Biology

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837

Stanislav Vosolsobě¹, Kateřina Schwarzerová¹, Jan Petrášek¹

¹Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

ERRATUM NOTICE

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Summary

여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

Abstract

이 메서드는 원형질 막 어떤 붙일 태그가 주변 관련 단백질의 원형질 막에 걸쳐 형광 강도의 프로필을 사용 하 여 분할의 결정에 대 한 빠른 접근을 제공 합니다. 측정 된 형광 프로필 셀 주변에 수직으로 적용 하는 선 따라 막과 세포질 형광 분배 모델에 적합 하다. 이 모델은 FM 4 64 표시 된 원형질 막과 세포질 붙일 태그 마커를 표현 하는 참조 셀의 형광 강도 값에서 생성 됩니다. 다양 한 세포 유형 및 유기 체; 메서드를 적용할 수 있습니다. 그러나, 비 이웃 세포의 플라즈마 막만 평가할 수 있습니다. 이 빠른 현미경-기반 방법은 실험, 플라즈마 멤브레인 관련 마커의 미묘 하 고 동적 변화가 예상 된다 고 양이 정해질 필요가, 예를 들어, 억제제 치료 단백질의 돌연변이 체 버전의 분석에 적합 그리고 신호 변환 관측. 메서드는 사용자 친화적인 인터페이스 역할 ImageJ 매크로와 결합 된 멀티 플랫폼 R 패키지에 구현 됩니다.

Introduction

주변 관련 된 플라즈마 막 단백질은 세포 신호 통로의 주요 구성 요소. 그들의 과도 플라즈마 멤브레인 협회와 분리, 플라즈마 막과 세포질 사이 신호 변환에 대 한 중요 한 그들의 기본적인 역할 중 하나입니다. 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 지질 앵커 (N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation) 또는 지질 바인딩 도메인 (phosphatidylinositol 인산 염, phosphatidic 산, 와 상호 작용 하 여 원형질 막에 붙어 있을 수 있다 등).

이 단백질의 속성 수 플라즈마 멤브레인 바인딩 검사 vivo에서, 예를 들어, 붙일 태그가 단백질 핵심 아미노산의 사이트 감독 mutagenesis에 의해 수정 될 때 또는 때 그것에 영향을 미치는 다양 한 억제제 처리 됩니다. 지질 신호입니다. 주변 플라즈마 막 단백질의 분포는 주로 되 고 질적으로, 경우에 특히 때 평가 단백질 다시 메일은 분명 합니다. 제시 방법은 상황에 대 한 최적의 단백질 다시 배포만 부분 이며 양적 평가 필요한 때입니다. 플라즈마 멤브레인 협회 confocal에서 추정 되는 때 자주 사용된 접근 레이저 스캐닝 현미경 이미지의 원형질 막에 및 세포질¹^,², 형광 강렬 비율 아니다 간단 하지만 정확한. 원형질 막에 형광 강렬 특정 형광 현미경 검사 법 기술과 사용 하는 광학 요소³에 대 한 빛의 회절 특성 때문 원형질 막 및 세포질 신호의 중첩을 반영합니다. 따라서, 세포질 신호 막 지역에도 포함 됩니다. 이러한 이유로, FM 4-64 얼룩 패턴 막 신호 선택⁴마스크로 사용할 수 없습니다. 또한, 막 신호 FM 4-64 항상 체계적으로 최대 얼룩에 의해 정의 된 위치에서의 간단한 측정 평가의 중첩으로 인해 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질의 진짜 플라즈마 막 신호는 막 그리고 세포질 화합물입니다. 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 관찰 된 신호의 최대 또한 공동 플라즈마 멤브레인 마커 (즉, FM 4-64 styryl 염료), 최대를 지역화 하지 않습니다 하지만 세포질 쪽으로 이동 된다. 또 다른 한계는 FM 4-64 방출 피크는 빛 회절³의 파장 의존성 때문 GFP 같은 녹색 형광 성 단백질을 위한 방출 봉우리에 비해 넓은 사실에 기반입니다.

여기에 설명 된 메서드에서 태그 단백질 신호 원형질 막 세포질 신호를 가상 배포를 설명 하는 것은 각각의 경험적 함수 두 개 장착 되어 있습니다. 이 신호 분해 수직 붙일 태그가 단백질 표현 confocal 섹션 일반, 2 채널 소스 이미지에서 원형질 막으로 세포 표면에 적용 되는 선형 형광 프로필에 적용 됩니다. 셀 FM 4-64 염료와 함께 표시입니다.

피팅을 사용 하는 첫 번째 함수는 셀 가장자리에 세포질 신호의 회절을 설명 합니다. 그것은 관심의 원형질 막 주변 관련 된 단백질으로 같은 발 색 단에 의해 표를 붙인 세포질 단백질 마커를 표현 하는 셀에 측정 되었다 이전 취득된 형광 프로필에서 얻은 것입니다. 원형질 막 신호의 회절을 설명 하는 두 번째 함수는 FM 4-64의 형광에서 파생 됩니다. 이 신호는 점 광원의 빛 회절의 대략적인 모델링에 사용 되는 가우스 함수에 의해 첫째로 직선 근사 줄. 둘째,이 모델, 빨간 FM 4-64 방출에 유효 수학적으로 원형질 막에 대 한 관심의 주변 관련 단백질의 태그에 사용 되는 발 색 단의 방출 파장에 대 한 관련 된 형식으로 변환 됩니다. 두 함수 모두 최대 강도 및 FM 4-64 신호 및 세포질 단백질 신호에 대 한 가장 높은 값의 10%에서 평균 각각 정규화 됩니다. 이 신호 분해 (비-선형 최소 평방 피팅 방법), 원형질 막의 비율과 시험된 단백질의 세포질 분수 수 수 추정 쉽고 정확 하 게. 분할 계수 계산된의 실제 물리적 차원은 세포질 볼륨 농도 표면 농도 플라즈마 멤브레인에 비해 마이크로미터의 범위입니다. 같은 양의 단백질은 원형질 막의 인접 한 지역에서 지역화 된 세포질에 플라즈마 막에서 거리를 정의 합니다. 이 값은 분할 계수 K₂ 도입 이전⁵. 방법은 매우 빠르고, 일상적인 confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 인수만 단일 confocal 단면도 요구 하 고 그것은 계산 요구 하지. 분석 핵심 휴대용 R 패키지에 구현 된 고 추가 ImageJ 매크로에서 직관적인 대화 상자는 분석을 실행 하려면 그래픽 사용자 인터페이스를 제공 하기 위해 작성 되었습니다. 소프트웨어 및 방법의 자세한 설명 (이전 출판⁶) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/에서 찾을 수 있습니다.

방법은 절연된 셀, protoplasts, 및 조직에 대 한 적합 한 개별 세포의 원형질 막 명확 하 게 구별할 수 어디에, 주변에 관련 된 단백질 검사의 붙일 태그 구문 표현. 발 색 단 호환 FM 4-64 얼룩을 사용 해야 합니다. FM 4-64에서 빨간 형광; 따라서, 검사 단백질 파란색, 녹색, 또는 황색 방출 (예를 들어, GFP, CFP, YFP)와 형광 단백질에 의해 태그가 될 수 있습니다. 생물학 물자의 안정적인 변화 단백질 분포의 덜 인공 하 고 쉽게 재현 가능한 관측을 수 있기 때문에 것이 좋습니다. 그것은 시험된 단백질 상대적으로 균질 세포질 배포 필요입니다. 바인딩과 그물 또는 다른 세포내 막 구획에 있는 단백질의 지 방화는 인공 결과 생성할 수 있습니다.

또한, 동일한 생물학 물자 세포질 마커를 표현 비교에 사용 해야 합니다. 셀 폐지 막 바인딩 용량 무료 chomophore (같은 사용 되는 태그, 예를 들어, 무료 GFP 주변 단백질)에 의해 또는 관심사의 태그 단백질에 의해 변환할 수 있습니다. 막 바인딩 용량 수 수 폐지, 예를 들어 막 바인딩 도메인의 트리밍 또는 주요 아미노산 잔류물 (예를 들어, 사이트에 대 한 N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation, 등)의 사이트 감독 mutagenesis.

공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대 한 세포 FM 4-64 염료 처럼 막 마커로 표시 해야 합니다. FM (때문에 간섭 autofluorescence, 불 쌍 한 염료 침투 등) 공부 자료에 적합 하지 않으면 4-64 얼룩, 원형질 막 수 표시, 예를 들어 적절 한 chomophore (태그 통합 플라즈마 막 단백질에 의해 mCherry, RFP, 등). 마커 세포내 막 구획 (endomembranes)에서 무시할 현지화가 필수적 이다.

고정된 샘플 및 항 체를 사용 하는 경우 고칠 수 아날로그 FM 4-64FX 또는 플라즈마 멤브레인 라벨 적절 한 대상에 대 한 항 체에 의해 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 고정 절차 단백질의 선택적 손실 세포질과 원형질 막에서 이어질 수 있기 때문에 매우 신중 하 게 결과 평가에 필수적 이다.

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Protocol

1입니다. 생물 자료의 준비

붙일 태그가 단백질 세포질 마커 뿐 아니라 관심의 표현 하는 생물 학적 자료를 준비 합니다. 소개에서 언급 하는 절차를 따릅니다.

2. confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법

4-64 염료⁷제 1 fm 준비 자료를 얼룩.
1. 공부 자료에 대 한 적합 한 얼룩 프로토콜을 적용 합니다. 담배 BY-2 셀, 10mm FM의 0.2 μ와 200 μ 셀 서 스 펜 션의 dimethylsulfoxide에서 4-64 솔루션 얼룩.
  참고: FM의 전형적인 착 색 농도 4-64 염료는 10 m m 재고 솔루션을 사용 하 여 dimethylsulfoxide에서 10 μ M에 대 한. 적절 한 얼룩에 대 한 FM 4-64의 가능한 가장 낮은 농도 사용 하 고 셀 얼음 (FM 4-64와 저온 수 플라즈마 멤브레인 속성에 영향을 미칠)에 품 어 하지 마십시오. 관찰 즉시 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 계속 합니다. 얼룩 및 이미지 수집 간격; 10 분 이상 하지 않아야 그렇지 않으면, 염료의 endocytosis 4-64 얼룩 FM 적용 됩니다.
2. 연속적으로, 여러 개의 샘플을 처리 하 고 실험의 시작 부분에 모든 샘플 얼룩이 되지 마십시오.
한 셀 당 한 적도 confocal 섹션을 캡처하십시오.
1. (첫 번째 채널에 있어야) 단백질 태그와 FM 4-64 (두 번째 채널에 있어야)로 사용 하는 발 색 단에 대 한 순차적 2 채널 스캔 설정 합니다. (10-20 픽셀/μ m) 높은 광학 해상도 설정 합니다. 예를 들어 설정: 63 X 기름 침수 목표, NA 1.3, 이미지 크기 1024 x 1024 픽셀. 원형질 막 비행기 획득된 이미지에 confocal 섹션 평면에 수직인 인지 확인 합니다.
2. 캡처 통계 평가 대 한 충분 한 데이터를 견본 당 적어도 20 셀 (가공된 소재에서 신호 변화에 따라 달라 집니다).

3. 필요한 소프트웨어 설치

피지 ImageJ 배포⁸와 주변 필요한 매크로 설치 합니다.
1. 사이트 https://fiji.sc/#download에서 소프트웨어를 다운로드 하 고 그들을 풀고 여 설치.
2. 압축 푼된 "Fiji.app" 디렉터리에 "ImageJ(.exe)" 파일을 두 번 클릭 하 여 피지를 시작 합니다.
3. "주변" 매크로 다음 사이트에서 다운로드:
  http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm입니다.
4. 피지에 플러그인을 선택 | 매크로 | 설치... 메인 메뉴에서 "Peripheral_.ijm" 다운로드 한 파일의 경로를 지정 하 고
  참고: 설치 매크로 "주변 장치"의 두 가지 새로운 도구 피지 도구 모음에 표시 됩니다: "받아 프로필 도구"와 "주변 단백질 메뉴."
R 프로젝트 소프트웨어⁹및 필요한 패키지를 설치 합니다.
1. R 프로젝트 설치에 대 한 사이트 https://cloud.r-project.org/에 지시를 따릅니다.
  참고: 전체 분석 피지에서 수행 됩니다. R 소프트웨어만 내부적으로 호출할 수 것입니다 피지 매크로 계산 "주변 장치"에 의해.
2. R GUI를 실행, 패키지를 선택 | 설치 패키지를... 메인 메뉴에서 가장 가까운 저장소 및 설치 패키지 "ggplot2" 지정.
  참고: 또는, r 명령줄 입력: install.packages("ggplot2").
3. 대상에서 주변 R 패키지를 다운로드: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. 패키지를 선택 하 여 설치 | 로컬 파일에서 패키지를 설치.
  참고: 또는 R 명령줄에이 명령을 입력:
  install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo NULL 입력 = = "소스").

4. 피지 이미지 분석

세포질 마커의 confocal 이미지를 처리 합니다.
1. 플러그인을 사용 하 여 피지를 가져오기는 이미지 | 바이오-형식 | 바이오-형식 가져오기 기본 설정으로 피지 메뉴에서.
2. 바이오-형식 가져오기 이미지 보정을 제대로 인식 경우 확인 하십시오. 상단 왼쪽된 정보 필드 이미지 창에 표시 된 그림 차원 원래 그림 크기를 같아야 합니다.
3. 치료는 잘못에서 잘못 된 이미지 보정 대화 창 분석에에서 올바른 매개 변수를 설정 하 여 개별적으로, 예를 들어, 크기 | 설정 규모... 피지 메뉴에서: 까지의 거리를 픽셀 단위로 필드와 거리 알려진 필드에 적절 한 길이 단위로 실제 너비에 이미지 너비 (픽셀) 입력).
  참고: Leica LCS LEI 파일 잘못 교정 단계 4.2.1를 따라 라.
분석 설정에 대 한 가져오기 옵션 매크로 실행 합니다. 세 가지 방법 중 하나에 의해 매크로 활성화: 플러그인을 선택 | 매크로 | 가져오기 옵션 [f1] 주 피지 메뉴에서 선택 같은 메뉴 도구 주변 단백질 메뉴, 클릭 한 후 항목을 누르거나 키보드 지름길 F1. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.
1. Leica LCS LEI 형식 경우 Leica.lei 이미지 확인란을 활성화 하 여 부적 절 한 보정 해결. 이 옵션은 제대로 "lei" 확장자를 가진 파일에서 이미지 크기를 가져옵니다.
2. 가우스 블러 반경 (픽셀)필드에 적절 한 값을 정의 합니다. 이 그림 스무 딩 및 소음 감소 영향. 낮은 값 (1 픽셀) 충분 하 고 모든 이미지 정보 손실이 발생 하지 않습니다.
3. 프로 파일 선 두께 (픽셀)필드에 값을 설정 합니다. 두꺼운 라인 프로 파일 곡선의 높은 다듬기 발생 합니다. 기본값 10 픽셀 것이 좋습니다.
4. "샘플 구분 기호" 와 "수출 항목." 의 정의 의해 구문 분석 이미지 제목 설정
  참고: 이미지 제목 ( 예:확장명 없이 파일 이름: "실험-1_line-02_cell-11") "샘플 구분 기호" 필드에 나열 된 모든 문자가 주위 분할 됩니다 (예: "-_") 항목의 집합으로 ("실험", "1"," 라인","02","셀", 및"11") 요소를 그룹화 (샘플, 셀, 행, 또는 치료 정체성)에 다음과 같은 분석으로 사용할 수 있습니다. 항목을 "내보낸 항목." 출원으로 그들의 시퀀스 번호 ("0"의 첫 번째 항목에 대 한)를 입력 하 여 사용 됩니다 정의 공백으로 형식, 예를 들어, "3 5."을 사용 하 여 이 예제에서 항목 "02", "11" 참조 됩니다 "Fac_0" 및 "Fac_1" 라는 요소를 그룹화 하는 것으로 서 또한, 각 측정의 id로 "나" 요소를 메시지를 지칭 합니다.
5. 또는 빈 샘플 구분 기호 를 유지 하 고 전체 이미지 제목 유지 될 수 있습니다 경우 수출 항목 에 0을 입력.
6. Windows 운영 체제에서 R 소프트웨어를 경로에 있을 것입니다 잘못 자동 검색 필드 R.exe 경로확인 합니다. 그렇지 않으면, 시스템 (예:"C:\Program Files\R\bin\R.exe")에서 R.exe 파일에 전체 경로 지정 합니다.
7. 확인을 클릭 합니다. 다음 대화 창에서 구문 분석 하는 제목을 확인 하 고 확인 또는 다시 재설정을 클릭 합니다.
  참고: 모든 사진은 자동으로 부드럽게 그리고 결국 recalibrated 될 것입니다. 모든 내보낸된 그룹화 요인의 목록이 결과 창에 표시 됩니다.
처리 된 이미지의 원형질 막 지역에 걸쳐 선형 선택 수행 하 고 형광 프로 파일을 측정.
1. 피지 도구 모음에서 직선 피지 도구를 선택 합니다. 이미지를 클릭 하 고 원형질 막 지역 선 끌어. 선 세포 외 공간에서 시작 해야 하며 플라즈마 멤브레인에 수직 이어야 한다. 대뇌 피 질의 세포질의 두꺼운 및 더 균질 층으로 영역을 선택 합니다. 선형 선택의 최적의 길이 5-10 μ m입니다.
2. 4.2 (단축키 "x") 단계에서 비슷한 방법으로 또는 프로필 도구 걸릴 피지 도구 모음에서 클릭 하 여 프로 파일 매크로 받아 실행 합니다. 두 채널에 형광 프로필의 자동 측정 수행 됩니다 하 고 데이터는 결과 창에 표시 됩니다.
3. "X" 키를 사용 하 여 생소 간주 됩니다, 경우 텍스트 편집기에서 매크로 소스 파일 Peripheral_.ijm 를 열고, 줄에 "x" 기호 대체 ' 매크로 "걸릴 프로필 [x]" {' 더 유리한 기호 (하지로 피지 환경에서 사용 되는 활성 키보드 지름길) 저장 합니다. 매크로 (3.1.4 단계)를 재설치 하 고 이미지 가져오기에서 분석을 시작.
4. 개별 신호 변화에 따라 각 셀에 대 한 프로필의 대표 번호를 가져가 라.
5. 파일을 통해 데이터 저장 | 저장 다른 이름으로. 항상 사용 "csv" 확장; 그것은 적절 한 데이터 형식이 필요 합니다.
프로필 데이터 매크로 플롯 (지름길 F5) 측정 된 프로필의 그래픽 시각화에 대 한 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.
1. 체크 상자 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택 되지 않은.
2. 줄거리는 단일 CSV 파일 또는 모든 CSV 파일에서 적절 한 라디오 단추를 클릭 하 여 지정된 된 디렉터리에 있는 결과 창에서 최근 데이터 에서 만들 수 경우 지정 합니다.
  참고: 최근 결과에서 줄거리를 만드는 경우 데이터 저장 됩니다 먼저 (다른 이름으로 저장 대화 상자는 자동으로 활성화).
3. 그룹화 요소 는 적절 한 체크 박스를 선택 하 여 그래프에 사용 됩니다 지정 합니다. 모든 프로 독특한 플롯에 표시 해야 하는 경우 "i." 요소를 선택 합니다. 하나의 플롯에서 플롯 모든 데이터에 의해 해야 하는 경우 선택 하지 않은, 체크 박스를 유지.
  주의: 플롯 작성 중 처리 결과 원인 오류에 존재 하지 않는 그룹화 요소의 선택 합니다.
4. 출력 파일 접두사 필드에서 음모를 저장할 때 파일 이름 지정 하 고 파일 높은 줄거리 와 플롯 폭에 그림 이미지 치수 를 정의 합니다.
  참고: 결과 플롯 저장 됩니다 소스 데이터 디렉토리에 PNG 파일로.
5. 선택은 Pdf 출력? 확인란 추가 PDF 출력 생성 될 수 있습니다.
6. 확인을 클릭 합니다. 결과 대 한 경로 지정 가져오거나 결국 데이터에 대 한 다음 대화 창에서. 분석 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 확인 합니다.
  참고: 새 이미지 창에서 열 것 이다 음모 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.
만약 일부 플롯된 프로필 과도 한 신호 (태그 단백질)에 대 한 세포 외 공간에 나 (4-64의 FM 신호)에 대 한 세포내 공간에서 프로 파일 필터링 설정 매크로 (지름길 F2) 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오.
참고: 필터링 지정 된 x 좌표에서 최대 허용된 강도 임계값에 따라 가난한 프로 파일의 제거를 수 있습니다.
1. 각 채널에 대 한 과도 한 세포 외 (세포내) 신호 측정을 제거하는 파일에 적절 한 강도 임계값을 설정 합니다. X 좌표에서 (보다) 낮은필드에서 강도 임계값 적용 될 영역을 지정 합니다.
2. 체크 상자는 프로필 데이터 매크로 플롯 (단계 4.4) 다시 실행 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택; 모든 탈 프로필 성공적으로 제거 되었습니다 확인 하십시오. 그렇지 않으면, 필터링 매개 변수 (4.5.1 단계) 개선.
실행 만들기 모델 매크로 (지름길 f 3) 원형질 막 및 교정 데이터에 따라 세포질 형광 분포 모델을 만듭니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오.
1. 지정 하는 경우 입력된 데이터를 선택 하 여 필터링된 (4.5 단계) 있어야는 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 체크 박스.
2. 4.4.2 단계 에서처럼 analogically 원본 데이터 를 지정 합니다.
3. Μ m에서 간격 을 모델 "시작", "끝"의 정의 의해 예측 될 것 이다 하 고 "단계" 값을 지정 합니다.
  참고: 모든 프로 파일 측정 지정 된 간격 보다 더 이상 이어야 한다.
4. 적절 한 분야에서 사용 chromophores의 형광의 파장 여기 및 방출 맥시 마를 지정 합니다. 4-64 조합 GFP와 FM에 대 한 기본값을 설정 합니다.
  참고: "GFP" 단백질 (GFP, CFP, YFP, 등), 태그에 사용 되는 발 색 단을 나타내고 "FM4" 발 색 단 (일반적으로 4-64 FM) 얼룩 원형질 막에 대 한 사용을 나타냅니다.
5. 출력 파일 접두사 필드를 지정 합니다. 접두사 원본 데이터 디렉터리로 RData 파일 결과 모델 저장에 대 한 사용 됩니다.
6. 체크 박스를 선택 음모 모델? 그래픽 출력 필요한 경우. 경우와 또한 PDF 파일 PNG로 줄거리 저장 됩니다는 Pdf 출력? -확인란을 선택.
7. 확인을 클릭 합니다. 입력을 지정 또는 다음 대화 창에서 경로 출력 하 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다.
  참고: 줄거리는 모델의 세포질 및 주변 관련 단백질 형광의 막 화합물에에서 표시 됩니다 새 이미지 창 고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.
관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 이미지를 처리 합니다.
1. 4.1 단계 에서처럼 analogically 이미지를 가져옵니다.
2. 4.2 단계 에서처럼 analogically 분석을 설정 합니다. 부드럽게 하 고 선 폭 동일 해야 합니다.
3. 측정 단계 4.3 에서처럼 analogically 프로필.
4. (단계 4.4)을 그려서 프로필의 정확성을 확인 하 고 (4.5 단계) 원하는 경우 필터링 설정.
원형질 막 사이 및 세포질 단백질 분할의 계산에 대 한 계산 배포 매크로 (지름길 F4)를 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수 설정에 따라.
1. Analogically 이전 단계 (단계 4.4), 데이터 원본, 필터링 및 파일 이름 접두사를 지정 합니다.
2. 피지 (선택 체크 박스 최근 결과)에 "주변" 매크로의 최근 인스턴스에서 마지막 모델 계산 또는 RData 파일 (단백질 분포 계산에 대 한 모델 로드 됩니다 지정 "파일"에서체크 박스 선택) 합니다.
3. 확인란 활성화 원하는 결과 필터링 하는 경우 잔여 가변성 보다 큰 결과 제거 하십시오. 최대 허용 잔류 프로 파일 측정의 신호 분해에 의해 설명할 수 없는 수 있는 임계값을 지정 합니다. 예: 0.200 나타냅니다 프로필에 형광 강도의 총 다양성의 설명할 수 없는 변화 20% 보다 높은 모든 측정 삭제 됩니다.
4. 샘플 그룹화 요소, 상자-플롯 만들기 (단계 4.4)에 사용할 수 있습니다를 선택 합니다.
5. 체크 박스를 활성화 Pdf 출력? PDF 파일로 상자 그림을 저장 하기 위한.
6. 확인을 클릭 합니다, 그리고 지정 하는 입력 또는 출력 경로, 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다.
  참고: 새 이미지 창에 표시 됩니다 주변 관련 단백질 플라즈마 막과 세포질 사이 분할의 상자 그림 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.
7. 파일을 통해 결과 창에 표시 하는 결과 저장 하는 외부 처리에 대 한 | 저장 다른 이름으로... 창 메뉴.

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Representative Results

DREPP¹⁰ 식물 관련 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 N-myristoylation와 phosphatidylinositol 인산 염¹¹^, 와 정전기 상호 작용을 통해 플라즈마 막으로 연결 되는¹². DREPP으로 식물 세포에서 칼슘 신호 기계 구성 요소 설명 했다 그리고 또한 골격¹³^,¹⁴와 상호 작용. 제시 실험에서 야생-타입 담배 DREPP2 및 그것의 비 myristoylated 돌연변이 버전 (Gly2 날개에 의해 대체) GFP 태그⁶ 되었고 담배 BY-2 현 탁 액 셀¹⁵ CaMV 35S promotor¹⁶아래에 표현. 3-하루-오래 된 (희석 후 3 일)에 측정 되었다 원형질 막이이 단백질의 분할 FM 4 64 표시 (8 µ M) 문화⁶ (그림 1A)와 (그림 1B) phosphoinositide 3-kinase의 추가 없이 억제제 Wortmannin (10 µ M)¹⁷, 위에서 설명한 프로토콜에 따라. 잘린된 버전 바인딩 도메인⁶ 플라즈마 멤브레인 부족 DREPP2(Δ1-23) 형광 분포 모델 건설 (그림 1C)에 대 한 세포질 표식으로 사용 되었다.

데이터 했다 제곱근 변환 계산 (최저 음수 값에 해당 하는 양수 값만 긍정적인 데이터를 검색 하는 모든 데이터에 추가 되었습니다), 데이터 R⁹에서 양방향 ANOVA 테스트 했다. 돌연변이 억제제 치료의 효과 매우 중요 했다 (p < 2.2 x 10^-16 * * *). 모든 그룹 비교 되었다 Tukey HSD test; 모든 그룹 DREPP2 Wortmannin 및 치료 비 DREPP2(G2A) (그림 1D) 의해 처리를 제외 하 고 크게 달랐다.

이러한 결과 명확 하 게 담배 DREPP2 단백질의 플라즈마 멤브레인 협회는 co-operatively 작동 하는 N-myristoylation 및 정전기 상호 작용의 결과 다는 것을 보여준다. N-myristoylation 사이트 돌연변이 및 Wortmannin 치료의 상호 효과만 원형질 막에서 DREPP2 단백질의 전체 분리를 발생합니다. 이러한 결과 이전에 게시 데이터⁶에 따라.

그림 1 : N-myristoylation 사이트 및 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 신호 전달 경로 식물 세포에서 칼슘에 포함 되는 DREPP의 분할 하는 원형질 막에 Wortmannin 치료에 돌연변이의 효과. 담배 BY-2 셀 야생 타입 양식 DREPP2 GFP와 돌연변이의 (A) 중간 confocal 단면도 형성 DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (녹색 채널). 셀 4-64 염료 (마젠타 채널) FM으로 표시 했다, 눈금 막대 10 µ m. (B) 동일한 셀 라인 10 µ M에 의해 대우 되었다 Wortmannin (WM). (C) 세포 세포질 마커 DREPP2(Δ1-23)을 표현. (D) 모든 샘플에 대 한 예상된 플라즈마 멤브레인 분할. 두 효과의 중요성은 양방향 ANOVA 테스트 (p < 2.2 x 10^-16 * * * 두 경우, 원래 데이터 제곱근 변환 했다). 문자는 크게 서로 Tukey HSD 테스트에 의해 결정으로 다른 그룹을 나타냅니다. 상자-플롯의 수염 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기 설명 하는 방법을 원형질 막 형광 강도⁵측정에 따라 다른 방법에 비해 주변 관련된 단백질에 대 한 분할의 더 정확한 견적을 생성 합니다. 이 방법의 주요 향상은 그것 계정에 빛의 회절 및 원형질 막의 세포질 신호 중첩입니다. 비록 이러한 메서드 결과 평균 세포질 막 위치에서 형광 강도의 비교에 기반 하는 간단한 방법의 결과와 상관 관계에는 신호 (같이 이전⁶),이 새로운 방법의 주요 장점은 특히 플라즈마 멤브레인 신호가 세포질 신호 보다 낮은 결과의 관련성의 추정 수 있도록 (신호 분해에 의해 정체 불명의) 잔여 가변성의 결심이 이다. 설명 방법은 또한 신호 잡음에 더 강력한 단백질 분할의 계산만 한 지점에 기반 하지 않은 때문에.

분석 단일 2 채널 confocal 이미지만 필요합니다. FRAP 접근¹⁸ 이상 시간 창에서 단백질 보급 역학의 측정에 따라, 달리 설명 방법은 동적 비보에 접근에 대 한 더 많은 적용 때 빠른 이미지 획득은 중요 한 요구 사항 ( 예를 들어, 신호 변환 탐험, 금지 분석 실험). 메서드를 사용 하면 신속 하 게 많은 양의 통계 평가 대 한 충분 한 데이터를 얻기 위해 적당 하다.

메서드는 단일 막만 제한 됩니다. 인접 셀의 두 개의 밀접 하 게 인접 한 세포 막에서 신호의 분석은 현재 지원 되지 않습니다. 이 경우에, 신호 피팅 유물의 더 높은 위험으로 더 요구 이다.

그러나, 분석은 원래 공장 현 탁 액 셀¹⁵, 설계 하 고 그것은 다른 종류의 세포도 분석에 대 한 적용 될 수 있습니다. 꽃가루 관 및 루트 머리카락 식물 생물학에 있는이 방법의 잠재적으로 매우 좋은 목표를 나타냅니다. 식물 표 피 세포의 외부 막은 세포 벽 FM 4-64에 의해 표시 되지 않는 및 간섭 autofluorescence를 전시 하지 않는 이전 확인 후 분석할 수 있습니다. 부드러운 플라즈마 막으로 간섭 autofluorescence, 효 모 세포, 동물 세포 뿐만 아니라 곰 팡이 세포의 무료 원생 생물 셀 설명된 방법;를 사용 하 여 분석 될 수 있습니다. 그러나, 동물 세포에 대 한 단백질 분포 fibroblast 세포의 앞 가장자리에 또는 상피 세포의 브러시 테두리에 분석 가능한 수 없습니다. 유연한 분석 설정으로 인해 4-64 얼룩 대체 될 수 있습니다 다른 플라즈마 멤브레인 시각화 방법에 의해 같은 붙일 FM 단백질 태그. 주의 하 여 고정 된 셀에 대 한 메서드를 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 NPU에 의해 지원 되었다 I, LO1417 (교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

Biology

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

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