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Genetics

मानव स्टेम और जनक आबादी के आणविक और Immunophenotypic विविधता की विशेषताएं करने के लिए एक मिश्रित एकल सेल दृष्टिकोण

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/57831
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Molecular Hematology, Lund Stem Cell Center, Lund University

Summary

थोक जीन अभिव्यक्ति माप बादल विषम कोशिका आबादी में व्यक्तिगत सेल मतभेद । यहां, हम कैसे एक सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और Florescence सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा छंटाई सूचकांक चित्रित विविधता और immunophenotypically के लिए संयुक्त किया जा सकता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन आणविक रूप से अलग कोशिका आबादी विशेषताएं ।

Abstract

Immunophenotypic लक्षण वर्णन और आणविक विश्लेषण लंबे समय विविधता चित्रित और अलग कोशिका आबादी को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । FACS स्वाभाविक एक एकल सेल परख है, लेकिन आणविक विश्लेषण से पहले, लक्षित कोशिकाओं को अक्सर भावी थोक में पृथक कर रहे हैं, जिससे एकल सेल संकल्प खोने । एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एक विषम कोशिका आबादी में व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच आणविक मतभेदों को समझने का मतलब प्रदान करता है । बल्क सेल विश्लेषण में एक विशिष्ट कोशिका प्रकार का प्रतिनिधित्व पूर्वाग्रहों और जैविक महत्व के साथ दुर्लभ कोशिकाओं से संकेतों के occlusions में परिणाम । FACS एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए युग्मित सूचकांक का उपयोग करके, आबादी एकल सेल संकल्प के नुकसान के बिना जांच की जा सकती है, जबकि मध्यवर्ती सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं को भी कब्जा कर रहे हैं, के मूल्यांकन को सक्षम करने सतत सतह मार्कर अभिव्यक्ति की प्रासंगिकता । यहां, हम एक दृष्टिकोण है कि एकल सेल रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (RT-qPCR) और FACS सूचकांक छंटाई के लिए एक साथ कोशिका आबादी के भीतर आणविक और immunophenotypic विविधता विशेषताएं जोड़ती है का वर्णन ।

एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण विधियों के विपरीत, विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन के साथ qPCR का उपयोग कम ड्रॉपआउट्स के साथ निम्न-बहुतायत टेप के मजबूत माप के लिए अनुमति देता है, जबकि यह कक्ष-से-कक्ष रूपांतरों से संबंधित समस्याओं द्वारा नहीं पाया जाता है पढ़ें गहराई. इसके अलावा, सीधे सूचकांक द्वारा-lysis बफर में एकल कोशिकाओं छंटाई इस विधि, सीडीएनए संश्लेषण और विशिष्ट लक्ष्य पूर्व प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है के लिए एक कदम में प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल सतह के साथ बाद में प्राप्त आणविक हस्ताक्षर के संबंध के लिए मार्कर व्यंजक । वर्णित दृष्टिकोण टेम एकल कोशिकाओं की जांच करने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन यह भी अंय प्रकार के सेल पर सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है ।

अंत में, यहां वर्णित दृष्टिकोण के साथ पूर्व के एक पैनल के लिए mRNA अभिव्यक्ति के संवेदनशील मापन के लिए अनुमति देता है की संभावना आणविक अलग उपआबादी के बाद के संभावित अलगाव के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने के साथ चयनित जीन ।

Introduction

प्रत्येक व्यक्ति के रक्त कोशिका के लिए एक सेलुलर पदानुक्रम में रहते माना जाता है, जहां स्टेम सेल तेजी से प्रतिबद्ध मध्यवर्ती progenitors की एक श्रृंखला के शीर्ष पर सर्वोच्च फार्म है कि अंततः टर्मिनल विशिष्ट ले जाने के अंतिम प्रभाव कोशिकाओं में अंतर जैविक कार्य1. कैसे स्टेम सेल सिस्टम का आयोजन कर रहे है के बारे में ज्ञान की बहुत टेम प्रणाली में उत्पंन किया गया है, क्योंकि संभावित रूप से अलग टेम बहुत स्टेम कोशिकाओं या विभिंन progenitors 2 के लिए समृद्ध आबादी को अलग करने की क्षमता का द्वारा FACS छंटाई । यह इन आबादी के कई के लिए अनुमति दी है कार्यात्मक या आणविक विश्लेषण किया जाना है, मुख्य रूप से जीन3,4रूपरेखा अभिव्यक्ति के माध्यम से । लेकिन जब थोक आबादी के जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण कोशिकाओं के बीच अलग मतभेद औसत बाहर है और5खो दिया है । इस प्रकार, विषम कोशिका अंशों के भीतर सेल के लिए कोशिका विविधताओं का पता लगाने के लिए अक्षमता महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ मिल सकता है अगर कोशिकाओं के छोटे सबसेट कि जनसंख्या6के आस्थगित जैविक समारोह के लिए खाते, 7. इसके विपरीत, एकल सेल संकल्प पर जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर की जांच के लिए एक संभावना चित्रित विविधता और8कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व सबसेट से प्रभावित छायाएं दरकिनार करने की पेशकश ।

एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए कई प्रोटोकॉल की तारीख को विकसित किया गया है; प्रत्येक दृष्टिकोण अपनी निरंतर होने के साथ । शीघ्रातिशीघ्र विधि सीटू संकरण (आरएनए-मछली), जो एक समय में टेप की एक सीमित संख्या के उपाय में आरएनए फ्लोरोसेंट था, लेकिन यह है कि यह आरएनए स्थानीयकरण की जांच के लिए अनुमति देता है में अद्वितीय है9,11. जल्दी पीसीआर और qPCR का उपयोग करने के लिए एक एकल या बहुत कुछ टेप का पता लगाने के तरीके भी12विकसित किया गया । हालांकि, इन हाल ही में microfluidics द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है आधारित तरीकों जो एक साथ qPCR के माध्यम से कोशिकाओं के सैकड़ों में सेल प्रति टेप के सैकड़ों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण कर सकते है और इस तरह उच्च आयामी विविधता का उपयोग कर विश्लेषण के लिए अनुमति पूर्व निर्धारित जीन पैनलों10,13. हाल ही में आरएनए अनुक्रमण आधारित प्रौद्योगिकियों व्यापक रूप से एक सेल विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में इन सैद्धांतिक रूप से एक सेल के पूरे transcriptome उपाय कर सकते हैं और इस तरह एक खोजपूर्ण आयाम जोड़ने के लिए विविधता विश्लेषण10, 14. मल्टीप्लेक्स qPCR विश्लेषण और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण अलग विशेषताएं हैं, इस प्रकार या तो तरीकों का उपयोग करने के लिए तर्क के रूप में अच्छी तरह से लक्ष्य जनसंख्या में कोशिकाओं की संख्या के रूप में पूछा सवाल पर निर्भर करता है । अज्ञात कोशिका या बड़ी आबादी की जांच कर रहे हैं जब उच्च-प्रवाह और कम लागत के साथ प्रति सेल निष्पक्ष, एकल सेल आरएनए अनुक्रमण की खोजपूर्ण विशेषताओं के साथ वांछनीय हैं. हालांकि, एकल सेल आरएनए अनुक्रमण भी अधिक बार अनुक्रमण उच्च प्रचुर मात्रा में टेप के प्रति पक्षपाती है, जबकि कम बहुतायत के साथ टेप ड्रॉपआउट्स करने के लिए प्रवण हैं । यह काफी जटिल डेटा है कि bioinformatic विश्लेषण पर उच्च मांगों डालता है महत्वपूर्ण आणविक संकेतों है कि अक्सर सूक्ष्म या तकनीकी शोर15में छिपा हुआ प्रकट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, अच्छी विशेषता के ऊतकों, एकल सेल qPCR विश्लेषण पूर्व निर्धारित प्राइमर पैनलों कार्यात्मक महत्वपूर्ण जीन या आणविक मार्करों के लिए चयनित का उपयोग कर एक संवेदनशील, सीधा दृष्टिकोण के विविधता निर्धारित करने के लिए एक के रूप में सेवा कर सकते है जनसंख्या. तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एकल सेल आरएनए-seq की तुलना में, प्रति कोशिका लागत आम तौर पर एकल कोशिका qPCR तरीकों के लिए अधिक है. यहां, हम एक दृष्टिकोण है कि एकल सेल RT-qPCR को जोड़ती है का वर्णन (टेली से संशोधित जे एट अल । 16), FACS अनुक्रमित17 और bioinformatics विश्लेषण18 छंटाई के क्रम में एक साथ आबादी के भीतर आणविक और immunophenotypic विविधता की विशेषता है ।

