Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Определение плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения количественный анализ уровня плазматической мембраны ассоциации дневно тегами периферически связанных белков. Метод основан на вычислительные разложение мембраны и цитоплазматических компонент сигнала, наблюдается в клетках, помечены плазматической мембраны флуоресцентных маркеров.

Abstract

Этот метод обеспечивает быстрый подход для определения плазматической мембраны перегородки любой дневно тегами периферически связанных белков с помощью профилей интенсивности флуоресценции через плазматическую мембрану. Измерений флуоресценции профили оснащены моделью распределения мембраны и цитоплазме флуоресценции вдоль линии прикладывании к периферии клетки. Эта модель построена из значения интенсивности флуоресценции в ссылочных ячеек, выражая дневно тегами маркер с FM 4-64-меченых плазматической мембраны и цитоплазме. Этот метод может применяться для различных типов клеток и организмов; Однако может оцениваться только плазменных мембран-соседних клеток. Этот метод быстро микроскопии основанные подходит для экспериментов, где ожидаются тонкие и динамических изменений маркеры плазматическую мембрану связанные и необходимость быть количественно, например, в анализе мутант версий белков, лечение ингибитором, и замечания трансдукции сигнала. Метод реализован в пакете R Multi-платформы, который соединен с ImageJ макрос, который служит удобным для пользователя интерфейсом.

Introduction

Периферически связанных плазмы мембранные белки являются ключевыми компонентами клеток, сигнальные пути. Одна из их основных ролей является их переходных плазматической мембраны ассоциации и диссоциации, который имеет важное значение для передачи сигнала между плазматической мембраны и цитоплазме. Периферически связанных плазматической мембраны белки могут быть закреплены на плазматической мембране анкерами липидов (N-myristoylation, S-ацилирования или prenylation) или липидов связывания доменов (взаимодействие с фосфатидилинозитол фосфаты, фосфатидной кислоты, и т.д.).

Плазматической мембраны привязки, свойства этих белков может быть рассмотрен в естественных условиях, например, когда белок дневно тегами изменяется с сайта Направленный мутагенез основных аминокислот, или когда он рассматривается с различных ингибиторов затрагивающих липидов сигнализации. Дистрибутивы периферийных плазмы мембранных белков основном оцениваются качественно, особенно в тех случаях, когда перераспределению белок является очевидным. Представлен метод является оптимальным для ситуаций, когда белок перераспределения только частичного и количественная оценка необходимости. Часто используемые подход когда плазматической мембраны Ассоциация оценивается от конфокальные лазерные сканирования микроскопии изображений как отношение интенсивности флуоресценции в плазматической мембраны и в цитоплазме1,2, простой, но не Точная. Интенсивностью флюоресценции в плазматической мембраны отражают суперпозиция плазматической мембраны и цитоплазме сигнала из-за дифракции света характерные для конкретного флуоресценции технику микроскопии и оптические элементы, используемые в3. Следовательно цитоплазматических сигнал включен также в регионе мембраны. По этой причине FM 4-64 окрашивание шаблон не может использоваться как маска для выбора сигнала мембраны4. Кроме того, простые измерения сигнала мембраны с позиции, определяемой FM 4-64 пятнать максимальная всегда систематически переоценивать реальные плазматической мембраны сигнал периферически связанных плазмы мембранные белки из-за наложения мембраны и цитоплазматических соединения. Максимум наблюдаемых сигналов для дневно тегами периферически связанных белков также не локализуется совместно с максимумом на плазматической мембране маркер (т.е., FM 4-64 стириловых красителей), но переносится к цитоплазме. Еще одним ограничением является что FM 4-64 пик выбросов является более широкой по сравнению с вершины выбросов для зеленых флуоресцентных белков, таких как GFP из-за дифракции света3волны зависимость.

В метод, описанный здесь протеин тегами сигнала установлен на два эмпирических функций, описывающих гипотетический распределение плазматической мембраны и цитоплазме сигнал, соответственно. Это разложение сигнала применяется линейный флуоресценции профили, которые применяются к клеточной поверхности перпендикулярно к плазматической мембране в исходных изображений, которые регулярно, 2 канальный конфокальный секции дневно тегами белка выражения клетки с FM 4-64 краска.

