller kanyler för drogen leverans47eller vilken typ av skada, inklusive en TBI modell48. Scoring mätvärden används på öppet fält rutnät test och stegen testning apparater kan ytterligare ändringar göras. Förutom många stödlinjerna korsade, totala tillryggalagd sträcka och den högsta hastighet som uppnås av djuret, tid som tillbringas stillastående och antalet höger och vänster varv kan också registreras som ytterligare parametrar för motorprestanda32 . I stege test, kan ta bort stegpinnarna49 eller utsläppande stegen på en lutning50 öka svårigheter, även om med de aktuella implantat författarna inte hittar detta nödvändigt att locka fram fina motor underskott i denna ansökan. Slutligen även testa utrustningen presenteras här var avsedd att användas med råttor, kan enheterna vara skalas upp eller ner för att användas med olika gnagare. Det är viktigt att notera att om problem där ett djur är inte kunna slutföra före operationen testning konsekvent djuret ska tas bort från studien.
Som med alla beteendemässiga testning, är det viktigt att förbli lika konsekvent som möjligt under loppet av studien. Det har visats att testresultaten kan variera baserat på den forskare som arbetar med djur51, den plats där testning utförs52, och miljömässiga faktorer inklusive djurens bostäder och djurhållning förfaranden53. Dessutom har forskning visat stor variation i producerar en hjärnskada genom skallen uppvärmning under en kraniotomi förfarande31 och modeller av TBI inklusive vikt-släpp modell54 och mekaniska variation i en kontrollerad kortikala påverka modell55. Forskare bör därför särskilt försiktig att upprätthålla konsekvens i kirurgiska ingrepp, testning och boendeförhållanden och testa personal, bland annat.
Framtida inriktningar av dessa beteende testmetoder kunde expandera på de tester som presenteras här för att ge mer noggranna resultat. Exempelvis skulle ett vatten labyrint test eller en rotor rod test kunna införlivas för att ytterligare extrahera ångest56 eller grov motorik57 underskott, respektive. Dessutom kan framtida arbete syftar också till att minska vävnadsskador som orsakats av en enhet isättning i hjärnan. Nuvarande arbete på detta område har fokuserat på inflammation riskreducerande genom Anti-oxidant behandlingar42,58, mekaniskt kompatibla implantat41,59,60, hämning av den medfödda immunitet signalering väg14,15, och att minska kärlskador under en enhet implantation31,61.
Slutligen måste det anses att det nuvarande arbetet avslutades med friska, unga, manliga råttor som inte nödvändigtvis förkroppsligar egenskaperna hos den typiska mänskliga patienten som fick ett implantat i hjärnan. Ytterligare forskning utforska ytterligare fin och grov motorik uppgifter i karakteristiska sjukdomsmodeller krävs att ratificera de resultat som presenteras här. I olika sjukdomsmodeller kräva skillnader mellan inopererad och icke-implanterade sham djur de ovannämnda ändringarna att testa villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av Merit i Award #B1495-R (Capadona) och utmärkelsen Presidential tidiga karriär för forskare och ingenjörer (PECASE, Capadona) från Förenta staterna (USA) Avdelningen för veteraner frågor rehabilitering analys och Utveckling Service. Dessutom stöddes detta arbete delvis av kontoret av den biträdande sekreteraren av försvar för hälsa frågor genom Peer recenserade medicinsk forskningsprogram under Award nr W81XWH-15-1-0608. Innehållet representerar inte åsikter US Department of Veterans Affairs eller Förenta staternas regering. Författarna vill tacka Dr Hiroyuki Arakawa i CWRU gnagare beteende kärna för hans vägledning i utformningen och gnagare beteendemässiga testprotokoll. Författarna vill även tacka James Drake och Kevin Talbot från CWRU institutionen av mekaniska och flygteknik för deras hjälp med att designa och tillverka gnagare stege testet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rats, male, 201-225g | Charles River | CD | |
| Compac5 anesthesia system | Vetequip | 901812 | |
| Electric trimmers | Wahl | 9918-6171 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | 1760 | |
| Gaymar heated water pad and pump | Braintree Scientific Inc | TP-700 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 07-805-5031 | |
| Dental drill | Pearson Dental | O60-0045 | |
| Dura pick | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Silicon shank microelectrode | Made in-house at Cleveland VA Medical Center | N/A | |
| KwikCast silicone elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | |
| Teets dental cement | A-M Systems | 525000 | |
| Webcam HD Pro c920 | Logitec | 960-000764 | |
| Grip strength meter | Harvard Apparatus | 565084 | |
| Minitab 17 statistical software | Minitab Inc | ||
| Open field grid test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A | |
| Ladder test | Made in-house at Case Western Reserve University | N/A | |
| Rabbit anti rat IgG antibody | Bio-Rad | 618501 |
References
- Donoghue, J. P. Bridging the brain to the world: a perspective on neural interface systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
- McFarland, D. J., Sarnacki, W. A., Wolpaw, J. R. Electroencephalographic (EEG) control of three-dimensional movement. Journal of Neural Engineering. 7 (3), 036007 (2010).
- Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17849-17854 (2004).
- Bell, C. J., Shenoy, P., Chalodhorn, R., Rao, R. P. Control of a humanoid robot by a noninvasive brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 5 (2), 214-220 (2008).
- Collinger, J. L., et al. High-performance neuroprosthetic control by an individual with tetraplegia. The Lancet. 381 (9866), 557-564 (2013).
- Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
- Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping movements through brain-controlled muscle stimulation in a person with tetraplegia: a proof-of-concept demonstration. The Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
- Bowsher, K., et al. Brain-computer interface devices for patients with paralysis and amputation: a meeting report. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 023001 (2016).
- Taylor, D. M., Tillery, S. I., Schwartz, A. B. Direct cortical control of 3D neuroprosthetic devices. Science. 296 (5574), 1829-1832 (2002).
- Taylor, D. M., Tillery, S. I., Schwartz, A. B. Information conveyed through brain-control: cursor versus robot. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (2), 195-199 (2003).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Anderson, D. J. Penetrating multichannel stimulation and recording electrodes in auditory prosthesis research. Hearing Research. 242 (1-2), 31-41 (2008).
- Pourfar, M., et al. Assessing the microlesion effect of subthalamic deep brain stimulation surgery with FDG PET. Journal of Neurosurgery. 110 (6), 1278-1282 (2009).
- Hermann, J. K., et al. Inhibition of the cluster of differentiation 14 innate immunity pathway with IAXO-101 improves chronic microelectrode performance. Journal of Neural Engineering. , (2018).
- Bedell, H. W., et al. Targeting CD14 on blood derived cells improves chronic intracortical microelectrode performance in chronic modified state of neuroinflammation. Biomaterials. 163, 163-173 (2018).
- Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
- Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
- Kozai, T. D., et al. Effects of caspase-1 knockout on chronic neural recording quality and longevity: insight into cellular and molecular mechanisms of the reactive tissue response. Biomaterials. 35 (36), 9620-9634 (2014).
- Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983 (1-2), 23-35 (2003).
- Gunasekera, B., Saxena, T., Bellamkonda, R., Karumbaiah, L. Intracortical recording interfaces: current challenges to chronic recording function. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 68-83 (2015).
- Villalobos, J., et al. Preclinical evaluation of a miniaturized Deep Brain Stimulation electrode lead. Conference Proceedings: Annual International Conferences of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 6908-6911 (2015).
- Zhong, Y., Bellamkonda, R. V. Controlled release of anti-inflammatory agent alpha-MSH from neural implants. Journal of Controlled Release. 106 (3), 309-318 (2005).
- Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), e3565 (2012).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: implications on potential considerations to brain computer interfacing and human augmentation. Scientific Reports. 7, 15254 (2017).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Bailey, K. R., Crawley, J. N. Anxiety-related behaviors in mice. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. chapter 5 (2009).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. European Journal of Pharmacology. 463 (1-3), 3-33 (2003).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy procedure: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. , (2017).
- Dona, K. R., et al. A novel single animal motor function tracking system using MATLAB's computer vision toolbox to assess functional deficits. Journal of Visualized Experiments. , Under Review (2018).
- Ereifej, E. S., et al. Implantation of neural probes in the brain elicits oxidative stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2018).
- Ereifej, E. S., et al. The neuroinflammatory response to nanopatterning parallel grooves into the surface structure of intracortical microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
- Ravikumar, M., et al. The roles of blood-derived macrophages and resident microglia in the neuroinflammatory response to implanted intracortical microelectrodes. Biomaterials. 0142-9612 (35), 8049-8064 (2014).
- Potter-Baker, K. A., et al. A comparison of neuroinflammation to implanted microelectrodes in rat and mouse models. Biomaterials. 34, 5637-5646 (2014).
- Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
- Ravikumar, M., et al. The effect of residual endotoxin contamination on the neuroinflammatory response to sterilized intracortical microelectrodes. Journal of Materials Chemistry B. 2, 2517-2529 (2014).
- Potter, K. A., Simon, J. S., Velagapudi, B., Capadona, J. R. Reduction of autofluorescence at the microelectrode-cortical tissue interface improves antibody detection. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 96-105 (2012).
- Potter, K. A., et al. Curcumin-releasing mechanically-adaptive intracortical implants improve the proximal neuronal density and blood-brain barrier stability. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2209-2222 (2014).
- Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11, 056014 (2014).
- Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
- Hamm, R. J., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Lyeth, B. G., Jenkins, L. W. The rotarod test: an evaluation of its effectiveness in assessing motor deficits following traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 11 (2), 187-196 (1994).
- Teuber, H. L. Recovery of function after brain injury in man. Ciba Foundation Symposium. (34), 159-190 (1975).
- Carmel, J. B., Kimura, H., Martin, J. H. Electrical stimulation of motor cortex in the uninjured hemisphere after chronic unilateral injury promotes recovery of skilled locomotion through ipsilateral control. Journal of Neuroscience. 34 (2), 462-466 (2014).
- Hayn, L., Koch, M. Suppression of excitotoxicity and foreign body response by memantine in chronic cannula implantation into the rat brain. Brain Research Bulletin. 117, 54-68 (2015).
- Marklund, N. Rodent models of traumatic brain injury: methods and challenges. Methods in Molecular Biology. 1462, 29-46 (2016).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Chesler, E. J., Wilson, S. G., Lariviere, W. R., Rodriguez-Zas, S. L., Mogil, J. S. Influences of laboratory environment on behavior. Nature Neuroscience. 5 (11), 1101-1102 (2002).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284 (5420), 1670-1672 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Auer, C., Kunert, J., Wurbel, H. Systematic variation improves reproducibility of animal experiments. Nature Methods. 7 (3), 167-168 (2010).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
- Osier, N. D., Dixon, C. E. The controlled cortical impact model: applications, considerations for researchers, and future directions. Frontiers in Neurology. 7, 134 (2016).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behavioural Brain Research. 198 (1), 247-251 (2009).
- Jackson, J. R., et al. Reduced voluntary running performance is associated with impaired coordination as a result of muscle satellite cell depletion in adult mice. Skeletal Muscle. 5, 41 (2015).
- Potter-Baker, K. A., et al. Implications of chronic daily anti-oxidant administration on the inflammatory response to intracortical microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046002 (2015).
- Ware, T., Simon, D., Rennaker, R. L., Voit, W. Smart polymers for neural interfaces. Polymer Reviews. 53 (1), 108-129 (2013).
- Ecker, M., et al. Sterilization of thiol-ene/acrylate based shape memory polymers for biomedical applications. Macromolecular Materials and Engineering. 302 (2), 160331 (2017).
- Kozai, T., et al. Reduction of neurovascular damage resulting from microelectrode insertion into the cerebral cortex using in vivo two-photon mapping. Journal of Neural Engineering. 7 (4), 046011 (2010).
