Summary
离子通道的纯化往往具有挑战性, 但一旦达到, 它就有可能允许对通道的功能和结构进行体外调查。在这里, 我们描述的步骤, 以表达和纯化哺乳动物 bestrophin 蛋白, 一个家庭的 Ca2 +激活 Cl 通道.
Abstract
人类基因组编码四 bestrophin paralogs, 即 BEST1、BEST2、BEST3 和 BEST4。BEST1, 编码的BEST1基因, 是一个 Ca2 +激活 Cl 通道 ( CaCC) 主要表现在视网膜色素上皮 (RPE)。BEST1 的生理和病理意义被强调的事实是, 在BEST1基因的200多个不同的突变已经基因链接到至少五视网膜退行性疾病的频谱, 如最佳 vitelliform黄斑营养不良 (最佳疾病)。因此, 了解 bestrophin 通道在单分子水平上的生物物理学具有重要的意义。然而, 获得纯化的哺乳动物离子通道往往是一项具有挑战性的任务。在这里, 我们报告了哺乳动物 bestrophin 蛋白的表达与 BacMam 杆状病毒基因转移系统和他们的亲和性和大小排斥色谱纯化的协议。纯化蛋白在随后的功能和结构分析中有潜在的应用前景, 如脂质双层和晶体学中的电生理记录。重要的是, 这条管道可以适应研究其他离子通道的功能和结构。
Introduction
Bestrophins 是一个通过从细菌到人类的不同物种而保存的离子通道的家族1。在人类中, BEST1基因, 位于染色体 11q12.3, 编码的膜蛋白 Bestrophin-1 (BEST1), 主要表现在基底膜的视网膜色素上皮 (RPE) 细胞的眼睛2,3 ,4。由585种氨基酸组成, 其中第一 ~ 350 在物种间高度保守, 含有其跨膜区域, BEST1 在人类1、5、6中起 CaCC 作用。此外, 鸡和肺炎克雷伯杆菌的 BEST1 同系物的作用为 homopentamers7,8, 表明整个进化过程中的保护水平很高。
在人类中, BEST1基因的200多个突变已经临床上与一组称为 bestrophinopathies1,9的视网膜变性疾病有关。报告了五项具体 bestrophinopathies, 包括最佳疾病、成人发病 vitelliform 营养不良、常染色体显性 vitreoretinochoroidopathy、常染色体隐性 bestrophinopathy 和视网膜色素变性3、4 ,10,11,12,13,14。这些疾病, 导致视力下降, 甚至失明, 目前无法治愈。为了发展治疗治疗和潜在的个性化医学, 重要的是要了解这些BEST1疾病引起的突变如何影响 BEST1 通道15的功能和结构。为了这些目的, 研究人员需要获得纯化的 bestrophin (野生类型和/或突变) 通道, 并进行体外分析5,8。
第一个关键步骤是哺乳动物细胞中较高物种的 bestrophin 通道的表达。由于 HEK293-F 细胞的杆状病毒转导 (BacMam 系统) 是 heterologously 表达膜蛋白16、17的一种强有力的方法, 该协议利用优化的 BacMam 向量 (pEG BacMam) 进行鲁棒表达。靶蛋白18, 在这种情况下是哺乳动物 bestrophin 同源。该载体用于各种膜蛋白的表达, 包括 G 蛋白偶联受体、核受体和其他离子通道18。还有证据表明, 所生产的蛋白质适合晶体学18。在 HEK293-F 细胞中具有较高的表达水平, 可以用色谱法纯化蛋白质;具体地说, 在 bestrophins 的情况下, 可以使用亲和性和大小排除色谱。
一旦该协议对 bestrophin 通道进行微调, 则可以通过平面脂质双层和 X 射线晶体学分别对纯化后的蛋白质进行分析, 以5、8为其功能和结构。总之, 这些技术为 bestrophins 和其他离子通道的功能和结构研究提供了强有力的管道。
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Protocol