इस दृष्टिकोण में, ब्याज की कोशिका जनसंख्या दाग है, और एकल कोशिकाओं FACS द्वारा सीधे lysis बफर में ९६-well पीसीआर प्लेटों में हल कर रहे हैं । इसके साथ ही, FACS-सॉर्टिंग के दौरान प्रत्येक एकल कक्ष के लिए कक्ष-सरफ़ेस मार्कर का एक अतिरिक्त सेट के व्यंजक स्तर रिकॉर्ड किए जाते हैं, एक विधि जिसे अनुक्रमणिका-सॉर्टिंग के रूप में संदर्भित किया जाता है । लीजड ड सेल सामग्री बाद में परिवर्धित और जीन के एक चयनित सेट के जीन अभिव्यक्ति RT-qPCR के साथ विश्लेषण किया है, एक microfluidic मंच का उपयोग कर । यह रणनीति क्रमबद्ध एकल सेल के आणविक विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक व्यक्ति कोशिका सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति का एक साथ लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है । सीधे अनुक्रमित क्रमबद्ध मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं के आणविक अलग सबसेट मानचित्रण द्वारा, उपआबादी एक विशिष्ट immunophenotype है कि उनके संभावित अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से जोड़ा जा सकता है । विधि चरण दर चरण 1में रेखांकित किया है । एक पूर्व निर्धारित जीन पैनल आगे लक्षित जीन अभिव्यक्ति की एक उच्च संकल्प करने के लिए योगदान देता है, क्योंकि यह अप्रासंगिक प्रचुर मात्रा में जीन है कि अंयथा बंद करना सूक्ष्म जीन अभिव्यक्ति संकेत कर सकते है की माप दरकिनार । इसके अलावा, विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन, एक कदम रिवर्स प्रतिलेखन, और प्रवर्धन कम की मजबूत माप के लिए अनुमति देता है, प्रतिलेखन कारकों या गैर पाली-adenylated RNAs की तरह टेप व्यक्त की । महत्वपूर्ण बात, qPCR तरीके फ्यूजन प्रोटीन से mRNA के माप के लिए अनुमति देते हैं, जो महत्वपूर्ण हैं जब कुछ घातक रोगों की जांच19. अंत में, जांच की जीन की केंद्रित संख्या, कम ड्रॉप आउट दरों, और सीमित तकनीकी अंतर कोशिकाओं के बीच इस विधि को आसानी से उच्च आयामी तरीकों की तुलना में विश्लेषण कर, जैसे एकल सेल आरएनए-seq । प्रोटोकॉल का पालन करके, एक संपूर्ण प्रयोग किया जा सकता है, कोशिकाओं छंटाई से परिणाम विश्लेषण के लिए, तीन दिनों के भीतर, इस संवेदनशील, उच्च प्रवाह एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक सीधी और त्वरित विधि बना ।

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Protocol

1. Lysis प्लेट्स तैयार करना

  1. एक आरएनए/डीएनए फ्री बेंच का प्रयोग, ९६ कुओं के लिए पर्याप्त lysis बफर तैयार करें, 10% अतिरिक्त के साथ, ३९० µ l nuclease मुफ्त पानी, 17 µ एल के 10% एनपी-४०, २.८ µ एल 10 मिमी dNTP, 10 µ एल ०.१ एम डीटीटी और ५.३ µ एल RNAse अवरोधक ( सामग्री की तालिकादेखें) के मिश्रण से । भंवर और स्पिन नीचे ।
  2. एक ९६ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए lysis बफर के 4 µ एल वितरित और चिपकने वाला फिल्म के साथ प्लेटें सील । प्लेटों के तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए नीचे ट्यूबों स्पिन । सेल छँटाई जब तक बर्फ पर प्लेटें रखें (अधिकतम 24 एच).

2. कक्ष सॉर्टिंग के लिए कक्षों की तैयारी

  1. प्रयोग के लिए कोशिकाओं की गल उचित संख्या (यहां, CD34 समृद्ध टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं) । 1 x 106 कोशिकाओं लगभग ३ ९६-एक नियंत्रण के साथ एकल कोशिकाओं की प्लेटों छंटाई के लिए उपयुक्त हैं ।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए गल कोशिकाओं स्थानांतरण और 8 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक पहुँच गया है जब तक हर 30 एस FBS 1 मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३५० एक्स जी में एक केंद्रापसारक में कोशिकाओं स्पिन और supernatant हटा दें ।
  3. 8 मिलीलीटर धुंधला बफर में कोशिकाओं resuspend (2% FBS के साथ पंजाब) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३५० x g पर केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  4. २०० µ l धुंधला बफ़र में कक्ष resuspend और नियंत्रण दाग के लिए कोशिकाओं को हटा दें ।
  5. प्रतिदीप्ति शूंय से एक नियंत्रण (FMOs) प्रत्येक fluorophore के लिए, ५० µ एल धुंधला बफर में कोशिकाओं का एक अंश दाग से बनाओ । इस उदाहरण में, २०,००० कक्षों के साथ 6 microcentrifuge ट्यूबों FMOSs के रूप में उपयोग किया जाता है । ध्यान दें कि कोशिकाओं की संख्या की जांच की जनसंख्या के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए । एक के लिए एक ट्यूब के अलावा नमूना दाग में के रूप में एक ही एकाग्रता में सभी एंटीबॉडी जोड़ें ।
  6. प्रत्येक fluorophore के लिए एक दाग ५० µ एल में कोशिकाओं का एक अंश दाग द्वारा इस्तेमाल प्रत्येक fluorophore के लिए बफर बनाओ । इस उदाहरण में 6 २०,००० कोशिकाओं के साथ microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग किया जाता है । ध्यान दें कि प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए लक्ष्य के लिए नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की जरूरत है । व्यक्तिगत ट्यूबों में नमूना दाग के रूप में एक ही एकाग्रता में प्रत्येक एंटीबॉडी जोड़ें । इसके अतिरिक्त एक दाग नियंत्रण के रूप में ५० µ एल में २०,००० unstain हुआ कोशिकाओं रखें ।
  7. सेल नमूना करने के लिए, उनके उचित एकाग्रता पर एंटीबॉडी जोड़ें । यहां प्रयोग किया जाता है CD34-FITC पर एक 1/100 एकाग्रता, CD38-सुरक्ष 1/50, CD90-पे 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 तथा वंश मिश्रण: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, व CD235a-PECy5 1/1000.
  8. अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को गर्मी ।
  9. 3 मिलीलीटर धुंधला बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और supernatant निकालें ।
  10. कक्षों को फिर से निलंबित करें और २.९ चरण दोहराएँ.
  11. ५०० में µ एल और FMOs में १०० µ एल धुंधला बफर 1/100 7AAD के साथ और एक एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक ५० µm फ़िल्टर के माध्यम से फिल्टर कोशिकाओं के साथ नमूना resuspend ।

3. सेल छँटाई

  1. सुनिश्चित करें कि FACS मशीन सही रूप से सेट है ड्रॉप देरी और cytometer सेटअप और ट्रैकिंग (सीएसटी) है जो हाल ही में निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि उपयुक्त कक्ष सॉर्ट किए जाते हैं । टेम कोशिकाओं के लिए, ८५ माइक्रोन नोक और 4 की अधिकतम गति के उपयोग की सिफारिश की है, जबकि इष्टतम घटना दर ८०० और २००० घटनाओं के बीच है/
  2. FMO नियंत्रण या आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण के अनुसार प्रतिदीप्ति मुआवजा और सेट गेट्स प्रदर्शन से वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए सही है ।
  3. एक नई microcentrifuge ट्यूब में १०० µ के दाग बफर के एल के साथ कम से १०० लक्ष्य कोशिकाओं छँटाई द्वारा लक्ष्य जनसंख्या का पुनर्विश्लेषण करते हैं । FACS सॉर्ट किए गए नमूने रिकॉर्डिंग द्वारा क्रमबद्ध कोशिकाओं का विश्लेषण और सुनिश्चित करें कि वे सॉर्ट गेट में अंत ।
  4. सेट अप एकल सेल प्लेट अच्छी तरह से एक ९६ में अच्छी तरह से A1 में ड्रॉप केंद्र द्वारा छंटाई प्लेट । जब यह केंद्रित है, तरह 50-एक खाली ९६ अच्छी तरह से प्लेट के किनारे के आसपास सभी कुओं में 100 6 µm कणों सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कुओं एक अच्छी तरह के केंद्र में एक सेल मिल जाएगा ।
  5. यदि संभव हो, एक अतिरिक्त नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए कि व्यवहार्य कोशिकाओं को हल कर रहे है एकल-कोशिकाओं के लिए इन विट्रो विकास में छंटाई द्वारा जोड़ा जा सकता है । Haematopoietic कोशिकाओं U-नीचे ९६ में अच्छी तरह से प्लेटें में उगाया जा सकता १०० µ l SFEM के साथ 1% पेनिसिलिन streptomycin, १०० एनजी/एमएल FLT3L, टीपीओ और एससीएफ. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल कालोनियों के लिए संस्कृति में 3 दिनों के बाद एक अच्छी तरह से विश्लेषण ।
  6. प्लेटों से चिपकने वाला फिल्म निकालें । ब्याज की एक एकल कोशिका को क्रमबद्ध करें (यहां लिन-CD34 + CD38-कोशिकाओं) ९२ में ९६ कुओं से बाहर, सक्रिय सूचकांक-FACS छंटाई सॉफ्टवेयर में छंटाई के लिए ब्याज के अंय मार्करों के लिए immunophenotypic प्रोफ़ाइल बचाने के लिए (यहां CD45RA, CD49f, और CD90) प्रत्येक एकल कक्ष के लिए ।
  7. पीसीआर प्रवर्धन में रैखिकता नियंत्रण के लिए क्रमशः 10 और 20 कोशिकाओं के साथ दो कुओं को क्रमबद्ध करें । वेल्स H1 और H2 आमतौर पर प्रयोग किया जाता है ।
  8. कोई भी कोशिकाओं के रूप में बिना कोई-टेंपलेट नियंत्रण, आमतौर पर वेल्स H3 और H4 दो कुओं रखो ।
  9. स्पष्ट चिपकने वाला फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें और सूखी बर्फ पर स्नैप जमने से पहले 1 मिनट के लिए ३०० x g पर प्लेट्स स्पिन ।
  10. -८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए प्लेटों की दुकान ।
    नोट: सुरक्षित रोक बिंदु । लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर क्रमबद्ध और लीजड ड कोशिकाओं को रखा जा सकता है ।

4. प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन रिवर्स

  1. प्रत्येक प्राइमरी जोड़ी के 2 µ l को जोड़ने के द्वारा सभी ९६ जीन लक्ष्यों के लिए प्राइमरी मिश्रण तैयार करें, जिसमें नुकीला नियंत्रण आरएनए के लिए साफसफाई करने वाले जीन प्राइमरों और प्राइमरों सहित, एक आरएनए पर एक १.५ मिलीलीटर RNAse फ्री ट्यूब/ अगर से कम ९६ प्राइमरों का उपयोग कर, लापता प्राइमरों के लिए nuclease मुफ्त पानी की एक बराबर मात्रा में जोड़ें । प्राइमरों के लिए अलग से वांछित जीन पैनल मैच का आदेश दिया जाता है.
  2. ६३२.५ µ एल 2x प्रतिक्रिया मिश्रण, १०१.२ µ एल Taq/SuperscriptIII, १५१.८ µ एल प्राइमर मिश्रण जोड़कर रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन मिश्रण बनाओ, और ०.७ µ एल नियंत्रण आरएनए में नुकीला । एक डीएनए मुक्त बेंच पर इस कदम के पहिले । भंवर द्वारा मिक्स और नीचे स्पिन ट्यूब के तल में तरल इकट्ठा करने के लिए । नमूने के अलावा जब तक बर्फ पर रखें ।
  3. बनाने के लिए कोई रिवर्स टेप नियंत्रण मिश्रण द्वारा चार कुओं के लिए २७.५ µ एल 2x रिएक्शन मिक्स, १.७६ µ एल ऑफ Taq एंजाइम, ६.६ µ एल के प्राइमरी मिक्स और २.६४ µ एल के nuclease मुफ्त पानी. नियंत्रण आरएनए में स्पाइक । डीएनए फ्री बेंच पर यह कदम परफॉर्म करें । भंवर और नीचे स्पिन के लिए ट्यूब के नीचे में तरल इकट्ठा करने और बर्फ पर रखने के लिए नमूने के अलावा जब तक ।
  4. बर्फ पर गल lysate प्लेटें । पहले से तैयार रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन मिश्रण के ८.७५ µ एल जोड़ें ९२ कुओं के लिए, रैखिकता और कोई टेम्पलेट नियंत्रण सहित. चार शेष कुओं के लिए कोई रिवर्स प्रतिलेखन नियंत्रण मिश्रण के ८.७५ µ एल जोड़ें । स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ सील प्लेटें और नीचे स्पिन प्लेटों के तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए ।
  5. preamp के कार्यक्रम के अनुसार एक पीसीआर मशीन में प्लेट चलाने के द्वारा रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन; चरण 1:50 ° c के लिए ६० मिनट, चरण 2:95 ° c के लिए 2 मिनट, चरण 3:95 ° c के लिए 15 एस, चरण 4:60 ° c 4 मिनट के लिए, दोहराएँ चरण 3 – 4 24 बार और अंत में चरण 5:8 ° c हमेशा के लिए.
  6. पीसीआर पूरी होने के बाद, शॉर्ट टर्म स्टोरेज के लिए 8 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट रखें और लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस ।
    नोट: सुरक्षित रोक बिंदु । प्रवर्धित सामग्री दीर्घकालिक भंडारण के लिए 8 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है और लंबी अवधि के भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस ।

