Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

doi: 10.3791/57832 Published: August 2, 2018

Summary

Rensing av ionekanaler er ofte utfordrende, men når oppnådd, det kan potensielt tillate i vitro undersøkelser av funksjoner og strukturer av kanalene. Her beskriver vi de gradvis prosedyrene for uttrykk og rensing av pattedyr bestrophin proteiner, en familie av Ca2 +-aktivert Cl- -kanaler.

Abstract

Det menneskelige genomet koder fire bestrophin paralogs, nemlig BEST1, BEST2, BEST3 og BEST4. BEST1, kodet av BEST1 genet, er en Ca2 +-aktivert Cl- kanal (CaCC) hovedsakelig uttrykt i netthinnens pigment epitel (RPE). Fysiologiske og patologiske betydningen av BEST1 er markert ved at over 200 forskjellige mutasjoner i genet BEST1 har vært genetisk knyttet til et spekter av minst fem netthinnens degenerative lidelser, som beste vitelliform macula dystrophy (beste sykdom). Derfor har forstå biofysikk bestrophin kanaler på enkelt-molekylet nivå enorm betydning. Men er å få renset pattedyr ionekanaler ofte utfordrende. Her rapporterer vi en protokoll for uttrykket av pattedyr bestrophin proteiner med BacMam-system for overføring av baculovirus genet og rensing av tilhørighet og størrelse-utestenging kromatografi. Renset proteiner har potensial til å bli utnyttet i påfølgende funksjonelle og strukturelle analyser, som elektrofysiologiske opptak i lipid bilayers og krystallografi. Viktigere, kan denne rørledningen tilpasses å studere funksjoner og strukturer i andre ionekanaler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bestrophins er en familie av ionekanaler holde arter varierer fra bakterier til mennesker1. Hos mennesker koder BEST1 genet, ligger på kromosom 11q12.3, membran protein Bestrophin-1 (BEST1) som er overveiende uttrykt i basolateral membran av netthinnens pigment epitel (RPE) celler av øyne2,3 ,4. Består av 585 aminosyrer, den første ~ 350 som er svært bevart blant arter og inneholder transmembrane regionen, fungerer BEST1 som en CaCC i mennesker1,5,6. Videre fungere BEST1 homologs i høner og Klebsiella pneumoniae både som homopentamers7,8, tyder på et høyt nivå av bevaring gjennom evolusjon.

Hos mennesker, har over 200 mutasjoner i genet BEST1 vært klinisk knyttet til en gruppe retinal degenerasjon sykdommer kalt bestrophinopathies1,9. Fem bestemte bestrophinopathies er rapportert, inkludert beste sykdom, voksen-utbruddet vitelliform dystrophy, autosomalt dominant vitreoretinochoroidopathy, autosomalt recessiv bestrophinopathy og retinitis pigmentosa3,4 ,,10,,11,,12,,13,,14. Disse sykdommer, som fører til redusert syn og med blindhet, er for tiden botemiddel. For å utvikle terapeutiske behandlinger og potensielt personlig medisin, er det avgjørende å forstå hvordan disse BEST1 sykdom-forårsaker mutasjoner påvirke funksjonen og struktur av BEST1 kanal15. For disse formål må forskere få renset bestrophin (wild type og/eller mutant) kanaler og gjennomføre i vitro analyser5,8.

Det første viktige steget er uttrykk for bestrophin kanaler fra høyere arter i pattedyrceller. Baculovirus signaltransduksjon HEK293-F celler (BacMam systemet) er en kraftig metode å uttrykke heterologously membran proteiner16,17, denne protokollen utnytter en optimalisert BacMam vektor (pEG BacMam) for robust uttrykk for den målrette protein18, som i dette tilfellet er et pattedyr bestrophin homolog. Denne vektoren er brukt for uttrykket av ulike membran proteiner, inkludert G-protein-kombinert reseptorer, kjernefysiske reseptorer og andre ion kanaler18. Det er også bevis for at produsert proteiner er egnet for krystallografi18. Med høye nivåer av uttrykk i HEK293-F celler, kan proteiner deretter bli renset med kromatografi; spesielt når det gjelder bestrophins, kan både tilhørighet og størrelse-utestenging kromatografi brukes.

Når denne protokollen er finjustert for en bestrophin kanal, kan renset protein bli analysert for funksjonen og struktur gjennom planar lipid bilayer og Røntgenkrystallografi, henholdsvis5,8. Sammen gir disse teknikkene en kraftig rørledning funksjonelle og strukturelle undersøkelser av bestrophins og andre ionekanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. produksjon BacMam uttrykk Baculoviruses

  1. Koding sekvensen av et ønsket pattedyr bestrophin protein inn pinnen BacMam vektor18 med en tobakk Etch Virus (TEV) protease anerkjennelse rekkefølge, etterfulgt av en GFP-10 x hans-tag på C-terminus av protein.
  2. Transiently transfect uttrykk plasmider i lim HEK293 celler19,20,21,22,23. Sjekk uttrykk for GFP-fusion protein under fluorescerende mikroskop med 10 X eller 20 X forstørrelse, en 488 nm excitation kilde og et 510 nm utslipp filter (figur 1A).
    Merk: Polymer-baserte transfection utføres rutinemessig med 1 μg av plasmider DNA for et 35 mm fat av HEK293 celler.
  3. Produsere baculoviruses i Sf9 insekt celler som beskrevet tidligere16,17.
    Merk: Passering 3 (P3) virus, som vil bli brukt til å infisere HEK293-F celler for protein produksjon, kan lagres på 4 ° C for 1 måned.
  4. Bestemme titer (smittsomme enheter) av P3 viruset av plakk formasjon analysen16,17.
    Merk: Som protein av interesse er merket med GFP, en raskere metode for å kontrollere smittsomme enheter er å infisere Sf9 celler med føljetong fortynninger av viruset og telle antall fluorescerende celler etter 48 timer.

2. protein uttrykk

  1. Opprettholde HEK293-F cellene i en suspensjon kultur med HEK293-F uttrykk mediet i en 37 ° C fuktet inkubator med 8% CO2. Bruke engangs kultur flasker som 2 - 2,5 ganger større enn kultur og rotere kulturen på en orbital plattform på 135 rpm.
    Merk: Det anbefales å infisere celler når de er mellom passasjer 5 og 30 og utføre disse handlingene under celle kultur hette.
  2. 24 timer før virusinfeksjon, legger 15 μL Trypan blå til en 15 μL aliquot med cellekulturer og kontrollere celle tetthet og levedyktighet ved hjelp av en hemocytometer under et mikroskop. Fortynne cellene til 0,6 x 106 celler/mL i 2 x 2 L flasker hver, med 500 mL medium pre varmet på 37 ° C.
    Merk: Døde celler er farget blå av Trypan blå. Ønsket celle levedyktighet er > 95%.
  3. På dagen for infeksjon, kontroller celle tetthet og levedyktighet (trinn 2.2).
    Merk: Et høyt levedyktigheten til > 95% er avgjørende for effektiv infeksjon og protein uttrykk. Celle tetthet er ~1.0 x 106 celler/mL (vokst over natten fra 2 x 500 mL 0.6 x 106 celler/mL cellekultur). Forventet antall celler er ~1.0 x 109.
  4. Legge til P3 baculoviruses til cellene i et mangfold av infeksjon (MOI) 5. For å avgjøre hvor mye virus å vaksinere, bruk denne formelen:
    Equation
  5. Riste cellene på orbital plattformen på 135 rpm i en fuktet 37 ° C inkubator med 8% CO2 24 h.
  6. Legger 10 mM av natrium butyrate til cellekultur og fortsette rugende 48 h.
    Merk: For noen proteiner, redusere celle kultur temperaturen til 30 ° C etter natrium butyrate tillegg kan forbedre uttrykk og stabilitet.
  7. Under fluorescens mikroskop med 10 X eller 20 X forstørrelse sjekke en 488 nm excitation kilde og 510 nm utslipp filter, prosent og lysstyrken på grønne celler, som direkte representerer protein (bestrophin-GFP-10xHis) avkastningen (figur 1B).
    Merk: Prosentandelen av grønne celler beregnes ved: 100 x (grønne celler/totalt celler). God protein uttrykk nivå er angitt med sterk grønne fluorescens under mikroskopet.
  8. Høste celler av sentrifugering 1000 x g i 4 ° C i 20 min. Fjern nedbryting og å suspendere celle pellets med fosfat-bufret saltvann (PBS) til et endelig antall ~ 80 mL. Del cellen suspensjon i 2 x 50 mL konisk rør og sentrifuger 1000 x g i 4 ° C i 20 min. lagre celle pellets på-80 ° C.

3. protein rensing

  1. Inkuber konisk rør som inneholder cellen pellets i en gripende vannbad ved romtemperatur for 10-15 min slik at de tine. Nytt suspendere cellene i 2 x (w/v) volumet av buffer (tabell 1) (f.eks 10 g av cellen pellets i 20 mL buffer) med proteinasen hemmere (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A og phenylmethylsulfonyl fluorid) på 0,1-1.0 mM. Pipetter opp og ned mye å få en homogen celle suspensjon.
  2. Lyse cellene med en høytrykks homogenizer. Kjøre celle suspensjon gjennom homogenizer på 7-10 MPa totalt 3 - 4 ganger å oppnå komplett homogenisering. Holde cellen lysate på is for 2-3 minutter mellom rundene.
  3. Legge til vaskemiddel [f.eks 2% w/v sol-grade n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] til lysate-cellen. Inkuber med agitering 1t 20 ° c til å trekke ut membran proteiner.
    Merk: Typen vaskemiddel må være optimalisert for hver protein målet18,24.
  4. Sentrifuge 150.000 x g i en ultracentrifuge på 4 ° C i 1 time.
    Merk: Alle de følgende trinnene utføres på 4 ° C.
  5. Samle klare celle lysate og flyt gjennom en 5 mL hans Trap Ni2 +- NTA affinitet kolonne pre equilibrated med buffer (tabell 1).
    Merk: Etter sentrifugering, klart cellen lysate vil være klemt mellom pellets nederst og en skyet lag på toppen. Bruk en 10 mL overføring Pipetter forsiktig samle den klare lysate og deretter bytte til en 1 mL Pipetter siste par ml lysate. Unngå pellets, som kan tette Ni2 + kolonnen. men en liten mengde det øverste laget er fint eller kan filtreres med en 1,5 μm filter.
  6. Vask kolonnen med 25 mL bufferen B og deretter 40 mL bufferen C (tabeller 2 og 3, henholdsvis).
    Merk: Dette er et godt sted å ta en pause, som totalt rensing kan ta opptil 12 h og protein kan forbli stabile mens festet til kolonnen over natten.
  7. Legge kolonnen til en rask protein flytende kromatografi (FPLC) system og elute protein fra kolonnen med 13 mL bufferen D (tabell 3) med fraksjoneres. Samle protein-beriket fraksjoner ifølge UV absorbansen avlesning.
    Merk: The FPLC betingelsene er følgende: en 1,0 mL brøkdel størrelse, en pre kolonnen press alarm 0,3 MPa, og en strømningshastighet på 0,5 mL/min.
  8. Måle elut protein produktet konsentrasjonen på et microvolume spektrofotometer. Lese absorbansen på 280 nm.
  9. (Valgfritt) Hvis du vil fjerne koden GFP-10xHis, legger til TEV protease en 1:1 forhold mellom og ruge på 4 ° C i 30 min.
    Merk: Koden kan eller kan ikke påvirke funksjonen eller struktur av renset kanalen. Beregne TEV beløpet fra volumet og konsentrasjonen av samlet protein fra trinn 3.7-3.8. For eksempel, hvis 10 mL elueringsrør produktet er samlet inn og målt på 0,1 mg/mL, totalt protein er 10 x 0,1 = 1 mg, og 1 mg TEV brukes for fordøyelsen.
  10. Konsentrere protein med en 15 mL sentrifugal (50 eller 100 kDa) filter enhet av snurrende 4000 x g i 4 ° C til et endelig antall 400-500 μL (for en 2 mL eksempel lasting sløyfe på FPLC).
    Merk: Centrifuging tiden for konsentrasjon varierer avhengig av konsentrasjonen og størrelsen på protein. For å unngå over konsentrere, kan som forårsake protein nedbør, spinn i 10 min først, deretter observere gjenværende volumet og anslå tiden for en etterfølgende snurr (f.eks 2-5 minutter) og så videre, å få det siste bindet. Pipetter mellom spinnene å spre protein, som er trukket til bunnen av filteret.
  11. Overføre konsentrert protein for å en ny 1,5 mL tube noen utløse eller bobler fra konsentrert produktet. Spinn på > 12.000 x g for 5-10 minutter til 4 ° C og samle nedbryting i en ny 1,5 mL tube.
  12. Laste det endelige produktet med en 1 mL sprøyte og en runde-tip nål på et FPLC system for størrelse-utestenging kromatografi størrelse-utestenging kolonnen pre equilibrated med buffer E (tabell 5).
    Merk: The FPLC betingelsene er følgende: en 0,5 mL brøkdel størrelse, en pre kolonnen press alarm satt til 2,50 MPa, en flyt volumsett til 30 mL av buffer E (tabell 5), og en strømningsrate 0,5 mL/min.
  13. Merk at veloppdragen proteiner kjøres som en enkelt topp (figur 2A) og samle protein fraction(s) tilsvarer at peak (figur 2A).
  14. Konsentrere protein med 4 mL eller 0,5 mL sentrifugal filter enhet (av samme molekylvekt cut-off som i trinn 3.10) og spinn på 4000 x g på 4 ° C til en siste konsentrasjon av 5-10 μg/μL. Bruk spektrofotometeret du sluttprodukt konsentrasjonen (trinn 3.8).
    Merk: Sentrifugering tid varierer ettersom sluttprodukt volumet kan variere mellom rensing prøvelser. Vanligvis tar sentrifugering 10-20 minutter. Det anbefales å Pipetter mellom spinnene å spre protein, som er trukket til bunnen av filteret.
  15. Overføre konsentrert protein til en ny 1,5 mL tube. Fjerne alle bunnfall ved sentrifugering på > 12.000 x g for 5-10 minutter til 4 ° C. Overføre nedbryting til en ny 1,5 mL tube. Gjør 10 μL dele for lagring på-80 ° C og lagre en 2-5 μL små aliquot kjøre på en 4-15% gradient SDS side gel på 9 V/cm (figur 2B).
  16. Bekrefte identiteten til renset protein av massespektrometri8.
    Merk: In vitro analyser av funksjonen og renset struktur kan utføres gjennom planar lipid bilayer og Røntgenkrystallografi, henholdsvis5,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fluorescens intensiteten i transiently transfekterte lim HEK293 celler (figur 1A) er en god indikator for det projiserte protein uttrykk i suspensjon HEK293-F celler (figur 1B). Hvis målet protein ikke er godt uttrykt eller mis er lokalisert i HEK293 celler etter forbigående transfection, anbefales det å endre uttrykket Konstruer (f.eks., endre plasseringen av GFP koden eller gjør mutasjoner/truncations på målet protein). Små HEK293-F suspensjon kulturer (f.eks 25 mL kulturer) brukes til å optimalisere betingelsene for protein uttrykk, blant annet infeksjonen MOI og dyrking temperatur har vært det viktigste i tidligere erfaringer.

En vellykket rensing angis av en enkelt hoved peak på forventet elueringsrør volumet i størrelse-utestenging kromatografi (figur 2A) og en enkelt dominerende band på en denaturert SDS side gel (figur 2B). Hvis flere topper vises i størrelse-utestenging Ture, er det viktig å samle hver topp og kjøre en innfødt gel for å avgjøre hvilke topp inneholder den funksjonelle kanal pentamers. Det bør bemerkes at mellom to protein konstruerer, hvilket uttrykk angitt av fluorescens intensitet på tid for innhøsting, gjør ikke nesessarily samsvarer med den endelige avkastningen, som hver protein konstruere forskjelllig under renselsen. For en veloppdragen bestrophin protein, kan vanligvis 200-500 µg på sluttproduktet renset fås fra 1 L HEK293-F suspensjon celler.

Figure 1
Figur 1: uttrykk for et pattedyr bestrophin protein. Mikroskopiske bilder av en GFP-merket pattedyr bestrophin uttrykt i (A) lim HEK293 celler av plasmider transfection og (B) suspensjon HEK293F celler av baculovirus infeksjon. Venstre = grønn fluorescens; høyre = lyse-feltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: rensing av et pattedyr bestrophin protein. (A) affinitet-renset GFP-merket proteiner kjørte på en størrelse utelukkelse gel-filtrering kolonne som et hoveddisplayet peak. Brøker mellom stiplede linjer ble samlet. (B) final protein produktet kjørte på en SDS side gel med stiger (venstre kolonne). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Reagens MW Beløp per 1 L Siste
HEPES 238.3 11,9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
Glyserol 92.09 50 mL 5% (v/v)
Imidazole 68.1 1.3616 g 20 mM
MgCl2 203 0.20331 g 1 mM
Tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 2,5 mL 200 mM lager 0,5 mM

Tabell 1: Protein rensing Buffer (rørets bufferen)

Reagens MW Beløp per 1 L Siste
HEPES 238.3 11,9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
Glyserol 92.09 50 mL 5% (v/v)
Imidazole 68.1 2.7232 g 40 mM
MgCl2 203 1.01655 g 5 mM
Tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
DDM (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabell 2: Protein rensing Buffer B (først vaske Buffer)

Reagens MW Beløp per 1 L Siste
HEPES 238.3 5.95 g 25 mM
NaCl 58.44 29,2 g 500 mM
Glyserol 92.09 50 mL 5% (v/v)
Imidazole 68.1 5.1 g 75 mM
Tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
DDM (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabell 3: Protein rensing Buffer C (andre vaske Buffer)

Reagens MW Beløp per 1 L Siste
HEPES 238.3 7.74 g 32,5 mM
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
Glyserol 92.09 25 mL 2,5% (v/v)
Imidazole 68.1 17.02 g 250 mM
Tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
DDM (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabell 4: Protein rensing Buffer D (elueringsbufferen)

Reagens MW Beløp per 1 L Siste
HEPES 238.3 9.53 g 40 mM
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
Tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL 200 mM lager 0,1 mM
DDM (anagrade) 510.6 0,5 g 0,05% (w/v)

Tabell 5: Protein rensing Buffer E (Gel filtrering Buffer)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen beskriver nyttig pipeline for uttrykk og rensing av pattedyr bestrophin ionekanaler som skal brukes for fremtidige i vitro analyser. Mens FPLC enheten er krevde for størrelse-utestenging Ture, er en sprøytepumpe tilstrekkelig for alle trinn av affinitet kromatografi inkludert bindende, vaske og eluting. Når du bruker en sprøytepumpe push løsninger (i en sprøyte) gjennom en kolonne, er det viktig å underlag siden våren for å unngå skyve luftbobler i kolonnen. Hvis renheten av protein etter affinitet kromatografi er allerede nok for senere eksperimenter, utelates størrelse-utestenging kromatografi slik at en FPLC enhet ikke kan være nødvendig i det hele tatt.

Som det tar ca 2 uker for å gjøre baculoviruses fra pBacMam plasmider, for å øke effektivitet, en første skjermen for veloppdragen protein homologs kan utføres ved å høste transiently transfekterte HEK293 cellene (f.eks., fra en 60 mm rett) og teste hvordan uttrykt protein av interesse (GFP-merket) oppfører seg i vaskemidler (f.eks DDM) med fluorescens-gjenkjenning størrelse-utestenging kromatografi (FSEC)18,24. Det er mest produktive å fokusere på protein konstruksjoner som viser sterk fluorescens i transfekterte HEK293 celler og god monodispersity og stabilitet i FSEC.

Det er flere anbefalinger for å øke avkastningen av protein rensing. Først må betingelsene for TEV fordøyelsen være optimalisert for hver protein. Dette kan gjøres ved å teste en rekke protein til TEV masse prosenter (f.eks 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 og 1:10) og rugende ganger (f.eks 0,5 h, 1 time, 2 timer, 5 h, og overnatting). Så, er det foreslått for å kjøre behandlet prøvene i en SDS-gel for å kontrollere cleavage effektiviteten. I tillegg er det viktig ikke å la noen sentrifugal nedbryting eller eluent lekkasje av tilkoblinger på FPLC eller sprøyter. På samme måte er det viktig å unngå bobler når pipettering konsentrert protein.

Ulike påfølgende i vitro analyser prosedyrer som bruker proteiner fra denne protokollen inkludere lipid bilayer, Røntgenkrystallografi, cryo-elektronmikroskop, spektroskopi og høy gjennomstrømning screening8,25 , 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Prosjektet ble finansiert ved NIH tilskudd EY025290, GM127652 og Universitetet i Rochester oppstart finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88, (2), 639-672 (2008).
  2. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97, (23), 12758-12763 (2000).
  3. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7, (9), 1517-1525 (1998).
  4. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19, (3), 241-247 (1998).
  5. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
  6. Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278, (42), 41114-41125 (2003).
  7. Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516, (7530), 213-218 (2014).
  8. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346, (6207), 355-359 (2014).
  9. Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. (2017).
  10. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104, (6), 449-453 (1999).
  11. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82, (1), 19-31 (2008).
  12. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85, (5), 581-592 (2009).
  13. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8, (4), 286-292 (2000).
  14. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (10), 3683-3689 (2004).
  15. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23, (12), 1805-1809 (2015).
  16. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  17. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, (5), 567-575 (2005).
  18. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9, (11), 2574-2585 (2014).
  19. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
  20. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111, (51), 18213-18218 (2014).
  21. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7, (5), e37079 (2012).
  22. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3, (12), 795-804 (2007).
  23. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588, (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  24. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, (4), 673-681 (2006).
  25. Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
  26. Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173, (9), 2307-2322 (2017).
Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).More

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter