Summary
De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.
Abstract
Het menselijk genoom codeert vier bestrophin paralogs, namelijk BEST1, BEST2, BEST3 en BEST4. BEST1, gecodeerd door de BEST1 gen, is een Ca2 +-Cl- kanaal (CaCC), voornamelijk uitgedrukt in retinale pigment epitheel (RPE) geactiveerd. De fysiologische en pathologische betekenis van BEST1 wordt benadrukt door het feit dat meer dan 200 verschillende mutaties in het gen BEST1 genetisch zijn gekoppeld aan een spectrum van ten minste vijf retinale degeneratieve aandoeningen, zoals de beste vitelliform macula dystrofie (ziekte van de beste). Daarom heeft begrijpen de biofysica van bestrophin kanalen op het niveau van de single-molecuul enorme betekenis. Verkrijgen van gezuiverde zoogdieren ionenkanalen is echter vaak een uitdagende taak. Wij rapporteren hier, een protocol voor de expressie van zoogdieren afkomstig bestrophin eiwitten met het transfersysteem voor BacMam baculovirus gen en hun zuivering door affiniteit en grootte-uitsluiting-chromatografie. De gezuiverde eiwitten hebben het potentieel om te worden gebruikt in latere functionele en structurele analyses, zoals elektrofysiologische opname in lipide bilayers en kristallografie. Nog belangrijker is, kan deze pijpleiding worden aangepast aan het bestuderen van de functies en structuren van andere ionenkanalen.
Introduction
Bestrophins zijn een familie van ionenkanalen geconserveerd door middel van soorten, variërend van bacterie tot mens1. Bij de mens codeert het BEST1 gen gelegen op chromosoom 11q12.3, het membraan eiwit Bestrophin-1 (BEST1) die zich voornamelijk in het basolaterale membraan van retinale pigment epitheel (RPE) cellen van de ogen2,3 ,4. Bestaat uit 585 aminozuren, de eerste ~ 350 waarvan sterk tussen de soorten zijn geconserveerd en bevatten de transmembrane regio, fungeert BEST1 als een CaCC in mensen1,5,6. Bovendien, de BEST1 homologen in kippen en Klebsiella pneumoniae beide fungeren als homopentamers7,8, hetgeen wijst op een hoog niveau van bescherming in de gehele evolutie.
Bij de mens, zijn meer dan 200 mutaties in het gen BEST1 klinisch gekoppeld aan een groep van ziekten van de retina degeneratie genoemd bestrophinopathies1,9. Vijf specifieke bestrophinopathies zijn gemeld, met inbegrip van beste ziekte, volwassen-onset vitelliform dystrofie, autosomaal dominante vitreoretinochoroidopathy, autosomaal recessieve bestrophinopathy en retinitis pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Deze ziekten, die tot verminderde gezichtsvermogen en zelfs blindheid leiden, zijn momenteel onbehandelbaar. Oog op de ontwikkeling van therapeutische behandelingen en potentieel gepersonaliseerde geneeskunde, is het essentieel om te begrijpen hoe deze BEST1 ziekte-veroorzakende mutaties invloed op de functie en structuur van de BEST1 kanaal15. Voor deze doeleinden moeten onderzoekers voeren in vitro analyses5,8te verkrijgen van gezuiverde bestrophin (wild type en/of mutant) kanalen.
De eerste belangrijke stap is de uitdrukking van bestrophin kanalen van hogere diersoorten in zoogdiercellen. Zoals baculovirus signaaltransductie van cellen van de HEK293-F (het BacMam-systeem) een krachtige methode is om geïnfecteerd express membraan eiwitten16,17, dit protocol maakt gebruik van een geoptimaliseerde BacMam vector (pEG BacMam) voor robuuste uitdrukking van de doel eiwit18, dat in dit geval een homolog van de zoogdieren bestrophin. Deze vector is gebruikt voor de uitdrukking van verschillende membraaneiwitten, met inbegrip van de G-proteïne-gekoppelde receptoren, nucleaire receptoren en andere ion kanalen18. Er is ook bewijs dat de geproduceerde eiwitten geschikt voor kristallografie18 zijn. Met hoge niveaus van meningsuiting in HEK293-F cellen, kunnen de eiwitten dan worden gezuiverd met behulp van chromatografie; in het bijzonder in het geval van bestrophins, zowel affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie kunnen worden gebruikt.
Zodra dit protocol afgestemd voor een bestrophin-kanaal is, kan de gezuiverde proteïne vervolgens worden geanalyseerd voor de functie en structuur door middel van vlakke lipide dubbelgelaagde en röntgendiffractie, respectievelijk5,8. Over het geheel genomen is deze technieken bieden een krachtige pijpleiding voor functionele en structurele onderzoek van bestrophins en andere ionenkanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de productie van BacMam expressie Baculoviruses
- De codering opeenvolging van een gewenste zoogdieren bestrophin eiwit invoegen de pEG BacMam vector18 met een tabak Etch Virus (TEV) protease erkenning opeenvolging, gevolgd door een GFP-10 x zijn-tag in het C-terminus van het eiwit.
- Transient transfect de expressie plasmide in lijm HEK293 cellen19,20,21,22,23. Controleer de expressie van het GFP-fusieproteïne onder een fluorescente microscoop met 10 X of 20 X vergroting, een 488 nm excitatie bron en een 510 nm emissie filter (figuur 1A).
Opmerking: Polymeer gebaseerde transfectie is routinematig uitgevoerd met 1 μg plasmide DNA voor een 35 mm-gerecht van HEK293 cellen. - De baculoviruses in Sf9 insect cellen produceren als eerder beschreven16,17.
Opmerking: De passage 3 (P3) virus, dat zal worden gebruikt voor het infecteren van de cellen van de HEK293-F voor eiwitproductie, kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende 1 maand. - Bepaal de titer (besmettelijke eenheden) van de P3-virus door de plaque vorming assay16,17.
Opmerking: Als de proteïne van belang is gelabeld met GFP, is een snellere methode voor de controle van besmettelijke eenheden te infecteren Sf9 cellen met seriële verdunningen van het virus en het aantal fluorescerende cellen na 48u.
2. de eiwituitdrukking
- De cellen van de HEK293-F in een schorsing cultuur met de HEK293-F expressie medium in een bevochtigde incubator van 37 ° C met 8% CO2handhaven. Gebruik wegwerp cultuur kolven die 2 - 2,5 keer groter zijn dan het volume van de cultuur en de cultuur op een orbitaal platform bij 135 t/min draaien.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om de cellen te infecteren wanneer ze tussen 5 en 30 passages worden en deze acties onder de motorkap van een cel cultuur uit te voeren. - 24 h vóór de virale infectie, 15 μL van Trypan blauwe toevoegen aan een hoeveelheid van 15 μL van celkweek, en controleer de celdichtheid en levensvatbaarheid met behulp van een hemocytometer onder een microscoop. Verdun de cellen 0,6 x 106 cellen/mL in 2 x 2 L kolven elk, met 500 mL medium opgewarmd vooraf bij 37 ° C.
Opmerking: Dode cellen zijn gekleurd blauw door Trypan blauwe. De levensvatbaarheid van de gewenste cellen is > 95%. - Op de dag van de infectie, Controleer de celdichtheid en levensvatbaarheid (stap 2.2).
Opmerking: De levensvatbaarheid van een hoge cellen van > 95% is van essentieel belang voor efficiënte infectie en eiwit expressie. De verwachte celdichtheid is ~1.0 x 106 cellen/mL (volwassen overnachting van 2 x 500 mL van de 0,6 x 106 cellen/mL celcultuur). Het verwachte totale aantal cellen is ~1.0 x 109. - De P3 baculoviruses toevoegen aan de cellen op een veelheid van infectie (MOI) van 5. Om te bepalen van de hoeveelheid virus om te enten, gebruikt u de volgende vergelijking:
- Schud de cellen op de orbitaal platform bij 135 t/min in een bevochtigde 37 ° C incubator met 8% CO2 gedurende 24 uur.
- Voeg 10 mM van natrium butyraat aan de celcultuur en blijven broeden gedurende 48 uur.
Opmerking: Voor sommige eiwitten, het verminderen van de cel cultuur temperatuur tot 30 ° C na toevoeging van natrium butyraat expressie en stabiliteit kan verbeteren. - Kijk onder een fluorescentie Microscoop met 10 X en 20 X vergroting, een 488 nm excitatie bron en een 510 nm emissie filter, of het percentage en de helderheid van de groene cellen, die rechtstreeks de opbrengst van de proteïne (bestrophin-GFP-10xHis) (figuur 1B vertegenwoordigen).
Opmerking: Het percentage groene cellen wordt berekend door: 100 x (groene cellen/totaal cellen). Goede eiwit expressie niveau wordt aangegeven door sterke groene fluorescentie onder de Microscoop. - Oogst van de cellen door centrifugatie bij 1.000 x g in 4 ° C gedurende 20 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellets met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindvolume van ~ 80 mL. Split de celsuspensie in 2 x 50 mL conische buizen en centrifugeer bij 1.000 x g in 4 ° C gedurende 20 min. slaan de cel pellets bij-80 ° C.
3. de eiwitreiniging
- Incubeer de conische buisjes met de cel pellets in een opzwepende waterbad bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten zodat ze ontdooien. Resuspendeer de cellen in 2 x (w/v) omvang van de buffer een (tabel 1) (bijvoorbeeld 10 g cel pellets 20 ml buffer) aangevuld met proteïnase remmers (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A en phenylmethylsulfonyl-fluoride) op 0,1-1.0 mM. Pipetteer omhoog en omlaag uitgebreid voor het verkrijgen van een homogene celsuspensie.
- Lyse de cellen met behulp van een hogedruk homogenizer. De celsuspensie doorlopen in de homogenizer op 7-10 MPa voor een totaal van 3 - 4 keer tot volledige homogenisering. Houd de cel lysate op ijs voor 2-3 minuten tussen de rondes.
- Wasmiddel [bijvoorbeeld 2% w/v sol-rang n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] aan de cel lysate toevoegen. Incubeer met agitatie gedurende 1 uur bij 20 ° C tot het halen van de membraaneiwitten.
Opmerking: Het soort wasmiddel moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit doel18,24. - Centrifugeer bij 150.000 x g in een ultracentrifuge bij 4 ° C gedurende 1 uur.
Opmerking: Alle van de volgende stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C. - Verzamel de cel wissen lysate en stroom door middel van een 5 mL zijn Trap Ni2 +- NTA affiniteit kolom vooraf geëquilibreerd met buffer een (tabel 1).
Opmerking: Na het centrifugeren, de cel wissen lysate zal worden ingeklemd tussen een pellet onderaan en een bewolkte laag bovenop. Gebruik een pipet 10 mL overdracht zorgvuldig verzamelen de duidelijke lysate en vervolgens overschakelen naar een 1 mL pipet voor de laatste paar milliliter van lysate. Voorkomen van de pellet, die de Ni2 + kolom verstoppen kan; echter, een kleine hoeveelheid van de bovenste laag is prima of kan worden gefilterd met een 1.5 μm-filter. - Was de kolom met 25 mL buffer B en vervolgens 40 mL buffer C (tabellen 2 en 3, respectievelijk).
Opmerking: Dit is een goede plek een pauze te nemen, zoals totale zuivering tot 12 h duren kan en het eiwit stabiel blijven kan terwijl aangesloten op de kolom 's nachts. - De kolom toevoegen aan een systeem van snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) en elueer de proteïne van de kolom met 13 mL buffer D (tabel 3) met fractionering. Het verzamelen van de breuken van eiwit-verrijkte volgens de UV-absorptie-uitlezing.
Opmerking: The FPLC voorwaarden zijn als volgt: een 1,0 mL breuk grootte, een pre kolom druk alarm ingesteld op 0,3 MPa en een debiet van 0,5 mL/min. - De product geëlueerd eiwitconcentratie op een microvolume spectrofotometer meten. Lees de absorptie bij 280 nm.
- (Optioneel) Als u wilt verwijderen de GFP-10xHis-tag, voeg de TEV protease op een massaverhouding van 1:1 en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
Opmerking: De tag kan of kan niet van invloed op de functie of de structuur van het gezuiverde kanaal. De TEV berekenen van het volume en de concentratie van het verzamelde eiwit uit stappen 3.7-3.8. Bijvoorbeeld, als 10 mL elutie product wordt verzameld en op 0,1 mg/mL, de totale proteïne gemeten massa is 10 x 0,1 = 1 mg en 1 mg TEV zal worden gebruikt voor de spijsvertering. - Concentreren op het eiwit met centrifugaal 15 mL (50 of 100 kDa) filter eenheid door spinnen bij 4000 x g in 4 ° C tot een eindvolume van 400-500 μL (voor een 2 mL monster-laden lus op FPLC).
Opmerking: De centrifuging tijd voor concentratie varieert afhankelijk van de concentratie en de grootte van de proteïne. Om te voorkomen dat overdreven te concentreren, die kan leiden tot eiwit neerslag, spin voor 10 min op het eerste, dan observeren het resterende volume en schatting van de tijd voor een latere spin (bijvoorbeeld 2-5 min), enzovoort, tot het eindvolume te verkrijgen. Pipetteer tussen de draaiingen te verspreiden van de proteïne, die wordt getrokken naar de onderkant van het filter. - Overdracht van de geconcentreerde eiwit om een nieuwe 1,5 mL tube en een eventueel neerslag of bubbels uit het geconcentreerde product verwijderen. Draaien op > 12.000 x g voor 5-10 min bij 4 ° C en verzamelen de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis.
- Laad het uiteindelijke product met een spuit van 1 mL en een ronde-tip naald op een FPLC-systeem voor grootte-uitsluiting chromatografie met een grootte-uitsluiting kolom vooraf zijn geëquilibreerd met buffer E (tabel 5).
Opmerking: The FPLC voorwaarden zijn als volgt: een grootte van de breuk 0,5 mL, een pre kolom druk alarm ingesteld op 2,50 MPa, een flow-volume ingesteld op 30 mL buffer E (tabel 5), en een debiet ingesteld op 0,5 mL/min. - Merk op dat goed opgevoede eiwitten als een enkele piek (figuur 2A uitvoeren) en verzamelen van het eiwit fraction(s) overeenkomt met die piek (figuur 2A).
- Het eiwit met een 4 mL of 0,5 mL centrifugaal filter eenheid (van de dezelfde molecuulgewicht licht-donkerscheiding als in stap 3.10) en draai bij 4000 x g bij 4 ° C tot een uiteindelijke concentratie van 5-10 μg/μL concentreren. De spectrofotometer gebruiken om te controleren van de concentratie van het eindproduct (stap 3.8).
Opmerking: Centrifugeertijd varieert, zoals het volume van het eindproduct van zuivering proeven verschillen kan. Centrifugeren duurt meestal 10-20 min. Het is aanbevolen om de pipet tussen de draaiingen te verspreiden van de proteïne, die wordt getrokken naar de onderkant van het filter. - De geconcentreerde eiwit overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buis. Verwijderen van een eventueel neerslag door centrifugeren op > 12.000 x g voor 5-10 min bij 4 ° C. Het supernatant overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buis. Breng 10 μL aliquots voor opslag bij-80 ° C en sla van één 2-5 μl kleine hoeveelheid uit te voeren op een 4-15% helling-SDS-pagina gel bij 9 V/cm (figuur 2B).
- De identiteit bevestigen van het gezuiverde eiwit door massaspectrometrie8.
Opmerking: In vitro analyse van de functie en structuur van het gezuiverde eiwit kunnen worden uitgevoerd door middel van vlakke lipide dubbelgelaagde en röntgendiffractie, respectievelijk5,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De intensiteit van de fluorescentie in Transient-transfected zelfklevende HEK293 cellen (figuur 1A) is een goede indicator voor de geprojecteerde eiwit expressie niveau in schorsing HEK293-F cellen (figuur 1B). Als het doel-eiwit niet goed uitgedrukt of is verkeerd vertaald in de HEK293 cellen na voorbijgaande transfectie, is het raadzaam om te overwegen de expressie construct wijzigen (bijv., veranderen van de positie van het GFP-tag of het maken van mutaties/opschoningen op de doel-eiwit). Kleine HEK293-F schorsing culturen (bijvoorbeeld 25 mL culturen) worden gebruikt voor het optimaliseren van de voorwaarden voor eiwit expressie, waaronder de infectie MOI en kweken van temperatuur de belangrijkste in eerdere ervaringen zijn.
Een succesvolle zuivering wordt aangegeven door een enkele belangrijkste piek bij de verwachte elutievolume in grootte-uitsluiting chromatografie (figuur 2A) en een enkele dominante band op een gedenatureerde SDS-pagina gel (figuur 2B). Als meerdere pieken in grootte-uitsluiting chromatografie wordt weergegeven, is het belangrijk te verzamelen van elke piek en uitvoeren van een inheemse gel om te bepalen welke piek bevat de functionele kanaal pentamers. Opgemerkt moet worden dat tussen twee eiwitten constructies, de expressie niveau, aangegeven door de intensiteit van de fluorescentie op het moment van oogst, doet niet nesessarily correleren met het uiteindelijke rendement, zoals elk eiwit construct zich anders gedraagt tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. Voor een goed opgevoede bestrophin eiwit, kan 200-500 µg van het gezuiverde eindproduct meestal worden verkregen uit 1 L HEK293-F schorsing cellen.
Figuur 1: expressie van een eiwit zoogdieren bestrophin. Microscopische beelden van een GFP-gelabeld zoogdieren bestrophin uitgedrukt in (A) lijm HEK293 cellen door plasmide transfectie, en (B) schorsing van de HEK293F cellen door baculovirus infectie. Links = groene fluorescentie; rechts = helder-veld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: zuivering van een eiwit zoogdieren bestrophin. (A) affiniteit-gezuiverd GFP-gelabelde proteïnen liep op een grootte uitsluiting gel-filtratie kolom als één van de belangrijkste piek. Breuken tussen onderbroken lijnen werden verzameld. B uiterste eiwit product liep op een SDS-pagina gel met ladders (linker kolom). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | MW | Bedrag per 1 L | Laatste |
| HEPES | 238.3 | 11.9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | 17.529 g | 300 mM |
| Glycerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazool | 68,1 | 1.3616 g | 20 mM |
| MgCl2 | 203 | 0.20331 g | 1 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) Fosfine | 287 | 2,5 mL 200 mM voorraad | 0.5 mM |
Tabel 1: Eiwitreiniging Buffer (resuspensie Buffer)
| Reagens | MW | Bedrag per 1 L | Laatste |
| HEPES | 238.3 | 11.9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | 17.529 g | 300 mM |
| Glycerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazool | 68,1 | 2.7232 g | 40 mM |
| MgCl2 | 203 | 1.01655 g | 5 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) Fosfine | 287 | 0,5 mL 200 mM voorraad | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0,05% (m/v) |
Tabel 2: Eiwit zuivering Buffer B (eerst wassen Buffer)
| Reagens | MW | Bedrag per 1 L | Laatste |
| HEPES | 238.3 | 5.95 g | 25 mM |
| NaCl | 58.44 | 29.2 g | 500 mM |
| Glycerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazool | 68,1 | 5.1 g | 75 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) Fosfine | 287 | 0,5 mL 200 mM voorraad | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0,05% (m/v) |
Tabel 3: Eiwit zuivering Buffer C (tweede wassen Buffer)
| Reagens | MW | Bedrag per 1 L | Laatste |
| HEPES | 238.3 | 7.74 g | 32.5 mM |
| NaCl | 58.44 | 11.686 g | 200 mM |
| Glycerol | 92.09 | 25 mL | 2,5% (v/v) |
| Imidazool | 68,1 | 17.02 g | 250 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) Fosfine | 287 | 0,5 mL 200 mM voorraad | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0,05% (m/v) |
Tabel 4: Eiwit zuivering Buffer D (elutie Buffer)
| Reagens | MW | Bedrag per 1 L | Laatste |
| HEPES | 238.3 | 9.53 g | 40 mM |
| NaCl | 58.44 | 11.686 g | 200 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) Fosfine | 287 | 0,5 mL 200 mM voorraad | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0,05% (m/v) |
Tabel 5: Eiwit zuivering Buffer E (Gel filtratie Buffer)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een handig pijpleiding voor expressie en zuivering van zoogdieren bestrophin ionenkanalen om te worden gebruikt voor toekomstige in vitro analyses. Terwijl het FPLC apparaat vereist voor de chromatografie van de grootte-uitsluiting is, is een spuitpomp voldoende voor alle stappen van de chromatografie van de affiniteit met inbegrip van bindende, wassen en eluerende. Wanneer u een spuitpomp naar oplossingen van de Duw (op een spuit) door een kolom, is het essentieel voor de onderlaag van de kant van de lente Voorkom duwen luchtbellen in de kolom. Als de zuiverheid van het eiwit na de chromatografie van de affiniteit al voldoende voor de latere experimenten is, kan grootte-uitsluiting chromatografie zodat een FPLC apparaat niet verplicht helemaal worden kan worden weggelaten.
Als het duurt ongeveer 2 weken om de baculoviruses van pBacMam plasmiden, te verhogen van efficiëntie, een eerste scherm voor goedgedragende eiwit homologen kan worden uitgevoerd door het oogsten van de Transient transfected cellen van de HEK293 (bv., van een schotel van 60 mm) en testen hoe de proteïne van belang uitgedrukt in detergentia (bijvoorbeeld DDM) met fluorescentie-detectie grootte-uitsluiting chromatografie (FSEC)18,24(GFP-gelabeld) gedraagt. Het is meest productieve te richten op eiwit constructies waarin sterke fluorescentie transfected cellen van de HEK293 en goede monodispersity en stabiliteit in FSEC worden weergegeven.
Er zijn verschillende aanbevelingen voor het verhogen van het rendement van eiwitreiniging. De voorwaarden voor een TEV spijsvertering kunnen eerst worden geoptimaliseerd voor elke proteïne. Dit kan worden gedaan door het testen van een aantal eiwitten-naar-TEV massa ratio's (bijvoorbeeld 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 en 1:10) en tijden (bijvoorbeeld 0,5 uur, 1 uur, 2 h, 5 h en overnachting) aan het broeden. Vervolgens wordt voorgesteld om de behandelde monsters in een SDS-pagina gel om te controleren de splitsingsproducten-efficiëntie worden uitgevoerd. Daarnaast is het belangrijk niet te laten elke centrifugale supernatant of eluens lek uit de verbindingen in het FPLC of spuiten. Ook is het belangrijk te voorkomen dat bellen wanneer het geconcentreerde eiwit pipetteren.
Diverse latere in vitro analyse procedures die gebruik maken van de eiwitten uit dit protocol omvatten lipide dubbelgelaagde röntgendiffractie, cryo-elektronenmicroscopie, spectroscopie en hoge throughput screening van8,25 , 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de NIH grants EY025290, GM127652 en Universiteit van Rochester start-up financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