5. मल्टीप्लेक्स Microfluidic जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए नमूना और परख प्लेट तैयार करना

  1. pipetting 3 µ एल परख लोड हो रहा है एक ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से एजेंट लदान परख के लिए तैयार । प्रत्येक किताब के 3 µ l जोड़ें परख लोड हो रहा है थाली में व्यक्तिगत कुओं के लिए ।
  2. चिपकने वाली फिल्म के साथ सील प्लेट और प्लेटों के तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन ।
  3. एक ९६ अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं में nuclease मुक्त पानी की pipetting 8 µ एल द्वारा कमजोर पड़ने प्लेट तैयार करते हैं । कमजोर पड़ने वाली थाली के लिए परिवर्धित नमूना के 2 µ एल जोड़ें, 1:5 के एक अंतिम कमजोर पड़ने बना ।
  4. चिपकने वाली फिल्म, 10 एस के लिए भंवर प्लेट द्वारा मिश्रण के साथ प्लेट सील, और अंत में प्लेटों के तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन ।
  5. नमूना लोडिंग रिएजेंट के ३५.२ µ एल के साथ मास्टर मिक्स के ३५२ µ एल ध्यान से मिश्रण द्वारा नमूना लोडिंग मिश्रण तैयार करें । एक ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से लोड हो रहा है मिश्रण के aliquoting ३.३ µ एल द्वारा नमूना लोडिंग प्लेट तैयार करें ।
  6. नमूना लोड हो रहा है प्लेट के प्रत्येक कुआं में पतला नमूना से २.७ µ एल जोड़ें.
  7. चिपकने वाली फिल्म के साथ सील प्लेट और प्लेटों के तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन ।

6. Microfluidic चिप की लोडिंग

  1. बाहर एक नया ९६ x ९६ microfluidic चिप ले लो । उंहें यकीन है कि वे ले जाया जा सकता है बनाने के लिए पर टोपी के साथ एक सिरिंज के साथ poking द्वारा लेट्स तैयार करें ।
  2. सीरिंज से बुलबुले निकालें । प्रत्येक वाल्व को सीरिंज की पूरी मात्रा में जोड़ें जबकि चिप ४५ डिग्री झुकाव और नीचे वाल्व दबा । IFC नियंत्रक के साथ प्रधानमंत्री चिप ।
  3. लोड ४.२५ µ एल के साथ प्रत्येक परख प्रवेश परख लोड थाली में कुओं में से प्रत्येक से । बुलबुले से बचें । यदि बुलबुले में अच्छी तरह से दिखाई देते हैं, उंहें एक पिपेट टिप के साथ हटा दें ।
  4. नमूना लोड हो रहा है प्लेट में कुओं में से प्रत्येक से ४.२५ µ एल के साथ प्रत्येक नमूना प्रवेश लदान जारी रखें, बुलबुले से बचने, और अगर बुलबुले दिखाई देते हैं, उन्हें पिपेट टिप के साथ हटा दें ।
  5. आईएफसी नियंत्रक के साथ लोड चिप ।
  6. जांच करें कि चिप लग रहा है और भी है कि सभी मंडलों भरी हुई है । यह टेप के साथ छू द्वारा चिप सतह से धूल निकालें । मल्टीप्लेक्स microfluidic जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म में चिप चलाते हैं ।

7. मल्टीप्लेक्स Microfluidic जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म पर रनिंग चिप

  1. मल्टीप्लेक्स microfluidic जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म में चिप लोड करने के बाद सैंपल को नाम दिया ।
  2. निष्क्रिय डाई के रूप में ROX सेट । सेट एकल जांच और FAM-एमजीबी प्रतिदीप्ति के रूप में । ९६ x ९६ मानक v2 प्रोटोकॉल के रूप में उपयोग करें । चलाना प्रारंभ करें ।
  3. भागो जब चिप को हटाने के पूरा हो गया है ।

8. चिप चलाने के प्रारंभिक विश्लेषण

  1. वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा लोड ।
  2. एक टैब सीमांकित फ़ाइल से सेल और जीन लेआउट चिपकाने के जीन नाम और सेल नाम लोड ।
  3. ओपन छवि दृश्य और डाई के रूप में ROX का चयन करें । जांच करें कि सभी कुओं ROX निष्क्रिय डाई है ।
  4. जांच यदि सभी प्रवर्धन भूखंडों ठीक है, नहीं spikes ( चित्रा 3Eके समान) के साथ एक चिकनी प्रवर्धन वक्र के साथ देखो ।
  5. सभी एकल-कोशिकाओं सभी ठीक से लोड किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नुकीला में नियंत्रण आरएनए की अभिव्यक्ति है कि यह सुनिश्चित करें.
  6. सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं की गृह व्यवस्था जीन अभिव्यक्ति है और इस तरह ठीक से हल किया गया है ।
  7. सुनिश्चित करें कि 10 और 20 सेल रैखिकता नियंत्रण लगभग 1 सीटी अंतर को मांय रैखिक प्रवर्धन है ।
  8. noRT नियंत्रण नमूने में अभिव्यक्ति है, तो जाँच करें । यदि अभिव्यक्ति noRT में पाया जाता है जांच को बदलने की जांच जो बाद में रन के लिए जीनोमिक डीएनए का पता नहीं है पर विचार करें ।
  9. आगे विश्लेषण के लिए csv फ़ाइलों में डेटा निर्यात करें ।

9. एकल सेल SCExV का उपयोग विश्लेषण

नोट: एक परिचयात्मक फिल्म20 मौजूद है करने के लिए उपकरण परिचय । यहां, कैसे प्रोटोकॉल में शुरू की नियंत्रण का उपयोग कर विश्लेषण करने के लिए की एक छोटी सिफारिश प्रस्तुत किया है ।

  1. SCexV वेबसाइट से कनेक्ट करें20.
  2. निर्यात की गई CSV फ़ाइलें अपलोड करें ।
  3. सकारात्मक नियंत्रण के रूप में नुकीला में नियंत्रण आरएनए चुना. 25 के ऊपर एक नियंत्रण आरएनए सीटी है, जो किसी भी सेल निकालें. नियंत्रण आरएनए के माध्य अभिव्यक्ति के लिए डेटा को सामान्य.
  4. क्लिक करें "यहां किया-> विश्लेषण" । निकालें कक्ष विकल्प में noRT, notemplate, 10 और 20 कक्ष नियंत्रण हटाएं ।
  5. क्लस्टर की अपेक्षित संख्या के साथ पसंद की clustering दृष्टिकोण के साथ कक्षों । निर्यात विश्लेषण मूल्यों ।

10. सूचकांक-छंटाई विश्लेषण

  1. FACS विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और अनुक्रमणित नमूने लोड करें ।
  2. स्क्रिप्ट संपादक खोलें और क्विन जे एट अल से उपलब्ध स्क्रिप्ट चलाते हैं । 21
  3. अब जब कि FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर एकल कोशिकाओं में से प्रत्येक के लिए एक गेट बना दिया जाना चाहिए, खुले लेआउट संपादक और रंग SCexV से समूहीकरण के अनुसार कोशिकाओं ("Sample_complete_Data. xls" नाम फ़ाइल में उपलब्ध है) ।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल जल्दी है, आसानी से प्रदर्शन किया और अत्यधिक विश्वसनीय । प्रयोगात्मक सेट-अप का एक सिंहावलोकन चित्रा 1में प्रस्तुत किया गया है । पूरे प्रोटोकॉल, एकल कोशिकाओं की छंटाई से, विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन करने के लिए, जीन अभिव्यक्ति माप और प्रारंभिक विश्लेषण तीन दिनों में किया जा सकता है । एक गर्मी नक्शे के रूप में विश्लेषण परिणामों का एक उदाहरण है कि प्रारंभिक एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से ९६ प्राइमरों और या तो एक पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया (CML) रोगी या ९६ कोशिकाओं से एक वृद्ध-मिलान स्वस्थ से ९६ कोशिकाओं का उपयोग करने से विश्लेषण डेटा का प्रतिनिधित्व करता है नियंत्रण चित्रा 2में प्रस्तुत किया है । श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग का उपयोग करके, विश्लेषित कक्षों को उनके जीन व्यंजक हस्ताक्षरों के आधार पर चार उपसमूहों में विभाजित किया जा सकता है. हीट मानचित्र विज़ुअलाइज़ेशन डेटा का ओवरव्यू प्राप्त करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है और साथ ही कुओं को नियंत्रित करने के लिए है जिसे विश्लेषण (उदा., नियंत्रण कुओं) से बाहर रखा जाना चाहिए. चित्रा बी एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) visualizing कैसे समान प्रत्येक समूह के कक्षों आयाम में कमी का उपयोग कर एक दूसरे के लिए कर रहे हैं । यहां, outliers आसानी से कोशिकाओं के बाकी हिस्सों से प्रतिष्ठित हैं । कैसे व्यक्तिगत जीन समूहों के बीच वितरित कर रहे है विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके बीच अलग, वायलिन भूखंड उपयोगी होते हैं । चित्रा 2cमें चार प्रतिनिधि जीन की अभिव्यक्ति दिखाई जाती हैं: फ्यूजन जीन BCR-ABL1, जो सभी ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं को निशाना बनाता है; कोशिका चक्र मार्कर mKI67, जो एक सक्रिय रूप से विभाजित समूह में व्यक्त किया जाता है; माइलॉयड विभेद मार्कर MPO, जो सायक्लिंग उपसमूह के लिए प्रतिबंधित है; और अंत में हाउस कीपिंग जीन RPS18, जो सभी कोशिकाओं में व्यक्त की जाती है. अंत में, चित्र 2d में आणविक हस्ताक्षरों immunophenotyped करने के लिए संबंधित किया गया है, प्रत्येक क्लस्टर में प्रत्येक कोशिका की पहचान के रूप में एक FACS भूखंड से उत्पंन सूचकांक-छंटाई में व्यक्तिगत कोशिकाओं रंग के लिए उपयोग किया जाता है । दिखाया टेम स्टेम सेल मार्करों CD90 और CD45RA के लिए सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति है कि इस मामले में कुछ समूहों के बीच भेदभाव और भावी उंहें कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

एकल सेल qPCR प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया microfluidics प्रणाली में हवा या कणों की शुरूआत के लिए बहुत संवेदनशील है । इसलिए, यह एक पोस्ट रन गुणवत्ता डेटा की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । चित्रा 3 प्रतिनिधि डेटा और एक सफल और एक असफल गरीब नमूना लदान के कारण चलाने के बीच के विपरीत से पता चलता है । 3 ए चित्रा से पता चलता है कैसे एक सफल चलाने के बाद Rox स्तरों सभी कुओं आश्वस्त है कि लोडिंग सफल रहा है पर समान रूप से फैल गया । इसके विपरीत, चित्र बी के रूप में दिखाता है कैसे नमूना और परख लदान विफल रहा है के रूप में चिप के बड़े हिस्से में ROX की कमी से संकेत दिया । एक बार Rox की गुणवत्ता का आकलन किया गया है, कच्चे जीन अभिव्यक्ति संकेतों की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया जा सकता है । चित्रा3 सी में, एक सफल चलाने के एक गर्मी नक्शा प्रस्तुत किया है, जहां अभिव्यक्ति समान रूप से चारों ओर 7-25 सीटी के मजबूत संकेत के साथ नमूनों में बाहर फैल रहा है: एस । इसके विपरीत, चित्रा 3d एक असफल चलाने के एक गर्मी नक्शा जहां कई नमूनों कोई संकेत नहीं है दिखाता है या जीन की एक बहुत ही सीमित मात्रा की अभिव्यक्ति । चित्रा 3 डी में परिणाम की संभावना एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पहले छंटाई FACS में एक त्रुटि के कारण कर रहे हैं, क्योंकि कई कोशिकाओं स्पष्ट अभिव्यक्ति संकेत है, जबकि अंय अभिव्यक्ति पूरी तरह से कमी है । अंत में, चित्रा 3E सभी कुओं कोई परिवर्तन करने के लिए थोड़ा के साथ लगभग 10 सीटी की स्पष्ट अभिव्यक्ति होने के साथ spiked में नियंत्रण आरएनए के अपेक्षित प्रवर्धन वक्र प्रदर्शित करता है. यह सकारात्मक नियंत्रण एकल-कक्ष qPCR विश्लेषण में सभी चरणों की कुशलता का उपाय है. यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रवर्धन डायनेमिक श्रेणी में है, भिन्न कक्ष संख्याओं को रेखीय नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाता है; यहां, 10-और 20-कक्ष नियंत्रणों का उपयोग किया जाता है । रैखिकता नियंत्रण के बीच सीटी अंतर कक्ष संख्याओं में अंतर को प्रतिबिंबित करना चाहिए । अंत में, कोई रिवर्स प्रतिलेखन (noRT) और कोई नकारात्मक नियंत्रण टेंपलेट सुनिश्चित करें कि कोई झूठी सकारात्मक संकेत जीनोमिक डीएनए या संदूषण, क्रमशः से पता चला रहे हैं ।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध दृश्य । कक्ष, सतह मार्कर व्यंजक रिकॉर्ड करने के लिए सक्रिय अनुक्रमणिका-सॉर्ट अनुप्रयोग के साथ सॉर्ट किए जाते हैं, और mRNA को रिलीज़ करने के लिए लीजड ड हैं । mRNA बाद में सीडीएनए को लिखित रिवर्स है और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन का उपयोग कर परिवर्धित । अगले, नमूने एक microfluidic चिप, जहां प्रत्येक कोशिका के जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल RT-qPCR का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है में व्यक्तिगत प्राइमरों के साथ एक साथ लोड कर रहे हैं । डेटा संग्रह के बाद, डेटा कम गुणवत्ता वाले कोशिकाओं को हटाने और क्लस्टरिंग के लिए आणविक अलग कोशिका आबादी को परिभाषित करने के लिए किया जाता है पूर्व संसाधित है । अंत में, आणविक रूप से परिभाषित उपआबादी FACS सूचकांक से मार्कर अभिव्यक्ति सतह के लिए डेटा छंटाई immunophenotypically आबादी के विविधता विशेषताएं संबंधित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: तीन सफल एकल सेल जीन अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम सामांय और ल्यूकेमिया से प्रभावित टेम स्टेम कोशिकाओं का विश्लेषण करती है । (एक) हीट मानचित्र एक पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया रोगी से २७० एकल कोशिकाओं के एकल सेल जीन अभिव्यक्ति माप के रूप में अच्छी तरह से एक उंर मिलान स्वस्थ नियंत्रण SCExV 18, एक विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर श्रेणीबद्ध clustering द्वारा विश्लेषण दिखा इस प्रकार के डेटा के लिए डिज़ाइन किया गया । लाल उच्च अभिव्यक्ति, ब्लू कम अभिव्यक्ति और ग्रे कोई अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है । उनके जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों के आधार पर कक्षों को चार भिन्न समूहों में विभाजित किया गया. यह डेटा से स्पष्ट है कि इस रोगी से ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम सेल जनसंख्या एक quiescent जनसंख्या में विभाजित किया जा सकता है (क्लस्टर 3), केवल कुछ भेदभाव मार्करों की अभिव्यक्ति के साथ, और एक सक्रिय रूप से विभाजित आबादी है कि अभिव्यक्ति की शुरुआत की है माइलॉयड विभेद (क्लस्टर 4) के साथ जुड़े जीन । यहां इस्तेमाल किया डेटा एक चयनित रोगी से Warfvinge एट अल द्वारा पहले प्रकाशित काम में शामिल है । 22 (ख) एक में प्रदर्शित आंकड़ों के प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), जहां चार अलग समूहों को दिखाया जा सकता है । (ग) क्लस्टर विशिष्ट अभिव्यक्ति, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 और MPO के साथ चार जीनों का वायलिन कथानक. प्रत्येक वायलिन प्लॉट प्रत्येक क्लस्टर में अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है और सभी कक्षों के लिए अभिव्यक्ति का माध्य मान का प्रतिनिधित्व करता है के बीच डॉटेड रेखा । (घ) एक रोगी को गर्मी के नक्शे, जहां प्रत्येक व्यक्ति कोशिका अपनी आणविक जनसंख्या के रंग के साथ चिह्नित है में प्रतिनिधित्व नमूनों की छंटाई विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: रीयल-टाइम पीसीआर सॉफ्टवेयर में मल्टीप्लेक्स qPCR की गुणवत्ता नियंत्रण । (एक) सफल नमूना और परख लदान के Rox लोडिंग छवि । (ख) असफल नमूना और परख लोड हो रहा है, जहां नमूनों की नाकाम लोडर क्षैतिज लाइनों में Rox की कमी के द्वारा दिखाए जाते है की Rox लोडिंग छवि । विफल लोडिंग परख के ऊर्ध्वाधर लाइनों में दिखाया जाएगा । (ग) हीट मानचित्र दृश्य में एक सफल चलाने का उदाहरण है, जहां एकल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व पंक्तियों और जीन स्तंभों का प्रतिनिधित्व करते हैं । उच्च जीन अभिव्यक्ति पीले, नीले रंग में कम अभिव्यक्ति में संकेत दिया है और कोई काला में अभिव्यक्ति का पता चला है । (D) हीट मैप दृश्य में विफल चलाने का उदाहरण, जहां एकल-कक्ष पंक्तियों और जीनों का प्रतिनिधित्व करते है स्तंभों का प्रतिनिधित्व करते हैं । उच्च जीन अभिव्यक्ति पीले रंग से प्रतिनिधित्व किया है, कम अभिव्यक्ति नीले रंग के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है, और काला के रूप में कोई पता चला अभिव्यक्ति. (ङ) सामान्यीकृत तीव्रता (बाएँ) और प्रवर्धन भूखंड (दाएँ) में एक नुकीला-आरएनए नियंत्रण. सीटी-सीमित भिन्नता के साथ लगभग 10 और घटता के मूल्यों के सभी कुओं के भीतर सफल और मजबूत रिवर्स प्रतिलेखन, पूर्व प्रवर्धन, और qPCR विश्लेषण से संकेत मिलता है. (च) सामान्यीकृत तीव्रता (बाएँ) और एक असफल जीन का प्रवर्धन भूखंड (दाएँ). सामान्यीकृत तीव्रता एक वक्र फार्म नहीं है और प्रवर्धन साजिश प्रतिदीप्ति में बड़े spikes से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हाल के वर्षों में, एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान इसके अलावा विभिंन सेल23आबादी के विविधता को परिभाषित बन गया है । आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के आगमन सैद्धांतिक रूप से एक सेल के पूरे transcriptome को मापने के लिए एक संभावना प्रदान करता है, लेकिन इन तरीकों सेल के लिए सेल अनुक्रमण गहराई और ड्रॉप बहिष्कार में बदलाव से जटिल हैं । एकल सेल qPCR महत्वपूर्ण जीन के सैकड़ों की अभिव्यक्ति का एक संवेदनशील और मजबूत विश्लेषण प्रदान करता है जहां सभी कोशिकाओं को इसी तरह इलाज कर रहे हैं, तकनीकी शोर को कम करने । टेप की एक सीमित संख्या का ध्यान केंद्रित विश्लेषण इसके अलावा अत्यधिक व्यक्त जीन से हस्तक्षेप के बिना सरलीकृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।

के बाद से दृष्टिकोण ही कोशिकाओं में व्यक्त जीन का एक सबसेट की जांच यह बेहद महत्वपूर्ण है जीन का सही सेट का चयन जब जीन पैनल डिजाइनिंग । जीन का चुनाव कई मायनों में किया जा सकता है; साहित्य के माध्यम से, थोक विश्लेषण द्वारा पिछले निष्कर्षों, और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध आंकड़ों के bioinformatics विश्लेषण । यह तुच्छ नहीं है; हालांकि, जीन के सही सेट के साथ दृष्टिकोण बहुत शक्तिशाली हो सकता है । जीन पैनल को जब डिजाइन किया गया है तो यह मान्य करना जरूरी है कि मल्टीप्लेक्सिंग के दौरान प्राइमरियों का दखल नहीं हो रहा है । यहां हम विश्लेषण की सिफारिश अगर प्राइमर पर्याप्त सामग्री के साथ एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के अनुरूप द्वारा रैखिक रहे हैं; इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्राइमरों की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला Warfvinge एट अल में पूरक चित्रा 2d में दिखाया गया है । 22

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल की दो मुख्य सीमाएँ कोशिकाओं की सीमित संख्या और जीन की जाँच की गई हैं. हालांकि, भले ही प्रत्येक रन में केवल ९६ कोशिकाओं की जांच कर रहे हैं, यह अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल एक दिन में पूरा किया जा सकता है और इस प्रकार की कोशिकाओं के सैकड़ों एक सप्ताह में विश्लेषण किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, यदि अधिक प्राइमर लक्ष्य-विशिष्ट पूर्व प्रवर्धन कदम में शामिल किए गए है जांच की जीन की संख्या बढ़ सकता है । इस मामले में, कई चिप्स ९६ प्राइमरों के प्रत्येक सेट की जांच की जरूरत है ।

उच्च आरएनए-सामग्री के साथ अत्यधिक व्यक्त जीन या कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा रहा है, कम समग्र जीन अभिव्यक्ति23 के साथ टेम स्टेम कोशिकाओं के लिए अनुकूलित चक्र की संख्या संशोधित किया जाना चाहिए । प्रवर्धन चक्र बदलने भी महत्वपूर्ण है जब थोक आबादी की जांच । टेम स्टेम सेल (१०० कोशिकाओं) के थोक विश्लेषण के लिए हम 25 से 18 के पूर्व प्रवर्धन चक्र की राशि को कम करने की सलाह देते हैं ।

विफल रन के लिए सबसे आम कारण है lysis प्लेट की अच्छी तरह से एकल कोशिकाओं के असफल छंटाई के कारण, गैर व्यवहार्य कोशिकाओं की छंटाई, इष्टतम पूर्व प्रवर्धन, या चिप लोड हो रहा है विफलता । प्रत्येक प्रतिक्रिया कक्ष में Rox स्तर या तो नमूना या परख की लोडिंग का एक संकेतक है, और अगर इन कम कर रहे हैं, यह सिफारिश की है कि नमूने फिर से एक नया चिप पर चला रहे हैं, के बाद से कम Rox स्तर की संभावना बुलबुले की शुरूआत के दौरान लदान के कारण होता है । spiked-नियंत्रण में की कमी आरएनए अभिव्यक्ति पूर्व-प्रवर्धन-या रिवर्स प्रतिलेखन रिएजेंट के साथ मुद्दों के कारण की संभावना में विफल रहे हैं कि एक संकेतक है. इस मामले में, यह अनुशंसित है कि नए सॉर्ट किए गए कक्षों और नए reactants के साथ एक नया चिप चलाया जाता है । नियंत्रण आरएनए का पता लगाने लेकिन अन्य जीन अभिव्यक्ति संकेतों का कोई संकेत नहीं असफल एकल-कोशिका FACS जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने से पहले छंटाई का एक संकेत है. FACS छंटाई के दौरान त्रुटियों से बचने के लिए यह सुनिश्चित करना है कि एकल कोशिकाओं को एक अच्छी तरह के केंद्र में हल कर रहे है महत्वपूर्ण है । यह एक खाली थाली में मोती छंटाई और नेत्रहीन जहां छोटी बूंद भूमि का निरीक्षण द्वारा किया जा सकता है । सुनिश्चित करें कि सेट-अप केवल पहले कुछ कुओं के लिए सही नहीं है के लिए प्लेट के किनारों में सभी कुओं में परीक्षण-क्रमबद्ध करें । जब लागू, एकल कोशिकाओं समानांतर में इन विट्रो विकास के लिए हल किया जा सकता है और qPCR विश्लेषण करने से पहले विश्लेषण सफल छंटाई प्रोटोकॉल के लिए नियंत्रित करने के लिए । अनुक्रमणिका-छंटाई जानकारी न केवल एक आणविक विशिष्ट उपजनसंख्या के immunophenotyped की जांच के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है जब समस्या निवारण, यदि आप एक अपरिभाषित जनसंख्या छंटाई कर रहे है और कई कम गुणवत्ता वाले कोशिकाओं रहे है एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में मौजूद । सूचकांक छंटाई जानकारी के लिए गेटिंग रणनीति का अनुकूलन और भविष्य कम गुणवत्ता कोशिकाओं की छंटाई से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण क्रांति कैसे विषम कोशिका आबादी है और जांच कर रहे है कोशिका भेदभाव के आगे की समझ के लिए रास्ता फ़र्श । haematopoiesis में, एकल सेल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण HSCs7के सबसेट के लिए रणनीति छंटाई को परिष्कृत करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, multipotent जनक आबादी के विविधता को हल करने के लिए6,24,25 , और चिकित्सा असंवेदनशील ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम सेल की पहचान करने के लिए आबादी22,26। दोनों एकल सेल जीन अभिव्यक्ति के साथ छंटाई सूचकांक का संयोजन-और कार्यात्मक विश्लेषण पहले से दिखाया गया है विश्वसनीय और कुशल जब जांच immunophenotype और विभिंन आबादी27के विविधता, 28,29. यहां, सेल की आबादी के आणविक और immunophenotypic विविधता की जांच के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है, जहां एकल सूचकांक छंटाई के साथ सेल qPCR संयोजन तेजी से और reproducible परिणाम जटिल विश्लेषण के बिना एक छोटी में सक्षम बनाता है Timeframe.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्वीडिश कैंसर सोसायटी, स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्वीडिश चिकित्सा अनुसंधान के लिए सोसायटी, स्वीडिश बचपन कैंसर फाउंडेशन, राग् Söderberg फाउंडेशन, और Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD14 PECY5 eBioscience 15-0149-42 Clone: 61D3
CD16 PECY5 Biolegend 302010 Clone: 3G8
CD56 PECY5 Biolegend 304608 Clone: MEM-188
CD19 PECY5 Biolegend 302210 Clone: HIB19
CD2 PECY5 Biolegend 300210 Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5 Biolegend 300310 Clone: HIT3a
CD123 PECY5 Biolegend 306008 Clone: 6H6
CD235A PECY5 BD Pharma 559944 Clone GAR2
CD34 FITC Biolegend 343604 Clone: 561
CD38 APC Biolegend 303510 Clone: Hit2
CD90 PE Biolegend 328110 Clone: 5E10
CD45RA BV421 BD bioscience 560362 Clone: HI100
CD49f Pecy7 eBioscience 25-0495-82 Clone: eBioGOH3
FBS HyClone SV30160.3
PBS HyClone SH30028.02
96-well u-bottom Plate VWR 10861-564
SFEM Stem cell technologies 9650
Penicillin streptomycin HyClone SV30010
TPO Peprotech 300-18
SCF Peprotech 300-07
FLT3L Peprotech 300-19
Falcon Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Eppendorph tube Sarstedt 72.690.001
CST beads BD 642412
Accudrop Beads BD 345249 6 µm particles 
Adhesive film Clear Thermo scientific  AB-1170
Adhesive film Foil Thermo scientific  AB-0626
96 well PCR plate Axygen PCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tube Axygen MCT-150-L-C
T100 PCR cycler BioRad 186-1096
10% NP40 Thermo scientific  85124
10 mM dNTP Takara 4030
0.1 M DTT Invitrogen P2325
RNAsout Invitrogen 10777-019 RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit Invitrogen 11753-100
Neuclease free water Invitrogen 11753-100 from CellsDirect kit
2x Reaction Mix Invitrogen 11753-100 from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix Invitrogen 11753-100 from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen 10966026
TaqMan Cells-to-CT Control Kit Invitrogen 4386995
Xeno RNA Control Invitrogen 4386995 From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay Invitrogen 4386995 From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs Fluidigm BMK-M10-96.96
2x Assay Loading Reagent Fluidigm From 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading Reagent Fluidigm From 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid  Fluidigm From 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
BioMark HD Fluidigm BMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFC Fluidigm BMK-M10-96.96GT
Excel Microsoft Microsoft
FlowJo V10 TreeStar TreeStar
Fluidigm real time PCR analysis Fluidigm Fluidigm
CD179a.VPREB1 Thermofisher scientific Hs00356766_g1
ACE Thermofisher scientific Hs00174179_m1
AHR Thermofisher scientific Hs00169233_m1
BCR_ABL.52 Thermofisher scientific Hs03043652_ft
BCR_ABL41 Thermofisher scientific Hs03024541_ft
BMI1 Thermofisher scientific Hs00995536_m1
CCNA2 Thermofisher scientific Hs00996788_m1
CCNB1 Thermofisher scientific Hs01030099_m1
CCNB2 Thermofisher scientific Hs01084593_g1
CCNC Thermofisher scientific Hs01029304_m1
CCNE1 Thermofisher scientific Hs01026535_g1
CCNF Thermofisher scientific Hs00171049_m1
CCR9 Thermofisher scientific Hs01890924_s1
CD10.MME Thermofisher scientific Hs00153510_m1
CD11a Thermofisher scientific Hs00158218_m1
CD11c.ITAX Thermofisher scientific Hs00174217_m1
CD123.IL3RA Thermofisher scientific Hs00608141_m1
CD133.PROM1 Thermofisher scientific Hs01009250_m1
CD151 Thermofisher scientific Hs00911635_g1
CD220.INSR Thermofisher scientific Hs00961554_m1
CD24.HSA Thermofisher scientific Hs03044178_g1
NCOR1 Thermofisher scientific Hs01094540_m1
CD26.DPP4 Thermofisher scientific Hs00175210_m1
CD274 Thermofisher scientific Hs01125301_m1
CD276 Thermofisher scientific Hs00987207_m1
CD32.FCGR2B Thermofisher scientific Hs01634996_s1
CD33 Thermofisher scientific Hs01076281_m1
CD34 Thermofisher scientific Hs00990732_m1
CD344.FZD4 Thermofisher scientific Hs00201853_m1
CD352.SLAMF6 Thermofisher scientific Hs01559920_m1
CD38 Thermofisher scientific Hs01120071_m1
CD4 Thermofisher scientific Hs01058407_m1
CD41.ITGA2B Thermofisher scientific Hs01116228_m1
CD49f.ITGA6 Thermofisher scientific Hs01041011_m1
CD56.NCAM1 Thermofisher scientific Hs00941830_m1
CD9 Thermofisher scientific Hs00233521_m1
CD97 Thermofisher scientific Hs00173542_m1
CD99 Thermofisher scientific Hs00908458_m1
CDK6 Thermofisher scientific Hs01026371_m1
CDKN1A Thermofisher scientific Hs00355782_m1
CDKN1B Thermofisher scientific Hs01597588_m1
CDKN1C Thermofisher scientific Hs00175938_m1
CEBPa Thermofisher scientific Hs00269972_s1
CSF1r Thermofisher scientific Hs00911250_m1
CSF2RA Thermofisher scientific Hs00531296_g1
CSF3RA Thermofisher scientific Hs01114427_m1
E2A.TCF3 Thermofisher scientific Hs00413032_m1
EBF1 Thermofisher scientific Hs01092694_m1
ENG Thermofisher scientific Hs00923996_m1
EPOR Thermofisher scientific Hs00959427_m1
ERG Thermofisher scientific Hs01554629_m1
FLI1 Thermofisher scientific Hs00956711_m1
FLT3 Thermofisher scientific Hs00174690_m1
FOXO1 Thermofisher scientific Hs01054576_m1
GAPDH Thermofisher scientific Hs02758991_g1
GATA1 Thermofisher scientific Hs00231112_m1
GATA2 Thermofisher scientific Hs00231119_m1
GATA3 Thermofisher scientific Hs00231122_m1
GFI1 Thermofisher scientific Hs00382207_m1
HES1 Thermofisher scientific Hs01118947_g1
HLF Thermofisher scientific Hs00171406_m1
HMGA2 Thermofisher scientific Hs00171569_m1
HOXA5 Thermofisher scientific Hs00430330_m1
HOXB4 Thermofisher scientific Hs00256884_m1
ID2 Thermofisher scientific Hs04187239_m1
IGF2BP1 Thermofisher scientific Hs00198023_m1
IGF2BP2 Thermofisher scientific Hs01118009_m1
IKZF1 Thermofisher scientific Hs00172991_m1
IL1RAP Thermofisher scientific Hs00895050_m1
IL2RG Thermofisher scientific Hs00953624_m1
IRF8 Thermofisher scientific Hs00175238_m1
ITGB7 Thermofisher scientific Hs01565750_m1
KIT Thermofisher scientific Hs00174029_m1
Lin28B Thermofisher scientific Hs01013729_m1
LMO2 Thermofisher scientific Hs00153473_m1
LYL1 Thermofisher scientific Hs01089802_g1
Meis1 Thermofisher scientific Hs01017441_m1
mKi67 Thermofisher scientific Hs01032443_m1
MPL Thermofisher scientific Hs00180489_m1
MPO Thermofisher scientific Hs00924296_m1
NFIB Thermofisher scientific Hs01029175_m1
Notch1 Thermofisher scientific Hs01062011_m1
Pten Thermofisher scientific Hs02621230_s1
RAG2 Thermofisher scientific Hs01851142_s1
RPS18 Thermofisher scientific Hs01375212_g1
RUNX1 Thermofisher scientific Hs00231079_m1
Shisa2 Thermofisher scientific Hs01590823_m1
Spi1 Thermofisher scientific Hs02786711_m1
Sterile.IgH Thermofisher scientific Hs00378435_m1
TAL1 Thermofisher scientific Hs01097987_m1
THY1 Thermofisher scientific Hs00264235_s1
Tim.3.HAVCR2 Thermofisher scientific Hs00958618_m1
VWF Thermofisher scientific Hs00169795_m1

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References

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Sommarin, M. N. E., Warfvinge, R.,… More

Sommarin, M. N. E., Warfvinge, R., Safi, F., Karlsson, G. A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations. J. Vis. Exp. (140), e57831, doi:10.3791/57831 (2018).

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