Summary
La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl– .
Abstract
El genoma codifica cuatro paralogs de bestrophin, es decir, BEST1, BEST2, BEST3 y BEST4. BEST1, codificada por el gen BEST1 , es un Ca2 +-activa Cl– canal (CaCC) predominante expresado en epitelio retiniano del pigmento (RPE). La importancia fisiológica y patológica de BEST1 destaca por el hecho de que más de 200 mutaciones distintas en el gen BEST1 se han relacionado genéticamente con un espectro de por lo menos cinco trastornos degenerativos retinianos, como vitelliform mejor distrofia macular (enfermedad de Best). Por lo tanto, comprensión de la biofísica de canales de bestrophin a nivel de una sola molécula tiene gran importancia. Sin embargo, obtención de canales iónicos mamíferos purificada es a menudo una tarea difícil. Aquí, Divulgamos un protocolo para la expresión de proteínas de mamíferos bestrophin con el sistema de transferencia de genes de BacMam baculovirus y su purificación por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. Las proteínas purificadas tienen el potencial para ser utilizados en posteriores análisis funcionales y estructurales, como la grabación electrofisiológica en bicapas lipídicas soportadas y Cristalografía. Lo importante, esta tubería puede ser adaptada para el estudio de las funciones y estructuras de otros canales iónicos.
Introduction
Bestrophins son una familia de canales iónicos, conservada a través de especies diferentes de bacterias a los seres humanos1. En los seres humanos, el gene BEST1 , situado en el cromosoma 11q12.3, codifica la proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expresa predominantemente en la membrana basolateral de las células del epitelio (RPE) pigmentario de la retina de los ojos2,3 ,4. Compuesta por 585 aminoácidos, el primer ~ 350 de los cuales están muy conservadas entre especies y contienen su región transmembrana, BEST1 actúa como un CaCC en los seres humanos1,5,6. Además, los homólogos BEST1 en pollos y Klebsiella pneumoniae funcionan como homopentamers7,8, lo que sugiere un alto nivel de conservación a lo largo de la evolución.
En los seres humanos, más de 200 mutaciones en el gen BEST1 han sido clínicamente asociadas a un grupo de enfermedades de degeneración retiniana llamado bestrophinopathies1,9. Cinco bestrophinopathies específicas se han divulgado, incluyendo enfermedad mejor, vitelliform adulto distrofia, autosómica dominante vitreoretinochoroidopathy, bestrophinopathy recesivo autosomal y pigmentosa de la retinitis3,4 ,10,11,12,13,14. Estas enfermedades, que conducen a la disminución de la visión e incluso ceguera, son actualmente intratables. Con el fin de desarrollar tratamientos terapéuticos y medicina personalizada potencialmente, es fundamental para entender cómo estas mutaciones enfermedad-que causan BEST1 influyen en la función y la estructura del BEST1 canal15. A estos efectos, los investigadores deben obtener canales de bestrophin purificada (tipo salvaje y mutante) y llevar a cabo in vitro análisis5,8.
El primer paso clave es la expresión de canales de bestrophin de especies mayores en células de mamíferos. Como baculovirus transduction de las células HEK293-F (el sistema de BacMam) es un método poderoso para expresar heterologously membrana proteínas16,17, este protocolo utiliza un vector de BacMam optimizado (pEG BacMam) para la expresión robusta de la objetivo proteína18, que en este caso es un homólogo de mamífero bestrophin. Este vector se ha utilizado para la expresión de diversas proteínas de membrana, incluyendo receptores g-proteína-juntados, receptores nucleares y otros canales de iones18. También hay evidencia de que las proteínas producidas son convenientes para Cristalografía18. Con altos niveles de expresión en células HEK293-F, las proteínas se pueden entonces purificar mediante cromatografía; específicamente, en el caso de bestrophins, afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño pueden utilizarse.
Una vez que este protocolo está optimizado para un canal de bestrophin, la proteína purificada puede entonces analizarse por su función y estructura a través de la bicapa lipídica planar y Cristalografía de rayos x, respectivamente de5,8. En conjunto, estas técnicas proporcionan una tubería de gran alcance para las investigaciones funcionales y estructurales de bestrophins y otros canales de iones.
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Protocol
1. producción de BacMam expresión baculovirus
- La secuencia de codificación de una proteína deseada bestrophin mamíferos Inserte la clavija BacMam vector18 con una secuencia de reconocimiento de proteasa tabaco Etch Virus (TEV), seguida por un GFP-10 x su etiqueta en el c-término de la proteína.
- Transfectar transitoriamente el plásmido de expresión en adhesivo HEK293 células19,20,21,22,23. Controlar la expresión de la proteína GFP-fusión bajo un microscopio fluorescente con 10 X o 20 aumentos, una fuente de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 510 nm (figura 1A).
Nota: Transfección con polímeros se realiza rutinariamente con 1 μg de ADN de plásmido para un plato de 35 mm de las células HEK293. - Producir el baculovirus en células de insecto Sf9 como se describió anteriormente16,17.
Nota: El paso 3 (P3) virus, que se utilizará para infectar las células HEK293-F para la producción de proteína, pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes. - Determinar el título (unidades infecciosas) P3 del virus de la placa formación ensayo16,17.
Nota: Como la proteína de interés es etiquetada con GFP, es un método más rápido para el control de unidades infecciosas infectar las células Sf9 con diluciones seriadas del virus y contar el número de celdas fluorescentes después de 48 h.
2. expresión de la proteína
- Mantener las células HEK293-F en una cultura de suspensión con el medio de expresión HEK293-F en una incubadora humidificada de 37 ° C con 8% CO2. Utilizar frascos de cultivo desechables que son 2 - 2.5 veces mayor que el volumen cultura y rotan la cultura en una plataforma orbital 135 rpm.
Nota: Se recomienda para infectar las células cuando son entre 5 y 30 pasos y llevar a cabo estas acciones bajo una campana de cultivo celular. - 24 h antes de la infección viral, añadir 15 μL de azul tripán a una alícuota de 15 μL del cultivo celular y Compruebe la densidad celular y viabilidad utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio. Diluir las células 0.6 x 106 células/mL en frascos de 2 x 2 L cada uno, con 500 mL de medio de calentado previamente a 37 ° C.
Nota: Las células muertas se tiñen azul de tripán azul. La viabilidad celular deseado es > 95%. - En el día de la infección, controlar la densidad celular y viabilidad (paso 2.2).
Nota: Una alta viabilidad celular de > 95% es esencial para la eficaz expresión de infección y de la proteína. La densidad celular esperado es ~1.0 x 106 células/mL (crecida durante la noche de 2 x 500 mL de 0,6 x 106 células/mL células la cultura). El número total esperado de células es ~1.0 x 109. - Añadir el baculovirus P3 a las células en una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Para determinar la cantidad de virus para inocular, utilice la siguiente ecuación:
- Agitar las células en la plataforma orbital en 135 rpm en una incubadora humidificada 37 ° C con 8% CO2 durante 24 h.
- Añadir 10 mM de butirato de sodio para el cultivo celular y continuar incubando durante 48 h.
Nota: Para algunas proteínas, reducir la temperatura de cultivo celular a 30 ° C, después de adición de butirato de sodio puede mejorar la expresión y la estabilidad. - Bajo un microscopio de fluorescencia con 10 X o 20 X aumentos, una fuente de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 510 nm, marque el porcentaje y el brillo de las células verdes, que representan directamente la producción de la proteína (GFP-bestrophin-10xHis) (figura 1B).
Nota: El porcentaje de células verdes se calcula: 100 x (células Total células verdes). Nivel de expresión de la proteína buena indica fuerte fluorescencia verde bajo el microscopio. - La cosecha de las células por centrifugación a 1.000 x g en 4 ° C por 20 minutos retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta un volumen final de ~ 80 mL. Split la suspensión celular en tubos cónicos de 2 x 50 mL y centrifugar a 1.000 x g en 4 ° C durante 20 min almacenar los pellets de células a-80 ° C.
3. purificación de proteínas
- Incubar los tubos cónicos que contienen los pellets de células en un baño de agitación a temperatura ambiente durante 10-15 min para que descongele. Resuspenda las células en 2 x volumen (w/v) de tampón A (tabla 1) (p. ej., 10 g de gránulos celulares en 20 mL de tampón) suplementado con los inhibidores de la proteinasa (fluoruro de aprotinina, Leupeptin, Pepstatin A y phenylmethylsulfonyl) en 0.1-1.0 mM. Pipeta de arriba y abajo ampliamente para obtener una suspensión homogénea.
- Lyse las células usando un homogeneizador de alta presión. Ejecutar la suspensión de células a través del homogeneizador a 7-10 MPa para un total de 3 - 4 veces para lograr la completa homogeneización. Mantener la celda lisado en hielo durante 2-3 minutos entre rounds.
- Agregue detergente [por ejemplo, 2% w/v sol de grado n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM)] a la celda lisada. Incubar con agitación durante 1 hora a 20 ° C para extraer las proteínas de membrana.
Nota: El tipo de detergente debe ser optimizado para cada proteína objetivo18,24. - Centrifugue a 150.000 x g en una ultracentrífuga a 4 ° C durante 1 hora.
Nota: Todos los pasos siguientes se realizan a 4 ° C. - Recoger el lisado de células claras y el flujo a través de una 5 mL su trampa Ni2 +- NTA afinidad columna previamente equilibrada con tampón (tabla 1).
Nota: Después de la centrifugación, el lisado de células claras se intercala entre un balín en la parte inferior y una capa turbia en la parte superior. Utilice una pipeta de transferencia de 10 mL para recoger con cuidado el lisado claro y luego cambiar a una pipeta de 1 mL para los últimos mililitros de lisado. Evitar que el sedimento, que puedan obstruir el2 + columna de Ni; sin embargo, una pequeña cantidad de la capa superior es fina o puede ser filtrada con un filtro de 1,5 μm. - Lavar la columna con 25 mL de tampón B y luego 40 mL de tampón C (tablas 2 y 3, respectivamente).
Nota: Este es un buen lugar para tomar un descanso, como purificación total puede tomar hasta 12 h y la proteína puede permanecer estable mientras que atado a la columna durante la noche. - Coloque la columna en un sistema de cromatografía líquida (FPLC) proteína rápida y eluir la proteína de la columna con 13 mL de buffer D (tabla 3) con el fraccionamiento. Recoger las fracciones de proteína enriquecida según la lectura de absorbancia de UV.
Nota: el FPLC condiciones son como sigue: un tamaño de fracción de 1,0 mL, una alarma de presión de la columna a 0,3 MPa y un caudal de 0,5 mL/min. - Medir la concentración de producto de proteínas eluídas en un espectrofotómetro de microvolume. Leer la absorbancia a 280 nm.
- (Opcional) Para quitar la etiqueta de GFP-10xHis, añadir la proteasa TEV en una proporción de 1:1 masa e incubar a 4 ° C durante 30 minutos.
Nota: La etiqueta puede o no puede afectar la función o estructura del canal purificado. Calcular la cantidad TEV del volumen y la concentración de la proteína recogida de medidas 3.7-3.8. Por ejemplo, si 10 mL de producto de elución se recoge y se mide en 0,1 mg/mL, proteínas totales masa es 10 x 0,1 = 1 mg y 1 mg de TEV se utilizará para la digestión. - Concentrado de la proteína con una centrífuga de 15 mL (kDa 50 o 100) unidad de filtro por giro a 4.000 x g en 4 ° C hasta un volumen final de 400-500 μL (para un bucle de carga de muestra de 2 mL en FPLC).
Nota: El tiempo de centrifugación para la concentración varía dependiendo de la concentración y el tamaño de la proteína. Para evitar el exceso de concentración, que puede causar precipitación de la proteína, centrifugado durante 10 minutos al principio, luego observar el volumen restante y estimar el tiempo de una vuelta posterior (por ejemplo, 2-5 minutos), y así sucesivamente, para obtener el volumen final. Pipeta entre giros para dispersar a la proteína, que se tira a la parte inferior del filtro. - La transferencia de la proteína concentrada para un nuevo 1,5 mL del tubo y retirar cualquier precipitado o burbujas del producto concentrado. Spin en > 12.000 x g durante 5-10 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mL.
- El producto final con una jeringa de 1 mL y una aguja de punta redonda en un sistema FPLC para cromatografía por exclusión de tamaño de la carga con una columna de exclusión de tamaño previamente equilibrada con el tampón E (tabla 5).
Nota: el FPLC condiciones son como sigue: un tamaño de fracción de 0,5 mL, una alarma de presión de la columna a 2,50 MPa, un volumen de flujo a 30 mL de buffer E (tabla 5), y una tasa de flujo de 0,5 mL/min. - Tenga en cuenta que las proteínas bien-se comportó como un solo pico (figura 2A) y recogen el fraction(s) de la proteína correspondiente a ese pico (figura 2A).
- Concentrado de la proteína con una unidad de filtro centrífugo de 4 mL o 0,5 mL (del misma corte de peso molecular como en el paso 3.10) y vuelta a 4.000 x g a 4 ° C a una concentración final de 5-10 μg/μL. Utilizar el espectrofotómetro para comprobar la concentración de producto final (paso 3.8).
Nota: Tiempo de centrifugación varía, ya que el volumen de producto final puede variar entre los ensayos de purificación. Generalmente, centrifugación tarda 10-20 minutos. Se recomienda a la pipeta entre giros para dispersar a la proteína, que se tira a la parte inferior del filtro. - Transferencia de la proteína concentrada a un nuevo tubo de 1,5 mL. Retire cualquier precipitado por centrifugación en > 12.000 x g durante 5-10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Hacer 10 alícuotas μL para el almacenamiento a-80 ° C y salvar un 2-5 μL pequeña parte alícuota para correr en un gel de SDS-PAGE del gradiente de 4-15% a 9 V/cm (figura 2B).
- Confirmar la identidad de la proteína purificada por espectrometría de masas8.
Nota: El análisis In vitro de la función y estructura de la proteína purificada pueden realizarse a través de la bicapa lipídica planar y Cristalografía de rayos x, respectivamente de5,8.
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Representative Results
La intensidad de fluorescencia en transitorio transfected las células HEK293 adhesivo (figura 1A) es un buen indicador para el nivel de expresión de la proteína proyectada en células HEK293-F de suspensión (figura 1B). Si la proteína diana no se expresa bien o mal se encuentra localizada en las células HEK293 después de transfección transitoria, se recomienda considerar modificar la construcción de la expresión (por ej., cambiar la posición de la etiqueta GFP o hacer mutaciones/truncamientos en la proteína diana). Pequeños cultivos de suspensión HEK293-F (por ejemplo, culturas de 25 mL) se utilizan para optimizar las condiciones para la expresión de la proteína, entre los que la infección MOI y temperatura de cultivo han sido los más importantes en las experiencias anteriores.
Una purificación exitosa se indica con un solo pico principal en el volumen de elución esperados en cromatografía por exclusión de tamaño (figura 2A) y una única banda dominante en gel de SDS-PAGE desnaturalizada (figura 2B). Si aparecen múltiples picos en la cromatografía por exclusión de tamaño, es importante recoger cada pico y correr un gel natural para determinar qué pico contiene el canal funcional pentámeros. Cabe señalar que entre dos constructos de proteína, el nivel de expresión, indicado por la intensidad de fluorescencia en el momento de la cosecha, se correlaciona con el rendimiento final, no nesessarily como la construcción de cada proteína se comporta diferentemente durante la purificación. Para una proteína bien-comportado bestrophin, 200-500 μg de producto final purificado puede obtenerse normalmente de 1 L de las células de suspensión HEK293-F.
Figura 1: expresión de una proteína de mamífero bestrophin. Imágenes microscópicas de una bestrophin mamífero etiquetado GFP expresan en (A) adhesivo HEK293 células por transfección de plásmidos y en (B) suspensión HEK293F células por la infección de baculovirus. Izquierda = fluorescencia verde; derecha = campo claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: purificación de una proteína de mamífero bestrophin. (A)-purificados por afinidad proteínas GFP-tagged funcionaron en una columna de gel filtración de exclusión de tamaño como un pico principal. Se colectaron fracciones entre las líneas punteadas. (B) producto de la proteína final corrió en un gel de SDS-PAGE con escaleras de mano (columna izquierda). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | MW | Cantidad por 1 L | Final |
| HEPES | 238.3 | 11,9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | g 17,529 | 300 mM |
| Glicerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | g 1,3616 | 20 mM |
| MgCl2 | 203 | 0,20331 g | 1 mM |
| Tris(2-Carboxyethyl) fosfina | 287 | stock de 200 mM 2,5 mL | 0,5 mM |
Tabla 1: Purificación de proteína tampón (tampón de resuspensión)
| Reactivo de | MW | Cantidad por 1 L | Final |
| HEPES | 238.3 | 11,9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | g 17,529 | 300 mM |
| Glicerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | g 2,7232 | 40 mM |
| MgCl2 | 203 | 1,01655 g | 5 mM |
| Tris(2-Carboxyethyl) fosfina | 287 | stock de 200 mM de 0, 5 mL | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
Tabla 2: Proteína purificación Buffer B (primer tapón de lavaje)
| Reactivo de | MW | Cantidad por 1 L | Final |
| HEPES | 238.3 | g 5,95 | 25 mM |
| NaCl | 58.44 | 29,2 g | 500 mM |
| Glicerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 5,1 g | 75 mM |
| Tris(2-Carboxyethyl) fosfina | 287 | stock de 200 mM de 0, 5 mL | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
Tabla 3: Tampón de purificación de proteína C (segundo tapón de lavaje)
| Reactivo de | MW | Cantidad por 1 L | Final |
| HEPES | 238.3 | 7,74 g | 32,5 mM |
| NaCl | 58.44 | g 11,686 | 200 mM |
| Glicerol | 92.09 | 25 mL | 2.5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 17,02 g | 250 mM |
| Tris(2-Carboxyethyl) fosfina | 287 | stock de 200 mM de 0, 5 mL | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
Tabla 4: Proteínas purificación Buffer D (tampón de elución)
| Reactivo de | MW | Cantidad por 1 L | Final |
| HEPES | 238.3 | g 9,53 | 40 mM |
| NaCl | 58.44 | g 11,686 | 200 mM |
| Tris(2-Carboxyethyl) fosfina | 287 | stock de 200 mM de 0, 5 mL | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
Tabla 5: Proteína purificación Buffer E (tampón de la filtración de Gel)
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Discussion
Este protocolo describe un oleoducto útil para la expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos bestrophin a utilizarse para el análisis futuro de vitro . Mientras que el dispositivo FPLC es necesario para la cromatografía por exclusión de tamaño, una bomba de jeringa es suficiente para todos los pasos de cromatografía de afinidad como vinculante, lavado y liberador. Cuando se utiliza una bomba de jeringa para soluciones de push (en jeringa) a través de una columna, es esencial para el lado de la primavera para evitar burbujas de aire empujando la columna de la arpillera. Si la pureza de la proteína después de la cromatografía de afinidad es ya suficiente para los experimentos posteriores, puede omitirse la cromatografía por exclusión de tamaño para que un dispositivo FPLC puede no requerirse en todos.
Como se tarda alrededor de 2 semanas para hacer el baculovirus de plásmidos pBacMam, para aumentar la eficiencia, una pantalla inicial de homólogos de la proteína bien-comportados puede realizarse cultivando las células HEK293 transitorio transfected (e.g., de un plato de 60 mm) y prueba cómo la expresan la proteína de interés (GFP-etiquetado) se comporta en detergentes (por ejemplo, DDM) con detección de fluorescencia cromatografía por exclusión de tamaño (FSEC)18,24. Es más productivo concentrarse en construcciones de proteínas que muestran fluorescencia fuerte en transfected las células HEK293 y buena monodispersity y estabilidad en FSEC.
Hay varias recomendaciones para aumentar el rendimiento de purificación de proteínas. En primer lugar, las condiciones para la digestión de la TEV pueden necesitar ser optimizado para cada proteína. Esto puede hacerse por pruebas una gama de cocientes masa proteína para TEV (por ejemplo, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10) e incubación de tiempos (p. ej., 0,5 h, 1 h, 2 h, 5 h y durante la noche). Luego, se recomienda ejecutar que las muestras tratadas en un SDS-PAGE gel para comprobar la eficacia de la hendidura. Además, es importante no dejar que cualquier fuga de sobrenadante o eluyente centrífugo de las conexiones en el FPLC o jeringas. Asimismo, es importante evitar las burbujas al pipetear la proteína concentrada.
Varios posteriores en vitro procedimientos de análisis que utilizan las proteínas de este protocolo incluyen la bicapa lipídica, Cristalografía de rayos x, microscopia del cryo-electrón, espectroscopia y alto rendimiento de cribado de8,25 , 26.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH EY025290 y GM127652 de la Universidad de Rochester financiación de puesta en marcha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
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