1. 产生 BacMam 表达杆状
- 将所需哺乳动物 bestrophin 蛋白的编码序列插入 pEG BacMam 向量18中, 用烟草蚀刻病毒 (TEV) 蛋白酶识别序列, 然后在蛋白质的 C 末端 GFP-10x 他的标记。
- 瞬时染表达质粒成胶粘剂 HEK293 细胞19,20,21,22,23。用10X 或20X 放大倍数、488 nm 激发源和 510 nm 发射过滤器 (图 1A) 检查荧光显微镜下的 GFP 融合蛋白的表达式。
注: 以聚合物为基础的转染通常以1微克的质粒 DNA 为 HEK293 细胞的35毫米皿进行。 - 在 Sf9 昆虫细胞中产生杆状, 如前所述16、17。
注: 通过 3 (P3) 病毒, 将用于感染 HEK293-F 细胞蛋白质生产, 可以储存在4摄氏度1月。 - 通过斑块形成试验确定 P3 病毒的效价 (传染性单位)16,17。
注: 由于感兴趣的蛋白质是用 GFP 标记的, 快速检查感染单位的方法是通过病毒的序列稀释感染 Sf9 细胞, 并计算48小时后荧光细胞的数量。
2. 蛋白质表达
- 保持悬浮培养中的 HEK293-F 细胞与 HEK293-F 表达培养基在37°c 湿润的孵化器与 8% CO2。使用一次性培养瓶的 2-2. 5 倍大于文化体积和旋转的文化在轨道平台上, 在 135 rpm。
注意: 建议在通道5和30之间对细胞进行感染, 并在细胞培养罩下执行这些操作。 - 24小时前病毒感染, 增加 15 ul 的台盼蓝到 15 ul 整除细胞培养, 并检查细胞密度和可行性使用一个 hemocytometer 显微镜下。稀释细胞到 0.6 x 106细胞/毫升在 2 x 2 L 瓶每, 与500毫升中等预热在37°c。
注意: 死细胞被台盼蓝染成蓝色。所需的细胞生存能力为 > 95%。 - 在感染日, 检查细胞密度和生存能力 (步骤 2.2)。
注意: 高细胞活力 > 95% 对于有效的感染和蛋白质表达是必不可少的。预期细胞密度为 ~ 1.0 x 106细胞/毫升 (从 500 x 0.610细胞/毫升细胞培养的 2 x 6 毫升一夜之间生长)。预期的单元格总数是 ~ 1.0 x 109。 - 添加 P3 杆状的细胞在多种感染 (语言) 的5。要确定接种病毒的数量, 请使用以下公式:
- 摇晃的轨道平台上的细胞在 135 rpm 在一个湿润的37°c 孵化器与 8% CO2为 24 h。
- 在细胞培养中加入10毫米丁酸钠, 继续孵化48小时。
注: 对于某些蛋白质, 在丁酸钠添加后, 将细胞培养温度降低到30摄氏度可以改善表达和稳定性。 - 在具有10X 或20X 放大倍数的荧光显微镜下, 488 毫微米激发源和 510 nm 发射过滤器, 检查绿色细胞的百分比和亮度, 直接代表蛋白质 (bestrophin-GFP-10xHis) 产量 (图 1B)。
注: 绿色细胞的百分比计算为: 100 x (绿色细胞/总细胞)。显微镜下强绿色荧光表示良好的蛋白表达水平。 - 通过离心在 1000 x g 在4°c 收获细胞20分钟. 取出上清液, 再用磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 将细胞颗粒重新悬浮至80毫升的最终体积。分裂细胞悬浮成 2 x 50 毫升圆锥管和离心机在 1000 x g 在4°c 为20分钟. 将细胞小球储存在-80 摄氏度。
3. 蛋白质纯化
- 在室温搅拌水浴中, 将含有细胞小球的锥形管孵化10-15 分钟, 使其解冻。在 2x (w/v) 缓冲区容量中重新挂起单元格 (表 1) (例如, 20 毫升的缓冲器中的10克细胞颗粒) 补充了蛋白酶抑制剂 (抑肽酶、Leupeptin、Pepstatin A 和 phenylmethylsulfonyl 氟), 其 0.1-1.0 毫米。吸管广泛的向上和向下, 以获得一个均匀的细胞悬浮。
