Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837

ERRATUM NOTICE

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

Abstract

שיטה זו מספקת גישה מהירה על הקביעה של קרום פלזמה חלוקת כל מתויג fluorescently שמעניינת קשורה חלבון באמצעות הפרופילים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית על פני קרום פלזמה. קרינה פלואורסצנטית נמדד פרופילים מצוידים על ידי מודל עבור ממברנה והפצה פלורסצנטיות הציטופלסמה לאורך קו שהוחל בניצב הפריפריה התא. מודל זה נבנה מתוך הערכים עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים הפניה לבטא סמן מתויג fluorescently הציטופלסמה ועם קרום פלזמה 4-64-שכותרתו ' FM. השיטה שניתן להחיל על סוגי תאים שונים, אורגניזמים; עם זאת, ניתן להעריך רק ממברנות פלזמה של תאים שאינם סמוכים. בשיטה זו מבוסס מיקרוסקופיה מהר מתאימה עבור ניסויים, שבה צפויים שינויים עדינים ולא דינמי של קרום פלזמה-הקשורים סמני ו צורך ניתן לכמת, לדוגמא, בניתוח של גירסאות מוטציה של חלבונים, מעכב טיפולים, האות התמרה חושית תצפיות. השיטה מיושמת בחבילה R בפלטפורמות כי זה משולב עם מאקרו של ImageJ המשמשת ממשק ידידותי למשתמש.

Introduction

באופן עקיף-הקשורים פלזמה-הממברנה חלבונים הם המרכיבים העיקריים של התא איתות המסלולים. אחד התפקידים הבסיסיים שלהם הוא שלהם האגודה קרום פלזמה ארעי, דיסוציאציה, וזה חשוב עבור אותות בין קרום פלזמה לבין הציטופלסמה. יכול להיות מצורף באופן עקיף-הקשורים קרום פלזמה חלבונים על קרום פלזמה השומנים עוגנים (N-myristoylation, S-acylation או prenylation) או על ידי השומנים מחייב תחומים (אינטראקציה עם מלחי phosphatidylinositol, חומצה phosphatidic, וכו).

קרום פלזמה מחייב מאפיינים של חלבונים אלה יכול להיות בדק ויוו, למשל, כאשר חלבון מתויג fluorescently שינה מוטגנזה של חומצות אמינו מפתח, או כאשר הוא מטופל עם מעכבי שונים המשפיעים השומנים איתות. חלוקות של חלבוני ממברנה פלזמה פריפריאלי בעיקר להיות מוערכים איכותית, במיוחד במקרים, כאשר חלוקה מחדש חלבון הוא ברור. השיטה הציג היא אופטימלית במצבים כאשר חלוקה מחדש של חלבון זה רק חלקי הערכה כמותית הוא הכרחי. בגישה בשימוש תכוף של מתי קרום פלזמה האגודה מוערך מן קונאפוקלית לייזר סריקה תמונות מיקרוסקופ כמו יחס של עוצמות קרינה פלואורסצנטית קרום הפלזמה, הציטופלסמה1,2, הוא פשוט, אבל לא . זה מדויק עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב קרום פלזמה משקפים צירוף לינארי של קרום פלזמה, הציטופלסמה האות בשל תכונת עקיפה אור טכניקה מיקרוסקופית פלורסצנטיות מסוים של רכיבים אופטיים בשימוש3. כתוצאה מכך, האות cytoplasmic כלולה גם באיזור הממברנה. מסיבה זו, דפוס מכתימים FM 4-64 לא ניתן להשתמש כמסיכה עבור בחירת אות4ממברנה. יתר על כן, מדידות פשוטות של קרום אות במיקום המוגדר על-ידי FM 4-64 מכתים המרבי תמיד באופן שיטתי מגזים האות קרום פלזמה האמיתי של חלבון קרום פלזמה הקשורים באופן עקיף כתוצאה הסופרפוזיציה של ממברנה, cytoplasmic המתחם. המרבי של אותות שנצפה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף גם לא לשפה משותפת עם המרבי של דה מרקר קרום פלזמה (קרי, FM 4-64 styryl צבע), אבל הוא זז לכיוון הציטופלסמה. מגבלה נוספת היא מבוססת על העובדה FM שיא פליטת 4-64 היא רחבה יותר בהשוואה הפסגות פליטה ירוק ניאון חלבונים כמו GFP בשל אורך גל-התלות של שבירת אור3.

השיטה המתוארת כאן, האות חלבון מתויג מולבשת על ידי שתי פונקציות אמפירי המתארת את התפלגות היפותטי של קרום פלזמה ו אות ציטופלזמה, בהתאמה. זה פירוק האות מוחל על פרופילים פלורסצנטיות ליניארי שניתן להחיל על פני השטח תא בניצב קרום פלזמה בתמונות המקור, אשר רגיל, שני ערוצים מקטעים קונאפוקלית מתויג fluorescently חלבון להביע תאים עם FM 4-64 צבע תוויות.

הפונקציה הראשונה המשמש למדידות מתאר דיפרקציה של אות הציטופלסמה בקצה התא. קבלתו של פרופילי פלורסצנטיות שנרכשו בעבר נמדדו בתאים המבטאים סימן הפרוטאין. ציטופלזמה שתייגת על ידי כרומופור אותו כמו החלבון הקשורים באופן עקיף קרום פלזמה עניין. הפונקציה השנייה המתארת דיפרקציה של אות קרום פלזמה נגזרת של זריחה של FM 4-64. האות הזה מוערכת ראשית באמצעות פונקציה לפי עקומת גאוס אשר נמצא בשימוש עבור מידול משוער של אור עקיפה של המקור. שנית, מודל זה, חוקי עבור פליטת FM 4-64 אדום, מבחינה מתמטית כשהופכים את הטופס הרלוונטי עבור אורך גל פליטה של כרומופור להשתמש בתיוג של חלבונים הקשורים באופן עקיף של עניין-קרום פלזמה. שתי הפונקציות הן מנורמל עוצמת מירבית ועל ידי הממוצע מ 10% של הערכים הגבוהים ביותר עבור אות FM 4-64 ו אות cytoplasmic חלבון, בהתאמה. על ידי פירוק זה האות (שיטת המדידה מרובע לפחות לא לינאריות), היחס של קרום פלזמה לבין השבר הציטופלסמה של החלבון שנבדקו יכול להיות מוערך בקלות ובדייקנות. הממד ממשית של מקדם חלוקה למחיצות מחושב הוא בטווח של מיקרומטר, כי ריכוז עוצמה cytoplasmic מושווה ריכוז משטח על קרום פלזמה. הוא מגדיר את המרחק של קרום פלזמה אל הציטופלסמה, שבתוכו כמות זהה של חלבונים הוא מקומי כמו האזור הסמוך של קרום פלזמה. ערך זה שווה למחיצות המקדם K2 הציגה בעבר5. השיטה מהירה מאוד, הדורש יחיד רק מקטעים קונאפוקלית רכשה באמצעות סריקת מיקרוסקופ, לייזר קונפוקלי שגרתית, זה לא דורש שהמפתחות. הליבה ניתוח יושמה במארז נייד R ונכתב מאקרו נוספות של ImageJ כדי לספק ממשק משתמש גרפי להפעיל הניתוח של תיבות הדו-שיח אינטואיטיבי. תיאור מפורט יותר של השיטה ותוכנה (פורסם קודם לכן6) ניתן למצוא ב- http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

השיטה מתאימה תאים בודדים, protoplasts, רקמות, איפה קרום פלזמה של תאים בודדים ניתן להבחנה ברורה, המבטאת מבנה מתויג fluorescently של בדק חלבונים הקשורים באופן עקיף. כרומופור תואמת ל- FM צביעת 4-64 יש להשתמש. FM 4-64 פולט פלואורסצנטי אדום; לכן, יכול להיות מתויגת חלבון שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית חלבון עם כחול, ירוק או צהוב פליטה (למשל, ה-GFP, CFP, YFP). שינוי יציב של חומר ביולוגי מומלץ מכיוון שהיא מאפשרת תצפיות ומלאכותית יותר לשחזור פחות חלבון הפצה. זה הכרחי כי החלבון שנבדקו יש התפלגות cytoplasmic יחסית הומוגנית. הלוקליזציה של חלבון את רשתית תוך-פלזמית או אחר תאיים קרום התא יכול לייצר תוצאות מלאכותי.

בנוסף, יש להשתמש באותו חומר ביולוגי לבטא סמן cytoplasmic עבור ההשוואה. תאים יכול להיהפך של chomophore חינם (זהה לזה המשמש חלבון היקפיים תיוג, למשל, ה-GFP חינם) או על ידי חלבון מתויג עניין עם קיבולת איגוד ביטל ממברנה. ממברנה איגוד קיבולת שאפשר לבטל, לדוגמה, על-ידי חיתוך של התחום מחייב ממברנה או מוטגנזה של חומצת אמינו מפתח residua (למשל, אתרים עבור N-myristoylation, S-acylation, או prenylation, וכו ').

עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקה, יש ליצור תאים על-ידי סמן קרום כמו צבען FM 4-64. אם FM 4-64 מכתים אינו מתאים חומר לימודי (עקב autofluorescence מפריעות, צבע עניים חדירה, וכו '), קרום פלזמה ניתן שכותרתו, לדוגמה, על ידי חלבון ממברנלי אינטגרלי פלזמה מתויג כדי (chomophore המתאים mCherry, RFP, וכדומה). זה חיוני כי דה מרקר יש לוקליזציה זניח בתאים ממברנה תאיים (endomembranes).

אם עובדים עם נוגדנים ודוגמאות קבוע, שניתן לתקן אנלוגי FM 4-64FX או קרום פלזמה תיוג על ידי נוגדנים נגד מטרה המתאים יכול לשמש. במקרה זה, זה חיוני כדי להעריך את התוצאות בזהירות רבה כי קיבוע הליכים יכול להוביל לאובדן סלקטיבי של חלבונים הציטופלסמה והן קרום פלזמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חומר ביולוגי

  1. להכין חומר ביולוגי לבטא את החלבון מתויגות fluorescently של עניין, כמו גם סמן cytoplasmic. בצע את ההליכים שצוין במבוא.

2. סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי

  1. כתם החומר מוכן בסעיף 1 עם FM 4-64 לצבוע7.
    1. החל פרוטוקול מכתימים המתאים עבור חומר לימודי. עבור טבק ב- 2 תאים, כתם μL 200 של השעיה תא עם 0.2 μL 10 מ מ FM 4-64 פתרון ב- dimethylsulfoxide.
      הערה: הריכוז מכתימים טיפוסי של FM צבע 4-64 עוסק μM 10 באמצעות 10 מ מ פתרון מניות ב- dimethylsulfoxide. לשימוש אפשרי הריכוז הנמוך ביותר של FM 4-64 מכתים נאותה, לא דגירה תאים על קרח (FM 4-64, טמפרטורה נמוכה יכול להשפיע על מאפייני קרום פלזמה). להמשיך עם התבוננות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מיד. המרווח בין ההכתמה ורכישת תמונות לא צריך להיות יותר מ 10 דקות; אחרת, אנדוציטוזה של לצבוע ישפיעו FM צביעת 4-64.
    2. לעבד מספר דגימות ברצף, אינו מכתים כל הדגימות בתחילת הניסוי.
  2. ללכוד מקטע קונאפוקלית המשוונית אחד לכל תא אחד.
    1. הגדר סריקתה בשני ערוצים רציפים עבור כרומופור משמש את תג חלבון (חייב להיות בערוץ הראשון) ו- FM 4-64 (חייב להיות בערוץ השני). הגדר רזולוציה אופטית גבוהה יותר (10 – 20 px/μm). הגדרת דוגמה: 63 X שמן גודל תמונה אובייקטיבית, נה 1.3, טבילה 1,024 x 1,024 px. ודא כי המטוס קרום פלזמה בניצב למישור קונפוקלי. באזור של תמונות נרכשות.
    2. לכידת לפחות 20 תאים עבור דגימה יש מספיק מידע על הערכה סטטיסטיקה (תלוי השונות האות חומר מעובד).

3. התקנת תוכנה נדרשים

  1. להתקין הפצה פיג'י ImageJ8ואת המאקרו הדרוש היקפיים.
    1. להוריד תוכנה https://fiji.sc/#download האתר ולאחר להתקינם על-ידי לפרוק.
    2. התחל פיג'י באמצעות לחיצה כפולה על קובץ ה-"ImageJ(.exe)" ספריה "Fiji.app" אריזתם.
    3. הורד מאקרו "הפריפריה" מאתר הבא:
      http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm.
    4. פיג'י, בחר תוספים | פקודות מאקרו | להתקין... בתפריט הראשי, לציין את הנתיב אל הקובץ שהורדת "Peripheral_.ijm."
      הערה: שני כלים חדשים של המאקרו המותקנות "ההיקפית" יופיע בסרגל הכלים פיג'י: "קח פרופיל כלי" ו- "תפריט היקפיים של חלבון."
  2. להתקין את התוכנה R-פרוייקט9ו חבילות הנדרש.
    1. בצע את ההוראות שעל https://cloud.r-project.org/ האתר להתקנה R-פרוייקט.
      הערה: הניתוח הכולל יבוצעו בפיג'י. התוכנה R ייקרא רק באופן פנימי על-ידי המאקרו פיג'י "הפריפריה" במהלך חישוב.
    2. הפעל R GUI, בחר חבילות | התקנת חבילות... בתפריט הראשי, וציין את מאגר הקרובה ואת חבילת "ggplot2" עבור ההתקנה.
      הערה: לחלופין, הקלד את שורת ה-R: install.packages("ggplot2").
    3. הורדה חבילת R היקפיים מהיעד: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. להתקין אותם על-ידי בחירת חבילות | להתקין את החבילות קבצים מקומיים..
      הערה: לחלופין, הקלד את ה-R של שורת הפקודה פקודה זו בלבד:
      install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", ריפו = NULL, סוג = "מקור").

4. תמונות ניתוח בפיג'י

  1. לעבד את התמונות קונאפוקלית של דה מרקר cytoplasmic.
    1. לייבא את התמונות לפיג'י באמצעות תוספים | ביו-תבניות | יבואן ביו-תבניות ' מתפריט ' פיג'י עם הגדרות ברירת מחדל.
    2. בדוק אם היבואן ביו-תבניות יזוהו כהלכה את כיול התמונה. הממד התמונות המוצגות בחלון התמונה שדה מידע השמאלי העליון חייב להיות שווה למידות התמונה המקורית.
    3. פינוק מכוילים באופן לא תקין תמונות עם שגוי ממדים בנפרד, למשלעל-ידי הגדרת הפרמטרים הנכונים בחלון שיח נתח | להגדיר... מתוך התפריט פיג'י: למלא את רוחב התמונה בפיקסלים לתוך השדה מרחק בפיקסלים ואת רוחב האמיתית ביחידה אורך המתאים לשדה ידוע מרחק ).
      הערה: אם הקבצים לייקה השנתיים ליי מכוילים כהלכה, בצע את שלב 4.2.1.
  2. הפעל את ייבוא אפשרויות מאקרו עבור הקמה ניתוח. להפעיל את המאקרו על-ידי אחד בשלוש דרכים שונות: בחר תוספים | פקודות מאקרו | ייבוא אפשרויות [f1] פיג'י בתפריט הראשי, בחר אותו פריט לאחר לחיצה על הכלי תפריט תפריט חלבון היקפיים, או הקש על המקשים קיצור F1. להגדיר את הפרמטר בחלון דו-שיח שהופעל מאקרו.
    1. במקרה של הפורמט לייקה השנתיים ליי, לפתור כיול לקוי על ידי הפעלת Leica.lei תמונות תיבות סימון. אפשרות זו מייבאת כראוי על מידות התמונה מתוך הקובץ עם הסיומת "ליי".
    2. הגדר את הערך המתאים בשדה Gaussian blur רדיוס (px). זה משפיע על התמונות החלקת הפחתת רעש. ערך נמוך (1 px) מספיקה, אינו גורם אובדן מידע התמונה.
    3. הגדר ערך בשדה פרופיל רוחב הקו (px). קו עבה יותר גורם להחלקה גבוהה יותר של עקומות פרופיל. ערך ברירת מחדל 10 מומלץ px.
    4. להגדיר כותרת התמונה של ניתוח על ידי הגדרה "מפרידים מדגם" ו- "פריטים לייצאם."
      הערה: כותרת התמונה (שם הקובץ ללא סיומת, למשל: "ניסוי-1_line-02_cell-11") תתחלק סביב כל התווים המופיעים השדה "מפרידים מדגם" (למשל: "-_") לתוך קבוצה של פריטים ("ניסוי", "1"," קו","02","תא"ו-"11") זה יכול לשמש קיבוץ גורמים (לדוגמה, תא, שורה או טיפול זהות) הניתוח הבא. להגדיר אילו פריטים ייעשה שימוש על-ידי הקלדת מספר רצף שלהם ("0" עבור הפריט הראשון) לתוך הקטגוריות "לייצא פריטים". השתמש תבנית מופרדת, למשל, "3 5." בדוגמה זו, הפריטים "02" ו- "11" יטופלו כמו קיבוץ גורמים בשם "Fac_0" ו- "Fac_1". בנוסף, זהותו של כל אחת מהמידות יטופלו כמו "אני" פקטור.
    5. לחלופין, לשמור את הדגימה מפרידים ריק ולהיכנס 0 פריטים לייצאם אם הכותרת תמונה מלאה עשויות להישמר.
    6. על מערכת ההפעלה Windows, בדוק אם הנתיב אל התוכנה R יהיה כראוי מזוהה אוטומטית בשדה הנתיב אל R.exe. אחרת, לציין את הנתיב המלא לקובץ ה-R.exe במערכת (למשל, "C:\Program Files\R\bin\R.exe").
    7. לחץ על אישור. בדוק את הכותרת של ניתוח בחלון דו-שיח הבא ולחץ על אישור או בחזרה לאפס.
      הערה: כל התמונות באופן אוטומטי החליק, חותמת בסופו של דבר. רשימה של גורמים קיבוץ כל מיוצאים יוצג בחלון תוצאות.
  3. לבצע בחירה ליניארי ברחבי האזור קרום פלזמה של תמונות מעובד ולמדוד את הפרופילים זריחה.
    1. בחרו בכלי פיג'י קו ישר מסרגל הכלים פיג'י. לחץ על התמונה, גרור קו ברחבי האזור קרום פלזמה. הקו חייב להתחיל בחלל חוץ-תאית, צריך להיות בניצב קרום פלזמה. בחר אזורים עם שכבה עבה ולא הומוגנית של הציטופלסמה קורטיקלית. האורך האופטימלי של הבחירה לינארית היא 5-10 μm.
    2. הפעל את לקחת פרופיל מאקרו בשיטה אנלוגית כמו השלב 4.2 (קיצור "x") או על-ידי לחיצה על לקחת פרופיל הכלי בסרגל הכלים פיג'י. המדד אוטומטית של קרינה פלואורסצנטית פרופילים בשני ערוצים, יבוצעו ואת הנתונים יוצגו בחלון תוצאות.
    3. אם שימוש במקש "x" נחשבת user-unfriendly, פתח את קובץ המקור של מאקרו Peripheral_.ijm בעורך טקסט, להחליף את הסמל "x" בשורה "מאקרו"לקחת פרופיל [x]"{' עם סמל יותר (כי לא נעשה שימוש בסביבה פיג'י כמו המקלדת הפעילה קיצור) ולשמור את הקובץ. התקן מחדש את המאקרו (שלב 3.1.4) ולהתחיל את הניתוח ייבא תמונה.
    4. לפי השתנות אות בודדת, קח את המספרים נציג של הפרופילים עבור כל תא.
    5. לשמור את הנתונים באמצעות קובץ | שמירה בשם.. תמיד השתמש בסיומת "csv"; זה הכרחי עבור תבנית הנתונים המתאימים.
  4. הפעל את העלילה פרופיל נתוני מאקרו (קיצור F5) עבור הדמיה גרפית של הפרופילים נמדד. להגדיר את הפרמטר בחלון דו-שיח שהופעל מאקרו.
    1. להשאיר את תיבת הסימון שימוש סינון עבור נתוני קלט? שלא נבחרו.
    2. ציין אם העלילה צריכה להיווצר מתוך נתונים עדכניים בחלון ' תוצאות ', מקובץ CSV יחיד או של כל קבצי CSV בספריה שצוינה על-ידי לחיצה על לחצן האפשרויות המתאים.
      הערה: אם העלילה נוצר מן התוצאות האחרונות, הנתונים יישמרו קודם (הדו-שיחשמירה בשם. באופן אוטומטי יופעל).
    3. ציין אילו גורמים קיבוץ ישמש את התווית על-ידי בחירה בתיבות הסימון המתאימות. בחר את הגורם "אני" אם כל הפרופילים תוצג במגרשים ייחודי. לשמור את תיבות הסימון מסומנת, אם כל הנתונים עליו על-ידי ההתוויה של חלקה אחת.
      התראה: בחירה של הקיבוץ גורם שאינו קיים בתוצאות מעובד גורם לשגיאה במהלך יצירת עלילה.
    4. ציין את שם הקובץ בעת שמירת מגרש בשטח קידומת קובץ הפלט ולהגדיר את העלילה מידות התמונה בקבצי מגרש גבוה ו רוחב מגרש.
      הערה: העלילה וכתוצאה מכך יישמרו בספריית מקור הנתונים כקובץ PNG.
    5. בחר פלט Pdf? תיבות סימון אם מסמך PDF נוספים פלט עלולה להיווצר.
    6. לחץ על אישור. ציין את הנתיב לשמירת התוצאות או בסופו של דבר עבור נתונים לייבא בחלון שיח הבאה. לאשר ניתוח על-ידי לחיצה על אישור בחלונות דו-שיח המציגה את הקוד R שבוצעו.
      הערה: העלילה תיפתח בחלון התמונה חדש, הפלט ניתוח R יפורטו בחלון הטקסט.
  5. הפעל פרופיל סינון הגדרת מאקרו (קיצור F2) אם כמה פרופילים המותווים יש אותות מופרז בחלל חוץ-תאית (עבור החלבון מתויג) או בחלל תאיים (לאות FM 4-64). פעל על-ידי הגדרת הפרמטרים בחלון דו-שיח שהופעל מאקרו.
    הערה: סינון מאפשרת הסרת מסכן פרופילים על פי הסף העוצמה המקסימלית המותרת ב קואורדינטות x שצוינו.
    1. בכל אחד מהערוצים, להגדיר הסף בעצימות המתאימה הקובץ להסיר מדידות עם אות מוגזמת (תאיים) חוץ-תאית. לציין את האזור שבו יוחל הסף עוצמת שדה ב קואורדינטות ה-x נמוך (גדול) מ.
    2. הפעל את העלילה פרופיל נתוני מאקרו (שלב 4.4) שוב עם תיבת הסימון שימוש סינון עבור נתוני קלט? נבחרת; ודא כי כל חריגה הפרופילים הוסרו בהצלחה. אחרת, לשפר את הפרמטרים סינון (שלב 4.5.1).
  6. הפעל את יצירת מודל מאקרו (קיצור F3) כדי ליצור מודל של קרום פלזמה והפצה הציטופלסמה פלורסצנטיות בהתבסס על נתוני כיול. פעל על-ידי הגדרת הפרמטרים בחלון דו-שיח שהופעל מאקרו.
    1. לציין אם נתוני הקלט להיות מסוננים (שלב 4.5) על-ידי בחירה שימוש סינון עבור נתוני קלט? תיבות סימון.
    2. לציין את נתוני המקור ה"הבדל כמו שלב 4.4.2.
    3. לציין מרווח שבו המודל ניתן לחזות לפי ההגדרה של "התחל", "end", ו "צעד" הערכים μm.
      הערה: כל המדידות פרופיל צריך להיות ארוך ממרווח הזמן שצוין.
    4. ציין עירור אורכי הגל של קרינה פלואורסצנטית maxima פליטה של הן שימוש, בשדות המתאימים. הגדר ברירות המחדל עבור GFP ו- FM שילוב 4-64.
      הערה: "GFP" מציינת את כרומופור המשמש החלבון תיוג (GFP, CFP, YFP, וכו '), "FM4" מציין את כרומופור המשמש קרום פלזמה מכתים (בדרך כלל 4-64 FM).
    5. לציין את השדה קידומת קובץ הפלט . הקידומת ישמש עבור שמירת מודל וכתוצאה מכך RData לקובץ ספריית מקור הנתונים.
    6. בחר את תיבת הסימון דגם מגרש? אם פלט גרפי נדרש. העלילה יישמרו את PNG וכן גם קובץ PDF אם פלט Pdf? נבחרה תיבת הסימון.
    7. לחץ על אישור. ציין את הקלט או פלט נתיבים בחלונות דו-שיח הבא ואשר הניתוח על-ידי לחיצה על OK בחלון דו-שיח המציג את הקוד R שבוצעו.
      הערה: חלקת modeled cytoplasmic ואת קרום תרכובת של זריחה חלבונים הקשורים שמעניינת יוצג בחלון התמונה החדשה, הפלט ניתוח R יפורטו בחלון הטקסט.
  7. לעבד את התמונות של התאים לבטא את החלבון עניין.
    1. לייבא את התמונות ה"הבדל כמו שלב 4.1.
    2. להגדיר את הניתוח ה"הבדל כמו שלב 4.2. החלקת וקו הרוחב צריכים להיות זהים.
    3. למדוד את הפרופילים ה"הבדל כמו שלב 4.3.
    4. בדוק את הדיוק של הפרופילים באמצעות התוויית (שלב 4.4) ולהגדיר את הסינון במידת הצורך (שלב 4.5).
  8. הפעל את חישוב התפלגות מאקרו (קיצור F4) עבור חישוב חלבון, מחיצות בין קרום פלזמה, בציטופלסמה. בצע את הגדרת הפרמטר בחלון דו-שיח שהופעל מאקרו.
    1. ה"הבדל עם השלב הקודם (שלב 4.4), ציין את מקור הנתונים, סינון, קידומת שם הקובץ.
    2. ציין אם מודל לחישוב ההתפלגות חלבון ייטענו חישוב מודל האחרון במופע האחרון של המאקרו "הפריפריה" בפיג'י (בחירת תיבות סימון אחרונים שהיו בשימוש תוצאות), או את הקובץ RData ( בחר בתיבת הסימון "מתוך קובץ").
    3. לשמור על תיבת הסימון להסיר תוצאות עם השתנות שיורית יותר מופעל אם סינון תוצאה רצויה. ציין את סף ההשתנות שיורית המותר המקסימלי אשר יכולים להיות מוסברים על ידי פירוק אות של המדידה פרופיל אישי. לדוגמה: הערך 0.200 מציין כי כל מדידה עם גבוה יותר מאשר 20% לא מוסברת השתנות ההשתנות הכולל של עוצמת קרינה פלואורסצנטית בפרופיל יימחקו.
    4. בחר מדגם קיבוץ גורמים, אשר יכול לשמש עבור תיבת-עלילת היצירה (שלב 4.4).
    5. להפעיל את תיבת הסימון פלט Pdf? שהצלת את תיבת-העלילה כקובץ PDF.
    6. לחץ על אישור, לציין את הקלט או פלט נתיבים, לאשר את הניתוח על ידי לחיצה על OK בחלון דו-שיח המציג את הקוד R שבוצעו.
      הערה: העלילה-התיבה של חלבונים הקשורים באופן עקיף מחיצות בין קרום פלזמה לבין הציטופלסמה יוצג בחלון התמונה חדש, הפלט ניתוח R יפורטו בחלון הטקסט.
    7. לעיבוד חיצוני, לשמור את התוצאות מוצגות בחלון תוצאות באמצעות קובץ | שמירה בשם. מתפריט ' חלון '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DREPP10 הוא חלבון צמחים ספציפיים הקשורים באופן עקיף-קרום פלזמה המשויך קרום פלזמה דרך של N-myristoylation יחד עם אינטראקציה אלקטרוסטטית עם מלחי phosphatidylinositol11, 12. DREPP תוארה רכיב של מכונות איתות הסידן בתא צמח ויפעל גם עם שלד התא13,14. בניסוי שהוצגו, הטבק פראי-סוג DREPP2, לגירסתו מוטנטים שאינם-myristoylated (Gly2 מוחלף על ידי Ala) היו מתויג GFP6 , שבאה לידי ביטוי טבק ב- 2 השעיה תאים15 תחת promotor 35S16CaMV. קרום פלזמה חלוקת חלבונים אלה נמדדו ב 3-מיושן (3 ימים לאחר דילול), FM 4-64-שכותרתו ' (8 מיקרומטר) תא תרבויות6 עם (איור 1 א') וללא (איור 1B) התוספת של phosphoinositide 3-קינאז מעכבי Wortmannin (10 מיקרומטר)17, לפי הפרוטוקול המתואר לעיל. הגירסה החתוך DREPP2(Δ1-23) חסר קרום פלזמה מחייב תחום6 שימש כסמן הציטופלסמה בניה דגם התפלגות קרינה פלואורסצנטית (איור 1C).

לחשב נתונים היו שורש טרנספורמציה (ערך חיובי המתאים לערך שלילי הנמוך ביותר נוספה לכל הנתונים כדי לאחזר נתונים חיוביים בלבד), הנתונים היו נבדק על ידי ANOVA דו-כיווני R9. השפעת הטיפול מוטציה והמעכב היו מאוד משמעותי (p < 2.2 x 10-16 * * *). כל הקבוצות הושוו על ידי במבחן Tukey HSD; כל הקבוצות שונה משמעותית למעט DREPP2 מטופלים על ידי Wortmannin ו- DREPP2(G2A) שאינם מטופלים (איור 1D).

תוצאות אלו מראות בבירור כי האגודה קרום פלזמה של טבק DREPP2 חלבון היא התוצאה של N-myristoylation ו אינטראקציה אלקטרוסטטית, אשר מתפקדים co-operatively. רק ההשפעה ההדדית של N-myristoylation אתר המוטציה וטיפול Wortmannin גרם דיסוציאציה מלאה של החלבון DREPP2 של קרום פלזמה. תוצאות אלה הם על פי נתונים שפורסמו בעבר6.

Figure 1
איור 1 : ההשפעה של המוטציה N-myristoylation האתר וטיפול Wortmannin על קרום פלזמה חלוקת קרום פלזמה הקשורים באופן עקיף חלבון DREPP, אשר מעורב של סידן איתות בתא צמח. (א) סעיפים קונאפוקלית המדיאלי של טבק ב- 2 תאים המבטאים את טופס פראי סוג DREPP2-GFP, החשבונאי טופס DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (ערוץ ירוק). תאים הודבקו תוויות עם FM צבע 4-64 (ערוץ מגנטה), סולם בר 10 מיקרומטר. (B) באותו קו תא טופלה ע י 10 מיקרומטר Wortmannin (WM). (ג) תאים המבטאים cytoplasmic סמן DREPP2(Δ1-23). (ד) קרום פלזמה מוערך למחיצות עבור כל הדגימות. המשמעות של שני אפקטים נבחנה ע י אנובה דו-כיווני (p < 2.2 x 10-16 * * * בשני המקרים; הנתונים המקוריים היו טרנספורמציה-שורש ריבועי). אותיות מציינים קבוצות שהן לא שונה באופן משמעותי מזו כפי שנקבע על ידי במבחן Tukey HSD. . שפם של תיבת-החלקות מצביעים על סמך 95%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן יוצר אומדן מדויק יותר של קרום פלזמה למחיצות חלבונים הקשורים באופן עקיף לעומת גישות אחרות מבוסס על מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית5. השיפור העיקרי של שיטה זו הוא כי זה לוקח בחשבון את שבירת האור ואת עקרון הסופרפוזיציה של קרום הפלזמה, את האותות cytoplasmic. למרות התוצאות האלה שיטת מתאם עם התוצאות של שיטה פשוטה המבוססת על ההשוואה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית במיקום קרום עם הממוצע cytoplasmic אות (כפי שמוצג בעבר6), היתרון העיקרי של שיטה זו הרומן היא הקביעה של ההשתנות שיורית (מוסברים על ידי פירוק אות) המאפשר את אומדן מידת הרלוונטיות של התוצאות, במיוחד שבו האות קרום פלזמה הוא נמוך יותר מאשר האות cytoplasmic. השיטה המתוארת גם היא איתנה יותר הרעש האות כי חישוב החלוקה למחיצות חלבון אינה מבוססת על נקודה אחת בלבד.

הניתוח דורש יחיד בשני ערוצים קונאפוקלית תמונות בלבד. בניגוד FRAP גישות18 על סמך מדידות של חלבון דינמיקה דיפוזיה בחלונות זמן ארוך יותר, השיטה המתוארת ישימה יותר דינמי ויוו גישות, בעת ייבוא תמונות מהיר היא דרישה קריטי ( למשל, אות התמרה חושית החקירות, מבחני מעכבות). השיטה מתאימה להשגת במהירות כמויות גדולות של נתונים מספיקים עבור הערכות סטטיסטיות.

השיטה היא מוגבלת רק קרום יחיד. הניתוח של אותות בין שני מקרוב סמוכים הממברנות של התאים הסמוכים כיום אינו נתמך. במקרה זה, ההתאמה אות היא תובענית יותר עם סיכון גבוה יותר של חפצים.

עם זאת, הניתוח תוכנן במקור עבור הצמח ההשעיה תאים15, זה עשוי להיות מיושם עבור ניתוחים של סוגי תאים אחרים גם כן. צינורות אבקה, שערות השורש מייצגות פוטנציאל טוב מאוד מטרות של שיטה זו של ביולוגית הצמח. חיצוני ממברנות של תאי אפידרמיס צמחים ניתן לנתח לאחר אימות הקודמת כי קירות התא לא מסומנים על ידי FM 4-64, לא מוצג autofluorescence מפריעות. פרוטיסטים תאים שנמצאים ללא autofluorescence מפריעות, תאי שמרים, פטריות תאים, כמו גם תאים בעלי חיים עם קרום פלזמה חלקה עשוי להיות מנותח באמצעות השיטה המתוארת; עם זאת, עבור תאים בעלי חיים הניתוח של חלבון הפצה בחוד החנית של פיברובלסטים או על הגבול מברשת של תאים אפיתל בלתי אפשרי עקב ההגדרות של ניתוח גמיש, FM 4-64 מכתים עשויים להיות מוחלפים על ידי ויזואליזציה של גישות אחרות קרום פלזמה, כגון fluorescently מתויגות חלבונים. בזהירות, השיטה יכול לשמש עבור תאים קבוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

פרויקט זה נתמך על ידי NPU, אני, LO1417 (משרד החינוך, נוער וספורט, של הרפובליקה הצ'כית).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FM 4-64 ThermoFisher Scientific T13320 Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 Sigma Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
  2. Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
  3. Kubitscheck, U. Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , John Wiley & Sons. (2013).
  4. Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
  5. Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
  6. Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
  7. Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  10. Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
  11. Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
  12. Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
  13. Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
  14. Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
  15. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
  16. Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
  17. Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
  18. Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 136 חלבון ממברנה פלזמה הקשורים באופן עקיף ממברנה זיקה ממברנה למחיצות מיקרוסקופיה קונפוקלית ImageJ R-פרוייקט FM 4-64 deconvolution

Erratum

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vosolsobě, S.,More

Vosolsobě, S., Schwarzerová, K., Petrášek, J. Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. J. Vis. Exp. (136), e57837, doi:10.3791/57837 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter