Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

doi: 10.3791/57832 Published: August 2, 2018

Summary

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

Abstract

İnsan genomu dört bestrophin paralogs, yani BEST1, BEST2, BEST3 ve BEST4 kodlar. BEST1, BEST1 Gen tarafından kodlanmış olan bir Ca2 +-Cl- ağırlıklı olarak retina pigment epiteli (RPE) ifade kanal (CaCC) aktif. BEST1 fizyolojik ve patolojik önemi olduğunu BEST1 gen 200'den fazla farklı mutasyonların genetik olarak en az beş Retina dejeneratif bozuklukları, en iyi vitelliform gibi bir yelpazede bağlantılı olmuştur aslında tarafından vurgulanır yaşa bağlı makula distrofi (en iyi hastalığı). Bu nedenle, Biyofizik bestrophin kanal tek molekül düzeyinde anlamak çok büyük önemi tutar. Ancak, saflaştırılmış memeli iyon kanalları almak kez zor bir görev olduğunu. Burada, BacMam baculovirus Gen aktarım sistemi ve onların arıtma benzeşme ve boyutu-dışlama kromatografi ile memeli bestrophin proteinlerin ifade için bir protokol raporu. Saf protein sonraki fonksiyonel ve yapısal analizleri, lipid bilayers ve kristalografisi elektrofizyolojik kayıt gibi kullanılmak üzere potansiyeline sahiptir. Önemlisi, bu boru hattı fonksiyonlar ve diğer iyon kanal yapıları çalışmaya adapte edilebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bestrophins iyon kanallarının bakterilerden insanlar1olarak değişen türler ile korunmuş bir aileyiz. İnsanlarda, BEST1 gen, kromozom 11q12.3 üzerinde bulunan membran proteini Bestrophin-1 (BEST1) ağırlıklı olarak retina pigment epiteli (RPE) hücreleri gözleri2,3 demiri membran ifade edilen kodlar. ,4. 585 ilk ~ 350 olan türler arasında son derece korunmuş ve onun transmembran bölge içeren, aminoasitler, oluşan bir CaCC insanlar1,5,6BEST1 görür. Ayrıca, BEST1 homologs tavuklarda ve Klebsiella pneumoniae koruma evrim boyunca yüksek düzeyde düşündüren homopentamers7,8olarak, işlev.

İnsanlarda, 200'den fazla mutasyon BEST1 gen klinik olarak retina dejenerasyonu hastalıklarının bestrophinopathies1,9adlı bir gruba bağlıdır. En iyi hastalık, Yetişkin başlangıçlı vitelliform distrofi, otozomal dominant vitreoretinochoroidopathy, otozomal resesif bestrophinopathy ve retinitis pigmentosa3,4 de dahil olmak üzere beş belirli bestrophinopathies bildirilmiştir ,10,11,12,13,14. Azalan görme ve hatta körlüğe yol açar, bu hastalıkların Şu anda tedavi edilemez. Tedavi tedaviler ve potansiyel olarak Kişiselleştirilmiş tıp geliştirmek için nasıl bu BEST1 hastalığa neden olan mutasyonlar etkisi işlevi ve BEST1 kanal15yapısını anlamak için önemlidir. Bu amaçla, araştırmacılar saf bestrophin (yabani türü ve/veya mutant) kanalları sağlamanız ve vitro analizler5,8yapmak gerekir.

İlk önemli adım bestrophin kanalları memeli hücrelerinde yüksek türlerden ifadesidir. Baculovirus iletim (BacMam sistemi) HEK293-F hücrelerinin zar proteinleri16,17heterologously ifade etmek için güçlü bir yöntem olduğu için bu iletişim kuralı sağlam ifade için en iyi duruma getirilmiş bir BacMam vektörü (pEG BacMam) kullanır Bu durumda bir memeli bestrophin homolog olan hedef protein18. Bu vektör reseptörleri G protein birleştiğinde, nükleer reseptörleri ve diğer iyon kanalları18de dahil olmak üzere çeşitli membran proteinlerinin ifade için kullanılmıştır. Üretilen proteinlerin kristalografisi18için uygun olduğuna dair bir kanıt da vardır. İfade HEK293-F hücrelerdeki yüksek seviyeleri ile proteinler sonra Kromatografi kullanarak saf; Özellikle, bestrophins söz konusu olduğunda, benzeşme ve boyutu-dışlama Kromatografi kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı için bir bestrophin kanal ince ayarlı olduğunda, saf protein sonra onun fonksiyonu ve düzlemsel lipid bilayer ve x-ışını kristalografisi, sırasıyla5,8aracılığıyla yapısı için analiz edilebilir. Özet olarak, bu teknikleri bestrophins ve diğer iyon kanalları fonksiyonel ve yapısal incelemeler için güçlü bir boru hattı sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. BacMam ifade Baculoviruses üreten

  1. BacMam vektör18 GFP 10 tarafından izleyen bir tütün Etch virüs (TEV) proteaz tanıma dizisi ile pEG istenen memeli bestrophin protein kodlama dizisi takın O'nun etiketi-protein C terminus x.
  2. Geçici ifade plazmid yapıştırıcı HEK293 hücreleri19,20,21,22,23transfect. Ifade 10 X veya 20 X büyütme, 488 nm uyarma kaynak ve 510 nm Emisyon filtre (Şekil 1A) Floresan mikroskop altında GFP-füzyon proteinin denetleyin.
    Not: Polimer esaslı transfection düzenli olarak plazmid DNA HEK293 hücrelerinin bir 35 mm yemek için 1 μg ile gerçekleştirilir.
  3. Sf9 böcek hücrelerinde baculoviruses yukarıda açıklanan16,17olarak üretmek.
    Not: Bölüm 3 (P3) HEK293-F hücrelerin protein üretimi için bulaştırmak için kullanılacak, virüs 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
  4. P3 virüs titresi (bulaşıcı adet) tarafından plak oluşumu tahlil16,17belirlemek.
    Not: ilgi protein GFP ile etiketlenir, bulaşıcı birimleri kontrol etmek için daha hızlı bir yöntem Sf9 hücreleri ile seri dilutions virüs bulaştırmak ve 48 saat sonra floresan hücreleri saymak gibidir.

2. protein ifade

  1. HEK293-F ifadenin orta 37 ° C oksijen kuluçka % 8 CO2HEK293-F hücrelerle süspansiyon kültürü korumak. Daha kültür Hacim 2 - 2.5 kat daha büyük olan ve kültür 135 devirde yörünge bir platformda döndürmek tek kullanımlık kültür şişeler kullanın.
    Not: Bu pasajlar 5 ve 30 arasında olduklarında enfekte hücreleri ve hücre kültür başlık altında bu eylemleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
  2. 24 saat önce viral enfeksiyon, Trypan mavi, 15 μL hücre kültürü için bir 15 μL aliquot ekleyin ve hücre yoğunluğu ve mikroskop altında bir hemasitometre kullanarak canlılığı denetleyin. 0,6 x 106 hücre/mL 2 x 2 L şişeler her biri, 500 mL orta önceden 37 ° C'de ısındı hücrelere sulandırmak
    Not: Ölü hücreleri mavi Trypan tarafından mavi lekeli. İstenen hücre canlılık olduğunu > % 95.
  3. Enfeksiyon günü, hücre yoğunluğu ve canlılığı (adım 2.2) denetleyin.
    Not: Bir yüksek hücre canlılığı > % 95 verimli enfeksiyon ve protein ifade için esastır. ~1.0 x 106 hücre/mL (2 x 500 mL 0,6 x 106 hücre/mL hücre kültürü yetişkin gecede) beklenen cep yoğunluğudur. Hücre beklenen toplam sayısı ~1.0 x 109' dur.
  4. P3 baculoviruses enfeksiyonu (MOI) 5 çokluğu, hücreleri ekleyin. Aşılamak için virüs miktarı belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanarak:
    Equation
  5. Bir oksijen 37 ° C kuluçka % 8 CO2 24 h 135 rpm'de yörünge platformda hücreleri sallamayın.
  6. Sodyum bütrat 10 mM hücre kültürü ekleyin ve 48 h için kuluçka devam edin.
    Not: Sodyum bütrat ek ifade ve istikrarı geliştirmek sonra bazı proteinler, hücre kültürü sıcaklığı 30 ° C ile azaltılması.
  7. 10 X-20 X büyütme, 488 nm uyarma kaynak ve 510 nm Emisyon filtre ile floresan mikroskop altında yüzde ve parlaklık doğrudan protein (bestrophin-GFP-10xHis) verim (Şekil 1B) temsil eden yeşil hücre kontrol.
    Not: Yeşil hücre yüzdesi tarafından hesaplanır: (yeşil hücreler/toplam hücreleri) x 100. İyi protein ifade düzeyi güçlü yeşil floresan mikroskop altında gösterilir.
  8. 1000 x g 20 dk. Kaldır süpernatant 4 ° c de centrifuging tarafından hücreleri hasat ve hücre topakları fosfat tamponlu tuz (PBS) ~ 80 mL son hacmiyle ile yeniden askıya alma. Split 2 x 50 mL konik boru ve 1000 x g 4 ° c de 20 dakika süreyle santrifüj içine hücre süspansiyon hücre granül-80 ° C'de depolamak

3. protein saflaştırma

  1. Onlar çözülme 10-15 dakika oda sıcaklığında coşkulu bir su banyosunda hücre granül içeren konik tüpler kuluçkaya. 2 x (w/v) hacmi İndinavir inhibitörleri (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A ve phenylmethylsulfonyl florür) ile desteklenmiş arabellek (Tablo 1) (Örneğin, hücre Pellet arabellek 20 ml 10 g) hücrelerde 0.1-1.0 yeniden askıya mM. Yukarı ve aşağı damlalıklı kapsamlı bir homojen hücre süspansiyon elde etmek için.
  2. Yüksek basınçlı bir homogenizer kullanarak hücreleri parçalayıcı. Hücre süspansiyon koşmak-den geçerek homogenizer, 7-10 MPa toplamda 3 - 4 kez tam homojenizasyon elde etmek için. Hücre lysate 2-3 dakika arasında tur için buz üzerinde tutun.
  3. Deterjan [Örneğin, % 2 w/v sol-grade n-Lauryl-β-D-Maltopyranoside (demir)] lysate hücreye ekleyin. 20 ° C'de membran proteinlerinin ayıklamak için 1 h için ajitasyon ile kuluçkaya.
    Not: Deterjan türü her protein hedef18,24için optimize edilmiş olması gerekir.
  4. Bir ultracentrifuge 4 ° c için 1 h 150.000 x g, santrifüj kapasitesi.
    Not: Aşağıdaki adımları 4 ° C'de gerçekleştirilir
  5. Açik Hücre lysate ve bunun üzerinden 5 mL O'nun tuzak Ni2 +- NTA benzeşme sütun ile tampon (Tablo 1) önceden equilibrated akış toplamak.
    Not: Santrifüjü sonra Açik Hücre lysate Pelet alt ve üst bulutlu bir katmanda arasında sıkışmış. 10 mL transfer damlalıklı dikkatle net lysate toplamak ve sonra 1 mL damlalıklı son birkaç lysate mililitre geçmek için kullanın. Ni2 + sütun yapışmasına neden olabilir Pelet kaçının; Ancak, küçük bir miktar üst tabaka yolunda veya 1,5 mikron filtre ile filtre uygulanabilir.
  6. Sütun arabelleği B 25 mL ve sonra arabellek C 40 mL ile yıkayın (Tablo 2 ve 3, sırasıyla).
    Not: Bu gibi toplam arıtma en fazla 12 saat sürebilir ve protein gecede sütuna bağlı iken kararlı kalabilir bir ara vermem için iyi bir yer olduğunu.
  7. Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi için sütun ekleyin ve protein arabelleği D 13 mL ile sütun (Tablo 3) ayırma ile elute. UV absorbans okuma göre protein zenginleştirilmiş kesirleri toplamak.
    Not: FPLC koşulları aşağıdaki gibidir: 1.0 mL kesir boyutu, bir ön sütun basınç alarm 0,3 MPa ve bir akış hızı 0.5 mL/dk için ayarlanmış.
  8. Microvolume spektrofotometre eluted protein ürün konsantrasyon ölçmek. 280 absorbans okumak nm.
  9. (İsteğe bağlı) GFP-10xHis etiketi kaldırmak için 1:1 yığın oran TEV proteaz ekleyin ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Etiketi olabilir veya işlev veya saf kanal yapısını etkileyen değil. Birim ve adımları 3.7-3,8 toplanan protein konsantrasyonu TEV tutarı hesaplamak. Örneğin, elüsyon ürün 10 mL toplanan ve 0.1 mg/mL, toplam protein ölçülen kütlesi olduğunu TEV 10 x 0,1 = 1 mg ve 1 mg sindirim için kullanılacak.
  10. Protein (50 ya da 100 kDa) 15 mL santrifüj ile konsantre filtre birimi tarafından 4.000 x g 4 ° c (için FPLC bir 2 mL örnek yükleme döngü) 400-500 μL son hacmiyle de iplik.
    Not: Konsantrasyon için centrifuging zaman konsantrasyon ve protein büyüklüğüne bağlı olarak değişir. Aşırı konsantre önlemek için hangi protein yağış neden olabilir, spin için ilk başta, 10 dk sonra kalan birim gözlemlemek ve tahmin bir sonraki tur time (Örneğin, 2-5 dk), ve benzeri, son hacim elde edilir. Damlalıklı filtre altına çekti protein dağıtmak için spin arasında.
  11. Yeni 1,5 mL tüp ve herhangi bir çökelti veya baloncuklar konsantre ürün kaldırmak için yoğun protein aktarın. At spin > 12.000 x g 5-10 dk 4 ° C ve süpernatant yeni 1,5 mL tüp içinde toplamak için.
  12. 1 mL şırınga ve bir FPLC sistemde yuvarlak uçlu iğne niyetine boyutu-dışlama kromatografi ile nihai ürün ile tampon E (Tablo 5) önceden dengelenmiş boyutu-dışlama sütun yükleyin.
    Not: FPLC koşulları aşağıdaki gibidir: 0.5 mL kesir boyutu, bir ön sütun basınç alarm 2.50 MPa için ayarlanmış, bir akış birim arabelleği E 30 mL (Tablo 5), ve bir akış hızı 0.5 mL/dk için ayarlayın.
  13. Su kuyusu-davranmak proteinler bir tek uç aynı derecede (Şekil 2A) çalıştırmak ve toplamak için bu zirve (Şekil 2A) karşılık gelen protein fraction(s) dikkat edin.
  14. 4 mL veya 0.5 mL santrifüj filtre birimi (aynı molekül ağırlığı kesme adım 3.10 olduğu gibi) ve 4000 x g 4 ° c 5-10 μg/μL son bir konsantrasyon ile spin ile protein konsantre. Spektrofotometre nihai ürün konsantrasyon (adım 3.8) denetlemek için kullanın.
    Not: nihai ürün birim arıtma denemeler arasında farklı olabilir Santrifüjü zaman, farklı olmadığı sürece. Genellikle, aralıklarla 10-20 dakika sürer. Bu filtre altına çekti protein dağıtmak için spin arasında damlalıklı önerilir.
  15. Yoğun protein yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Herhangi bir çökelti, centrifuging tarafından Kaldır > 12.000 x g 4 ° C'de 5-10 dk Süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. -80 ° C'de 10 μL aliquots muhafazası için yapın ve bir 4-%15 degrade SDS-sayfa jel 9 V/cm (Şekil 2B) çalıştırmak için bir 2-5 μL küçük aliquot kaydedin.
  16. Kütle spektrometresi8tarafından saf protein kimliğini onaylayın.
    Not: Vitro analiz fonksiyonu ve saf protein yapısını düzlemsel lipid bilayer ve x-ışını kristalografisi, sırasıyla5,8gerçekleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Geçici transfected yapışkanlı HEK293 hücrelerinde (Şekil 1A) Floresan yoğunluğu öngörülen protein ifade düzey süspansiyon HEK293-F hücrelerdeki (Şekil 1B) için iyi bir göstergedir. Hedef protein iyi ifade veya HEK293 hücrelerde sonra geçici transfection yanlış yerelleştirilmiştir değilse, bu ifade yapısı değiştirme göz önünde bulundurun için tavsiye edilir (Örn., GFP etiket konumunu değiştirme veya mutasyon/truncations yapma hedef protein üzerinde). Küçük HEK293-F süspansiyon kültürler (Örneğin, 25 mL kültürleri) protein ifade, aralarında enfeksiyon MOI ve sıcaklık kültürü çalışmalarının en önemli önceki deneyimleri olmuştur koşullarını optimize etmek için kullanılır.

Başarılı bir saflaştırma beklenen elüsyon birimin boyutu-dışlama Kromatografi (Şekil 2A) ve tek bir baskın bant denatüre SDS-sayfa jel (Şekil 2B) üzerinde tek bir ana zirvesinde simgesiyle gösterilir. Birden çok doruklarına boyutu-dışlama Kromatografi içinde görünüyorsa, her tepe toplamak ve hangi tepe fonksiyonel kanal pentamers içeren belirlemek için yerel bir jel çalıştırmak önemlidir. Bu iki protein yapıları arasında ifade düzey belirtilen hasat zamanında floresan yoğunluğu tarafından değil nesessarily son verim ile ilişkilendirmek yok her protein yapısı farklı arıtma sırasında davranır gibi olması gerekmektedir. Su kuyusu-davranmak bestrophin protein için 200-500 µg nihai arıtılmış ürünün genellikle 1 L HEK293-F süspansiyon hücre elde edilebilir.

Figure 1
Şekil 1: ifade bir memeli bestrophin protein. GFP öğesini memeli bestrophin mikroskobik görüntülerini (A) yapışkan HEK293 hücrelerde plazmid transfection tarafından ve (B) süspansiyon HEK293F hücre baculovirus enfeksiyon tarafından ifade. Solda = yeşil floresans; Şu alanda parlak =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: bir memeli bestrophin protein saflaştırma. (A) GFP öğesini proteinler benzeşme saf bir boyutu dışlama jel-filtrasyon sütun üzerinde bir ana uç aynı derecede koştu. Kesik çizgiler arasında kesirler toplanmıştır. (B) SDS-sayfa jel merdivenler (sol sütun) ile son protein ürünü araştırdım. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktif MW 1 L başına miktar Son
HEPES 238.3 11.9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
Gliserol 92.09 50 mL %5 (v/v)
İmidazole 68.1 1.3616 g 20 mM
MgCl2 203 0.20331 g 1 mM
Tris(2-carboxyethyl) fosfamin 287 2,5 mL 200 mM hisse senedi 0,5 mM

Tablo 1: Protein Saflaştırma tampon (Resuspension tampon)

Reaktif MW 1 L başına miktar Son
HEPES 238.3 11.9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
Gliserol 92.09 50 mL %5 (v/v)
İmidazole 68.1 2.7232 g 40 mM
MgCl2 203 1.01655 g 5 mM
Tris(2-carboxyethyl) fosfamin 287 0.5 mL 200 mM hisse senedi 0,1 mM
DEMİR (anagrade) 510.6 0,5 g %0,05 (w/v)

Tablo 2: Protein Saflaştırma arabellek B (önce yıkayın arabellek)

Reaktif MW 1 L başına miktar Son
HEPES 238.3 5,95 g 25 mM
NaCl 58.44 29.2 g 500 mM
Gliserol 92.09 50 mL %5 (v/v)
İmidazole 68.1 5,1 g 75 mM
Tris(2-carboxyethyl) fosfamin 287 0.5 mL 200 mM hisse senedi 0,1 mM
DEMİR (anagrade) 510.6 0,5 g %0,05 (w/v)

Tablo 3: Protein Saflaştırma arabellek C (ikinci yıkama arabellek)

Reaktif MW 1 L başına miktar Son
HEPES 238.3 7,74 g 32.5 mM
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
Gliserol 92.09 25 mL %2.5 (v/v)
İmidazole 68.1 17,02 g 250 mM
Tris(2-carboxyethyl) fosfamin 287 0.5 mL 200 mM hisse senedi 0,1 mM
DEMİR (anagrade) 510.6 0,5 g %0,05 (w/v)

Tablo 4: Protein Saflaştırma arabellek D (elüsyon arabellek)

Reaktif MW 1 L başına miktar Son
HEPES 238.3 9,53 g 40 mM
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
Tris(2-carboxyethyl) fosfamin 287 0.5 mL 200 mM hisse senedi 0,1 mM
DEMİR (anagrade) 510.6 0,5 g %0,05 (w/v)

Tablo 5: Protein Saflaştırma arabellek E (jel filtrasyon arabellek)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iletişim kuralı ifade ve gelecekteki vitro analizler için kullanılmak üzere memeli bestrophin iyon kanalları arınma için yararlı bir potansiyel açıklar. FPLC aygıt boyutu-dışlama kromatografi için gerekli olmakla birlikte, bir şırınga pompa benzeşme Kromatografi bağlama, yıkama ve eluting de dahil olmak üzere tüm adımları için yeterli olur. Bir şırınga pompa itme çözümlerinde (şırınga) üzerinden sütun için kullanırken, hava kabarcıkları sütuna iterek önlemek için bahar yan altına koymak için önemlidir. Benzeşme Kromatografi sonra protein saflığı zaten sonraki deneyler için yeterliyse, FPLC aygıt tüm gerekli olmayabilir böylece boyutu-dışlama Kromatografi atlanabilir.

Yaklaşık 2 hafta baculoviruses pBacMam plazmid üzerinden yapmak gerekirse, verimliliği artırmak için su kuyusu-davranmak protein homologs için bir başlangıç ekranı geçici transfected HEK293 hücre hasat tarafından yürütülen olabilir (Örn., 60 mm çanak üzerinden) ve test ne kadar protein ilgi ifade (GFP öğesini) deterjanlar (Örneğin, DDM) ile floresan-algılama boyutu-dışlama Kromatografi (FSEC)18,24davranır. Transfected HEK293 hücreleri ve iyi monodispersity ve FSEC istikrardır güçlü floresans görüntülemek protein yapıları odaklanmak için en verimli değil.

Protein arıtma verimini artırmak için çeşitli öneriler vardır. İlk olarak, TEV sindirim için koşullar her protein için optimize edilmiş olması gerekir. Bu protein TEV kitle oranları (Örneğin, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 ve 1:10) bir dizi test ve (Örneğin, 0,5 h, 1 h, 2 h, 5 s ve gecede) kuluçka tarafından yapılabilir. Sonra bölünme etkinliğini denetlemek için bir SDS-sayfa tedavi örneklerinde jel çalıştırmak için önerilmektedir. Buna ek olarak, herhangi bir santrifüj süpernatant veya eluent sızıntı dışarı FPLC veya şırınga bağlantıları izin önemlidir. Benzer şekilde, kabarcıklar yoğun protein pipetting önlemek önemlidir.

Lipid bilayer, x-ışını kristalografisi, cryo-elektron mikroskobu, spektroskopi ve yüksek işlem hacmi8,25 eleme proteinler Bu protokolden yararlanmak çeşitli sonraki vitro analiz yordamlar içerir , 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu proje NIH hibe EY025290, GM127652 ve Rochester başlangıç finansman Üniversitesi tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88, (2), 639-672 (2008).
  2. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97, (23), 12758-12763 (2000).
  3. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7, (9), 1517-1525 (1998).
  4. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19, (3), 241-247 (1998).
  5. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
  6. Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278, (42), 41114-41125 (2003).
  7. Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516, (7530), 213-218 (2014).
  8. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346, (6207), 355-359 (2014).
  9. Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. (2017).
  10. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104, (6), 449-453 (1999).
  11. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82, (1), 19-31 (2008).
  12. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85, (5), 581-592 (2009).
  13. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8, (4), 286-292 (2000).
  14. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (10), 3683-3689 (2004).
  15. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23, (12), 1805-1809 (2015).
  16. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  17. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, (5), 567-575 (2005).
  18. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9, (11), 2574-2585 (2014).
  19. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
  20. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111, (51), 18213-18218 (2014).
  21. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7, (5), e37079 (2012).
  22. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3, (12), 795-804 (2007).
  23. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588, (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  24. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, (4), 673-681 (2006).
  25. Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
  26. Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173, (9), 2307-2322 (2017).
İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).More

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter