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Biochemistry

स्तनधारी Bestrophin आयन चैनलों की अभिव्यक्ति और शुद्धि

doi: 10.3791/57832 Published: August 2, 2018

Summary

आयन चैनलों की शुद्धि अक्सर चुनौतीपूर्ण है, लेकिन एक बार हासिल की, यह संभावित इन विट्रो कार्यों और चैनलों की संरचनाओं की जांच में अनुमति दे सकते हैं । यहाँ, हम स्तनधारी bestrophin प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए stepwise प्रक्रियाओं का वर्णन, एक परिवार के Ca2 +-सक्रिय सीएल चैनल.

Abstract

मानव जीनोम encodes चार bestrophin paralogs, अर्थात् BEST1, BEST2, BEST3, और BEST4 । BEST1, BEST1 जीन द्वारा इनकोडिंग, एक Ca है2 +-सक्रिय सीएल चैनल (CaCC) मुख्य रूप से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में व्यक्त. BEST1 के शारीरिक और रोग महत्व तथ्य यह है कि BEST1 जीन में २०० से अधिक विशिष्ट उत्परिवर्तनों आनुवंशिक रूप से इस तरह के रूप में सबसे अच्छा vitelliform के रूप में पांच रेटिना अपक्षयी विकारों, की एक स्पेक्ट्रम से जुड़ा हुआ है द्वारा डाला गया है धब्बेदार dystrophy (सर्वोत्तम रोग). इसलिए, एकल-अणु स्तर पर bestrophin चैनलों की भौतिकी को समझना जबर्दस्त महत्व रखता है. हालांकि, प्राप्त शुद्ध स्तनधारी आयन चैनल अक्सर एक चुनौतीपूर्ण काम है । यहां, हम BacMam baculovirus जीन अंतरण प्रणाली और अपनत्व और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा उनकी शुद्धि के साथ स्तनधारी bestrophin प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । शुद्ध प्रोटीन के बाद कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण में उपयोग किया जा करने की क्षमता है, ऐसे लिपिड bilayers और क्रि में electrophysiological रिकॉर्डिंग के रूप में । महत्वपूर्ण बात, इस पाइपलाइन के कार्यों और अंय आयन चैनलों की संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

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Bestrophins1मनुष्यों के लिए बैक्टीरिया से अलग प्रजातियों के माध्यम से संरक्षित आयन चैनलों के एक परिवार के हैं । मनुष्यों में, BEST1 जीन, 12.3 11q गुणसूत्र पर स्थित है, झिल्ली प्रोटीन Bestrophin-1 (BEST1) है कि मुख्य रूप से रेटिना वर्णक उपकला की basolateral झिल्ली में व्यक्त किया है encodes (RPE) आंखों की कोशिकाओं2,3 ,4. ५८५ अमीनो एसिड, पहले ~ ३५० जिनमें से अत्यधिक प्रजातियों के बीच संरक्षित और अपने transmembrane क्षेत्र शामिल हैं, के शामिल BEST11,5,6मनुष्यों में एक CaCC के रूप में कार्य करता है । इसके अलावा, मुर्गियों और Klebsiella निमोनिया में BEST1 homologs7,8homopentamers के रूप में दोनों कार्य, विकास के दौरान संरक्षण के एक उच्च स्तर का सुझाव ।

मनुष्यों में, BEST1 जीन में २०० से अधिक उत्परिवर्तनों चिकित्सकीय1,9bestrophinopathies बुलाया रेटिना अध कि रोगों के एक समूह से जुड़ा हुआ है । उत्तम रोग, वयस्क-शुरुआत vitelliform dystrophy, autosomal प्रमुख vitreoretinochoroidopathy, autosomal अवकाश bestrophinopathy, और रेटनाइटिस pigmentosa3,4 सहित पांच विशिष्ट bestrophinopathies की सूचना दी गई है । ,10,11,12,13,14. इन रोगों, जो दृष्टि कम और भी अंधापन का नेतृत्व, वर्तमान में अनुपचारित हैं । आदेश में चिकित्सकीय उपचार और संभावित व्यक्तिगत दवा विकसित करने के लिए, यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि कैसे इन BEST1 रोग-उत्परिवर्तनों के कारण समारोह और BEST115चैनल की संरचना को प्रभावित करते हैं । इन प्रयोजनों के लिए, शोधकर्ताओं ने शुद्ध bestrophin प्राप्त करने की आवश्यकता (जंगली प्रकार और/या उत्परिवर्ती) चैनल और आचरण इन विट्रो में 5,8विश्लेषण ।

पहला महत्वपूर्ण कदम स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च प्रजातियों से bestrophin चैनलों की अभिव्यक्ति है । HEK293-F कोशिकाओं (BacMam प्रणाली) के baculovirus transduction के रूप में heterologously एक्सप्रेस झिल्ली प्रोटीन16,17के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, इस प्रोटोकॉल की मजबूत अभिव्यक्ति के लिए एक अनुकूलित BacMam वेक्टर (खूंटी BacMam) का इस्तेमाल लक्ष्य प्रोटीन18, जो इस मामले में एक स्तनधारी bestrophin homolog है । इस सदिश की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया है विभिंन झिल्ली प्रोटीन, जी सहित-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स, परमाणु रिसेप्टर्स, और अंय आयन चैनल18। इस बात का भी प्रमाण है कि उत्पादित प्रोटीन18क्रि के लिए उपयुक्त हैं । HEK293-F कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के साथ, प्रोटीन तो क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है; विशेष रूप से, bestrophins के मामले में, दोनों संबध और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी उपयोग किया जा सकता है ।

एक बार इस प्रोटोकॉल ठीक है एक bestrophin चैनल के लिए देखते, शुद्ध प्रोटीन तो planar लिपिड bilayer और एक्स-रे क्रि, क्रमशः5,8के माध्यम से अपने कार्य और संरचना के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । कुल मिलाकर, इन तकनीकों bestrophins और अंय आयन चैनलों के कार्यात्मक और संरचनात्मक जांच के लिए एक शक्तिशाली पाइपलाइन प्रदान करते हैं ।

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Protocol

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१. उत्पादक BacMam अभिव्यक्ति Baculoviruses

  1. एक वांछित स्तनधारी bestrophin प्रोटीन की कोडिंग अनुक्रम एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) के साथ खूंटी BacMam वेक्टर18 में डालें मांयता अनुक्रम, एक GFP द्वारा पीछा-10x-सी पर अपने टैग-प्रोटीन की-टर्मिनस ।
  2. क्षणिक transfect चिपकने HEK293 कोशिकाओं में प्लाज्मिड अभिव्यक्ति19,20,21,22,23. 10x या 20X इज़ाफ़ा, एक ४८८ एनएम उत्तेजना स्रोत के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत GFP-फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करें, और एक ५१० एनएम उत्सर्जन फ़िल्टर (1a आंकड़ा) ।
    नोट: बहुलक-आधारित अभिकर्मक नियमित रूप से 1 μg प्लाज्मिड डीएनए के HEK293 कोशिकाओं के ३५ mm डिश के लिए के साथ प्रदर्शन किया है ।
  3. पहले16,17वर्णित के रूप में Sf9 कीट कोशिकाओं में baculoviruses का उत्पादन ।
    नोट: 3 गद्यांश (पी. पी.) वायरस, जो प्रोटीन उत्पादन के लिए HEK293-एफ कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. पट्टिका गठन परख16,17द्वारा पी 3 वायरस के titer (संक्रामक इकाइयों) का निर्धारण ।
    नोट: के रूप में ब्याज की प्रोटीन GFP के साथ टैग, संक्रामक इकाइयों की जांच के लिए एक तेजी से विधि है वायरस के धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या ४८ के बाद गिनती ।

2. प्रोटीन एक्सप्रेशन

  1. 8% CO2के साथ ३७ ° c humidified मशीन में HEK293-f व्यंजक माध्यम के साथ एक निलंबन संस्कृति में HEK293-f कक्षों को बनाए रखें । उपयोग डिस्पोजेबल संस्कृति कुप्पी कि 2-2.5 बार संस्कृति की मात्रा से बड़ा है और १३५ rpm पर एक कक्षीय मंच पर संस्कृति को घुमाएगी ।
    नोट: यह कोशिकाओं को संक्रमित जब वे 5 और 30 मार्ग के बीच है और एक सेल संस्कृति हूड के तहत इन कार्यों को करने के लिए सिफारिश की है ।
  2. 24 एच वायरल संक्रमण से पहले, सेल संस्कृति के 15 μL aliquot के लिए Trypan नीले रंग के 15 μL जोड़ें, और सेल घनत्व और व्यवहार्यता एक खुर्दबीन के नीचे एक hemocytometer का उपयोग की जांच करें । कोशिकाओं को पतला करने के लिए ०.६ x 106 कोशिकाओं/एमएल में 2 एक्स 2 एल कुप्पी प्रत्येक, के साथ ५०० एमएल मध्यम पूर्व के ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म ।
    नोट: मृत कोशिकाओं नीले Trypan नीले दाग रहे हैं । वांछित सेल व्यवहार्यता > 95% है ।
  3. संक्रमण के दिन, सेल घनत्व और व्यवहार्यता की जांच करें (२.२ कदम) ।
    नोट: एक उच्च कोशिका व्यवहार्यता > 95% कुशल संक्रमण और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है । अपेक्षित सेल घनत्व है ~ १.० x 106 कोशिकाओं/एमएल (2 एक्स ५०० एमएल से रातोंरात उगाया ०.६ x 106 कोशिकाओं/एमएल सेल संस्कृति) । कक्षों की अपेक्षित कुल संख्या ~ १.० x 109है ।
  4. 5 के संक्रमण (MOI) की बहुलता पर कोशिकाओं को पी 3 पी baculoviruses जोड़ें । inoculate करने के लिए वायरस की मात्रा निर्धारित करने के लिए, निम्न समीकरण का उपयोग करें:
    Equation
  5. एक humidified ३७ डिग्री सेल्सियस में 8% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए १३५ rpm पर कक्षीय मंच पर कोशिकाओं शेक
  6. 10 मिमी सोडियम butyrate के सेल संस्कृति के लिए जोड़ें और ४८ ज के लिए मशीन जारी है ।
    नोट: कुछ प्रोटीन के लिए, सोडियम butyrate अलावा अभिव्यक्ति और स्थिरता में सुधार हो सकता है के बाद सेल संस्कृति तापमान 30 डिग्री सेल्सियस को कम करने ।
  7. 10x या 20X इज़ाफ़ा, एक ४८८ एनएम उत्तेजना स्रोत, और एक ५१० एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत, हरी कोशिकाओं के प्रतिशत और चमक की जांच, जो सीधे प्रोटीन (bestrophin-GFP-10xHis) उपज (आंकड़ा 1b) का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
    ध्यान दें: हरी कोशिकाओं का प्रतिशत द्वारा गणना की है: १०० x (हरी कोशिकाओं/ अच्छा प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर माइक्रोस्कोप के तहत मजबूत हरे प्रतिदीप्ति द्वारा संकेत दिया है ।
  8. फसल के लिए 4 ° c में १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं 20 मिनट के लिए supernatant निकालें और फिर से निलंबित सेल छर्रों के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के लिए एक अंतिम मात्रा ~ ८० मिलीलीटर. सेल सस्पेंशन को 2 x ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में विभाजित करें और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में १,००० x g पर रखें ।-८० डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों स्टोर ।

3. प्रोटीन शुद्धि

  1. वे गल तो 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक क्रियाशीलता पानी स्नान में कोशिका छर्रों युक्त शंकु ट्यूब की मशीन । पुन: निलंबित कोशिकाओं में 2x (डब्ल्यू/वी) बफर की मात्रा A (तालिका 1) (उदा., बफर के 20 मिलीलीटर में सेल छर्रों के 10 ग्राम) proteinase अवरोधकों के साथ पूरक (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin एक और phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड) 0.1-1.0 मिमी. प्लास्टिक ऊपर और नीचे बड़े पैमाने पर एक समरूप सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
  2. उच् च दाब homogenizer का प्रयोग कर कोशिकाओं को लाइसे । 7-10 MPa पर homogenizer के माध्यम से सेल सस्पेंशन कुल 3-4 बार के लिए पूर्ण homogenization प्राप्त करने के लिए चलाते हैं । राउंड के बीच 2-3 मिनट के लिए बर्फ पर सेल lysate रखें ।
  3. डिटर्जेंट जोड़ें [जैसे, 2% डब्ल्यू/वी सोल-ग्रेड n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (डीडीएम)] सेल lysate के लिए । झिल्ली प्रोटीन निकालने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए आंदोलन के साथ मशीन ।
    नोट: डिटर्जेंट के प्रकार के लिए प्रत्येक प्रोटीन लक्ष्य18,24के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  4. 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ultracentrifuge में १५०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: निम्न चरणों के सभी 4 ° c पर किया जाता है ।
  5. स्पष्ट सेल lysate लीजिए और यह एक 5 मिलीलीटर के माध्यम से प्रवाह अपने जाल नी2 +-ंत् संबध कॉलम पूर्व बफर a (तालिका 1) के साथ equilibrated ।
    नोट: केंद्रापसारक के बाद, स्पष्ट सेल lysate नीचे और शीर्ष पर एक बादल परत पर एक गोली के बीच सैंडविच हो जाएगा । का प्रयोग करें एक 10 मिलीलीटर हस्तांतरण प्लास्टिक ध्यान से साफ lysate इकट्ठा करने के लिए और फिर lysate के पिछले कुछ मिलीलीटर के लिए एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक के लिए स्विच । गोली, जो नी2 + कॉलम रोकना कर सकते है से बचें; हालांकि, शीर्ष परत की एक छोटी राशि ठीक है या एक १.५ माइक्रोन फिल्टर के साथ बाहर फ़िल्टर किया जा सकता है ।
  6. स्तंभ की 25 मिलीलीटर बफ़र B के साथ और फिर बफ़र C (2 तालिकाओं और 3, क्रमशः) के ४० मिलीलीटर धो लें ।
    नोट: यह एक अच्छी जगह के लिए एक ब्रेक ले रहा है, के रूप में कुल शुद्धि 12 घंटे तक लग सकता है और प्रोटीन स्थिर रह सकते हैं, जबकि कॉलम रात भर से जुड़ी ।
  7. स्तंभ को एक फ़ास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (FPLC) सिस्टम से अनुलग्न करें और प्रोटीन को स्तंभ से 13 मिलीलीटर की बफ़र D (तालिका 3) के साथ भिंन से elute । यूवी अवशोषक readout के अनुसार प्रोटीन-समृद्ध अंशों को एकत्र करें ।
    नोट: FPLC स्थितियों निंनानुसार हैं: एक १.० मिलीलीटर अंश आकार, एक पूर्व स्तंभ दबाव अलार्म ०.३ MPa के लिए सेट, और ०.५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर/
  8. एक microvolume spectrophotometer पर eluted प्रोटीन उत्पाद एकाग्रता उपाय । २८० एनएम में अवशोषक पढ़ें ।
  9. वैकल्पिक GFP-10xHis टैग को हटाने के लिए, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 1:1 जन अनुपात और गर्मी में टेव को चिढ़ाने जोड़ें ।
    नोट: टैग कर सकते है या समारोह या शुद्ध चैनल की संरचना को प्रभावित नहीं कर सकते हैं । मात्रा और कदम से एकत्र प्रोटीन की एकाग्रता से टेव राशि की गणना 3.7-3.8 । उदाहरण के लिए, यदि 10 मिलीलीटर का रेफरेंस उत्पाद एकत्र किया जाता है और ०.१ मिलीग्राम/एमएल पर मापा जाता है, तो कुल प्रोटीन द्रव्यमान 10 x ०.१ = 1 मिलीग्राम होता है, और टेव के 1 मिलीग्राम पाचन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  10. एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक (५० या १०० केडीए) फ़िल्टर इकाई के साथ प्रोटीन ध्यान 4 ° c में ४,००० x g पर कताई द्वारा 400-500 μL के एक अंतिम खंड के लिए (एक 2 मिलीलीटर नमूना-FPLC पर पाश लोड हो रहा है के लिए) ।
    नोट: एकाग्रता के लिए केंद्रापसारक समय एकाग्रता और प्रोटीन के आकार के आधार पर बदलता रहता है । से बचने के लिए पर ध्यान केंद्रित है, जो प्रोटीन वर्षा का कारण हो सकता है, पहले 10 मिनट के लिए स्पिन, तो शेष मात्रा का पालन करें और एक बाद स्पिन (जैसे, 2-5 मिनट) के लिए समय का अनुमान है, और इतने पर, अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए । प्रोटीन को फैलाने के लिए स्पिनर्स के बीच प्लास्टिक, जिसे फिल्टर के नीचे तक खींचा जाता है ।
  11. एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए केंद्रित प्रोटीन हस्तांतरण और केंद्रित उत्पाद से किसी भी वेग या बुलबुले को हटा दें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए > 12, 000 x g पर स्पिन और एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में supernatant इकट्ठा ।
  12. 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ अंतिम उत्पाद लोड और आकार-अपवर्जन कॉलम के साथ एक FPLC प्रणाली पर एक दौर टिप सुई के साथ एक आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी बफर ई (तालिका 5) के साथ पूर्व equilibrated ।
    नोट: FPLC स्थितियों के रूप में इस प्रकार हैं: एक ०.५ मिलीलीटर अंश आकार, एक पूर्व स्तंभ दबाव अलार्म २.५० MPa के लिए सेट, एक प्रवाह की मात्रा बफर ई (तालिका 5) के 30 मिलीलीटर के लिए सेट, और एक प्रवाह के लिए निर्धारित दर ०.५ मिलीलीटर/
  13. ध्यान दें कि अच्छी तरह से व्यवहार प्रोटीन एक चोटी (चित्रा 2a) के रूप में चलाने के लिए और प्रोटीन अंश (ओं) कि चोटी (चित्रा 2a) इसी के लिए इकट्ठा ।
  14. एक 4 मिलीलीटर या ०.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक फिल्टर इकाई के साथ प्रोटीन ध्यान केंद्रित (एक ही आणविक वजन कट के रूप में ३.१० चरण में बंद) और ४,००० x g पर 4 ° c पर स्पिन 5-10 μg/μL के एक अंतिम एकाग्रता के लिए । अंतिम उत्पाद एकाग्रता (चरण ३.८) की जांच करने के लिए spectrophotometer का उपयोग करें ।
    नोट: केंद्रापसारक समय बदलता है, अंतिम उत्पाद की मात्रा के रूप में शुद्धि परीक्षणों के बीच अलग कर सकते हैं । आमतौर पर, केंद्रापसारक लेता है 10-20 मिन । इसमें प्रोटीन को फैलाने के लिए स्पिनर्स के बीच प्लास्टिक की सिफारिश की जाती है, जिसे फिल्टर के नीचे तक खींचा जाता है ।
  15. एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए केंद्रित प्रोटीन हस्तांतरण । 4 ° c में 5-10 मिनट के लिए > 12, 000 x g पर केंद्रापसारक द्वारा किसी भी हाला निकालें । supernatant एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । ८० ° c पर भंडारण के लिए 10 μL aliquots बनाओ और एक 2-5 μL छोटे aliquot एक 4-15% ढाल एसडीएस पर चलाने के लिए-पृष्ठ जेल 9 V/
  16. जन स्पेक्ट्रोमेट्री8द्वारा शुद्ध प्रोटीन की पहचान की पुष्टि करें ।
    नोट: इन विट्रो में समारोह और शुद्ध प्रोटीन की संरचना के विश्लेषण planar लिपिड bilayer और एक्स-रे क्रि, क्रमशः5,8के माध्यम से किया जा सकता है ।

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Representative Results

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क्षणिक में प्रतिदीप्ति तीव्रता-transfected चिपकने वाला HEK293 कोशिकाओं (चित्रा 1a) सस्पेंशन HEK293-F कोशिकाओं (चित्रा 1b) में अनुमानित प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के लिए एक अच्छा संकेतक है । यदि लक्ष्य प्रोटीन अच्छी तरह से व्यक्त नहीं है या गलत है HEK293 कोशिकाओं में क्षणिक अभिकर्मक के बाद स्थानीय, यह अभिव्यक्ति के निर्माण को संशोधित करने पर विचार की सिफारिश की है (जैसे, GFP टैग की स्थिति बदलने या परिवर्तन/ लक्ष्य प्रोटीन पर) । छोटे HEK293-च निलंबन संस्कृतियों (जैसे, 25 मिलीलीटर संस्कृतियों) के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति, जो बीच में संक्रमण MOI और संवर्धन तापमान पिछले अनुभवों में सबसे महत्वपूर्ण रहा है के लिए शर्तों का अनुकूलन किया जाता है ।

एक सफल शुद्धि एक एकल मुख्य शिखर द्वारा आकार में अपेक्षित रेफरेंस वॉल्यूम-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 2a) और एक विकृत एसडीएस पर एक प्रमुख बैंड-पृष्ठ जेल (चित्रा बी) पर संकेत दिया है । यदि एकाधिक चोटियों आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी में दिखाई देते हैं, यह महत्वपूर्ण है प्रत्येक चोटी को इकट्ठा करने और निर्धारित करने के लिए एक देशी जेल चलाने जो चोटी कार्यात्मक चैनल pentamers शामिल हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दो प्रोटीन के निर्माण के बीच, अभिव्यक्ति स्तर, फसल के समय प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा संकेत, अंतिम उपज के साथ सहसंबंधी nesessarily नहीं है, के रूप में प्रत्येक प्रोटीन का निर्माण अलग शुद्धि के दौरान व्यवहार करता है । एक अच्छी तरह से व्यवहार bestrophin प्रोटीन के लिए, अंतिम शुद्ध उत्पाद के 200-500 µ जी आम तौर पर HEK293-F निलंबन कोशिकाओं के 1 एल से प्राप्त किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक स्तनधारी bestrophin प्रोटीन की अभिव्यक्ति । एक GFP के सूक्ष्म छवियों-टैग स्तनधारी bestrophin में व्यक्त (क) प्लाज्मिड अभिकर्मक द्वारा चिपकने वाली HEK293 कोशिकाओं, और में (ख) HEK293F संक्रमण द्वारा निलंबन baculovirus कोशिकाओं । वाम = हरी प्रतिदीप्ति; सही = उज्ज्वल क्षेत्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक स्तनधारी bestrophin प्रोटीन की शुद्धि । (क) अपनत्व-शुद्ध GFP-टैग प्रोटीन एक मुख्य चोटी के रूप में एक आकार अपवर्जन जेल-निस्पंदन कॉलम पर भाग गया । डैश्ड रेखाओं के बीच भिंन एकत्र किए गए । (ख) अंतिम प्रोटीन उत्पाद सीढ़ी (बाएं कॉलम) के साथ एक एसडीएस-पृष्ठ जेल पर भाग गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक मेगावाट राशि प्रति 1 L अंतिम
HEPES २३८.३ ११.९ छ 50mm
Nacl ५८.४४ १७.५२९ छ 300mm
ग्लिसरॉल ९२.०९ ५० एमएल ५% (वि. वि./
Imidazole ६८.१ १.३६१६ छ 20 एमएम
MgCl २०३ ०.२०३३१ छ 1 मिमी
tris (2-carboxyethyl) phosphine २८७ २.५ एमएल २०० एमएम स्टॉक ०.५ एमएम

तालिका 1: प्रोटीन शुद्धि बफर एक (resuspension बफर)

अभिकर्मक मेगावाट राशि प्रति 1 L अंतिम
HEPES २३८.३ ११.९ छ 50mm
Nacl ५८.४४ १७.५२९ छ 300mm
ग्लिसरॉल ९२.०९ ५० एमएल ५% (वि. वि./
Imidazole ६८.१ २.७२३२ छ 40mm
MgCl २०३ १.०१६५५ छ 5 मिमी
tris (2-carboxyethyl) phosphine २८७ ०.५ एमएल २०० एमएम स्टॉक ०.१ एमएम
डीडीएम (anagrade) ५१०.६ ०.५ छ ०.०५% (डब्ल्यू/

तालिका 2: प्रोटीन शुद्धि बफर बी (पहले धो बफर)

अभिकर्मक मेगावाट राशि प्रति 1 L अंतिम
HEPES २३८.३ ५.९५ छ 25 एमएम
Nacl ५८.४४ २९.२ छ ५०० एमएम
ग्लिसरॉल ९२.०९ ५० एमएल ५% (वि. वि./
Imidazole ६८.१ ५.१ छ ७५ एमएम
tris (2-carboxyethyl) phosphine २८७ ०.५ एमएल २०० एमएम स्टॉक ०.१ एमएम
डीडीएम (anagrade) ५१०.६ ०.५ छ ०.०५% (डब्ल्यू/

तालिका 3: प्रोटीन शुद्धि बफर सी (दूसरा धोने बफर)

अभिकर्मक मेगावाट राशि प्रति 1 L अंतिम
HEPES २३८.३ ७.७४ छ ३२.५ एमएम
Nacl ५८.४४ ११.६८६ छ २०० एमएम
ग्लिसरॉल ९२.०९ 25 मिलीलीटर २.५% (वि. वि./
Imidazole ६८.१ १७.०२ छ २५० एमएम
tris (2-carboxyethyl) phosphine २८७ ०.५ एमएल २०० एमएम स्टॉक ०.१ एमएम
डीडीएम (anagrade) ५१०.६ ०.५ छ ०.०५% (डब्ल्यू/

तालिका 4: प्रोटीन शुद्धि बफर डी (रेफरेंस बफर)

अभिकर्मक मेगावाट राशि प्रति 1 L अंतिम
HEPES २३८.३ ९.५३ छ 40mm
Nacl ५८.४४ ११.६८६ छ २०० एमएम
tris (2-carboxyethyl) phosphine २८७ ०.५ एमएल २०० एमएम स्टॉक ०.१ एमएम
डीडीएम (anagrade) ५१०.६ ०.५ छ ०.०५% (डब्ल्यू/

तालिका 5: प्रोटीन शुद्धि बफर ई (जेल निस्पंदन बफर)

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति और स्तनधारी bestrophin आयन चैनलों की शुद्धि के लिए एक उपयोगी पाइपलाइन का वर्णन करने के लिए भविष्य में इन विट्रो विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । जबकि FPLC डिवाइस आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के लिए आवश्यक है, एक सिरिंज पंप बंधन, धुलाई, और eluting सहित अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के सभी चरणों के लिए पर्याप्त है. जब एक सिरिंज पंप का उपयोग करने के लिए समाधान पुश (एक सिरिंज में) एक कॉलम के माध्यम से, यह वसंत की ओर बुनियाद के लिए कॉलम में हवा के बुलबुले धक्का से बचने के लिए आवश्यक है । यदि अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के बाद प्रोटीन की शुद्धता पहले से ही बाद के प्रयोगों के लिए पर्याप्त है, तो आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का लोप किया जा सकता है ताकि एक FPLC डिवाइस बिलकुल भी आवश्यक न हो.

के रूप में यह लगभग 2 सप्ताह लगते है pBacMam plasmids से baculoviruses बनाने के लिए, क्षमता बढ़ाने के लिए, अच्छी तरह से व्यवहार प्रोटीन homologs के लिए एक प्रारंभिक स्क्रीन क्षणिक transfected HEK293 कोशिकाओं की कटाई से बाहर किया जा सकता है (जैसे, एक ६० mm पकवान से) और परीक्षण कैसे ब्याज की व्यक्त प्रोटीन (GFP-टैग) डिटर्जेंट में व्यवहार करताहै (जैसे, डीडीएम) प्रतिदीप्ति के साथ-डिटेक्शन आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC)18,24। यह प्रोटीन निर्माण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सबसे अधिक उत्पादक है कि transfected HEK293 कोशिकाओं और अच्छी monodispersity और FSEC में स्थिरता में मजबूत प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करते हैं ।

प्रोटीन शुद्धिकरण की उपज बढ़ाने के लिए कई सिफारिशें की जाती हैं । सबसे पहले, टेव पाचन के लिए शर्तों प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । यह प्रोटीन की एक सीमा के परीक्षण के द्वारा किया जा सकता है-टेव जन अनुपात (जैसे, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, और 1:10) और मशीनिंग टाइंस (जैसे, ०.५ एच, 1 एच, 2 एच, 5 एच, और रात भर) । उसके बाद, यह एक एसडीएस-पृष्ठ जेल में क्लीवेज दक्षता की जांच करने के लिए इलाज नमूने चलाने के लिए सुझाव दिया है । इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी केंद्रापसारक supernatant या eluent FPLC या सीरिंज पर कनेक्शन से बाहर रिसाव । इसी तरह, यह महत्वपूर्ण है बुलबुले से बचने के लिए जब pipetting केंद्रित प्रोटीन ।

इन विट्रो में विभिंन अनुवर्ती विश्लेषण प्रक्रियाओं है कि इस प्रोटोकॉल से प्रोटीन का उपयोग लिपिड bilayer, एक्स-रे क्रि, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, स्पेक्ट्रोस्कोपी, और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग8,25 शामिल , 26.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना NIH अनुदान EY025290, GM127652 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और रोचेस्टर शुरू की वित्त पोषण विश्वविद्यालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

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References

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स्तनधारी Bestrophin आयन चैनलों की अभिव्यक्ति और शुद्धि
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Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).More

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

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