Summary
Основная ген выражение измерения облако отдельной ячейки различия в гетерогенных клеточных популяций. Здесь мы описываем протокол для анализа выражения гена как одноклеточных и индекс Сортировка по цветения активирован ячейку Сортировка (FACS) могут быть объединены для разграничения неоднородность и immunophenotypically характеризуют молекулярно различных клеточных популяций.
Abstract
Иммунофенотипический характеристика и молекулярный анализ давно использовались для разграничения неоднородность и определить собственный клеточных популяций. СУИМ относится по своей сути одноклеточных, однако до молекулярного анализа, клетки-мишени часто проспективно изолированы навалом, тем самым теряя резолюции одноклеточных. Анализ выражения гена одноклеточных предоставляет средства для понимания молекулярные различия между отдельными ячейками в гетерогенных клеточных популяций. В массового анализа клеток завышается типа отдельных клеток приводит к предубеждения и окклюзий сигналов от редких клеток с биологической важности. Путем использования СУИМ индекс сортировки в сочетании с анализ выражения гена одноклеточных, населения могут быть исследованы без потери одной ячейки резолюции в то время как клетки с поверхности маркер выражения промежуточные клетки также регистрируются, включение оценки актуальность непрерывной поверхности маркер выражения. Здесь мы опишем подход, сочетающий одной ячейки обратной транскрипции количественного PCR (RT-ПЦР) и СУИМ индекс сортировки одновременно характеризовать молекулярных и иммунофенотипических гетерогенность в популяции клеток.
В отличие от одноклеточного РНК последовательности методов использование ПЦР с конкретной цели усиления позволяет для надежного измерения низкой изобилие стенограммы с меньшим количеством отсева, в то время как она не confounded, вопросы, связанные с вариациями для ячеек в чтение глубины. Кроме того непосредственно индекс сортировка сингл клетки в лизис буфер этот метод, позволяет для синтеза cDNA и конкретных целевых предварительного усиления выполнить за один шаг, а что касается корреляции впоследствии производных молекулярной подписей с клеточной поверхности маркер выражения. Описанный подход был разработан для расследования гемопоэтических сингл клетки, но также успешно используются на других типах клеток.
В заключение подход, описанный в настоящем документе для чувствительных измерения mRNA выражение для группы предварительно отобранных генов с возможностью позволяет разрабатывать протоколы для последующих потенциальных изоляции молекулярно отдельных субпопуляций.
Introduction
Каждой отдельной клетки крови, как считается, проживают в клеточном иерархии, где стволовые клетки формируют Апекс поверх ряда все более совершенные промежуточных прародителей, которые в конечном итоге неизлечимо дифференцироваться в окончательный эффекторные клетки, несущие конкретных биологические функции1. Большая часть знаний о том, как организованы стволовых клеток систем был создан в системе кроветворения, во многом из-за способность перспективно изолировать отдельных гемопоэтических населения высокообогащенного стволовых клеток или различных прародителей2 сортируя СУИМ. Это позволило для многих из этих групп населения будут проанализированы функционально или молекулярно, преимущественно через выражение гена профилируя3,4. Однако когда анализ экспрессии генов сыпучих населения индивидуальных различий между ячейками усредняются и потерял5. Таким образом невозможности выявления отклонений в ячейке в гетерогенных клеток фракций может посрамить нашего понимания важнейших биологических процессов, если малого подмножества ячеек для выводимого биологические функции этого населения6, 7. И наоборот расследование подписей выражение генов в одной ячейки резолюции предлагают возможность разграничить неоднородность и обойти затмевает влияний из перепредставленных подмножеств клетки8.
На сегодняшний день были разработаны многие протоколы для анализа выражения гена одной ячейки; с каждым подходом, имея свой собственный предостережений. Метод ранней был РНК флуоресцентные в situ гибридизация (РНК-рыба), который измеряет ограниченное количество стенограммы в то время, но является уникальным в том, что она позволяет для исследования РНК локализации9,11. Ранние методы, с помощью ПЦР и ПЦР для выявления одного или немногих стенограммы были также разработаны12. Однако они в последнее время были заменены на основе микрофлюидика методы, которые можно одновременно анализировать выражение сотни стенограммы на ячейку в сотни клеток через ПЦР и таким образом позволяют для высоких мерного неоднородность анализ с помощью предопределены гена панелей10,13. Недавно РНК последовательности-технологии на основе стали широко использовали для анализа одной ячейки, как теоретически можно измерить всю транскриптом клетки и таким образом добавить произвольное измерение неоднородность анализа10, 14. Multiplexed ПЦР анализ и одноклеточного РНК последовательности имеют разные функции, таким образом обоснование с использованием любого из методов зависит вопрос, а также количество клеток в целевой популяции. Высокой пропускной способностью и низкой стоимости в клетку вместе с беспристрастной, исследовательские характеристики сингл клеточной РНК последовательности желательно, когда расследование неизвестной клетки или больших групп населения. Однако сингл клеточной РНК последовательности также предвзято к виртуализации высокой обильные стенограммы чаще пока стенограммы с низкой изобилие подвержены отсева. Это может привести к значительно сложных данных, которые ставит высокий спрос на bioinformatic анализ, чтобы выявить важные молекулярных сигналов, которые часто тонкие или скрытые в технических шума15. Таким образом, для хорошо изученных тканях, одной ячейки ПЦР анализ с использованием заранее грунтовка панелей, отобранных для функционально важно генов или молекулярных маркеров может служить в качестве чувствительных, простой подход, чтобы определить неоднородности населения. Однако, следует отметить, что по сравнению с одной ячейкой РНК seq, стоимость ячейки как правило, выше для одной ячейки ПЦР методов. Здесь мы опишем подход, сочетающий одноклеточных RT-ПЦР (изменение от Телеш J. et al. 16), СУИМ индекс сортировки17 и биоинформатики анализ18 для того чтобы одновременно характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность населения.
В этом подходе окрашенных клеток населения интерес, и одного клетки отсортированы по СУИМ непосредственно в буфер lysis в 96-луночных ПЦР планшетов. Одновременно выражение уровни дополнительного набора маркеров клетк поверхности записываются для каждой одной ячейки во время СУИМ сортировка, метод, который называется индекс сортировка. Лизированных клеточный материал впоследствии усиливается и экспрессии генов выбранного набора генов, проанализированы с RT-ПЦР, используя microfluidic платформа. Эта стратегия позволяет молекулярный анализ отсортированный одноклеточных, а также одновременное характеристика каждой отдельной ячейки клетк поверхности маркер выражения. Непосредственно сопоставив молекулярно различные подмножества ячеек в выражение индексированных маркеров отсортированный, субпопуляции могут быть связаны с конкретной иммунофенотип, который может использоваться для их будущих изоляции. Описан метод шаг за шагом на рисунке 1. Заранее гена Группа далее способствует более высоким разрешением экспрессии целевых генов, поскольку он обходит измерения не значения обильные генов, которые в противном случае может загородить тонкие ген выражение сигналов. Кроме того конкретные цели усиления, один шаг обратной транскрипции и усиления позволяет для надежного измерения низким выраженным стенограмм, как факторы транскрипции или не поли adenylated РНК. Важно отметить, что ПЦР методы позволяют для измерения mRNA от синтез белков, которые имеют важное значение при расследовании некоторых злокачественных заболеваний19. Наконец расследование целенаправленных количество генов, низкий процент отсева, и ограниченные технические различия между клетки делают этот метод легко проанализированы по сравнению с выше размеров методы, такие как сингл клеточной РНК seq. В соответствии с протоколом, может выполняться эксперимент всего, от сортировки клеток проанализированы результаты, в течение трех дней, что делает это простой и быстрый метод для чувствительной, высок объём одноклеточных гена выражения анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Lysis пластин
- Используя свободный скамейке РНК/ДНК, подготовить достаточно буфера lysis для 96 скважин, с 10% Дополнительно, путем смешивания 390 мкл нуклеиназы свободной воды, 17 мкл 10% NP-40, 2.8 мкл dNTP 10 мм, 10 мкл 0,1 М DTT и АБС битор РНКазы 5.3 мкл (см. Таблицу материалы). Вортекс и спином вниз.
- Распространять 4 мкл буфера lysis для каждой скважины 96 хорошо ПЦР пластины и уплотнения пластин с липкой пленкой. Спин вниз трубы для сбора жидкости в нижней части пластины. Держите пластины на льду до ячейку Сортировка (максимум 24 часа).
2. Подготовка клеток для сортировки клеток
- Оттепель соответствующее количество клеток (здесь, CD34 обогащенного гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток) для эксперимента. 1 х 106 клеток являются подходящими для сортировки примерно три пластины 96-луночных сингл-клеток с элементами управления.
- Размороженный клетки перехода к 15 мл Конические трубки и добавьте 1 mL FBS каждые 30 s, пока не будет достигнут общий объем 8 мл. Спина клетки в центрифуге на 350 x g 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 8 мл, окрашивание буфера (PBS с 2% FBS) и центрифуги на 350 x g 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 200 мкл окрашивание буфер и удаление ячеек для управления пятна.
- Сделать флуоресценции минус один из элементов управления (FMOs) для каждого Флюорофор, путем пятнать часть клеток в 50 мкл, окрашивание буфера. В этом примере 6 microcentrifuge трубы с 20 000 ячеек используются как FMOSs. Обратите внимание, что количество клеток должны быть скорректированы в зависимости от населения расследование. Добавьте все антитела на такой же концентрации как в образце пятно за исключением одного для каждой трубы.
- Сделайте одного пятна для каждого Флюорофор, окрашивание, часть клеток в 50 мкл буфера для каждого Флюорофор используется. В этом примере используются 6 microcentrifuge трубы с 20 000 ячеек. Обратите внимание, что целевой объект для каждого антитела необходимо быть выраженные ячеек, которые используются для элементов управления. Добавьте каждое антитело на такой же концентрации как в образце пятно в отдельных труб. Кроме того Держите 20000 неокрашенных клетки в 50 мкл как элемент неокрашенных.
- Образец клеток добавьте в их соответствующей концентрации антител. Используется здесь CD34-FITC в концентрации 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 и Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, и CD235a-PECy5 1/1000.
- Инкубируйте клетки с антителами 30 мин на льду в темноте.
- Вымойте клетки с 3 мл, окрашивание буфера. Центрифуга клетки на 350 x g 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки и повторите шаг 2.9.
- Ресуспензируйте образца в 500 мкл и FMOs в 100 мкл, окрашивание буфер с 1/100 7AAD и фильтр клетки через фильтр 50 мкм, чтобы получить одну ячейку подвеска.
3. ячейку Сортировка
- Убедитесь, что машина СУИМ установлен правильно с падения задержки и цитометр установки и отслеживания (КНТ) недавно выполненных согласно инструкциям производителя, чтобы обеспечить, что соответствующие клетки отсортированы. Для гемопоэтических клеток рекомендуется использовать 85 мкм сопла и максимальная скорость 4, в то время как стоимость оптимальной событий между 800 и 2000 событий/сек.
- Исправление для спектрального наложения, выполняя компенсации по флюоресценции и установить ворота согласно FMO или внутренними негативные элементы управления.
- Выполняют реанализа целевых групп населения путем сортировки по меньшей мере 100 клеток-мишеней в новой microcentrifuge трубу с 100 мкл буфера пятно. СУИМ анализировать сортировки клеток путем записи отсортированный образца и убедитесь, что они в конечном итоге в ворота сортировки.
- Установка одной пластине ячейку Сортировка по центрирование падение хорошо A1 в 96 хорошо пластины. Когда он центрируется, сортировать 50 – 100 6 мкм частицы во всех скважин вокруг края пустой 96 хорошо пластины для обеспечения получения всех скважин ячейки в центре каждой скважины.
- Если возможно дополнительный элемент управления для обеспечения жизнеспособных клеток сортируются могут быть добавлены путем сортировки сингл клетки для роста в пробирке . Кроветворной клетки можно выращивать в U-дно 96 хорошо пластины в 100 мкл SFEM с 1% пенициллин стрептомицина, 100 нг/мл, FLT3L, ТПО и SCF. Анализ каждой скважины после 3 дней в культуре клеток колоний с помощью микроскопа.
- Удаления клейкая пленка из плит. Сортировка одну ячейку интерес (здесь Линь-CD34 + CD38-клетки), в 92 из 96 скважин, активировать, индекс сортировка в СУИМ, сортировка программного обеспечения, чтобы сохранить Иммунофенотипический профиль для других отметок интереса (здесь CD45RA, CD49f и CD90) для каждой одной ячейки.
- Сортировать две скважины с ячейками 10 и 20 соответственно для элементов управления линейность в ПЦР-амплификации. Обычно используются Уэллс H1 и H2.
- Держите две скважины без каких-либо клетки как без шаблон управляет, обычно скважин H3 и H4.
- Печать пластины с ясно липкой пленкой и спин таблички на 300 x g за 1 мин до замораживания на сухой лед оснастки.
- Хранить замороженные пластины-80 ° c.
Примечание: Пункт безопасной остановки. Сортировки и лизированных клетки могут храниться при температуре-80 ° C для длительного хранения.
4. обратной транскрипции и конкретных целевых усилители
- Подготовка смеси праймера для всех целей 96 гена, добавив 2 мкл каждой пары праймера, включая уборки гена грунтовки и грунты для управления шипами в РНК, в 1,5 мл РНКазы бесплатно трубки на лавочке бесплатно РНК/ДНК. Если используется менее чем 96 грунты, добавьте эквивалентный объем нуклеиназы свободной воды для отсутствующих грунтовки. Праймеры заказаны отдельно чтобы соответствовать панели нужного гена.
- Сделать обратной транскрипции и конкретных целевых амплификации перемешать, добавив 632.5 мкл 2 x реакции микс, 101.2 мкл Taq/SuperscriptIII, 151.8 смеси праймера мкл и 0,7 мкл шипами в управления РНК. Преформа этот шаг на лавочке бесплатные ДНК. Смесь vortexing и спин вниз сбор жидкости в нижней части трубки. Держите на льду до дополнение к образцу.
- Сделать нет обратной транскрипции управления микс для четырех скважин, смешивая 27,5 мкл 2 x реакции микс, 1,76 мкл энзим Taq, 6,6 мкл смеси праймера и 2,64 мкл нуклеиназы свободной воды. Спайк в управления РНК. Выполните этот шаг на лавочке бесплатные ДНК. Вортекс и спин вниз сбор жидкости в нижней части трубки и держать на льду до дополнение к образцу.
- Оттепель lysate пластины на льду. Мкл 8,75 ранее подготовленных обратной транскрипции и конкретных целевых амплификации микс 92 скважин, включая линейность и без шаблон элементов управления. Мкл 8,75 без обратной транскрипции управления смеси четырех оставшихся скважинах. Уплотнение пластины с четкой самоклеющаяся пленка и спин вниз собрать жидкость в нижней части пластины.
- Преформа обратной транскрипции и конкретных целевых амплификации, запустив пластину в машину ПЦР согласно программе предусилителя; Шаг 1:50 ° C в течение 60 мин., шаг 2: 95 ° C в течение 2 мин, шаг 3: 95 ° C 15 s, шаг 4: 60 ° C в течение 4 мин, повторите шаги 3 – 4 24 раза и наконец шаг 5: 8 ° C навсегда.
- После завершения ПЦР Держите пластины на 8 ° C для краткосрочного хранения и -20 ° C для длительного хранения.
Примечание: Пункт безопасной остановки. Усиленный материал может храниться на 8 ° C для кратковременного хранения и при-20 ° C для длительного хранения.
5. Подготовка образца и пробирного пластины мультиплекс Microfluidic гена анализ выражения
- Подготовка анализа загрузки плита дозирования 3 мкл Реагента загрузки Assay для каждой скважины 96 хорошо плиты. 3 мкл каждого праймера, для отдельных скважин в assay загрузки плита.
- Печать табличка с клейкой пленки и спин вниз собрать жидкость в нижней части пластины.
- Подготовьте разрежения пластины дозирования 8 мкл нуклеиназы свободной воды на всех скважинах 96 хорошо плиты. 2 мкл усиливается образца, для разбавления пластины, делая окончательный разбавления 1:5.
- Печать табличка с липкой пленкой, mix vortexing пластина для 10 s и наконец спина до сбора жидкости в нижней части пластины.
- Подготовьте пример загрузки микс, тщательно перемешивая 352 мкл мастер смеси с 35,2 мкл пример загрузки реагента. Подготовка образца пластина мкл aliquoting 3.3 Загрузка смеси для каждой скважины 96 хорошо плиты.
- Мкл 2.7 из разреженных образца в каждой скважине образца загрузки плита.
- Печать табличка с клейкой пленки и спин вниз собрать жидкость в нижней части пластины.
6. Загрузка Microfluidic чип
- Выньте новый чип microfluidic 96 x 96. Подготовьте заливов, тыкая их с помощью шприца с крышкой на чтобы убедиться, что они могут быть перемещены.
- Удалите пузыри из шприцы. Добавьте полный объем шприцы для каждого клапана во время наклона чип 45 градусов и нажав вниз клапан. Основной чип с контроллером МФК.
- Загрузка каждого пробирного входе с 4,25 мкл каждого из скважин в assay загрузки плита. Избегайте пузырей. Если в колодец появляются пузыри, удалите их с кончиком пипетки.
- Продолжить загрузку каждого образца входе с 4,25 мкл каждого из скважин в образце загрузки плита, избежать пузырей и если появятся пузырьки, удалите их с кончиком пипетки.
- Загрузить чип с контроллером МФК.
- Проверьте, что чип выглядит даже и что все камеры были загружены. Удалите пыль с поверхности чипа, прикоснувшись с лентой. Запустите чип в платформе выражение гена мультиплекс microfluidic.
7. Запуск чип на платформе мультиплекс Microfluidic ген выражение
- После загрузки чип в платформу выражение гена мультиплекс microfluidic, имя образца.
- Установите ROX как пассивный краситель. Установите один зонд и FAM-МГБ как флуоресценции. Используйте стандартные v2 96 x 96, как протокол. Начало выполнения.
- Удаление стружки при запуске полной.
8. предварительный анализ выполнения чип
- Загрузка данных в реальном масштабе времени PCR анализа программного обеспечения.
- Загрузить гена имена и названия ячеек путем вставки клеточной и генной макеты из файла с разделителями табуляции.
- Открыть изображение и выберите ROX как краситель. Проверьте, если все скважины ROX пассивной красителя.
- Исследовать, если все усилители участки выглядят нормально, с гладкой амплификации кривой с без каблука (аналогично рис 3E).
- Обеспечьте все одно клетки выражение шипами в управления РНК, чтобы убедиться, что все были загружены правильно.
- Убедитесь, что все клетки имеют уборки экспрессии генов и таким образом были отсортированы должным образом.
- Обеспечьте контроль линейность ячейки 10 и 20 примерно 1 CT разница для проверки линейные усилители.
- Проверьте, если есть выражение в Норт контрольных образцов. Если выражение обнаружен в Норт аккумуляторную зонды для датчиков, которые не обнаруживают геномной ДНК для последующих запусков.
- Экспорт данных в файлы csv для дальнейшего анализа.
9. одноклеточных анализ с использованием SCExV
Примечание: Ознакомительного фильма является настоящей20 представить инструмент. Здесь представлены короткие рекомендации о том, как сделать анализ с помощью элементов управления, представил в протоколе.
- Подключение к веб-сайт SCexV20.
- Загрузите экспортированный CSV-файлов.
- Выбрал управления шипами в РНК как позитивный элемент управления. Удалите любую ячейку, которая имеет контроль над 25 CT РНК. Нормализовать данные средний выражение управления РНК.
- Нажмите «здесь -> анализ». Удаление Северный, notemplate, 10 и 20 мобильные элементы управления в параметре исключить ячейки.
- Клетки кластера кластеризации подход по выбору с ожидаемое количество кластеров. Экспорт анализируемого значения.
10. индекс сортировка анализ
- Откройте программное обеспечение анализа СУИМ и загрузить индексированные образцов.
- Открыть редактор сценариев и запустите сценарий доступен из Quinn J. et al. 21
- Теперь, когда анализ программного обеспечения СУИМ следовало бы ворота для каждого из одной клетки, откройте редактор макетов и цвет ячеек в зависимости от группировки из SCexV (доступна в файл с именем «Sample_complete_Data.xls»).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, в описанный быстро, легко осуществляется и высокой надежностью. На рисунке 1представлен обзор экспериментальной установки. Весь протокол от сортировки одного-клеток, усиление конкретных целевых, ген выражение измерения и предварительный анализ может выполняться в течение трех дней. Пример проанализированы результаты в виде тепла карта, которая представляет предварительные проанализированы данные от одноклеточного ген выражение анализа с помощью грунтовки 96 и 96 ячейки от пациента хронический миелолейкоз (CML) или 96 от возраста согласованной здорового управления представлена на рисунке 2. Использование иерархической кластеризации, проанализированы клетки можно разделить на четыре подгруппы, основанный на их подписи выражения гена. Визуализации карты тепла является удобным способом получить обзор данных, а также управления для скважин, которые должны быть исключены из анализа (например, контроль скважины). Рисунок 2B является анализ главных компонентов (PCA), визуализации, насколько похожи друг к другу с помощью измерения сокращение клеток каждой группы. Здесь нетипичные легко отличить от остальной части клетки. Чтобы проанализировать как отдельные гены распределены между кластерами, а также отличаются между ними, скрипка участки являются полезными. В рисунке 2 c, показываются экспрессии генов, четыре представителя: Сплавливание гена BCR-ABL1, который помечает все лейкозных клеток; mKI67 маркера клеточного цикла, который выражается в группе активного деления; Миелоидные дифференциации маркер MPO, который ограничивается Велоспорт подгруппы; и наконец дом гена RPS18, которая выражается во всех клетках. Наконец в 2D фигура молекулярных подписей было увязать с immunophenotyped, как идентификаторы каждой ячейки в каждом кластере используются цвета отдельных ячеек в участке СУИМ, образующиеся индекс сортировка. Показана клеток поверхности маркер выражение для маркеров гемопоэтических стволовых клеток CD90 и CD45RA, что в этом случае может использоваться для различения некоторых из кластеров и проспективно изолировать их для функционального анализа.
Микрофлюидика, используемых для выполнения одной ячейки ПЦР очень чувствителен к введение воздуха или частиц в системе. Таким образом важно сделать проверку после выполнения качества данных. Рисунок 3 показывает представитель данных и контраст между успешными и неудачными запустить из-за плохой пример загрузки. На рисунке 3A показывает, как успешно Rox уровни после успешного запуска распространение равномерно через все скважины, обнадеживает то, что загрузки. В противоположность этому рисунок 3B иллюстрирует, как образец и пробирного загрузки провалились как указывалось отсутствие ROX в больших частях чипа. После оценки качества Rox, можно оценить качество сырья ген выражение сигналов. В рисунке 3 c, представлен тепловую карту успешного запуска, где выражение равномерно распределяется по всей образцы с сильным сигналом вокруг 7-25 Ct:s. в контраст, Рисунок 3D показывает тепловую карту неудачного запуска где многие образцы имеют нет сигнала или выражение очень ограниченное количество генов. Результаты в рисунке 3D , вероятно, из-за ошибки в сортировке СУИМ до анализ выражения гена одной ячейки, так как многие клетки имеют четкое выражение сигналы, в то время как другие не выражение полностью. Наконец 3E рисунок отображает кривой ожидаемого усиления борьбы с шипами в РНК с все скважины, имеющие четкое выражение около 10 КТ с практически никаких изменений. Этот положительный контроль мер эффективности всех мер в рамках одной ячейки ПЦР анализа. Для того, чтобы усиление в рамках динамического диапазона, числа различных клеток включены как линейность контроля; Здесь используются элементы 10 - и 20-клеток. CT различия между линейность управления должны отражать различия в число клеток. Наконец нет обратной транскрипции (Норт) и не негативный контроль шаблон убедитесь, что не ложные положительные сигналы обнаружены от геномной ДНК или загрязнений, соответственно.
Рисунок 1: Схема протокола. Клетки витражи, отсортированных с индекс сортировка приложение активировано для записи поверхности маркер выражения и анализироваться выпустить мРНК. мРНК впоследствии обратной транскрипции cDNA и усиливаются с помощью конкретных целевых амплификации. Далее, образцы загружаются вместе с отдельными грунтовки в microfluidic чип, где ген выражение профиль каждой ячейки анализируется с помощью RT-ПЦР. После сбора данных данные предварительно обработанную, чтобы удалить низкого качества клетки и кластеризации выполняется для определения молекулярно различных клеточных популяций. Наконец, молекулярно определенных подгрупп населения связаны с поверхности маркер выражения от СУИМ индекс сортировки данных для immunophenotypically характеризует неоднородность населения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты трех успешных одноклеточных гена выражения анализирует гемопоэтических стволовых клеток нормальных и лейкозных. (A) тепла карта, показывающая одноклеточных ген выражение измерения 270 единичных клеток от одного пациента хронический миелолейкоз, а также возраст соответствует здорового управления, анализируемой иерархической кластеризации с использованием SCExV 18, инструмент анализа для этого типа данных. Красный представляет высокое выражение, синий низкая и серый не выражение. Клетки были разделены на четыре различных кластеров на основе их подписи выражения гена. Это ясно из данных, что лейкозных стволовых клеток населения от этого пациента можно разделить в одной покоя населения (Группа 3), с выражением лишь несколько маркеров дифференциации и одного активного деления населения, инициировавший выражение гены, связанные с миелоидной дифференциации (Группа 4). Данные, используемые здесь — от выбранного пациента, включены в ранее опубликованных работ по Warfvinge и др. 22 (Б) основной компонент анализа (PCA) данных, отображаемых в A, где четыре разделенных групп может быть доказано. (C) скрипка участков четырех генов с конкретным выражением кластера, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 и MPO. Каждый участок скрипка представляет выражение в каждом кластере и пунктирная линия через представляет среднее значение выражения для всех ячеек. (D) индекс сортировка анализ одного из пациентов образцов, представленных на тепловой карте, где каждой отдельной ячейки отмеченные цветом его молекулярной субпопуляция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: контроль качества мультиплексной ПЦР в реальном масштабе времени PCR программного обеспечения. (A) Rox Загрузка изображений успешного образца и пробирного загрузки. (B) Rox Загрузка изображений неудачные пробы и пробирного загрузки, где неудачных нагрузки образцов показали отсутствие ROX в горизонтальные линии. Сбой загрузки анализов будет показан в вертикальных линий. (C) пример успешного запуска в режиме карты тепла, где сингл клетки представляют собой строки, и гены представляют столбцы. Высокая ген выражение указывается в желтый, низким синим цветом и не обнаруженного выражений в черном. (D) пример неудачного запуска в режиме карты тепла, где сингл клетки представляют собой строки, и гены представляют столбцы. Представляет выражение гена высокой, желтый, низкий выражение представлено синий и не обнаруженного выражение как черный. (E) нормированный интенсивности (слева) и амплификации сюжета (справа) элемента управления шипами в РНК. CT-примерно 10 и кривых с ограниченной вариации указывают успешных и надежных обратной транскрипции, предварительного усиления и ПЦР анализа в рамках всех скважин. (F) нормированный интенсивности (слева) и амплификации сюжета (справа) неудачной гена. Нормализованное интенсивности не образуют кривую и амплификации сюжета показывает большие пики в флуоресцировании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние годы анализ выражения гена одной ячейки стал ценным дополнением для определения неоднородности популяций различных клеток23. Появление РНК последовательности технологий теоретически обеспечивает возможность измерить всю транскриптом ячейки, однако эти методы осложняются вариации в последовательности ячеек в глубинах и отсева. Предлагает одной ячейки ПЦР, чувствительной и надежный анализ выражения сотен генов критическое, где все клетки обрабатываются аналогичным образом, сокращение технических шум. Целенаправленный анализ ограниченного числа стенограммы дополнительно позволяет для упрощенного анализа без вмешательства с сильно выраженной генов.
Поскольку подход расследует только подмножество генов в клетках крайне важно выбрать правильный набор генов при проектировании панели ген. Выбор генов может быть сделано несколькими способами; через литературу, предыдущие выводы массового анализа и анализа биоинформатики публично доступных данных. Это не тривиальный; Однако с правильным набором генов подход может быть очень мощным. Когда группа генов были разработаны, важно проверить, что праймеры не вмешивается во время мультиплексирования. Здесь мы рекомендуем анализа если грунты являются линейными, брикетирования серию разрежения с достаточным материалом; разрежения, проявленную серии праймеров, используемые в данном исследовании в дополнительном рисунок 2D в Warfvinge и др. 22
Два основных ограничения протокола, представленные здесь являются ограниченное количество клеток и гены расследование. Однако даже несмотря на то, что только 96 клетки исследуются в каждом run, этот относительно простой протокол может быть завершена в течение одного дня и таким образом сотен клеток могут быть проанализированы в течение одной недели. Кроме того число генов, расследование может быть увеличено, если больше грунтовки, включены в этап предварительного усиления целевой объект специфического. В этом случае несколько фишек необходимы для расследования каждого набора 96 грунтовки.
Если сильно выражена генов или клетки с высоким РНК содержание анализируются, количество циклов, оптимизированный для гемопоэтических стволовых клеток с низкой общей выражение гена23 должен быть изменен. Изменение усиления циклов также имеет важное значение при расследовании массовых населения. Для массового анализа гемопоэтических стволовых клеток (100 клеток) мы рекомендуем, уменьшая количество циклов предварительного усиления от 25 до 18 лет.
Наиболее распространенные причины не работает из-за неудачной сортировка сингл-клеток в колодец лизис пластины, сортировка нежизнеспособных клеток, субоптимальный предварительного усиления или чип загрузки провал. Уровень Rox в каждой камере реакция является показателем загрузки образца или пробы, и если они являются низкими, рекомендуется, что образцы повторно запускаются на новый чип, с низкой Rox, уровни вероятно вызваны введением пузырей во время загрузки. Отсутствие контроля шипами в РНК выражение является показателем, предварительных усилителей потерпели неудачу, вероятно из-за проблем с предварительного усиления- или обратить вспять транскрипции реагентов. В этом случае рекомендуется выполнение новый чип с недавно сортировки клеток и новых реагентов. Определение управления РНК, но никаких признаков других экспрессии генов сигналов является признаком неудачных одноклеточных СУИМ сортировки до анализ выражения гена. Чтобы избежать ошибок во время СУИМ, Сортировка это важно обеспечить что сингл клетки отсортированы в центр каждой скважины. Это может быть сделано путем сортировка бисера в пустую тарелку и визуальный контроль, где капли земель. Убедитесь, что тест сортировки во всех скважин в края пластины для правильность настройки не только для первых нескольких скважин. Когда применимо, сингл клетки параллельно могут быть отсортированы для роста в пробирке и проанализированы предварительного анализа ПЦР для управления для успешной сортировки протоколов. Индекс Сортировка информации не только позволяют для расследования immunophenotyped молекулярно собственный субпопуляции, но также может предоставить полезную информацию при устранении неполадок, если сортировке неопределенный населения и многие клетки низкого качества в анализ выражения гена одной ячейки. Индекс сортировка информация может использоваться для оптимизации стробирования стратегии и избежать будущих сортировки клеток низкого качества.
Анализ выражения гена одноклеточных революцию как гетерогенной клеток населения исследованы и проложить путь для дальнейшего понимания дифференцировки клеток. Анализ выражения гена одноклеточных в гемопоэз, были использованы для уточнения стратегии сортировки для подмножества СКК7, чтобы устранить неоднородность Multipotent с прародителем населения6,24,25 и для выявления терапии нечувствительны лейкозных стволовых клеток населения22,26. Сочетание индекса, сортировка с одноклеточных ген выражение - и функциональный анализ ранее было показано, быть надежной и эффективной при расследовании иммунофенотип и неоднородности различных популяциях27, 28,29. Здесь, подход для исследования молекулярной и иммунофенотипических гетерогенности клеток населения были описаны, где сочетание одной ячейки ПЦР с индекс сортировки позволяет быстро и воспроизводимые результаты без сложного анализа в короткие сроки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается грантов от шведского общества рака, Шведский исследовательский совет, Шведское общество для медицинских исследований, Шведский фонд детства рака, Рагнар Söderberg фонд и кнут и Фонд Рауля Валленберга Алиса
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
FBS | HyClone | SV30160.3 | |
PBS | HyClone | SH30028.02 | |
96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
TPO | Peprotech | 300-18 | |
SCF | Peprotech | 300-07 | |
FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
CST beads | BD | 642412 | |
Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
Excel | Microsoft | Microsoft | |
FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
- Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).