- 用高压均质机溶解细胞。通过 7-10 MPa 的均质机进行细胞悬浮, 共3-4 次, 达到完全均匀化。把细胞裂解液放在冰上2-3 分钟。
- 添加洗涤剂 [例如, 2% 瓦特/v 溶胶级的 n-月桂-Maltopyranoside ()) 的细胞裂解。在20摄氏度孵育1小时以提取膜蛋白。
注: 洗涤剂的类型需要为每个蛋白质目标18,24进行优化。 - 离心机在 15万 x g 在 ultracentrifuge 在4°c 为 1 h。
注意: 以下所有步骤都在4摄氏度执行。 - 收集清楚的细胞裂解液, 并通过一个5毫升他的陷阱镍2 +NTA 亲和柱预平衡与缓冲 a (表 1)。
注: 离心后, 透明细胞裂解液将夹在底部的颗粒和顶部的混浊层之间。使用10毫升转移吸管仔细收集清楚的裂解, 然后切换到1毫升吸管的最后几毫升裂解。避免颗粒, 可堵塞镍2 +柱;然而, 一小部分的顶层是罚款或可以过滤出与1.5 微米的过滤器。 - 用25毫升的缓冲器 B 和40毫升的缓冲 C (分别为表 2 和 3) 冲洗柱。
注意: 这是一个休息的好地方, 因为总纯化可能需要多达12小时, 蛋白质可以保持稳定, 而附加到专栏一夜之间。 - 将该柱连接到快速蛋白液相色谱 (FPLC) 系统, 并洗脱13毫升的缓冲 D (表 3) 与分馏的蛋白质。根据紫外吸光度读数, 收集富含蛋白质的分数。
注: FPLC 条件如下: 1.0 毫升分数大小, 前柱压力报警设置为0.3 兆帕, 流量0.5 毫升/分钟。 - 测定 microvolume 分光光度计中洗脱蛋白产品浓度。读280纳米的吸光度。
- 选要去除 GFP-10xHis 标签, 添加 TEV 蛋白酶在1:1 质量比和孵化在4°c 30 分钟。
注: 该标签可能会或不影响纯化通道的功能或结构。计算从 3.7-3.8 步骤中收集到的蛋白质的体积和浓度的 TEV 量。例如, 如果10毫升的洗脱产品是收集和测量0.1 毫克/毫升, 总蛋白质量是 10 x 0.1 = 1 毫克, 和1毫克的 TEV 将用于消化。 - 将蛋白质与15毫升离心 (50 或 100 kDa) 过滤单元, 通过旋转在 4000 x g 在4°c 到最后容量 400-500 ul (为2毫升样品装载循环在 FPLC)。
注意: 离心时间的变化取决于蛋白质的浓度和大小。为了避免过度集中, 这可能导致蛋白质沉淀, 首先旋转10分钟, 然后观察剩余的体积, 并估计随后的旋转 (如2-5 分钟) 的时间, 以获得最终的体积。吸管之间的旋转, 以分散的蛋白质, 这是拉到底部的过滤器。 - 将浓缩蛋白转移到新的1.5 毫升管中, 从浓缩产物中除去任何沉淀或气泡。旋转在 > 1.2万 x g 5-10 分钟在4°c 和收集上清在一个新的1.5 毫升管。
- 用1毫升注射器和一个圆尖针在 FPLC 系统上装载最终产品, 尺寸排除色谱与缓冲器 E (表 5) 预平衡。
注: FPLC 条件如下: 0.5 毫升分数大小, 前柱压力报警设置为2.50 兆帕, 流量设置为30毫升的缓冲 E (表 5), 流量设置为0.5 毫升/分钟。 - 注意, 表现良好的蛋白质作为一个单一的峰值运行 (图 2A), 并收集与该峰值对应的蛋白质分数 (图 2A)。
- 浓缩蛋白质与4毫升或0.5 毫升离心过滤单元 (与步骤3.10 相同的分子量切断) 和旋转在 4000 x g 在4°c 到最后浓度5-10 微克/ul。使用分光光度计检查最终产品浓度 (步骤 3.8)。
注: 离心时间不同, 因为最终的产品体积可以不同的纯化试验。通常, 离心需要10-20 分钟。建议吸管之间的旋转, 以分散的蛋白质, 这是拉到底部的过滤器。 - 将浓缩蛋白转移到新的1.5 毫升管中。用离心在 > 1.2万 x g 处去除任何沉淀, 5-10 分钟4摄氏度。将上清液转移到新的1.5 毫升管。使 10 ul 整除数存储在-80 摄氏度, 并保存一个 2-5 ul 小整除运行在4-15% 梯度 SDS 页凝胶在9伏/厘米 (图 2B)。
- 用质谱法确定纯化蛋白的鉴定8。
注: 对纯化蛋白的功能和结构进行体外分析可以通过平面脂质双层和 x-射线晶体学分别进行5、8。
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Representative Results
瞬态转染胶粘剂 HEK293 细胞的荧光强度 (图 1A) 是悬浮 HEK293-F 细胞中预测蛋白表达水平的良好指标 (图 1B)。如果靶蛋白在瞬态转染后在 HEK293 细胞中表达不良好或被错误地定位, 建议考虑修改表达结构 (例如, 改变 GFP 标记的位置或做出突变/截断目标蛋白)。小 HEK293-F 悬浮培养 (例如, 25 毫升培养) 用于优化蛋白质表达条件, 其中感染的语言和培养温度是最重要的在以往的经验。
一个成功的净化是由一个单一的主峰值, 在预期洗脱量的大小排除色谱 (图 2A) 和单一的优势带上变性 SDS 页凝胶 (图 2B)。如果在尺寸排除色谱中出现多个峰值, 则收集每个峰值并运行本机凝胶以确定哪个峰值包含功能通道 pentamers 是很重要的。应注意的是, 在两种蛋白质结构之间, 在收获时荧光强度表示的表达水平与最终产量不 nesessarily 相关, 因为每种蛋白质结构在纯化过程中都有不同的行为。对于表现良好的 bestrophin 蛋白, 最终纯化产物的200-500 µg 通常可以从 HEK293-F 悬浮细胞的1升中获得。
图 1: 哺乳动物 bestrophin 蛋白的表达.荧光蛋白标记哺乳动物 bestrophin 的显微图像, 通过质粒转染在 (a) 粘合剂 HEK293 细胞中表达, 并在 (B) 悬浮 HEK293F 细胞中通过杆状病毒感染。左 = 绿色荧光;右 = 明亮领域。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 哺乳动物 bestrophin 蛋白的纯化.(A) 亲和纯化的 GFP 标记蛋白在大小排除凝胶过滤柱上运行, 作为一个主要的峰值。收集虚线之间的分数。(B) 最终蛋白产品在 SDS 页凝胶上运行 (左栏)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 试剂 | M w | 每1升金额 | 最后 |
| HEPES | 238。3 | 11.9 克 | 50毫米 |
| Nacl | 58.44 | 17.529 克 | 300毫米 |
| 甘油 | 92.09 | 50毫升 | 5% (v/v) |
| 咪 | 68。1 | 1.3616 克 | 20毫米 |
| 氯化镁2 | 203 | 0.20331 克 | 1毫米 |
| 三 (2-羧乙基) 膦 | 287 | 2.5 毫升200毫米库存 | 0.5 毫米 |
表 1: 蛋白质纯化缓冲器 A (泥沙缓冲器)
| 试剂 | M w | 每1升金额 | 最后 |
| HEPES | 238。3 | 11.9 克 | 50毫米 |
| Nacl | 58.44 | 17.529 克 | 300毫米 |
| 甘油 | 92.09 | 50毫升 | 5% (v/v) |
| 咪 | 68。1 | 2.7232 克 | 40毫米 |
| 氯化镁2 | 203 | 1.01655 克 | 5毫米 |
| 三 (2-羧乙基) 膦 | 287 | 0.5 毫升200毫米库存 | 0.1 毫米 |
| (anagrade) | 510。6 | 0.5 克 | 0.05% (w/v) |
表 2: 蛋白质净化缓冲 B (第一洗涤缓冲器)
| 试剂 | M w | 每1升金额 | 最后 |
| HEPES | 238。3 | 5.95 克 | 25毫米 |
| Nacl | 58.44 | 29.2 克 | 500毫米 |
| 甘油 | 92.09 | 50毫升 | 5% (v/v) |
| 咪 | 68。1 | 5.1 克 | 75毫米 |
| 三 (2-羧乙基) 膦 | 287 | 0.5 毫升200毫米库存 | 0.1 毫米 |
| (anagrade) | 510。6 | 0.5 克 | 0.05% (w/v) |
表 3: 蛋白质纯化缓冲 C (第二洗涤缓冲器)
| 试剂 | M w | 每1升金额 | 最后 |
| HEPES | 238。3 | 7.74 克 | 32.5 毫米 |
| Nacl | 58.44 | 11.686 克 | 200毫米 |
| 甘油 | 92.09 | 25毫升 | 2.5% (v/v) |
| 咪 | 68。1 | 17.02 克 | 250毫米 |
| 三 (2-羧乙基) 膦 | 287 | 0.5 毫升200毫米库存 | 0.1 毫米 |
| (anagrade) | 510。6 | 0.5 克 | 0.05% (w/v) |
表 4: 蛋白质纯化缓冲 D (洗脱缓冲器)
| 试剂 | M w | 每1升金额 | 最后 |
| HEPES | 238。3 | 9.53 克 | 40毫米 |
| Nacl | 58.44 | 11.686 克 | 200毫米 |
| 三 (2-羧乙基) 膦 | 287 | 0.5 毫升200毫米库存 | 0.1 毫米 |
| (anagrade) | 510。6 | 0.5 克 | 0.05% (w/v) |
表 5: 蛋白质纯化缓冲 E (凝胶过滤缓冲器)
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Discussion
该协议描述了一种有用的管道, 用于表达和纯化哺乳动物 bestrophin 离子通道, 用于未来的体外分析。虽然 FPLC 设备是需要的大小排除色谱, 注射器泵是足够的所有步骤的亲和层析, 包括捆绑, 洗涤和洗脱。当使用注射器泵来推动溶液 (在注射器中) 通过一列, 这是必不可少的垫弹簧一侧, 以避免推动气泡进入柱。如果蛋白质的纯度在亲和层析后已经足够的后续实验, 大小排除色谱可以省略, 以便 FPLC 设备可能根本不需要。
由于需要大约2周的时间从 pBacMam 质粒, 以提高效率, 一个初步的屏幕上表现良好的蛋白质同系物可以通过收割瞬时转染 HEK293 细胞 (e., 从60毫米菜), 并测试如何表达的兴趣蛋白 (GFP 标记) 的行为在洗涤剂 (如,分解) 与荧光检测大小-排除色谱 (FSEC)18,24。最有效的重点是在 HEK293 细胞中显示强荧光的蛋白质结构, 以及 FSEC 良好的单分散性和稳定性。
对提高蛋白质纯化率有若干建议。首先, TEV 消化的条件可能需要对每种蛋白质进行优化。这可以通过测试一系列蛋白质到 TEV 质量比率 (例如, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 和 1:10) 和孵化时间 (例如, 0.5 h, 1 h, 2 h, 5 h, 和隔夜)。然后, 建议在 SDS 页凝胶中运行处理后的样品, 以检查裂解效率。此外, 重要的是不要让任何离心上清或淋洗泄漏的连接上的 FPLC 或注射器。同样, 在吹打浓缩蛋白时避免气泡是很重要的。
随后的各种体外分析程序, 利用该协议的蛋白质包括脂质双层, x 射线晶体学, 低温电子显微镜, 光谱学, 高通量筛选8,25,26。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由 NIH 赠款 EY025290、GM127652 和罗切斯特大学开办资金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
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