Первая функция, используемая для установки описывает дифракции цитоплазме сигнала на краю ячейки. Он получается из ранее приобретенного флуоресценции профилей, которые были измерены в клетках, выражая маркер белков цитоплазмы, помечены же хромофора как плазматической мембраны периферически связанных протеина интереса. Вторая функция, описывающие дифракции плазматической мембраны сигнала является производным от флуоресценции FM 4-64. Во-первых, этот сигнал аппроксимируется Гауссова функция, которая используется для приблизительной моделирование дифракции света точечного источника. Во-вторых эта модель, действительны для красных FM 4-64 выбросов, математически преобразуется в форму, которая имеет отношение к выбросов волны хромофора, используемый для пометки периферически связанных протеинов интереса на плазматической мембраны. Обе функции нормализуются путем максимальной интенсивности и среднее от 10% от высоких значений для FM 4-64 и цитоплазматических белков сигнал, соответственно. На этот сигнал разложения (нелинейный метод наименее кв установку) соотношение плазматической мембраны и цитоплазме доля обследованных белка может быть оценена легко и точно. Реальные физические измерения секционирования Вычисляемый коэффициент находится в диапазоне микрометра, потому что цитоплазматических объемной по сравнению с поверхности концентрация на плазматической мембраны. Он определяет расстояние от плазматической мембраны в цитоплазму, в течение которого такое же количество белков локализован в прилегающем районе плазматической мембраны. Это значение эквивалентно значению разделять коэффициент K2 ранее представил5. Этот метод очень быстро, требует только одного конфокальный секции, приобретенных с помощью обычной конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, и он не требует вычислений. Основной анализ был реализован в портативный пакет R и дополнительные макро ImageJ был написан предоставлять графический интерфейс пользователя для выполнения анализа из интуитивно диалоги. Программное обеспечение и более детальное описание метода (ранее опубликованы6) можно найти на http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Этот метод подходит для протопласта изолированных клеток и тканей, где ясно distinguishable плазматической мембраны отдельных ячеек, выражая дневно тегами конструкт рассмотрены периферически связанных белков. Хромофора совместим с FM 4-64 окрашивания необходимо использовать. FM 4-64 испускает красный флуоресценции; Таким образом исследуемых белков может быть помечена флуоресценции белков с синего, зеленого или желтого выбросов (например, GFP, СЛП, рекламы ЯФП). Стабильные преобразование биологического материала рекомендуется, потому, что он позволяет меньше искусственных и более воспроизводимые наблюдений белка распределения. Это необходимо изучить белка имеет сравнительно однородный цитоплазматических распределение. Локализация протеина в эндоплазматический ретикулум или другой отсек внутриклеточные мембраны может производить искусственные результаты.

Кроме того же биологический материал, выражая цитоплазматических маркер должен использоваться для сравнения. Клетки могут быть преобразованы бесплатно chomophore (так же, как используется для периферийных белка, пометки, например, бесплатные GFP) или тегами протеин интереса с отменено мембраны связывающая способность. Потенциал мембраны привязки могут быть отменены, например, путем обрезки мембраны связывающий домен или сайт Направленный мутагенез residua основных аминокислот (например, сайты для N-myristoylation, S-ацилирования, или prenylation и т.д.).

Для сканирования конфокальная микроскопия клетки должны быть помечены на мембране маркер как краситель FM 4-64. Если FM 4-64 окрашивания не подходит для материала (из-за помех аутофлюоресценция, бедных краситель проникновения и т.д.), плазматической мембраны может называться, например, неотъемлемой плазматической мембраны белка, отмеченных в соответствующие chomophore ( mCherry, ППП, и т.д.). Важно, что маркер имеет незначительный локализации в отсеках внутриклеточные мембраны (endomembranes).

При работе с фиксированной образцов и антител, может использоваться поправимо аналогового FM 4-64FX или плазматической мембраны маркировки, антитела против соответствующей цели. В этом случае важно оценить результаты очень тщательно, потому что фиксации процедур может привести к селективная потеря белков от цитоплазмы и плазматической мембраны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка биологического материала

  1. Подготовьте биологический материал, выражая дневно тегами белка интерес, а также цитоплазматических маркеров. Следуйте процедурам, упомянутых во введении.

2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

  1. Пятно материал, подготовленный в разделе 1 с FM 4-64 краска7.
    1. Применить окрашивание протокол, который подходит для материала. Для клеток табака по-2 пятно 200 мкл суспензии клеток с 0,2 мкл 10 мм FM 4-64 решения в диметилсульфоксид.
      Примечание: Типичный окрашивание концентрация FM 4-64 краситель — о 10 мкм, с использованием 10 мм раствор в диметилсульфоксид. Используйте низкие возможной концентрации FM 4-64 для надлежащего окрашивания и не инкубации клеток на льду (FM 4-64 и низкой температуры может повлиять на свойства плазматической мембраны). Продолжите наблюдение с использованием confocal микроскопии немедленно. Интервал между окрашивание и захвата изображений не должны быть длиннее 10 минут; в противном случае эндоцитоза красителя будет влиять на FM 4-64 пятнать.
    2. Последовательно обрабатывать несколько образцов и не пачкает все образцы в начале эксперимента.
  2. Захват один экваториальных конфокальный секции в одну ячейку.
    1. Установите Последовательный 2 канального сканирования для хромофора, используется в качестве тега белка (должен быть на первом канале) и FM (должен быть на втором канале) 4-64. Задайте более высокое оптическое разрешение (10 – 20 px/мкм). Пример настройки: 63 X масло погружения цель, NA 1.3, размер изображения 1024 x 1024 px. Убедитесь, что плазматической мембраны плоскость перпендикулярна плоскости конфокальный секции в полученные изображения.
    2. Захват по меньшей мере 20 клеток на сэмпл иметь достаточно данных для оценки статистики (зависит от сигнала изменчивости в обрабатываемый материал).

3. необходимое программное обеспечение установки

  1. Установите распределение Фиджи ImageJ8и требуемый макрос периферийных.
    1. Загрузить программное обеспечение с сайта https://fiji.sc/#download и установить их, распаковка.
    2. Начало Фиджи, дважды щелкнув на файле «ImageJ(.exe)» в Распакованный каталог «Fiji.app».
    3. Скачайте макрос «периферийных» со следующего узла:
      http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.IJM.
    4. В Фиджи, выберите плагины | Макросы | Установить... в главном меню и укажите путь к загруженному файлу «Peripheral_.ijm.»
      Примечание: Два новых средства установленных макроса «периферийных» появится в панели инструментов Фиджи: «Взять профиль инструмент» и «Периферийных белка меню».
  2. Установка программного обеспечения R-проекта9и требуемые пакеты.
    1. Следуйте инструкциям на сайте https://cloud.r-project.org/ для R-проекта установки.
      Примечание: Общий анализ будет производиться на Фиджи. Программное обеспечение R будет вызываться только внутренне, Фиджи макрос «периферийных» во время вычисления.
    2. Запуск R GUI, выберите пакеты | Установить пакет(ы)... в главном меню и укажите ближайший репозитория и пакет «ggplot2» для установки.
      Примечание: в качестве альтернативы, тип R командной строки: install.packages("ggplot2").
    3. Скачать пакет R периферийных устройств от назначения: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Установить их, выбрав пакеты | Установить пакеты из локальных файлов....
      Примечание: Альтернатива, тип R командной строки только эту команду:
      Install.Packages («http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz», репо = NULL, тип = «источник»).

4. образ анализ в Фиджи

  1. Процесс конфокальный изображения цитоплазматических маркеров.
    1. Импорт изображений в Фиджи с помощью плагины | Био форматы | Био-форматы импортер от Фиджи меню с параметрами по умолчанию.
    2. Проверьте, если импортер био-форматы должным образом признала калибровки изображения. Измерении изображение показано в окне изображения поля верхнего левого информации должен быть равен оригинальные размеры изображения.
    3. Лечить не откалиброван изображения с неправильные размеры индивидуально, например, устанавливая правильные параметры в диалоговом окне анализ | Задать масштаб... в Фиджи меню: заполняют ширину изображения в точках в поле расстояние в пикселях и реальная ширина в соответствующей длины блока в поле известно расстояние ).
      Примечание: Если Leica LCS лей файлы не откалиброван, выполните шаг 4.2.1.
  2. Запустите макрос параметры импорта для настройки анализа. Активировать макрос одним из трех способов: выберите плагины | Макросы | Импортировать параметры [f1] в главном меню Фиджи, выберите то же пункт после нажатия кнопки меню инструмента Периферийных белка меню, или нажмите клавишу клавиатуры Короткорезанные F1. Установите значение параметра в диалоговом окне вызываемый макрос.
    1. В случае формата Leica LCS леев решите неправильное калибровки , активировав флажок Leica.lei изображения . Этот параметр должным образом импортирует размеры изображения из файла с расширением «лей».
    2. Определите соответствующее значение в поле по Гауссу радиус (px). Это влияет на изображение сглаживания и снижения шума. Низкое значение (1 px) является достаточным и не вызывают потерю информации изображения.
    3. Задайте значение в поле Ширина линии профиля (px). Толще линия вызывает выше сглаживание кривых профиля. Значение по умолчанию 10 рекомендуется px.
    4. Задать название изображения, разбор по определению «Образец разделители» и «Экспортируемых элементов.»
      Примечание: Название изображения (имя файла без расширения, например: «Эксперимент 1_line-02_cell-11») будут разделены вокруг все символы, перечисленные в поле «Образец разделители» (например: «-_») в набор элементов («Эксперимент», «1»,» ««линия», «02», «клетка» и «11»), может использоваться как Группировка факторов (образец, ячейки, строки или лечения личность) в следующем анализе. Определить, какие элементы будут использоваться, введя их порядковый номер («0» для первого элемента) в поданной «Экспортируемые элементы.» Использовать формат, разделенных пробелами, например, «3 5.» В этом примере элементы «02» и «11» будет называться Группировка факторов, под названием «Fac_0» и «Fac_1.» Кроме того личность каждого измерения будет называться как «я» фактор.
    5. Кроме того держать образец разделителей пустым и введите 0 в экспортируемых товаров , если название полного изображения могут быть сохранены.
    6. На операционной системе Windows проверьте, если путь к программного обеспечения R будет правильно auto обнаружены в поле путь к R.exe. В противном случае укажите полный путь к файлу R.exe в системе (например, «C:\Program Files\R\bin\R.exe»).
    7. Нажмите кнопку ОК. Проверьте название разбора в следующем диалоговом окне и нажмите кнопку ОК или обратно для сброса.
      Примечание: Все фотографии будут автоматически сглаженный и в конечном итоге калибровки. Список всех экспортированных Группировка факторов будет отображаться в окне результаты.
  3. Выполните выбор линейной во всем регионе плазматической мембраны на обработанных изображениях и измерить профили флуоресценции.
    1. Выберите инструмент «Фиджи» прямой линии из панели инструментов Фиджи. Нажмите на изображение и перетащите линию в регионе плазматической мембраны. Строка должна начинаться в внеклеточного пространства и должен быть перпендикулярен плазматической мембраны. Выберите регионы с более толстые и более однородным слоем кортикального слоя цитоплазмы. Оптимальная длина линейного отбора составляет 5-10 мкм.
    2. Запустите взять профиль макрос , аналогичный метод как в шаге 4.2 (ярлык «x») или нажав принять профиль инструмент в панели инструментов Фиджи. Будет выполнено автоматическое измерение профилей флуоресценции в обоих каналах и данные будут отображаться в окне результаты.
    3. Если используя клавишу «x» считается недружественный, откройте макрос исходный файл Peripheral_.ijm в текстовом редакторе, заменить символ «x» в строке ' макрос «Взять профиль [x]» {' с более благоприятным символом (который не используется в среде Фиджи как активной клавиатуры укороченный) и сохраните файл. Переустановите макрос (шаг 3.1.4) и начать анализ от импорта изображений.
    4. Согласно индивидуальных сигнала изменчивости принять представительного числа профилей для каждой ячейки.
    5. Сохранить данные через файл | Сохранить как.... Всегда используйте расширение «csv»; Это необходимо для надлежащего данных формата.
  4. Запустите участок макрос данных профиля (укороченный F5) для графической визуализации измеряемых профилей. Установите значение параметра в диалоговом окне вызываемый макрос.
    1. Храните чек бокс использования фильтрации для ввода данных? невыбранном.
    2. Укажите, если участок должен быть создан из последних данных в окне результат из единого файла CSV или от всех CSV-файлов в указанном каталоге, щелкнув соответствующий переключатель.
      Примечание: Если участок создан из последних результатов, будут храниться данные сначала (Сохранить как диалоговое окно будет автоматически активирована).
    3. Укажите, какие факторы группировка будет использоваться для построения, установив соответствующие флажки. Выберите фактор «i.», если все профили должны отображаться в уникальных участков. Держите флажки не выбран, если все данные должны изобразить в один сюжет.
      Предупреждение: Выбор группировки фактора, который не существует в обработанные результаты причины ошибок во время создания сюжета.
    4. Укажите имя файла при сохранении участок в поле префикс файла вывода и определить участок размеры изображения в файлах высокий участок и участок шириной.
      Примечание: Получившийся график будет сохранен в исходном каталоге данных как файл PNG.
    5. Выберите Pdf выход? флажок Если дополнительные PDF вывода могут быть произведены.
    6. Нажмите кнопку ОК. Укажите путь для сохранения результатов, или в конечном итоге для данных импорта в следующем диалоговом окне. Подтвердите, нажав кнопку OK в диалоговых окнах, показаны выполняется код R анализ.
      Примечание: Участок будет открыт в новом окне изображения и R анализ вывода будут перечислены в текстовом окне.
  5. Запустите профиль фильтрации макро установки (укороченный F2), если некоторые построены профили имеют чрезмерное сигналов в внеклеточного пространства (протеин тегами) или в внутриклеточного пространства (для сигнала FM 4-64). Следовать за путем настройки параметров в диалоговом окне вызываемый макрос.
    Примечание: Фильтрация позволяет удаление бедных профилей по максимально разрешенных интенсивности порог в указанной x координаты.
    1. Для каждого канала установите соответствующие интенсивность порог в файле удалить измерения с чрезмерным внеклеточно (внутриклеточной) сигнала. Укажите регион, где будет применяться порога интенсивности в поле координатами x меньше (больше).
    2. Участок макрос данных профиля (шаг 4.4) снова запустить с чек бокс использования фильтрации для ввода данных? выбран; Убедитесь, что все аберрантных профили были успешно удалены. В противном случае улучшения фильтрации параметров (шаг 4.5.1).
  6. Запустите макрос создания модели (укороченный F3) для создания модели плазматической мембраны и цитоплазме флуоресценции дистрибутив, основанный на данных калибровки. Следовать за путем настройки параметров в диалоговом окне вызываемый макрос.
    1. Укажите, если входные данные должны быть отфильтрованных (шаг 4.5), выбрав использования фильтрации для ввода данных? -флажок.
    2. Укажите источник данных аналогично как шаг 4.4.2.
    3. Укажите интервал на котором модель будет прогнозироваться по определению «Пуск», «конец», и «шаг» значения в мкм.
      Примечание: Все измерения профиля должно быть больше, чем заданный интервал.
    4. Укажите длин волн флуоресценции возбуждения и выбросов Максима хромофоры используется, в соответствующие поля. Установите значения по умолчанию для GFP и FM комбинацию 4-64.
      Примечание: «ГФП» указывает хромофора, используемые для белка пометки (GFP, СЛП, рекламы ЯФП и т.д.), а «FM4» хромофора, используемых для плазматической мембраны, окрашивание (обычно FM 4-64).
    5. Укажите поле префикс файла вывода . Префикс будет использоваться для сохранения результирующая модель как RData файлов в каталог исходных данных.
    6. Выберите флажок участок модель? Если требуется графический вывод. Сюжет будет сохранен как PNG, а также как PDF-файл, если Pdf выход? -флажок.
    7. Нажмите кнопку ОК. Укажите ввода или вывода пути в следующих диалоговых окнах и подтверждают анализ, нажав кнопку OK в диалоговом окне показаны выполняется код R.
      Примечание: Участок моделируется цитоплазмы и мембраны соединение периферически связанных белка флюоресценции будет показан в новом окне изображения, и R анализ вывода будут перечислены в окне текст.
  7. Обработка изображения клетки, выражения протеина интереса.
    1. Импорт изображений так же, как и шаг 4.1.
    2. Настройка анализа аналогично как в шаге 4.2. Сглаживание и линии ширина должны быть идентичны.
    3. Измерьте профили аналогично как в шаге 4.3.
    4. Проверьте точность профили путем построения (шаг 4.4) и установка фильтрации при желании (шаг 4.5).
  8. Рассчитать распределение макро (укороченный F4) запустите для расчета белка разделять между плазматической мембраны и в цитоплазме. Выполните настройки параметра в диалоговом окне вызываемый макрос.
    1. Аналогично с предыдущий шаг (шаг 4.4), укажите источник данных, фильтрации и префикс имени файла.
    2. Укажите, если модель для расчета распределения белка будет загружен из последней модели вычислений в экземпляре недавно «Периферийных» макроса на Фиджи (выберите флажок последние результаты) или ( RData файлов Установите флажок «из файла»).
    3. Держите флажок удалять результаты с остаточной изменчивостью больше активации если результат фильтрация пожелан. Укажите пороговое значение максимально допустимых остаточных изменчивости, что может быть необъяснимые разложение сигнала измерения индивидуального профиля. Например: значение 0.200 указывает, что будут отменены все измерения с необъяснимые изменчивость превышает 20% общей изменчивости интенсивности флуоресценции в профиле.
    4. Выберите образец группировки факторы, которые могут быть использованы для создания коробки участок (шаг. 4.4).
    5. Активировать чек бокс Pdf выход? для сохранения коробки сюжет как PDF-файл.
    6. Нажмите кнопку ОК, указать входные данные или выходного пути и подтверждают анализ, нажав кнопку OK в диалоговом окне показаны выполняется код R.
      Примечание: Поле участок периферически связанных белков перегородки между плазматической мембраны и цитоплазме будет показан в новом окне изображения, и R анализ вывода будут перечислены в текстовом окне.
    7. Для внешней обработки, сохранить результаты отображаются в окне результаты через файл | Сохранить как... в меню окно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DREPP10 — завод конкретных периферически связанных плазмы мембранный белок, который связан с плазматической мембраны через N-myristoylation и электростатического взаимодействия с фосфатидилинозитол фосфаты11, 12. DREPP был описан как компонент механизма кальция сигнализации в растительной клетке и также взаимодействует с цитоскелета13,14. В представленных эксперименте табак одичал типа DREPP2 и черепашки версии ее не myristoylated (заменены Ала Gly2) были GFP-тегами6 и выражена в табак BY-2 подвеска клетки15 под активаторных 35S CaMV16. Секционирование плазматической мембраны этих белков были измерены в 3-дневных (3 дня после разбавления) Телефоны, FM 4-64-меченых (8 мкм)6 культур с (рис. 1A) и без (рис. 1B) добавлением phosphoinositide 3-киназа ингибитор Вортманнин (10 мкм)17, согласно протоколу, описанных выше. Обрезанную версию DREPP2(Δ1-23), не хватает плазматической мембраны привязки домена6 был использован как маркер цитоплазмы для построения модели распределения флуоресцирования (рис. 1 c).

Вычисляемые данные были преобразованы корень квадратный (положительное значение, соответствующее минимально отрицательное значение была добавлена ко всем данным для извлечения только положительные данные), и данные были проверены двусторонний ANOVA R9. Эффекты лечения мутации и ингибиторы были весьма значительными (p < 2.2 x 10-16 ***). Все группы были сопоставлены с Тьюки HSD теста; все группы значительно отличались за исключением DREPP2, Вортманнин и DREPP2(G2A) лечение (рис. 1 d).

Эти результаты ясно показывают, что Ассоциация плазматической мембраны табака DREPP2 белок является результатом N-myristoylation и электростатического взаимодействия, которые работают сообща. Только взаимное влияние мутация сайта N-myristoylation и Вортманнин лечения причиной полной диссоциации DREPP2 белка из плазматической мембраны. Эти результаты являются в соответствии с ранее опубликованных данных6.

Figure 1
Рисунок 1 : Эффект мутаций в сайта N-myristoylation и Вортманнин лечения на плазматической мембране секционирования периферически связанных плазмы мембранный белок DREPP, который участвует в кальция, сигнальный путь в растительной клетке. Медиальной конфокальный секций (A) клеток табака по-2, выражая формы дикого типа DREPP2-GFP и мутанта образуют DREPP2 (Gly2Ala)-ГФП (зеленый канал). Клетки были помечены FM 4-64 краситель (пурпурный канал), шкалы бар 10 мкм. (B) одной и той же линии клеток лечили 10 мкм Вортманнин (WM). (C) клеток выразить цитоплазматической маркер DREPP2(Δ1-23). (D) секционирование оценкам плазматической мембраны для всех образцов. Значение обоих эффектов был проверен двусторонний ANOVA (p < 2.2 x 10-16 *** в обоих случаях; исходные данные были преобразованы квадратный корень). Буквы обозначают группы, которые не являются значительно отличаются друг от друга как определяется Тьюки HSD теста. Усы прямоугольные показывают, 95% доверительный интервал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, описанный здесь генерирует более точной оценки плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков, по сравнению с другими подходами, основанный на измерении интенсивности флуоресценции5. Основные улучшения данного метода является, что он принимает во внимание дифракции света и суперпозиция плазматической мембраны и цитоплазматических сигналов. Хотя эти результаты метода находятся в корреляции с результатами простой метод, основанный на сравнении интенсивности флуоресценции в положении мембраны с среднем цитоплазматических сигнал (как показано ранее6), основное преимущество данного метода Роман Это определение остаточного изменчивости (необъяснимые разложения сигнала), что позволяет оценки релевантности результатов, особенно когда сигнал плазматической мембраны меньше, чем цитоплазматических сигнал. Описан метод также является более прочной, чтобы сигнал шум потому что вычисление белка секционирования не основано на только одной точки.

Анализ требует только одного 2 канальный конфокальный изображения. В отличие от FRAP подходы18 на основе измерения динамики белков диффузии в длиннее время windows метод описан более применимо для динамических в vivo подходы, когда приобретение быстро изображений является критическим требованием ( например, сигнальной трансдукции исследования, тормозящий анализов). Этот метод подходит для быстрого получения больших объемов данных, достаточных для статистической оценки.

Этот метод ограничен только один мембраны. Анализ сигналов от двух тесно прилегающих мембраны соседних клеток в настоящее время не поддерживается. В этом случае установка сигнала является, более требовательных с более высоким риском артефактов.

Однако анализ был первоначально разработан для растений подвеска клетки15, и она может быть применена для анализа других типов клеток, а также. Пыльца трубы и корневые волоски представляют собой потенциально очень хорошие цели данного метода в биологии растений. После предыдущей проверки стены клетки не обозначены FM 4-64 и exhibit помехи аутофлюоресценция могут быть проанализированы внешней мембраны эпидермальных клеток растений. Протисты клетки, которые свободны от помех аутофлюоресценция, дрожжевых клеток, грибковых клеток, а также животных клеток с гладкой плазматической мембраны могут быть проанализированы с помощью метода описано; Однако для животных клеток анализ распределения белка на переднем краю клеток фиброцита или на границе кисти эпителиальных клеток не может быть возможным. Из-за параметров гибкого анализа FM 4-64 окрашивания могут быть заменены другими подходами визуализации плазматической мембраны, такие как дневно меткой белков. С осторожностью этот метод может использоваться для фиксированных ячеек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Этот проект был поддержан НПУ I, LO1417 (Министерство образования, молодежи и спорта Чешской Республики).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FM 4-64 ThermoFisher Scientific T13320 Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 Sigma Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
  2. Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
  3. Kubitscheck, U. Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , John Wiley & Sons. (2013).
  4. Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
  5. Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
  6. Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
  7. Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  10. Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
  11. Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
  12. Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
  13. Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
  14. Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
  15. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
  16. Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
  17. Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
  18. Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).

Tags

Биология выпуск 136 периферически связанных плазматической мембраны белка мембраны сходства мембранные перегородки конфокальная микроскопия ImageJ R-проекта FM 4-64 деконволюция

Erratum

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

Определение плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vosolsobě, S.,… More

Vosolsobě, S., Schwarzerová, K., Petrášek, J. Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. J. Vis. Exp. (136), e57837, doi:10.3791/57837 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter